CN104529710B - 一种利用手性衍生试剂对dl‑薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用手性衍生试剂对DL‑薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，即使用手性芳香酸与DL‑薄荷醇进行柱前衍生化反应得具有紫外吸收的DL‑薄荷醇酯衍生物；再通过配有紫外可见光检测器的高效液相色谱仪，使用普通的非手性硅胶色谱柱，采用水相与有机相作为反相洗脱流动相，将上述所得DL‑薄荷醇酯衍生物配成浓度为0.5‑1.0 mg/mL的样品溶液，控制流速为0.4‑1.2 mL/min，进样量为2‑10µL，检测波长为210‑285 nm,色谱柱柱温箱为20‑35℃进行色谱柱分离，从而将上述所得的DL‑薄荷醇酯非对映异构体进行分离检测，最后再分别进行水解即得D‑薄荷醇和L‑薄荷醇。

Description

一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相 色谱手性拆分的方法
技术领域
本发明涉及一种使用手性衍生试剂的柱前衍生高效液相色谱分析分离方法，具体以手性芳香酸作为衍生试剂，对DL-薄荷醇进行柱前紫外衍生化，得到具有紫外吸收的非对映异构体衍生物，对衍生物采用非手性常规C18色谱柱和二极管阵列检测器来拆分检测。
背景技术
薄荷(Mentha haplocalyx)又称苏薄荷、水益母、夜息香、水薄荷、鱼香草、人丹草、蕃荷菜等，为唇形科多年生宿根性草本植物，是一种有特种经济价值的芳香作物，广泛分布于全国各地。薄荷醇，学名5-甲基-2-异丙基环己醇，俗称薄荷脑，有机化合物，无色针状结晶或粒状。薄荷醇作为薄荷和欧薄荷精油中的主要成分，主要以游离和酯的状态存在。薄荷醇有8种立体异构体，它们所呈现的香气性质各不相同，L-薄荷醇不仅具有薄荷香气而且有清凉的作用，消旋的DL-薄荷醇也有清凉作用，但其他的异构体无清凉作用。L-薄荷醇可以作为赋香剂应用于牙膏、香水、饮料和糖果等产品中；其作用于皮肤或黏膜，具有清凉止痒的作用，可在医药上作为刺激药使用；内服又可用于头痛及鼻、咽、喉炎症等。由于L-薄荷醇的应用范围较广，只依靠从天然薄荷中提取已经不能满足日益增长的工业需求，因而更多的厂家越来越依赖于化学合成的薄荷醇。目前，合成薄荷醇的方法主要有化学合成和不对称合成，不对称合成是使用手性诱导催化剂将无手性作用物转化成光学活性物，得到某个异构体的量占优势。然而，不对称合成手性催化剂的种类有限，且价格昂贵。化学合成薄荷醇易得到消旋的薄荷醇。
L-薄荷醇由于其特有的清新香气及清凉作用，在医药卫生、食品工业和日用精细化工品等方面具有广泛的应用，可用作杀菌剂、鼻吸入剂、局部麻醉剂，并可用于牙膏、卷烟、化妆品、清凉饮品和其它食品香精中。因此，研究如何高效地获取光学活性的L-薄荷醇具有十分重要的意义
薄荷醇的化学拆分包括两种方法：一种是DL-薄荷醇与具有光学活性的试剂反应生成两种不同镜像、不同物理性质的非对映异构体，然后通过分步结晶的方法进行拆分，分离得到的产物再分别水解便可得到光学纯的D-薄荷醇和L-薄荷醇，这种方法在早期研究最多且使用最普遍。但是这种分离技术也存在较大的缺点：一是反应所使用的光学活性试剂价格昂贵且不易回收；二是后续分离工序繁杂，不能进行大规模的生产。
另一种是使用非光学活性试剂来拆分，即先将DL-薄荷醇与非光学活性试剂反应，在反应产物的过冷饱和溶液中加入其中一种对映体衍生物晶种，诱导与其相同构型的对映体衍生物的结晶先行析出，而另一种手性对映体衍生物仍留在溶液中。使用此方法首先要制得纯的D或L对映体衍生物，其次要严格控制结晶析出温度，但这在实际应用操作上很难得到有效的控制。
生物酶作为生物催化剂具有高催化效率、反应专一性及立体选择性。目前，国内外学者主要利用酶和微生物催化酯和醇的不对称水解和不对称酯化两者途径来拆分DL-薄荷醇。但生物酶拆分一般反应时间较长，反应条件要求较高，稀释度大，产品的香气质量下降；这些拆分方法一般要求高纯度的酶来保证其高的酶活性，但纯化酶的工序较复杂，易造成酶的失活，直接采用粗酶拆分，酶活性太低。
综上所述，化学拆分和生物酶拆分都有较大的不足，都不利于工业大规模拆分生产。
现已报道的许多薄荷醇的分析方法，包括用气相火焰离子检测器、使用液相折射检测器、液质联用和液相荧光检测器来对薄荷醇进行非手性的分析。而手性分析的方法目前有：用取代的β-环糊精作为固定相进行气相色谱分离，但不能达到完全分离；液相手性分析用旋光检测器得到的灵敏度较低；通过柱前衍生高效液相色谱使用手性填料进行分离，成本较高。
本发明采用先将薄荷醇衍生化得到非对映异构体，再利用高效液相色谱仪，使用非手性常规键合硅胶色谱柱进行拆分分离，这种柱前衍生薄荷醇的色谱拆分方法相对于以上拆分方法具有廉价经济、实用、快速、分离度高、灵敏度高等优点。此方法可应用于使用模拟移动床设备快速、大量的分离DL-薄荷醇衍生物，将分离开的D-薄荷醇衍生物和L-薄荷醇衍生物进行脱衍生试剂即得到D-薄荷醇和L-薄荷醇。
发明内容
本发明其目的在于提供一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法。
本发明的技术方案
一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，即首先将DL-薄荷醇进行柱前衍生酯化反应得到相应的具有紫外吸收的DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物；
所述的柱前衍生酯化反应即将DL-薄荷醇与手性芳香酸在甲苯溶剂中，通过催化剂一水对甲苯磺酸进行催化酯化反应，得到DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物；
上述酯化反应所用的手性芳香酸、DL-薄荷醇和催化剂一水对甲苯磺酸的量，按摩尔比计算，即手性芳香酸：DL-薄荷醇：催化剂一水对甲苯磺酸为1.2：1：0.05；
其中所述的芳香酸为D-扁桃酸、(+)-萘普生；
然后，使用配有紫外可见光检测器的高效液相色谱仪，以普通非手性的键合硅胶常规柱为色谱柱，用水相与有机相组成的反相流动相系统，将上述所得的DL-薄荷醇酯配成浓度为0.5-1.0 mg/mL的样品溶液，然后控制流速为0.4-1.2 mL/min，进样量为2-10 µL，检测波长为210-285 nm,色谱柱柱温为20-35℃，从而将上述所得的DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物进行分离，分别得到D-薄荷醇酯和L-薄荷醇酯；
所述的普通非手性的键合硅胶常规柱为Phenomenex Luna 5 μm C18(2) 250 x4.6 mm，即直链烷烃键合在5 µm硅胶表面而形成的；
所述的水相与有机相组成的反相流动相系统为由乙腈与水组成的混合液或由甲醇与水组成的混合液；
D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物的分离所用的水相与有机相组成的反相流动相系统优选为按体积百分比计算，即由乙腈与水按乙腈：水为60-90%：10-40%组成的混合液，更优选为按体积百分比计算，即由乙腈与水按乙腈：水为75%：25%的比例而组成的混合液；
(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物的分离所用的水相与有机相组成的反相流动相系统优选为按体积百分比计算，即由甲醇与水按甲醇：水为70-95%：5-30%组成的混合液，更优选为按体积百分比计算，即由甲醇与水按甲醇：水为90%：10%的比例而组成的混合液；
最后，将分离得到的D-薄荷醇酯、L-薄荷醇酯再分别在氢氧化锂的甲醇溶液中进行水解，即得D-薄荷醇和L-薄荷醇；
所述的氢氧化锂的甲醇溶液中，溶质氢氧化锂的质量百分比浓度为20%，溶剂为甲醇。
本发明的一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，可放大应用于制备色谱分离与模拟移动床分离DL-薄荷醇。
本发明的有益技术效果
本发明的一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，能够有效的拆分薄荷醇的衍生物DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物，使D-薄荷醇酯和L-薄荷醇酯的分离度达到分离要求，拆分开的D-薄荷醇酯和L-薄荷醇酯可分别经水解得到对应的单构型的薄荷醇，本发明方法可应用于使用制备色谱或模拟移动床设备对DL-薄荷醇进行分离。
进一步，本发明的利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法能快速、简便、准确的拆分分离DL-薄荷醇对映异构体。
进一步，本发明的利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法具有灵敏度高、成本低等特点。
附图说明
图1a、实施例1中所得的D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物，在色谱柱为Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：乙腈-水=75：25（v/v）；流速0.7 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25℃；进样体积：10µL的液相分析条件下所得的液相色谱分离图；
图1b、实施例1中对照品溶液（即标准的D-扁桃酸-L-薄荷醇酯），在色谱柱为Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：乙腈-水=75：25（v/v）；流速0.7 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25℃；进样体积：10µL的液相分析条件下所得的液相色谱图；
图2a、实施例2中所得的白色固体白色固体(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物，在色谱条件为Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：甲醇-水=90：10（v/v）；流速0.9 mL/min；检测波长：220nm；柱温：25℃；进样体积：10µL的液相分析条件所得的液相分离色谱图；
图2b、实施例2中对照品溶液（即标准的(+)-萘普生-L-薄荷醇酯），在色谱柱为Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：甲醇-水=90：10（v/v）；流速0.9 mL/min；检测波长：220nm；柱温：25℃；进样体积：10µL的液相分析条件下所得的液相色谱图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例并结合说明书附图对本发明做详细的阐述，但本发明并不限于下述的实施例。
本发明的各实施例中所用的D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯、(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯的合成方法，具体步骤如下：
向装有温度计、分水器、球型冷凝管和干燥管的250 mL三口烧瓶中依次加入手性芳香酸、DL-薄荷醇和对甲苯磺酸一水合物，其摩尔比为1.2：1：0.05，溶于100 mL甲苯中，向分水器中加入甲苯，加热至110oC搅拌回流过夜，TLC检测原料反应完全。将反应体系冷却至室温，向体系中加入20 mL水淬灭反应，搅拌10 min后静置分液，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后浓缩得DL-薄荷醇酯衍生物粗品，用石油醚与乙酸乙酯作为淋洗液进行柱层析即得相应的DL-薄荷醇酯的纯品。
本发明所用的高效液相色谱仪为：Agilent LC1260，G1311C-1260 Quat Pump VL，G1329B-ALS SL，G1316A-TCC，G1315D-DAD。
实施例1
一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，具体步骤如下：
（1）、在250mL三口烧瓶中依次加入手性芳香酸D-扁桃酸（5.84 g， 38.39 mmol）、DL-薄荷醇（5 g，31.99 mmol）和催化剂一水对甲苯磺酸（0.31 g, 1.60 mmol），按摩尔比计算，即手性芳香酸：DL-薄荷醇：催化剂一水对甲苯磺酸为1.2：1：0.05，然后加入100 mL的甲苯做溶剂，摇匀加入磁子，安装分水器、球型冷凝管和干燥管，在分水器里另外加满甲苯，加热110℃左右，搅拌回流，冷凝分水，反应完成后即分水器里的水不再增加为止，将反应体系冷却至室温，加入20 mL水，分出有机层，有机层依次用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗涤，控制温度为40-50℃旋干即得D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物粗品，用石油醚做淋洗液硅胶柱柱层析即得白色固体D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物纯品，收率为85%；
采用核磁共振仪器（Bruker-500/VANCE Ⅲ）对上述所得的白色固体进行测定，得到两组核磁共振数据，分别如下：
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.46 – 7.31 (m, 10H), 5.16 (d, J = 5.8 Hz,1H), 5.12 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 4.79 (td, J = 10.9, 4.4 Hz, 1H), 4.67 (td, J =11.0, 4.4 Hz, 1H), 3.63 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 3.53 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 2.06(dt, J = 9.8, 5.5 Hz, 1H), 1.89 (dtd, J = 13.9, 7.0, 2.6 Hz, 1H), 1.76 (dt, J= 9.5, 5.1 Hz, 1H), 1.71 – 1.64 (m, 3H), 1.59 (ddd, J = 13.0, 6.5, 3.2 Hz,1H), 1.48 – 1.36 (m, 2H), 1.26 (ddd, J = 15.0, 11.8, 8.8 Hz, 2H), 1.10 – 0.98(m, 3H), 0.96 – 0.90 (m, 7H), 0.82 (ddd, J = 15.2, 8.8, 5.6 Hz, 9H), 0.59 (d,J = 7.0 Hz, 3H), 0.40 (d, J = 6.9 Hz, 3H)；
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.58 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.45 (t, J = 7.4Hz, 2H), 7.28 (s, 1H), 5.95 (s, 1H), 5.33 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.60 (td, J =10.9, 4.4 Hz, 1H), 1.90 (dd, J = 7.2, 4.8 Hz, 1H), 1.67 – 1.61 (m, 1H), 1.60– 1.53 (m, 1H), 1.40 (ttd, J = 13.6, 6.8, 3.7 Hz, 1H), 1.20 – 1.07 (m, 2H),0.97 – 0.86 (m, 5H), 0.80 (ddd, J = 25.1, 12.6, 3.2 Hz, 1H), 0.65 (d, J = 7.0Hz, 3H), 0.43 (d, J = 6.9 Hz, 3H)；
从上述的核磁共振数据可以看出，所得的白色固体中含有D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯和D-扁桃酸-L-薄荷醇酯，其结构式分别如下：
；
（2）、取25 mg 步骤（1）所得的D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物，用由水相与有机相组成的反相流动相系统进行溶解后转移至25 mL容量瓶中并用由水相与有机相组成的反相流动相系统定容，得到供试品溶液；
所述的由水相与有机相组成的反相流动相系统，按体积百分比计算，即由乙腈与水按乙腈：水为75%：25%的比例而组成的混合液；
取对应的标准的D-扁桃酸-L-薄荷醇酯25 mg，按上述相同方法溶解配置作为供试对照品溶液；
（2）、分别进样供试品溶液和对照品溶液，按下述液相条件进行高效液相色谱分析；
采用如下液相分析条件进行分析：
色谱柱：Agilent zorbax 300SB-C18 3.5 μm （250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：乙腈-水=75：25（v/v）；流速0.7 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25℃；进样体积：10µL；
从按上述液相分析条件所得的液相色谱分离图中得到，D-扁桃酸-D-薄荷醇酯的保留时间为4.817 min，D-扁桃酸-L-薄荷醇酯的保留时间为4.997 min；分离度为1.19。
采用如下液相分析条件进行分析：
色谱柱：Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：乙腈-水=75：25（v/v）；流速0.7 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25℃；进样体积：10µL。
供试品溶液（含有D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物）采用上述液相分析条件所得的液相色谱分离图如图1a所示，从图1a中可以看出，其中保留时间18.460 min为D-扁桃酸-D-薄荷醇酯，保留时间19.492 min为D-扁桃酸-L-薄荷醇酯，两者的分离度为2.14。
对照品溶液（含有标准的D-扁桃酸-L-薄荷醇酯）采用上述液相分析条件所得的液相色谱图如图1b所示，从图1b中可以看出，D-扁桃酸-L-薄荷醇酯的保留时间为19.496min。
综上所述，当采用色谱柱：Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：乙腈-水=75：25（v/v）；流速0.7 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25℃；进样体积：10µL的液相分析条件时，D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物即D-扁桃酸-D-薄荷醇酯、D-扁桃酸-L-薄荷醇酯能达到有效的分离且保留时间合适。
实施例2
一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，具体步骤如下：
在250mL三口烧瓶中依次加入手性芳香酸 即(+)-萘普生（8.84 g, 38.39 mmol）、DL-薄荷醇（5 g，31.99 mmol）和催化剂一水对甲苯磺酸（0.31 g, 1.60 mmol），按摩尔比计算，即手性芳香酸：DL-薄荷醇：催化剂一水对甲苯磺酸为1.2：1：0.05，然后加入100mL的甲苯做溶剂，摇匀加入磁子，安装分水器、球型冷凝管和干燥管，在分水器里另外加满甲苯，加热110℃左右，搅拌回流，冷凝分水，反应完成后即分水器里的水不再增加为止，将反应体系冷却至室温，加入20mL水，分出有机层，有机层依次用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗涤，控制温度为40-50℃旋干即得(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物粗品，用石油醚做淋洗液硅胶柱柱层析即得白色固体(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物纯品，收率为88%。
采用核磁共振仪器（Bruker-500/VANCE Ⅲ）对上述所得的白色固体进行测定，得到两组核磁共振数据，分别如下：
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.72 (td, J = 8.4, 5.8 Hz, 6H), 7.48 – 7.42(m, 2H), 7.17 (ddd, J = 10.7, 6.6, 2.5 Hz, 4H), 4.77 – 4.63 (m, 2H), 3.93 (s,6H), 3.86 (dt, J = 14.3, 7.2 Hz, 2H), 2.08 – 2.01 (m, 1H), 1.90 – 1.86 (m,1H), 1.70 – 1.64 (m, 3H), 1.61 (dd, J = 7.2, 2.0 Hz, 6H), 1.48 – 1.43 (m,2H), 1.38 – 1.28 (m, 4H), 1.01 (tdd, J = 12.0, 7.8, 4.3 Hz, 3H), 0.94 – 0.85(m, 13H), 0.78 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.64 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.53 (d, J =6.9 Hz, 3H)。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.77 – 7.66 (m, 3H), 7.43 (dd, J = 8.5, 1.7Hz, 1H), 7.19 – 7.11 (m, 2H), 4.71 (td, J = 10.9, 4.4 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H),3.85 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 1.91 – 1.78 (m, 2H), 1.71 – 1.63 (m, 2H), 1.59 (d,J = 7.2 Hz, 3H), 1.46 (tdd, J = 12.0, 6.5, 3.2 Hz, 1H), 1.40 – 1.32 (m, 1H),1.05 (qd, J = 13.0, 3.0 Hz, 1H), 0.90 – 0.79 (m, 8H), 0.75 (d, J = 7.0 Hz,3H)。
从上述的核磁共振数据可以看出，所得的白色固体含有(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯和(+)-萘普生-L-薄荷醇酯，其结构式分别如下：
；
（2）、取25 mg步骤（1）所得的(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物，用由水相与有机相组成的反相流动相系统进行溶解后转移至25 mL容量瓶中并用由水相与有机相组成的反相流动相系统定容，得到供试品溶液；
同样，取对应的标准的(+)-萘普生-L-薄荷醇酯25 mg，按上述相同方法溶解配置作为供试对照品溶液；
（2）、分别进样供试品溶液和对照品溶液，按下述液相条件进行高效液相色谱分析；
液相色谱分析的条件如下：
色谱柱：Agilent zorbax 300SB-C18 3.5 μm （250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：乙腈-水=75：25（v/v）；流速0.7 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25℃；进样体积：10µL。
从按上述液相色谱分析条件所得的色谱图中得到，(+)-萘普生-D-薄荷醇酯的保留时间为10.361 min，(+)-萘普生-L-薄荷醇酯的保留时间为10.758 min；分离度为1.30；
液相色谱分析的条件如下：
色谱柱：Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：甲醇-水=90：10（v/v）；流速0.9 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25℃；进样体积：10µL；
供试品溶液（含有(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物）采用上述液相分析条件所得的液相色谱分离图如图2a所示，从图2a中可以看出，保留时间18.191 min为(+)-萘普生-D-薄荷醇酯，保留时间19.409 min为(+)-萘普生-L-薄荷醇酯，两者的分离度为2.15。
对照品溶液（含有标准的(+)-萘普生-L-薄荷醇酯）采用上述液相分析条件所得的液相色谱图如图2b所示，从图2b中可以看出，(+)-萘普生-L-薄荷醇酯的保留时间为19.409min。
综上所述，当采用色谱柱：Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：甲醇-水=90：10（v/v）；流速1.0mL/min；检测波长：220nm；柱温：25℃；进样体积：10µL的液相色谱分析条件进行分析时，(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物中(+)-萘普生-D-薄荷醇酯和(+)-萘普生-L-薄荷醇酯能达到有效的分离且保留时间合适。
实施例3
一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，具体步骤如下：
（1）、同实施例1的步骤（1）；
（2）、同实施例1的步骤（2），得到供试品溶液和对照品溶液；
（3）、将所得的供试品溶液和对照品溶液，按下述液相条件进行高效液相色谱分析；
采用如下液相色谱分析条件进行分析：
色谱柱：Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：乙腈-水=75：25（v/v）；流速分别是0.5mL/min、0.6 mL/min、0.7 mL/min、0.8mL/min、0.9 mL/min、1.0 mL/min；检测波长：220nm；柱温：25℃；进样体积：10µL；
从按上述液相色谱分析条件所得的色谱图中得到，不同的流速条件下D-扁桃酸-D-薄荷醇酯的保留时间， D-扁桃酸-L-薄荷醇酯的保留时间，D-扁桃酸-D-薄荷醇酯、D-扁桃酸-L-薄荷醇酯的分离度分别如下表：
流速 (mL/min) t1 (min) t2 (min) Rs
0.5 25.489 26.922 2.19
0.6 21.264 22.456 2.17
0.7 18.329 19.356 2.15
0.8 16.041 16.939 2.12
0.9 14.287 15.085 2.08
1.0 12.889 13.607 2.07
上表中t1为D-扁桃酸-D-薄荷醇酯的保留时间，t2为D-扁桃酸-L-薄荷醇酯的保留时间，Rs为分离度；
从上表中可以看出，D-扁桃酸-D-薄荷醇酯和D-扁桃酸-L-薄荷醇酯分离度随流速的升高而减小，保留时间随流速的升高而变小，特别是0.7 mL/min的流速条件对D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯进行分离，D-扁桃酸-D-薄荷醇酯、D-扁桃酸-L-薄荷醇酯能达到完全分离。
实施例4
一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，具体步骤如下：
（1）、同实施例2的步骤（1）；
（2）、同实施例2的步骤（2），得到供试品溶液和对照品溶液；
（3）、将所得的供试品溶液和对照品溶液，按下述液相条件进行高效 液相色谱分析，液相色谱分析的条件如下：
色谱柱：Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：甲醇-水=90：10（v/v）；流速分别是0.6 mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min、0.9 mL/min，检测波长：220 nm；柱温：25℃；进样体积：10 µL；
从按上述液相色谱分析条件所得的色谱图中可以得到，不同的流速条件下(+)-萘普生-D-薄荷醇酯的保留时间，(+)-萘普生-L-薄荷醇酯的保留时间、(+)-萘普生-D-薄荷醇酯和 (+)-萘普生-L-薄荷醇酯的分离度分别如下表：
流速 (mL/min) t1 (min) t2 (min) Rs
0.6 27.558 29.419 2.40
0.7 23.442 25.019 2.32
0.8 20.506 21.885 2.22
0.9 18.193 19.413 2.20
上表中t1为(+)-萘普生-D-薄荷醇酯的保留时间，t2为(+)-萘普生-L-薄荷醇酯的保留时间，Rs为分离度；
从上表中可以看出，(+)-萘普生-D-薄荷醇酯和(+)-萘普生-L-薄荷醇酯的分离度随流速的升高而减小，(+)-萘普生-D-薄荷醇酯和(+)-萘普生-L-薄荷醇酯的保留时间随流速的升高而变小，特别是选择0.9 mL/min的流速条件对(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯进行分离，能达到(+)-萘普生-D-薄荷醇酯和(+)-萘普生-L-薄荷醇酯完全分离。
实施例5
一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，具体步骤如下：
（1）、同实施例1的步骤（1）；
（2）、同实施例1的步骤（2），得到供试品溶液和对照品溶液；
（3）、将所得的供试品溶液和对照品溶液，按下述液相条件进行高效液相色谱分析，液相色谱分析的条件如下；
色谱柱：Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：乙腈-水=75：25（v/v）；检测波长：220nm；柱温分别为20℃、25℃、30℃、35℃流速：0.7 mL/min；进样体积：10µL；
从按上述液相色谱分析条件所得的色谱图中可以得到，不同的流速条件下D-扁桃酸-D-薄荷醇酯的保留时间，D-扁桃酸-L-薄荷醇酯的保留时间，D-扁桃酸-D-薄荷醇酯和D-扁桃酸-L-薄荷醇酯的分离度分别如下表：
温度 (℃) t1 (min) t2 (min) Rs
20 19.091 20.208 2.18
25 18.460 19.492 2.14
30 17.912 18.870 2.10
35 17.009 17.881 2.03
上表中t1为D-扁桃酸-D-薄荷醇酯的保留时间，t2为D-扁桃酸-L-薄荷醇酯的保留时间，Rs为分离度；
从上表中可以看出，D-扁桃酸-D-薄荷醇酯和D-扁桃酸-L-薄荷醇酯分离度随温度的升高而减小，保留时间随温度的升高而变小，选择25℃的温度条件对D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯进行分离，D-扁桃酸-D-薄荷醇酯、D-扁桃酸-L-薄荷醇酯能达到完全分离。
实施例6
一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，具体步骤如下：
（1）、同实施例2的步骤（1）；
（2）、同实施例2的步骤（2），得到供试品溶液和对照品溶液；
（3）、将所得的供试品溶液和对照品溶液，按下述液相条件进行高效 液相色谱分析，液相色谱分析的条件如下：
色谱柱：Phenomenex Luna 5 μm C18(2)（250 mm x 4.6 mm）；水相与有机相组成的反相流动相：甲醇-水=90：10（v/v）；检测波长：220nm；流速：0.9 mL/min；进样体积：10µL。
从按上述液相色谱分析条件所得的色谱图中可以得到，不同的流速条件下(+)-萘普生-D-薄荷醇酯的保留时间，(+)-萘普生-L-薄荷醇酯的保留时间，(+)-萘普生-D-薄荷醇酯和(+)-萘普生-L-薄荷醇酯的分离度分别如下表：
温度 (℃) t1 (min) t2 (min) Rs
20 19.379 20.752 2.19
25 18.191 19.409 2.15
30 17.154 18.240 2.10
35 16.329 17.307 2.03
上表中t1为(+)-萘普生-D-薄荷醇酯的保留时间，t2为(+)-萘普生-L-薄荷醇酯的保留时间，Rs为分离度；
从上表中可以看出，(+)-萘普生-D-薄荷醇酯和 (+)-萘普生-L-薄荷醇酯的分离度随温度的升高而减小，保留时间随温度的升高而变小，特别是在25℃的温度条件对(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯进行分离，能达到(+)-萘普生-D-薄荷醇酯和(+)-萘普生-L-薄荷醇酯的完全分离。
实施例7
一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，具体步骤如下：
（1）、同实施例1的步骤（1）；
（2）、使用模拟移动床设备HB-HP-SMB（江苏汉邦科技有限公司），对步骤（1）所得的D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物进行分离制备,分别得到D-扁桃酸-D-薄荷醇酯、D-扁桃酸-L-薄荷醇酯。
实施例8
一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，具体步骤如下：
（1）、同实施例2的步骤（1）；
（2）、使用模拟移动床设备HB-HP-SMB（江苏汉邦科技有限公司）对步骤（1）所得的(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物进行分离制备,分别得到 (+)-萘普生-D-薄荷醇酯、(+)-萘普生-L-薄荷醇酯。
实施例9
将实施例1、3、5分离得到的D-扁桃酸-D-薄荷醇酯、D-扁桃酸-L-薄荷醇酯分别在氢氧化锂的甲醇溶液中进行水解，然后用乙酸乙酯萃取，减压旋蒸浓缩即分别得到D-扁桃酸-D-薄荷醇、D-扁桃酸-L-薄荷醇；
所述的氢氧化锂的甲醇溶液中，溶质氢氧化锂的质量百分比浓度为20%，溶剂为甲醇。
实施例10
将实施例2、4、6分离得到的(+)-萘普生-D-薄荷醇酯、(+)-萘普生-L-薄荷醇酯分别在氢氧化锂的甲醇溶液中进行水解，然后用乙酸乙酯萃取，减压旋蒸浓缩即得(+)-萘普生-D-薄荷醇、(+)-萘普生-L-薄荷醇；
所述的氢氧化锂的甲醇溶液中，溶质氢氧化锂的质量百分比浓度为20%，溶剂为甲醇。
综上所述，本发明的一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法是先通过DL-薄荷醇与手性芳香酸进行柱前衍生得到具有紫外吸收的DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物，然后使用配有紫外可见光检测器的高效液相色谱仪通过普通常规Phenomenex Luna 5 μm C18(2) 250 x 4.6 mm色谱柱对具有紫外吸收的DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物进行分离分析，在实施例1、2中的液相分析条件下，D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物、(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物实现了完全分离，且分离度与保留时间都相对其他实施例中的分离结果较好。
进一步，实施例7、8中是将具有紫外吸收的DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物用模拟移动床设备进行分离。
进一步本发明的一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法具有快速、方便、准确的特点，同时具有，灵敏度高、成本低等优点。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，其特征在于：
首先，通过柱前化学衍生法将DL-薄荷醇与手性芳香酸衍生酯化反应得到相应的具有紫外吸收的DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物；
然后，使用配有紫外可见光检测器的高效液相色谱仪，以普通非手性的键合硅胶常规柱为色谱柱，用有机相与水相组成的反相洗脱流动相体系，将上述所得的DL-薄荷醇酯衍生物配成浓度为0.5-1.0 mg/mL的样品溶液，控制流速为0.4-1.2 mL/min，进样量为2-10 µL，检测波长为210-285 nm,色谱柱柱温为20-35℃，从而将上述所得的DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物进行分离；
最后，将分离得到的D-薄荷醇酯、L-薄荷醇酯再分别在氢氧化锂的甲醇溶液中进行水解,即得D-薄荷醇和L-薄荷醇；
其中，所述的手性芳香酸为D-扁桃酸或(+)-萘普生；
所述的有机相与水相组成的反相流动相系统为由乙腈与水组成的混合液或由甲醇与水组成的混合液；
所述的氢氧化锂的甲醇溶液中，氢氧化锂的质量百分比浓度为20%。
2.如权利要求1所述的一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，其特征在于所述的普通非手性的键合硅胶常规柱为直连C18烷烃键合在5 µm硅胶表面而形成的色谱柱，具替为Phenomenex Luna 5 μm C18(2) 250 x 4.6 mm色谱柱。
3.如权利要求1所述的一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，其特征在于所述的柱前衍生酯化反应即将DL-薄荷醇与手性芳香酸在甲苯溶剂中，通过催化剂一水对甲苯磺酸进行催化酯化反应，得到DL-薄荷醇酯非对映异构体衍生物；
上述酯化反应所用的手性芳香酸、DL-薄荷醇和催化剂一水对甲苯磺酸的量，按摩尔比计算，即手性芳香酸：DL-薄荷醇：催化剂一水对甲苯磺酸为1.2：1：0.05。
4.如权利要求1所述的一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，其特征在于所述的手性芳香酸为D-扁桃酸；
所述的有机相与水相组成的反相流动相系统为乙腈和水组成的混合液，按体积百分比计算，即乙腈：水为60-90%：10-40%；
进行色谱分离时，样品溶液中D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯的浓度为1.0mg/mL，控制流速为0.7mL/min，进样量为10µL，色谱柱柱温为25℃，检测波长220nm。
5.如权利要求4所述的一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，其特征在于所述的有机相与水相组成的反相流动相系统为乙腈和水组成的混合液，按体积百分比计算，即乙腈：水为75%：25%；
进行色谱分离时，样品溶液中D-扁桃酸-DL-薄荷醇酯的浓度为1.0 mg/mL，控制流速为0.7 mL/min，进样量为10 µL，色谱柱柱温为25℃, 检测波长220nm。
6.如权利要求1所述的一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，其特征在于所述的手性芳香酸为(+)-萘普生；
所述的有机相与水相组成的反相流动相系统为甲醇和水组成的混合液，按体积百分比计算，即甲醇：水为70-95%：5-30%；
进行色谱分离时，样品溶液中(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯的浓度为1.0 mg/mL，控制流速为0.9 mL/min，进样量为10 µL，色谱柱柱温为25℃, 检测波长220nm。
7.如权利要求6所述的一种利用手性衍生试剂对DL-薄荷醇进行柱前衍生高效液相色谱手性拆分的方法，其特征在于所述的有机相与水相组成的反相流动相系统为甲醇和水组成的混合液，按体积百分比计算，即甲醇：水为90%：10%；
进行色谱分离时，样品溶液中(+)-萘普生-DL-薄荷醇酯的浓度为1.0 mg/mL，控制流速为0.9 mL/min，进样量为10 µL，色谱柱柱温为25℃, 检测波长220nm。
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