CN104508471A - Glyca的nmr测量 - Google Patents

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Abstract

生物标志物和/或风险评价鉴定具有某些临床疾病状态(包括，例如，CHD、2型糖尿病、痴呆或全因死亡(ACD))的增加风险的患者，其使用NMR信号来以任意单位或定义单位(例如，μmol/L)测量“GlycA”的水平，这可以使用质子NMR谱的定义单峰区域来确定。GlycA测量值可以用作用于临床疾病状态的炎症生物标志物。用于GlycA的NMR信号可包括质子NMR谱的约2.080 ppm和1.845 ppm之间的信号的拟合区域。

Description

GLYCA的NMR测量
相关申请
本申请要求2012年6月8日提交的的美国临时申请系列号61/657,315、2012年10月9日提交的美国临时申请系列号61/711,471、2012年12月19日提交的美国临时申请系列号61/739,305和2013年3月14日提交的美国临时申请系列号13/830,199的权益和优先权，其内容如同在本文完整记载地通过引用并入此处。
发明领域
本发明总体涉及体外生物样品的分析。本发明可特别适用于人血浆和血清的NMR分析。
发明背景
常规地，患者的冠心病(CHD)和/或冠状动脉疾病(CAD)的整体风险已经基于患者的低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的胆固醇含量(LDL-C、HDL-C)而非LDL和HDL颗粒的数量的测量进行评价。LDL-C和HDL-C用于评价患者的CHD风险，并且可以作出治疗决定以减少“坏”胆固醇(LDL-C)和/或增加“好”胆固醇(HDL-C)。
“C反应蛋白”(CRP)测试是一种血液测试，其测量血液样品中CRP蛋白的量。C反应蛋白被认为测量患者体内的总体炎症水平。可以进行一种类型的CRP测试，被称为高灵敏度CRP测试(hs-CRP)，以找出人是否具有患有心脏病发作的增加风险。
NMR波谱法已经用于同时测量极低密度脂蛋白(VLDL)、LDL和HDL作为来自体外血浆或血清样品的VLDL、LDL和HDL颗粒子类。参见，美国专利号4,933,844和6,617,167，其内容通过引用并入此处，如同在本文中完全记载。一般来说，为了评价血浆和/或血清样品中的脂蛋白，通过对复合甲基信号包络(envelope)去卷积而推算NMR谱的化学位移区域内的多个NMR谱衍生的信号的幅度，以得到子类浓度。所述子类由与NMR频率和脂蛋白直径相关的许多(通常超过60)离散的贡献性子类信号代表。NMR评价可以询问NMR信号以产生不同亚群的浓度，通常七十三个离散亚群，极低密度脂蛋白(VLDL)为27，LDL为20，且HDL为26。这些亚群可进一步表征为与VLDL、LDL或HDL子类内的特定大小范围相关。
在过去，“高级”脂蛋白测试实验对象组，诸如可得自LipoScience, Raleigh, N.C.的LIPOPROFILE®脂蛋白测试，已经通常包括总高密度脂蛋白颗粒(HDL-P)测量(例如，HDL-P数量)(其对所有HDL子类的浓度求和)和总低密度脂蛋白颗粒(LDL-P)测量(其对所有LDL子类的浓度求和)(例如，LDL-P数量)。LDL-P和HDL-P数量代表以浓度单位(诸如nmol/L)计的那些各自颗粒的浓度。
炎症可以与许多不同的疾病状态(包括但不限于CHD)相关。还据信，炎症可调节HDL功能性。参见，例如，Fogelman, When Good Cholesterol Goes Bad, Nature Medicine, 2004。糖蛋白的碳水化合物组分可以在蛋白分选、免疫和受体识别、炎症和其他细胞过程中行使生物学功能。还可以存在结构变化和不同程度的糖基化。参见，Gates等人, Glycoprotein Analysis Manual，综述，第1版，2004, Sigma Aldrich, www.sigmaaldrich.com/img/assests/15402/Glyocprotein。上述参考文献的内容通过引用并入此处，如同在本文中完整记载。
在过去，人寿保险公司已经考虑关于潜在客户的各种信息，以鉴定是否为人投保和以什么价格投保。一些公司用于预测用于此类分析的全因死亡风险的一种输入是总胆固醇与HDL-C的比率。然而，据信这是全因死亡的相对较差的预测物。
概述
本发明的实施方案基于血浆或血清样品的NMR谱的定义区域的去卷积鉴定被称为“GlycA”的一种新型NMR衍生的生物标志物。
本发明的实施方案基于血浆或血清样品的NMR谱的定义区域的去卷积鉴定被称为“GlycB”的一种新型NMR衍生的生物标志物。
本发明的实施方案提供了使用GlycA和(i)缬氨酸和(ii)至少一种脂蛋白子类输入中的一种或两种的多参数风险评价和/或筛选。
本发明的实施方案提供了使用GlycA和(i)缬氨酸和(ii)至少一种脂蛋白输入(诸如HDL-P)中的一种或两种的多参数全因死亡风险评价和/或筛选。
本发明的实施方案使用方程：HDL-P*缬氨酸/GlycA来评价体外生物样品来计算全因死亡风险。
计算机程序产品可包括计算机可读程序代码，其将转换因子应用于求和的洛伦兹函数以生成以µmol/L计的GlycA的测量值。
计算机程序产品可包括计算机可读程序代码，其将GlycA测量值与具有相关程度的CHD风险的测量值的预定范围进行比较。
计算机程序产品可包括计算机可读程序代码，其生成具有GlycA测量值和与风险评价的关联性的患者报道。
可以配置提供测量值的计算机程序代码以便使用具有集中于约2.00 ppm的峰的NMR信号评价体外血浆或血清患者样品的NMR谱。
还其他实施方案涉及系统，所述系统包括：用于获取体外生物样品的至少一个NMR谱的NMR波谱仪；和与NMR波谱仪通信的至少一个处理器，经配置以使用至少一个NMR谱获得GlycA的NMR测量值的至少一个处理器。
所述至少一个处理器可以被配置为：(i) 获得体外血浆生物样品的拟合区域的复合NMR谱；(ii)使用具有高密度脂蛋白(HDL)分量、低密度脂蛋白(LDL)分量、VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、定义蛋白信号分量和与至少一个GlycA峰区域相关的曲线拟合函数的定义去卷积模型去卷积复合NMR谱；和(iii)电子求和函数的定义数量以生成GlycA的NMR测量值。
曲线拟合函数可以包含洛伦兹和/或其他合适的函数。
可以配置所述至少一个处理器以便将转换因子应用于求和的NMR测量值以生成以µmol/L计的GlycA测量值。
生物样品可以是血浆或血清样品。配置所述至少一个处理器以获得高密度脂蛋白颗粒(HDL-P)的浓度测量值和低密度脂蛋白颗粒(LDL-P)的浓度测量值。
配置所述至少一个处理器以生成总结各自的LDL-P、HDL-P 和GlycA测量值的患者报道。
仍其他实施方案涉及患者报道，其包括多个脂蛋白测量值，包括以µmol/L和/或任意单位计的GlycA的定量量度，和至少以下之一：(i) 以浓度单位计的低密度脂蛋白颗粒数量(LDL-P)和(ii) 以浓度单位计的高密度脂蛋白颗粒(HDL-P)数量。
患者报道还可以包括镁和/或缬氨酸的NMR量度中的至少一个。
仍其他实施方案涉及NMR分析仪。NMR分析仪包括：NMR波谱仪；与波谱仪通信的流探针；和与波谱仪通信的控制器，其经配置以获得与流探针中的流体样本的GlycA相关的NMR谱的定义单峰区域的NMR信号且生成提供GlycA水平的患者报道。
控制器可包括至少一个本地或远程的处理器或与至少一个本地或远程的处理器通信，其中，所述至少一个处理器被配置成：(i) 获得体外血浆生物样品的拟合区域的复合NMR谱；(ii)使用具有高密度脂蛋白(HDL)分量、低密度脂蛋白(LDL)分量、VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、定义蛋白信号分量和应用至至少一个GlycA峰区域的曲线拟合函数(例如，重叠的洛伦兹函数)的定义去卷积模型去卷积复合NMR谱；和(iii)电子求和定义数量的应用的洛伦兹函数以生成GlycA水平。
可以配置所述至少一个处理器以便将转换因子应用于求和的NMR测量值以生成以µmol/L计的GlycA测量值。
在一些实施方案中，可以测定与GlycA相关的质子NMR谱的定义峰区域中NMR信号的NMR量度。GlycA信号测量值可以用作用于评价CHD风险的炎症生物标志物。
用于GlycA的NMR信号可包括在血浆或血清的质子NMR谱的约2.080 ppm和1.845 ppm之间的N-乙酰基糖化蛋白相关的信号(通常在47℃+/- 0.2)。
可以配置所述至少一个处理器以便将GlycA测量值用作定义的全因死亡风险比的分母，以生成与全因死亡的风险相关的风险预测物。
据信，人血浆GlycA是比hs-CRP更独立且更强的CHD/心脏病发作风险的炎症生物标志物，特别是当针对其他混杂因素(例如，收缩压、年龄、性别、BMI、糖尿病和吸烟)调整风险相关性时。
患者的具有或发生CHD和/或心脏病发作的风险可以使用多个NMR衍生的测量值(包括LDL-P、HDL-P和GlycA)进行评价。
本发明的实施方案可以使用比率：(缬氨酸*HDL-P)/GlycA生成包括缬氨酸、HDL-P和GlycA的计算比率的患者报道。
所述方法可以包括从生物样品的NMR谱电子计算LDL-P和HDL-P，并且所述测定步骤可以包括当GlycA和LDL-P高于各自群体标准且HDL-P低于群体标准时鉴定CHD的增加风险。
一些实施方案涉及评价或预测人的全因死亡风险的方法。所述方法包括：(a) 电子计算以下中的至少一个的测量值的比率：缬氨酸/GlycA、HDL-P/GlycA或(缬氨酸*HDL-P)/GlycA；和(b) 评价人是否相对于群体具有全因死亡的增加风险，其中当计算的比率在群体的第一三分位数、四分位数或五分位数中时，各人具有相对于群体增加的风险。所述计算可以使用(缬氨酸*HDL-P)/GlycA的比率实施。
其他实施方案涉及定量生物样品中代谢物A的水平的方法。所述方法包括去卷积具有与脂蛋白相关信号的质子NMR谱的定义代谢物A峰区域和与代谢物A相关的单峰；将多个曲线拟合函数应用至代谢物A的峰区域；和使用应用的曲线拟合函数测量代谢物A的水平。
仍其他实施方案涉及定量生物样品中缬氨酸的方法。所述方法包括：使用脂蛋白和蛋白分量的去卷积模型去卷积NMR谱；鉴定0.90-1.01 ppm之间的区域中的多重峰信号；和计算生物样品中缬氨酸的水平。
所述方法可以包括，在去卷积步骤之前，使用获取的NMR谱应用质量控制预分析分析。
本发明的额外方面涉及测量GlycB的方法。所述方法包括：(i) 电子获得受试者的生物样品的拟合区域的复合NMR谱；(ii)使用具有高密度脂蛋白(HDL)分量、低密度脂蛋白(LDL)分量、VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、和与至少一个GlycB峰区域相关的多个曲线拟合函数的定义去卷积模型电子去卷积复合NMR谱；和(iii) 使用曲线拟合函数电子生成GlycB的量度。
可以配置所述方法、计算机产品或系统以生成GlycA/GlycB或GlycB/GlycA的比率。
本发明的其他特征、优势和细节将由本领域普通技术人员从阅读随后的优选实施方案的图和详述后理解到，此类描述仅说明本发明。关于一个实施方案描述的特征可与其它实施方案合并，尽管对此没有具体讨论。就是说，值得注意的是，关于一个实施方案描述的本发明的方面可并入不同的实施方案中，尽管相对于其没有具体描述。就是说，所有实施方案和/或任何实施方案的特征可以任何方式和/或组合进行组合。申请人保留改变任何原始提交的权利要求或者相应地提交任何新的权利要求的权利，包括能够修改任何原始提交的权利要求来从属于和/或合并任何其他权利要求的任何特征的权利，尽管最初没有以那种方式要求保护。本发明的前述和其他方面在以下阐述的说明书中详细解释。
如同本领域技术人员鉴于本公开将理解的那样，本发明的实施方案可包括方法、系统、装置和/或计算机程序产品或其组合。
附图简述
图1是NMR谱，其显示根据本发明的实施方案的示例性血浆NMR谱的炎症标志物(分别来自糖基化急性期蛋白GlycA和GlycB的N-乙酰基甲基信号)。
图2A和2B是N-乙酰基糖基化蛋白的碳水化合物部分的化学结构的示意图，其显示产生GlycA NMR信号的CH3基团。
图3A和3B是N-乙酰基神经氨酸(也称为唾液酸)修饰的糖蛋白的碳水化合物部分的化学结构的示意图，其显示产生GlycB NMR信号的CH3基团。
图4A是根据本发明的实施方案的含有来自血浆脂蛋白的信号包络和基本GlycA和GlycB信号的血浆NMR谱的扩展。
图4B和4C是图4A中显示的NMR谱区的图，其说明根据本发明的实施方案得到用于测量GlycA和GlycB的NMR信号的去卷积模型。
图5A-5D是GlycA/B NMR谱区，其说明对于具有高TG(甘油三酯)的样品的来自脂蛋白信号(特别来自VLDL/乳糜)的谱重叠。
图6A是根据去卷积(例如，“拟合”)模型中使用的蛋白分量的GlycA浓度的不同量度的表格。
图6B-6D说明根据本发明的实施方案使用具有不同蛋白分量(图6A中表格中的#1-#3)的去卷积模型的相同血浆样品的GlycA和GlycB“拟合”(去卷积)。
图7A是根据本发明的实施方案的N-乙酰基葡糖胺的10 mmol/L参考样品的去卷积的示意屏幕截图，其用于生成将GlycA和GlycB信号区域与糖蛋白N-乙酰基甲基浓度相关的转换因子。
图7B是根据本发明的实施方案的GlycA/B去卷积模型中的分量的表格。
图7C是NMR谱，其显示根据本发明的实施方案的以典型正常(低)浓度存在于样品中的代谢物A。
图7D是NMR谱，其显示根据本发明的实施方案的以升高(高)浓度存在于样品中的代谢物A。
图8A和8B是两个不同群体的NMR测量的GlycA水平(以甲基浓度单位计)的分布图。图8A来自表面健康的男性和女性的MESA研究。图8B来自具有类风湿性关节炎的女性的研究。
图9是根据本发明的实施方案的hs-CRP和NMR测量的GlycA和NMR测量的缬氨酸水平与MESA(n=5680)中各种疾病结果的前瞻性关联的图表。
图10A是含有来自脂蛋白和支链氨基酸的甲基信号的血浆NMR谱的区域。
图10B是根据本发明的实施方案使用四个缬氨酸信号(两个双峰)来计算缬氨酸的NMR量度的拟合函数/去卷积模型的实例。
图11是根据本发明的实施方案的通过NMR测量的GlycA四分位数(以“NMR信号区域单位”计)的MESA受试者的特征的图表。
图12是显示根据本发明的实施方案的hsCRP、纤维蛋白原和GlycA与MESA中将来CHD事件的独立关联的图表。
图13是根据本发明的实施方案当添加至包括8个协变量的基础预测模型时各种参数(包括脂质、脂蛋白、炎症标志物和GlycA)与MESA(345个死亡，N=5607)中全因死亡的关联的各种统计评价的表。
图14是NMR测量的GlycA(NMR信号区域单位相比于CRP (mg/dL))的图，其显示根据本发明的实施方案基于MESA数据的hsCRP值<5和≥5 mg/dL的线性回归。
图15A是根据本发明的实施方案的通过LDL-P、HDL-P和GlycA的五分位数的平均颈动脉IMT(微米)的图。
图15B是根据本发明的实施方案的通过LDL-P/HDL-P*GlycA构成的风险指数的五分位数的平均颈动脉IMT的图。
图16是根据本发明的实施方案的不同脂蛋白参数的示意图。
图17是根据本发明的实施方案使用的用于分析临床疾病状态和/或风险的系统(包括GlycA评价模块和/或电路)的示意图。
图18是根据本发明的实施方案的NMR波谱设备的示意图。
图19是根据本发明的实施方案的数据处理系统的示意图。
图20是根据本发明的实施方案的可以用于计算GlycA的NMR量度的示例性操作的流程图。
图21A是根据本发明的实施方案的可以用于评价临床疾病状态(包括，仅通过实例的方式，CHD风险)的示例性操作的流程图。
图21B是根据本发明的实施方案的可以用于评价全因死亡的风险的示例性操作的流程图。
图22A是根据本发明的实施方案的包括GlycA测量值的患者报道的实例。
图22B是根据本发明的实施方案的具有GlycA测量值和紧密间隔的相应风险概述的患者报道的实例。
图22C–22E是根据本发明的实施方案的患者报道的其他实例。
图23A是根据本发明的实施方案的GlycA相对于时间的图的预示性实例，其可以监测变化来评价患者的风险状况和/或一种或多种临床疾病状态，状态变化，和/或治疗的临床疗效，或者甚至用于临床试验或与计划治疗矛盾等。
图23B说明根据本发明的实施方案的计算的ACD风险比相对于时间的图的预示性实例，其可以被监测以评价健康状况或健康状况的变化(或风险变化)。
图24是根据本发明的实施方案的来自针对年龄、性别、种族、吸烟、收缩压、高血压药物、体重指数、糖尿病和LDL-P调整的逻辑回归分析的表格，其说明全因死亡预测。
图25A是根据本发明的一些实施方案的风险比相对于(HDL-P*缬氨酸/GlycA)的五分位数的图。
图25B是根据本发明的实施方案的对于GlycA和每种参数的五分位数中的(HDL-P*缬氨酸)调整死亡率的三维图。
图26A是根据本发明的实施方案的NMR缬氨酸测试方案的流程图。
图26B是根据本发明的实施方案的可以在获得生物样品的NMR信号之前使用的示例性预分析处理的流程图。
图26C是根据本发明的实施方案的可以用于使用NMR评价缬氨酸的操作的流程图。本发明的前述和其他目的和方面在下面记载的说明书中进行详细解释。
本发明实施方案的详述
本发明现参考其中显示本发明实施方案的附图在下文中更充分地进行描述。然而，本发明可以不同形式体现，并且不应视为对本文记载的实施方案的限制；反而，提供这些实施方案使得本公开将是充分和完整的，并将把本发明的范围充分传达给本领域技术人员。
类似数字自始至终是指类似要素。在图中，为了清晰起见，可夸大某些线、层、元件、要素或特征的粗度。虚线说明任选的特征或操作，除非另有规定。
本文使用的术语用于仅描述特定实施方案的目的，而不是意在限制本发明。如本文所使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该”意在同样包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。将进一步理解，当用于本说明书时，术语“包含(comprises)”和/或“包括(comprising)”指定存在所述特征、整数、步骤、操作、要素和/或元件，但是不排除存在或增加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、元件和/或其组。如本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列举项的任何和所有组合。如本文所使用的短语诸如“X和Y之间”和“约X和Y之间”应解释为包括X和Y。如本文所使用的短语诸如“约X和Y之间”意指“约X和约Y之间”。如本文所使用的短语诸如“约X至Y”意指“约X至约Y”。
除非另外定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。应该进一步理解，术语，诸如在常用字典中定义的那些术语，应解释为具有与其在说明书和相关领域的情况下的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来解释，除非本文明确地如此定义。为了简洁和/或清楚，可以不详细描述众所周知的函数或结构。
将理解的是，尽管术语第一、第二等可在本文中用来描述各种要素、元件、区域、层和/或部分，但是这些要素、元件、区域、层和/或部分不应受这些术语限制。这些术语仅用于将一个要素、元件、区域、层或部分与另一区域、层或部分区分。因此，下面讨论的第一要素、元件、区域、层或部分在不脱离本发明的教导的情况下可以被称为第二要素、元件、区域、层或部分。操作(或步骤)的顺序不限于权利要求或附图中呈现的顺序，除非特别另外指明。
术语“编程地”意指使用计算机程序和/或软件、处理器或ASIC引导的操作来实施。术语“电子的”及其衍生词是指使用具有电路和/或模块的设备而非经由心理步骤实施的自动化或半自动化的操作，并且通常是指编程实施的操作。术语“自动化的”和“自动的”是指可以实施所述操作，而手工劳动或输入极少或没有手工劳动或输入。术语“半自动的”是指允许操作者进行一些输入或活动，但电子地，通常编程地进行计算和信号获取以及离子化成分的浓度的计算，而不需要手动输入。术语“约”是指指定值或数的+/- 10%(平均值或平均数)。
术语“CAD”和“CHD”可互换使用以对应于患者或受试者分别发生或具有冠状动脉疾病和/或冠心病的风险。术语心血管疾病(CVD)是指一种组合结果，其通常为CHD加上中风。
术语“全因死亡”是指死于任何原因，由于疾病诸如CHD或癌症，或意外，或自然原因诸如年老。
术语“GlycA”是指衍生自来自含有N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺部分的急性期反应物糖蛋白的碳水化合物部分(更具体地来自2-NAcGlc和2-NAcGal甲基的质子)的复合NMR信号的量度的新的生物标志物。GlycA信号集中于约47摄氏度的血浆NMR谱中的约2.00 ppm。峰位置独立于波谱仪场(spectrometer field)，但可以根据生物样品的分析温度而变化。因此，如果测试样品的温度变化，则GlycA峰区域可以变化。GlycA NMR信号可以包括在定义峰区域的NMR信号子集，以便仅包括临床相关信号贡献，并且可以排除蛋白对该区域信号的贡献，这将在下面进一步讨论。
术语“GlycB”是指衍生自来自含有N-乙酰神经氨酸(唾液酸)部分的急性期反应物糖蛋白的碳水化合物部分(更具体地来自5-N-乙酰基甲基的质子)的复合NMR信号的量度的新的生物标志物。GlycB信号集中于约47摄氏度的血浆NMR谱中的约2.04 ppm。峰位置独立于波谱仪场(spectrometer field)，但可以根据生物样品的分析温度而变化。因此，如果测试样品的温度变化，则GlycB峰区域可以变化。
如本文所使用，化学位移位置(ppm)是指内部涉及2.519 ppm的CaEDTA信号的NMR谱。因此，本文讨论和/或要求保护的所示峰位置可以根据如何如本领域技术人员众所周知地生成或涉及化学位移而变化。因此，为了清楚起见，所述和/或要求保护的峰位置中的某些在其他相应的化学位移中具有等量不同的峰位置，如本领域技术人员所众所周知。
术语“生物样品”是指人或动物的体外血液、血浆、血清、CSF、唾液、灌洗液、痰液或组织样品。本发明的实施方案可特别适于评价人血浆或血清生物样品。血浆或血清样品可以禁食或非禁食的。GlycA和GlycB没有在尿中发现，并且最适于在血浆或血清样品中评价。
术语“群体标准(population norm)”和“标准(standard)”是指一项或多项大研究定义的值，诸如弗雷明汉后代研究(Framingham Offspring Study)或动脉粥样硬化的多种族研究(MESA)或样品足够大足以代表一般群体的其他研究。然而，本发明不限于MESA中的群体值，因为本定义的正常和风险群体值或水平可随时间变化。因此，可以提供与来自定义群体的值相关的参考范围，并用于评价升高或降低的水平和/或具有临床疾病状态的风险。
术语“患者”被广泛使用并且是指为测试或分析提供生物样品的个体。
术语“临床疾病状态”意指处于风险的医学状况，其可表明医疗干预、治疗、治疗调整或某种治疗(例如，药物)的排除和/或监测是适当的。临床疾病状态的可能性的鉴定可以允许临床医生相应地治疗、延缓或抑制状况的发作。临床疾病状态的实例包括，但不限于，CHD、CVD、中风、2型糖尿病、前驱糖尿病、痴呆、阿尔茨海默氏症、癌症、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、肾病、肺病、COPD(慢性阻塞性肺病)、周围血管疾病、充血性心脏衰竭、器官移植物反应、和/或与免疫缺陷，蛋白分选、免疫和受体识别、炎症、致病性、转移和其他细胞过程的生物功能异常相关的医学状况。
术语“HDL-P”是指求和定义HDL子类的浓度的高密度脂蛋白颗粒(HDL-P)测量值(例如，HDL-P数)。HDL-P可以包括求和大小范围在约7 nm至约14 nm之间的所有HDL子类(大、中和小)的浓度(µmol/L)的总高密度脂蛋白颗粒(HDL-P)测量值。在一些实施方案中，HDL-P测量值可以采用所示大小范围的HDL子类的所选组合。
如本领域技术人员所知，缬氨酸为具有化学式HO 2CCH(NH2)CH(CH3)2的α-氨基酸。当通过NMR测量时，值可以是无单位的。缬氨酸测量值可以乘以定义转化系数以便将值转化为µmol/L浓度单位。当前缬氨酸实施方案具有2271的转化系数，以便以μM单位报道缬氨酸；然而，该值可以变化±10％，而不会显著过度影响报道值。
本发明的实施方案使用生物样品的GlycA的NMR定量量度与缬氨酸和/或至少一种脂蛋白子类的量度来筛选和/或鉴定受试者的健康风险的可能性，诸如，但不限于，受试者的全因死亡的风险的预测物。
GlycA可以由血浆NMR谱中集中于约2.00 ppm(在47摄氏度+/- 0.2)的单峰区域来代表。峰区域位置可以随温度变化。
据信，GlycA和/或GlycB响应于总体蛋白糖基化水平，并且可以反映总体炎症状态。可以如标准筛选试验进行GlycA的NMR量度，单独或与其他定义的分析物的量度组合，或GlycA/GlycB的比率(或反之亦然)，以鉴定处于风险的个体或受试者。
GlycA，就其本身而言，可以指示可以就临床疾病状态而言非特异性的总体炎症量度，但该值，特别是当与其他定义的患者特异性参数组合时，仍可以比常规总胆固醇(TC)/ HDL-C比率是更好的全因死亡的预测物。参见，例如，下面关于图24和25A/25B的讨论，例如。
GlycA具有与死亡的正相关。为了评价全因死亡的风险，可以使用体外生物样品评价其他参数(相同生物样品用于评价GlycA或不同的生物样品)。一个或多个其他参数可以具有与死亡的负相关。因此，本发明的实施方案采用多参数风险方程和/或包括GlycA的全因死亡(ACD)风险比，和具有与死亡的负相关的至少一个参数，诸如，例如缬氨酸和/或HDL-P。在本实施方案中，风险评价方程可以包含HDL-P/GlycA和/或缬氨酸/GlycA的比率，例如。
本发明的实施方案使用多参数方程，其包括：(i) GlycA的NMR量度； (ii) 缬氨酸的量度(其也可以通过NMR或通过其他分析试验测量)；和(iii) 也可以通过NMR或通过其他分析试验测量的至少一个其他脂蛋白(子类)参数。计算可以提供全因死亡的风险预测物。所述至少一个其他脂蛋白参数可以是HDL-P。
所述多参数方程可以通过方程1定义。
(HDL-P*缬氨酸)/GlycA 方程 1 。
HDL-P可以以µmol/L单位计。缬氨酸和/或GlycA可以以任意单位计，或者一个或每个可以乘以各自的定义转化系数，以提供以µmol/L的单位计的数量(参见，例如，图7A)。
可以考虑此类多参数值还可以用于监测临床试验和/或药物治疗中的受试者和/或监测与特定药物、患者的生活方式等(其可以是患者特异性的)相关的风险状态的变化(正或负)。
本文中某些图的流程图和方框图说明根据本发明的分析模型和评价系统和/或程序的可能实施的结构、功能和操作。在这方面，流程图或方框图中的每个方框代表模块、区段、操作或代码部分，其包含用于实施指定逻辑功能的一个或多个可执行指令。还应当指出，在一些替代实施中，方框中指出的功能可能发生在图中指出的顺序之外。例如，连续显示的两个方框实际上可以实质上同时执行，或者这些方框有时可以以相反的顺序执行，这取决于所涉及的功能。
图1说明血浆NMR谱中与GlycA相关的GA和与GlycB相关的GB的共振峰区域。这些峰区域中的一个或两个可以包括血浆NMR谱中可以被定义为炎症标志物的信号。
图2A/2B说明N-乙酰基糖基化蛋白的碳水化合物部分的化学结构，其显示产生GlycA NMR信号的CH3基团。图3A/3B说明N-乙酰神经氨酸(也称为唾液酸)修饰的糖蛋白的碳水化合物部分的化学结构，其显示产生GlycB NMR信号的CH3基团。
图4A说明2.080和1.845 ppm之间NMR谱的化学位移部分。图4A还说明来自VLDL、LDL和HDL中脂质的烯丙基质子的计算的C信号和测量的(复合)信号包络(signal envelope)Cm，下面为去卷积(deconvolved)的GlycA和GlycB和其他共振峰。GlycA可以包括来自2-NAcGlc和2-NAcGal甲基的贡献。GlycB包括来自糖蛋白的唾液酸部分上的N-乙酰基甲基的信号。
定义的数学去卷积模型可用于测量GlycA和/或GlycB。可以将“复合”或测量的信号包络Cm去卷积以定量GlycA和GlycB和其他贡献分量诸如脂蛋白子类分量的信号贡献。去卷积计算对测量的信号形状有贡献的分量的信号幅度，并计算所述分量的总和。计算的信号C和测量的信号Cm之间的紧密匹配表明去卷积成功模拟了构成NMR信号的分量。
GlycA区域GA的峰区域和GlycB区域GB的峰通过中心分别在2.04 ppm和2.00 ppm(在约47摄氏度样品温度)的峰显示，其在复合(上部)包络信号线Cm的下面。在一些实施方案中，GlycA和GlycB的峰区域可以包括去卷积模型中负责稍微不同频率的GlycA和GlycB信号的相邻较小附近信号。
蛋白信号Ps包括分别与GA和GB对齐的“驼峰”或峰PGA和PGB。GlycA可以使用如血浆GlycA信号的总峰面积给出的总血浆GlycA信号或“GA”和“PGA”(可以源自血浆的蛋白(d>1.21 g/L)分量中非炎症糖蛋白的该GlycA部分)之间的差异计算。可以实施去卷积以减去在GA区域的总NMR信号(患者/受试者)可变“临床非信息”部分，以留下GlycA的更有信息的疾病相关量度。
换言之，尽管不受任何特定理论束缚，但在一些实施方案中，在2.00 ppm测量的GlycA信号可以被称为GA，去卷积可以将其分为3部分：1) 由选择为主要缺乏炎性蛋白的蛋白(d>1.21 g/L)贡献的部分，2) 由非炎性脂蛋白(d<1.21 g/L)贡献的部分，和3) 炎性糖蛋白(包括脂蛋白和蛋白)，后者通过重叠洛伦兹(LGA)或其他曲线拟合函数来建模。来自去卷积的提供临床信息的GlycA可以定义为GA减去PGA且减去非炎性脂蛋白分量= LGA。GlycB可以使用GB减去PGB信号贡献减去非炎性脂蛋白分量以类似的方式来确定。
线形去卷积可以使用非负最小二乘法拟合程序(Lawson, CL, Hanson RJ, Solving Least Squares Problems, Englewood Cliffs, NJ, Prentice-Hall, 1974)来实现。这避免了使用可以导致特别是低信噪比波谱中的误差的负浓度。在数学上，论文Otvos, JD, Jeyarajah, EJ and Bennett, DW, Clin Chem, 37, 377, 1991中详细描述了对于脂蛋白的合适的线形分析。合成基线校正函数也可以用于计算从残留蛋白分量的基线偏移。这可以采用二次或其他多项式函数的形式。确定加权因子，并且拟合可以通过尽可能减小实验和计算波谱之间的均方根偏差进行优化。对于去卷积复合NMR谱来测量脂蛋白子类的描述，参见，例如，美国专利号美国专利号4,933,844 和 6,617,167，其内容通过引用并入本文，如同在本文中完全记载。对于去卷积具有重叠信号贡献的化学组分的方案的描述，参见，例如，美国专利号7,243,030，其内容通过引用并入本文，如同在本文中完全记载。
图4B和4C说明图4A的NMR谱的复合(测量)信号“Cm”，其中拟合区域FR对应于2.080和1.845 ppm之间的NMR谱。拟合区域FR通常包含315个数据点，但可以使用更多或更少个数据点，诸如约200-400个之间的数据点，例如。GlycA定量模型包括VLDL/乳糜(chylos)分量、LDL分量和HDL分量。表1显示可以根据本发明的实施方案在去卷积模型中定量的各种TRL。
表1：通过NMR LipoProfile®分析测量的富含甘油三酯的脂蛋白子类的特征
。
术语“TRL V6”是指TRL(富含甘油三酯的脂蛋白)颗粒或亚级分，其具有约90 nm直至多达约170 nm的直径，更通常具有约100-140 nm之间的直径。术语“TRL V6”也可以关于对应于上表1中提供的估计直径的脂质甲基NMR信号化学位移(ppm)进行定义。
术语“TRL V5”是指大TRL颗粒，其具有约60 nm和约80 nm之间的直径(对于相关NMR化学位移，参见上表1)。
术语“乳糜微粒”和“乳糜(chylos)”是指非常大的TRL颗粒，其具有大于TRL V6的直径。因此，乳糜微粒是指TRL颗粒或亚级分，其具有约170 nm直至约260 nm之间的直径(对于它们的相关NMR化学位移，参见下表1)。TRL V5和TRL V6之间或TRL V6和乳糜微粒之间没有清楚的界限，从而使得对于每个亚组存在在约80-90 nm之间(对于TRL V5-6)和在约140-170 nm之间(对于TRL V6 &乳糜微粒)之间的范围内重叠的粒径分布。
当定量TRL时，可以以颗粒浓度单位(nmol/L)或甘油三酯浓度单位(mg/dL)表示浓度。因此，对于每个“大VLDL”的不同定义，在DRI模型中可以使用颗粒浓度或甘油三酯浓度。不希望受任何特定理论束缚，基于线性回归分析，甘油三酯浓度单位可以产生略微更好的糖尿病风险预测。
图5A-5D说明随着TG(甘油三酯)值增加来自富含甘油三酯的脂蛋白的谱重叠，这对于以提供精确且可靠的GlycA和GlycB测量值的方式可靠地去卷积是有挑战性的。
该模型提供了足够的HDL、LDL和VLDL/乳糜分量，以便能够提供实验信号的良好拟合，如计算的信号C和实验或测量的复合信号Cm之间的紧密匹配所示。通常，该模型将具有比LDL或HDL分量更多紧密间隔的VLDL/乳糜分量，因为这些TRL为谱的左侧贡献更多信号。该模型可以包括20-50种VLDL/乳糜分量，通常约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或40种。在一个优选的实施方案中，该模型包括30种VLDL/乳糜分量。
该模型可包括多个“N”(通常重叠)曲线拟合分量N，其居于拟合区域FR的子区域Fs，其从几个数据点(例如，约10或更小)延伸到GlycA测量区域R1的右侧(例如，在约1.9 ppm或更高开始)，到至少几个数据点到GlycB区域R2的左侧(并且可以延伸到拟合区域FR的末端到2.080 ppm)。每种分量N，在本实施方案中，可以是具有线宽约1.4 Hz 的洛伦兹形信号。此外，在具体实施方案中，每个数据点可以分开约0.275 Hz，如通过谱的数字解析所测定。左侧区域Fs的尾部可以包括比右侧尾部更多(洛伦兹)分量。区域Fs中分量N的数量n可以是约46(例如，约46 个洛伦兹)，但可以使用更多或更少分量“N”。例如，区域Fs可以包括但不限于，30-70个之间的洛伦兹，或n=30、35、36. 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或60。曲线N通常为具有2-10个数据点(在400 MHz，0.55-2.75 Hz)、更通常4-6个数据点的半高线宽的洛伦兹函数，并且彼此偏移定义量，诸如，例如，2个数据点(0.55 Hz)。
GlycA和GlycB洛伦兹(或其他曲线拟合分量N)可以具有相同或不同的数据点数量。GlycB洛伦兹N可以具有比GlycA洛伦兹N相同、更少或更多的数据点。洛伦兹拟合分量“N”可以具有约1.4 Hz的峰线宽(LW)(在半高)。然而，可以使用其他LWs，包括但不限于，1.1、1.2、1.3、1.5等。
GlycA可以使用填充整个区域R1的曲线拟合分量数N的定义子集来计算，且GlycB可以使用填充整个区域R2的曲线拟合(例如，洛伦兹拟合)分量合适数N来计算。区域R1可为5-6 Hz之间。GlycB区域R2可为7-8 Hz。任选地，GlycA分量N可以被偏移2个数据点，而GlycB分量N可以被偏移4个数据点。
GlycA可以使用相邻洛伦兹分量N(通常为9-15之间，诸如9、10、11、12、13、14 和15个分量)的总和来计算。GlycB可以是相邻洛伦兹拟合分量N的总和，其等于、大于、或小于、通常小于用于GlycA测量值的，诸如约5-10个分量N，通常为约7、约8或约9个分量。R1和R2之间的洛伦兹不被包括在GlycA或GlycB的定量测量中。图4B说明7个相邻洛伦兹的总和可用于计算GlycB测量值，且10个(更窄)洛伦兹的总和可用于计算GlycA测量值。图4C说明9个相邻洛伦兹的总和可用于计算GlycB测量值，且12个(更紧密间隔)洛伦兹的总和可用于计算GlycA测量值。
HDL、LDL 和VLDL分量的数量可以变化。如显示，HDL分量可以是20个HDL分量(跨越HDL子类直径的范围)，但可以使用更多或更少，例如，约10-26。如显示，LDL分量的数量可以是9个分量(代表不同LDL直径)，但可以使用更多或更少，例如，约5-20。如显示，VLDL/乳糜分量的数量是30，但可以使用更多或更少，例如，25-60的不同大小范围。
为了清楚，尽管优选的实施方案将曲线拟合分量描述为洛伦兹拟合分量，但可以使用其他拟合分量，包括但不限于，实验N-乙酰基甲基信号或高斯线形函数。因此，可以使用任何合适的曲线拟合函数。
图6A是不同蛋白分量(蛋白1、蛋白2和蛋白3)的表格，在Glyc去卷积模型中使用时，其产生不同的GlycA浓度和不同GlycA与MESA中的CHD事件和全因死亡的关联。图6B、6C和6D说明去卷积波谱中各自的蛋白信号Ps和它们在GlycA和GlycB峰区域中信号幅度中表现的差异。为了优化计算的GlycA和/或GlycB测量，在一些实施方案中，去卷积模型包括如上所讨论的定义蛋白信号分量。该蛋白信号分量Ps用于除了脂蛋白以外的蛋白，例如，除了HDL、LDL、VLDL/乳糜以外的蛋白，例如，并且可以与通过超速离心获得的>1.21 g/L血浆密度级分(其包括血浆中的白蛋白和其他非脂蛋白蛋白)相关。
图6A中的表格是GlycA与CHD事件(n=289)和全因死亡(n=346)的关联，这来自针对年龄、性别、种族、吸烟、收缩压、高血压药物、体重指数、糖尿病、LDL-P和HDL-P调整的逻辑回归分析。似然比(likelihood ration)χ2统计给出GlycA当添加至回归模型中的10个共变量时改进结果预测的程度的定量量度。
该信号分量“Ps”显示于图4A-4C。令人惊讶地，尽管该蛋白信号Ps确实包括与GlycA和GlycB两者的化学位移处的峰对齐的峰(分别为PGA、PGB)，但是发现从去卷积模型消除蛋白NMR信号的该部分(通过例如数字操纵或信号处理)使得计算的GlycA和GlycB测量值具有相对较少的临床信息(更弱的疾病关联)。在另一个极端，包括在去卷积模型中，在GlycA和GlycB位置具有相对大信号的蛋白分量导致更低的GlycA和GlycB浓度，这也具有较少临床信息，如图6C和6D中的蛋白#2和蛋白#3所示。因此，通过选择在GlycA和GlycB位置具有中间信号幅度的适当蛋白分量，诸如图6B中的蛋白#1，可以将去卷积模型 “调谐”以产生就其与炎症和相关疾病状态的临床关联而言改进和/或优化的GlycA和GlycB浓度。
因此，在一些实施方案中，考虑如果GlycA测量不包括脂蛋白信号(在具有VLDL/乳糜、LDL和HDL分量的去卷积模型中解释)，并且如果其仅包括其余NMR信号的部分，例如，其不包括在GlycA峰区域处的所有其他NMR蛋白信号，则GlycA测量将提供更好的临床指标。NMR信号在GlycA峰区域的该子集可以更加反映炎症蛋白活性，例如，来自糖基化急性期蛋白的N-乙酰基甲基信号。
图7A是N-乙酰基葡糖胺的10 mmol/L参考标准样品的去卷积的屏幕截图，由其测定17.8的转换因子以便将GlycA和GlycB的信号区域浓度转化为μmol/L糖蛋白N-乙酰基甲基浓度。在一些实施方案中，根据MESA受试者，GlycA的第一至第四四分位数(平均)水平(图14)可以是：Q1: 21.6*17.8，Q2: 25.8*17.8，Q3: 29.3*17.8且Q4: 35.3*17.8。
使用图4B中显示的模型的GlycA测量精度被显示是良好的。最低GlycA的运行内(来自2009的5个合并物)分析 =40.5 (CV =2.47%)，且最高GlycA =58.4 (CV=1.6%)。来自2010和2011的13个合并物的实验室内结果具有最低GlycA =25.6 (CV=4.08%)和最高GlycA=69.1 (CV=1.87%)。这些浓度被表示为NMR信号区域的“任意单位”，并且可以乘以17.8以便将它们转化为µmol/L N-乙酰基甲基浓度。
图7B是可用于GlycA/B去卷积模型中的分量的表格。代谢物A是可在GlycA/B去卷积模型中测量并且可以在临床上使用的一种分量。如图7C和7D中说明，代谢物A可以作为单峰存在于波谱中，并且通常以低浓度存在于样品中(图7C)，但高浓度的代谢物A可以存在于样品中(图7D)。用于代谢物A峰区域的多个曲线拟合函数可用于定量评价代谢物A的水平和/或去卷积NMR谱用于定量GlycA和/或GlycB，例如。
图7B中显示的去卷积模型分量列举了多个曲线拟合函数Glyc1-Glyc46，其可以被应用于拟合区域，其包括GlycA峰区域，并延伸到GlycB峰区域(通常具有约40-50个曲线拟合函数，显示为具有46个，但可以使用或少或多此类曲线拟合函数，例如30-100)。如上所讨论，GlycA测量可以通过对曲线拟合函数的定义的第一子集的值，与Glyc1-Glyc 26分量中的所有或一些相关的值(例如)求和来实施。GlycB测量可以通过对曲线拟合函数的第二(通常较小)定义的子集的值，诸如Glyc27和Glyc 46之间的一些或所有分量(例如)求和来实施。
图8A和8B是来自两个不同研究群体的NMR测量的GlycA值的直方图。图8B提供具有类风湿性关节炎(RA)(一种已知的慢性炎性疾病)的182个妇女的GlycA的NMR测量值，而图8A给出来自不具有已知炎性疾病的健康男性和女性的MESA群体的值。
据信，任一样品中GlycA信号的所测量幅度可以具有提供比hs-CRP或其他个别炎性蛋白的测量值提供的更稳定且“时间整合”的患者的炎症状态的测量值的优点。
图9是hs-CRP和NMR测量的GlycA和缬氨酸水平与基于MESA数据(n ≈5680)的各种示例性疾病的结果的前瞻性关联的图表。该图表来自针对年龄、性别、种族、吸烟、收缩压、高血压药物、体重指数、糖尿病、LDL-P和HDL-P调整的逻辑回归分析。似然比(likelihood ratio) 统计值χ2给出所示变量当添加至回归模型中的10个共变量时改进疾病预测的程度的定量量度。该分析使用来自图4B中显示的去卷积模型的GlycA测量值。右侧栏显示GlycA和缬氨酸当它们都分别具有检查的显著关联时在它们与疾病的关联中是累加的。
在一些实施方案中，NMR测量可以包括GlycA和缬氨酸，并且每个可以在患者报道中提供用于临床考虑。图10A是显示含有来自脂蛋白和支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)的甲基信号的血浆NMR波谱的区域的图。图10B是具有缬氨酸信号的四重峰的去卷积信号的实例，其经鉴定以生成具有缬氨酸NMR信号的两个双峰的缬氨酸信号的计算的C和测量的Cm波谱(约0.90-1.07之间)，其可用于测量缬氨酸。
考虑单一(血液/血浆)体外生物样品的GlycA和缬氨酸的NMR测量可提供重要的临床信息和/或进一步改进患者或受试者的具有临床疾病状态或处于其增加风险的风险的预测或评价和/或评价全因死亡的风险。
如普遍接受，通过常规脂质实验对象组提供的HDL-胆固醇和/或LDL-胆固醇水平不能充分区分有和没有CHD/CAD的升高风险的群体。如本领域技术人员所知，弗雷明汉研究提出了相对冗长风险模型，所述模型考虑很多因素，诸如年龄、性别、吸烟习惯以及胆固醇值。弗雷明汉后代研究中进行的研究还定义了来自研究中受试者的标准和处于风险群体的值。参见Wilson等人, Impact of National Guidelines for Cholesterol Risk Factor Screening. The Framingham Offspring Study, JAMA, 1989; 262: 41-44。
考虑炎症是心脏病发作风险的单独贡献因素。尽管不希望束缚于代谢活性和风险的任何特定理论，但考虑，例如，如果患者具有动脉粥样硬化的稳定形式(斑块或相关蛋白在动脉壁内是稳定的(例如))，则心脏事件的风险可以小于相同患者还表现出炎症的情况，其可以弱化使斑块容易破裂的蛋白盖(protein cover)，因此呈现CHD和/或心肌梗塞(MI)的增加风险。
根据特定实施方案，GlycA的NMR量度，单独或与其他定义分析物(例如，GlycB、HDL-P、LDL-P、Mg或缬氨酸中的一种或多种)组合，可以提供比hs-CRP更强大且更容易测量的健康/死亡风险评价，其中后者以非常低水平存在于各自患者体外样品中。
如上所示，图7A说明了可用于计算GlycA的测量值的转换因子。GlycA测量值也可以是如通过NMR通过计算NMR谱中定义峰处的峰区域下面积评价的无单位参数。在任何事件中，关于已知群体(诸如MESA)的GlycA量度可用于定义某些亚组的水平或风险，例如，具有定义范围的上半部分内的值(包括第三和第四四分位数或上3-5五分位数等中的值)的那些。
图8A说明来自MESA的受试者的GlycA值的分布。Bell等人, Assignment of resonances for 'acute-phase' glycoproteins in high resolution proton NMR spectra of human blood plasma, FEBS Letters, Vol. 215, No. 2, pp. 311-315 (1987)提出急性期反应性血浆糖蛋白的测量值在检测、预后和治疗监测具有组织损伤的患者中可具有相当大的价值，并且将“正常”水平与具有黑色素瘤、类风湿性关节炎和单克隆丙种球蛋白病的患者进行比较。该参考文献的内容通过引用并入此处，如同在本文中完整记载。尽管前述内容，并且从该研究的出版以来已有许多年，但本专利申请的发明人已经出乎意料地发现，尽管急性期反应性血浆糖蛋白提供的总体炎症信息具有非特异性性质，但GlycA的增加水平可以是CHD风险的强大生物标志物，比hs-CRP更强。
图11是NMR测量的GlycA的四个四分位数中的每个内的MESA受试者的各种特征的平均值的表格。第三四分位数中的那些的平均GlycA水平为29.3。该表格显示具有较高GlycA水平的人具有与较高炎症(更多吸烟、高血压、hs-CRP等)相关的特征。NMR信号区域单位可以被称为“任意”单位。该表格中的GlycA水平呈这些“任意单位”，其可以通过乘以17.8而转化为甲基浓度单位(umol/L)。
图12是用于从Cox逻辑回归模型预测具有n=289 CHD事件的MESA N=5607中的CHD事件的不同模型的图表，所述逻辑回归模型针对年龄、性别、种族、吸烟、收缩压(SBP)、高血压药物治疗(HTNrx)、BMI(身体质量指数)、糖尿病LDL-P和HDL-P状态进行调整。模型χ2统计值提供了模型中的添加变量改进CHD风险预测的程度的定量量度。参数/标志物χ2统计值和相应的“p”值定量炎症标志物为模型给出的改进预测的幅度和统计学显著性。值得注意的是，如图12中所示，GlycA具有10.4 χ2值，大于纤维蛋白原和hs-CRP(事实上，hs-CRP在三个参数中最低，其中标志物χ2为1.8)。
图13是与MESA N=5607, 345例死亡中的全因死亡相关的表格。针对年龄、性别、种族、吸烟、SPB、高血压药物、BMI和糖尿病调整Cox模型。基本模型中的HDL-P、GlycA和具有HDL-P和GlycA参数两者的模型显示改进的风险预测。
图14是基于MESA数据的NMR GlycA(信号区域单位)相比于hs-CRP (mg/dL)的图。对于2 个hs-CRP范围(0-5和>5 mg/dL)显示线性回归。对于较低CRP值的回归较陡峭斜率显示GlycA是反映慢性炎症状况，但较少反映涉及具有CRP水平>5 mg/dL的那些的急性炎症中的差异。
图15A是来自线性回归模型的LDL-P、GlycA和HDL-P的五分位数的平均颈动脉IMT(微米)的图，所述线性回归模型由未公开的MESA数据针对年龄、性别、种族、SBP、高血压药物、糖尿病、BMI和吸烟进行调整。LDL-P和GlycA两者的升高水平与更大的颈动脉IMT值相关，反映更大的动脉粥样硬化风险。
图15B是对于颈动脉IMT(微米)的基于LDL-P/HDL-P的比率乘以GlycA的颈动脉IMT(与CHD/CVD有关)相比于基于MESA的未公开数据的五分位数值的单一风险预测物和对于图15A讨论的线性回归模型的图。
本发明的实施方案考虑可以分析患者生物样品的相对于患者自身的“基线”和/或相对于群体标准或与增加的医疗“风险”相关的“标准”或其他定义的升高水平的GlycA的增加水平。GlycA也可以或替代用作临床疾病状态的多参数风险预测模型中的一个参数。用于CHD的多参数模型可以包括脂蛋白参数。
图16说明脂蛋白子类分组的实例，包括具有可以求和以便根据本发明的一些具体实施方案测定HDL-P和LDL-P用于CHD控制/风险评价的浓度的那些。本发明的实施方案将脂蛋白颗粒分为通过基于功能/代谢相关性的大小范围分组的子类，如它们与脂质和代谢变量的相关性所评价。所述评价可以测量超过20个离散亚群(大小)的脂蛋白颗粒，通常约30-80之间的不同大小亚群(或甚至更多)。图16还显示这些离散亚群可分为定义子类，包括对于VLDL和HDL各自三个，对于LDL两个或三个(如果是前者，则三个中的一个被鉴定为大LDL和小VLDL之间的大小范围中的IDL)。对于GlycA和/或GlycB测量计算，HDL和LDL分组的离散数量可以小于用于定量测量脂蛋白子类的数量。
HDL子类颗粒范围(平均)通常为约7 nm至约15 nm 之间，更通常约7.3 nm至约14 nm或7.3-13.5 nm。HDL-P浓度是其HDL子类的各自亚群的颗粒浓度的总和，例如，小HDL-P可包括H1-H8亚群。大HDL子类可具有9.4-14 nm之间，通常9.7-13.5 nm之间的大小范围。不同大小的HDL子类可以由它们的波谱独特的脂质甲基NMR信号的幅度进行定量。参见，Jeyarajah等人, Lipoprotein particle analysis by nuclear magnetic resonance spectroscopy, Clin Lab Med. 2006; 26: pp. 847-870，其内容通过引用并入此处，如同在本文中完整记载。本文所示的NMR衍生的HDL-P和LDL-P粒径通常是指平均测量值，但也可使用其他大小界限。
如图16所示，小LDL颗粒可包括大小范围为约18.0至约20.5 nm之间，通常19-20 nm之间的颗粒。大LDL颗粒可以包括直径范围为约20.5-23.0 nm之间的颗粒。注意颗粒的LDL子类可以分为其他大小范围。例如，小的可以为约19.0-20.5 nm之间，中间的可以为约20.5-21.2 nm之间，并且大的可以为约21.2-23 nm之间。此外，中间密度脂蛋白颗粒(“IDL”或“IDL-P”)，其直径范围为约23.0-29.0 nm，可以包括在定义为LDL的颗粒间。因此，大LDL颗粒可以包括19.0-28 nm之间的大小(例如)。VLDL可具有29-100 nm或29-160 nm之间的大小，其中大的VLDL分别为60 nm和100或160 nm之间，且乳糜分别为100-260 nm或160 nm至260 nm之间。
现在参考图17，考虑GlycA和/或Glyc B测量分析可以使用系统10与NMR临床分析仪22实施，如例如下图18和/或在美国专利号8,013,602中所述，其内容通过引用并入此处，如同在本文中完整记载。分析仪22包括波谱仪22s和样品处理系统。
系统10可以包括GlycA分析模块和/或电路20，其可以板载(onboard)到分析仪22或者至少部分地远离分析仪22。如果是后者，分析模块或电路20可完全或部分地存在于服务器150上。服务器150可使用云计算(cloud computing)提供，所述云计算包括在要求时经由计算机网络提供计算资源。所述资源可体现为各种基础设施服务(例如计算机、存储等)以及应用、数据库、文件服务、电子邮件等。在传统的计算模型中，数据和软件两者通常完全包含在用户计算机上；在云计算中，用户计算机可含有很少的软件或数据(也许是操作系统和/或网页(Web)浏览器)，并可仅仅用作外部计算机网络上发生的过程的显示终端。云计算服务(或多个云资源的聚集)通常可称为“云”。云存储可包括网络计算机数据存储模型，其中数据存储于多个虚拟服务器，而不是托管于一个或多个专用服务器上。数据传输可被加密并可使用任何合适的防火墙经由互联网进行，以符合行业或监管标准诸如HIPAA。术语“HIPAA”是指由健康保险携带和责任法案(Health Insurance Portability and Accountability Act)所定义的美国法律。患者数据可包括登记号或标识符、性别、年龄和测试数据。
可以将分析结果经由计算机网络诸如因特网、经由电子邮件等传输至患者，临床医生位点50，至医疗保险机构52或药房51。可以将结果从分析位点直接发送，或者可以间接发送。可以将结果打印出来，并经由常规邮件发送。也可以将该信息传输至监测处方或药物使用(其可以导致不良事件的增加风险)的药房和/或医疗保险公司或者甚至患者，或放置医疗提示以防止矛盾药剂的处方。可以将所述结果经由电子邮件发送至“主”计算机或普及计算设备，诸如智能电话或记事本等。所述结果可以是作为整个报道的电子邮件附件或作为文本信息提示(例如)。
现在参考图18，说明用于获取并计算所选样品的线形的系统207。系统207包括用于采集样品的NMR测量值的NMR波谱仪22s。在一个实施方案中，配置波谱仪22s，使得对于质子信号在400 MHz进行NMR测量；在其他实施方案中，可以在200 MHz至约900 MHz之间或其他合适的频率实施测量。也可采用对应于所期望的操作磁场强度的其他频率。通常，安装质子流探针，这是将样品温度维持在47 +/- 0.5℃的温度控制器。波谱仪22由数字计算机214或其他信号处理单元控制。计算机211应当能够进行快速傅立叶转换。它也可以包括至另一个处理器或计算机213的数据链路212，和可以连接至硬存储器存储单元215的直接存储器存取通道214。
数字计算机211还可以包括一组模拟-数字转换器，数字-模拟转换器和通过脉冲控制连接的慢速设备I/O端口，和至波谱仪22s的操作元件的接口电路216。这些元件包括产生可以板载或与数字计算机211通信的至少一个数字信号处理器引导的持续时间、频率和幅度的RF激发脉冲的RF发射器217，和扩增所述脉冲并将其耦合至环绕样品室220和/或流探针220p的RF传输线圈219的RF功率放大器218。在由超导磁体221产生的9.4特斯拉偏振磁场存在的情况下由激发样品产生的NMR信号被线圈222接受并应用至RF接收器223。扩增和滤波的NMR信号在224进行解调，将所得正交信号应用至接口电路216，其中它们通过数字计算机211数字化并输出。脂蛋白测量和/或GlycA分析仪电路20和/或模块350(图18-19)可以位于与数字计算机211相关的一个或多个处理器中和/或辅助计算机213或可在现场或远程、可经由全球网络诸如因特网227访问的其他计算机中。
从测量单元220中的样品获取NMR数据之后，由计算机211的处理产生另一个文件，所述文件可以根据需要存储在存储215中。第二个文件是化学位移波谱的数字表示，随后将其读出至计算机213，用于在其存储225或与一个或多个服务器相关的数据库中存储。在存储在其存储器中或可由计算机213访问的程序的引导下，计算机213（其可以是膝上型计算机、台式计算机、工作站计算机、电子记事本、电子平板、智能电话或具有至少一个处理器的其他设备或其他计算机）处理根据本发明的教导的化学位移波谱以生成报道，所述报道可以被输出至打印机226或电子形式存储并中继至期望的电子邮件地址或URL。本领域技术人员将认识到，其他输出设备，诸如计算机显示屏幕、电子记事本、智能电话等，也可以用于显示结果。
应当对于本领域技术人员显而易见的是，也可以将由计算机213和其单独存储225执行的功能并入由波谱仪的数字计算机211执行的功能。在此类情况下，可以将打印机226直接连接至数字计算机211。也可以采用其他接口和输出设备，这对于本领域技术人员是众所周知的。
本发明的某些实施方案涉及提供方法、系统和/或计算机程序产品，其使用特别可用于临床疾病状态的自动化筛选试验和/或用于筛选体外生物样品的风险评估评价的GlycA评价。
本发明的实施方案可以采取完全软件实施方案或组合软件和硬件方面的实施方案的形式，所有在本文中通常被称为“电路”或“模块”。
如同本领域技术人员将理解的那样，本发明可体现为装置、方法、数据或信号处理系统或计算机程序产品。因此，本发明可采取完全软件实施方案或者结合软件与硬件方面的实施方案的形式。此外，本发明的某些实施方案可采取计算机可用存储介质上的计算机程序产品的形式，所述计算机可用存储介质具有体现在介质中的计算机可用程序代码装置。可采用任何合适的计算机可读介质，包括硬盘、CD-ROM、光学存储设备或磁存储设备。
计算机可用或计算机可读介质可以是，但不限于，电子、磁性、光学、电磁、红外或半导体系统、设备、装置或传播介质。计算机可读介质的更具体实例(非详尽列表)将包括以下：具有一个或多个电线的电连接、便携式计算机软盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦可编程只读存储器(EPROM或闪速存储器)、光导纤维和便携式光盘只读存储器(CD-ROM)。注意，计算机可用或计算机可读介质甚至可为在其上面打印程序的纸或另一种合适的介质，因为程序可经例如纸或其它介质的光学扫描而被电子捕获，然后编译、解释或以合适的方式进行其它处理(如果必要)，并然后储存于计算机存储器中。
用于实施本发明操作的计算机程序代码可以面向对象的编程语言诸如Java7、Smalltalk、Python、Labview、C++或VisualBasic书写。然而，用于实施本发明操作的计算机程序代码也可以传统的程序编程语言诸如“C”编程语言或者甚至汇编语言书写。程序代码可完全在用户的计算机上、部分地在用户的计算机上，作为独立的软件包，部分地在用户的计算机上和部分地在远程计算机上或完全在远程计算机上执行。在后一种情况下，远程计算机可通过局域网(LAN)或广域网(WAN)连接到用户的计算机，或者可连接到外部计算机(例如通过互联网使用互联网服务提供商(Internet Service Provider))。
本文的某些图的流程图和方框图说明根据本发明的分析模型和评价系统和/或程序的可能实现的结构、功能和操作。在这方面，流程图或方框图中的每一个方框代表代码的模块、分段、操作或部分，其包含用于实现指定的逻辑功能的一个或多个可执行指令。还应注意到，在一些替代的执行中，方框中指出的功能可不按图中所示顺序发生。例如，依次显示的两个方框事实上可实质上同时执行，或者方框有时可根据所涉及的功能，以颠倒的顺序执行。
图19是数据处理系统305的示例性实施方案的框图，其说明根据本发明实施方案的系统、方法和计算机程序产品。处理器310与存储器314经由地址/数据总线348通信。处理器310可为任何市售可得的或定制的微处理器。存储器314代表含有用于实现数据处理系统305的功能的软件和数据的存储装置的总体层次结构。存储器314可包括但不限于以下类型的装置：高速缓冲存储器、ROM、PROM、EPROM、EEPROM、闪速存储器、SRAM和DRAM。
如图19中显示，存储器314可包括用于数据处理系统305的几类软件和数据：操作系统352、应用程序354、输入/输出(I/O)设备驱动程序358；GlycA评价模块350；和数据356。GlycA评价模块350可以将NMR信号去卷积以揭示各自生物样品的质子NMR谱中定义的NMR信号峰区域以鉴定GlycA水平。系统305还可以包括临床疾病状态评价模块370或风险预测模块375中的一个或多个，其考虑测量的GlycA的水平或生成复合风险数量或多参数风险模型。系统305还可以或者替代包括全因死亡(ACD)风险评价模块378。ACD模块可以通过编程使用分母中的GlycA计算至少一个比率。
数据356可以包括信号(成分和/或复合谱线形)数据362，其可以从数据或信号采集系统320(例如，NMR波谱仪22s和/或分析仪22)获得。如本领域技术人员将理解，操作系统352可以是适于与数据处理系统一起使用的任何操作系统，诸如来自International Business Machines Corporation, Armonk, NY的OS/2、AIX或OS/390，来自Microsoft Corporation, Redmond, WA的WindowsCE、WindowsNT、Windows95、Windows98、Windows2000或WindowsXP，来自Palm, Inc.的PalmOS，来自Apple Computer的MacOS，UNIX、FreeBSD或Linux，专有操作系统或专用操作系统，例如，用于嵌入式数据处理系统。
I/O设备驱动程序358通常包括经操作系统352，通过应用程序354访问，以与装置诸如I/O数据端口、数据存储356和某些存储器314组件和/或图像获取系统320通信的软件程序。应用程序354说明实现数据处理系统305的各种特征，并可包括至少一个应用的程序，其支持根据本发明实施方案的操作。最后，数据356代表由应用程序354、操作系统352、I/O设备驱动程序358及可存在于存储器314中的其他软件程序使用的静态和动态数据。
尽管本发明例如参照为图19中的应用程序的模块350进行了说明，但如同本领域技术人员将理解的那样，也可采用其它配置，同时仍然受益于本发明的教导。例如，GlycA模块350，和，当使用时，临床疾病状态评价模块370、风险预测模块375或ACD风险评价模块378中的一个或多个也可并入操作系统352、I/O设备驱动程序358或数据处理系统305的其他此类逻辑划分。因此，本发明不应理解为限于图19的配置，其意欲包括能够实施本文描述的操作的任何配置。
在某些实施方案中，模块350包括用于提供GlycA水平的计算机程序代码，其可用作炎症标志物，以评价临床疾病状态或风险和/或表明是否需要治疗干预和/或追踪治疗的功效或甚至治疗的意外后果。
图20是可以实施本发明的实施方案的示例性操作的流程图。可以获得生物样品(例如，血浆或血清)的拟合区域的NMR谱的(测量的)复合包络NMR谱(方框400)。使用具有HDL、LDL和VLDL/乳糜分量的定义模型和与集中于与GlycA相关的定义化学位移位置(例如，2.00 ppm)的至少一个GlycA峰区域相关的多个曲线拟合(例如，洛伦兹)函数电子去卷积NMR复合信号包络(方框402)。可以将对于与GlycA相关的峰区域的定义数量的 (例如，洛伦兹和/或高斯)曲线拟合函数求和(方框415)。可以将转换因子应用至求和函数以生成GlycA的计算的测量值(方框420)。
可以在患者和/或临床试验报道中提供GlycA和/或GlycB测量值(方框422)。至少部分基于GlycA测量值，所述报道可以就他或她是否是处于具有或发生临床疾病状态的风险和/或其他筛选是否可能是适当的进行鉴定或提示(方框424)。
定义的模型可以包括密度大于约1.21g/L、通常高于1.21 g/L的蛋白信号分量，其可以从信号复合包络去卷积/分离(方框403)。
对于GlycB，拟合区域的子集可以包括或延伸通过集中于2.04 ppm的峰区域(方框412)。可以将定义数量的对于与GlycB相关的峰区域的(例如，洛伦兹和/或高斯)曲线拟合函数求和，并且可以应用转换因子以生成GlycB的计算的测量值(方框414)。
图21A是可以实施本发明的实施方案的示例性操作的流程图。体外生物样品中的GlycA可以使用质子NMR谱中的定义峰区域进行测量(方框500)。患者的CHD风险可以至少部分地基于GlycA测量值进行确定(方框510)。
风险可以基于测量值相对于群体标准或标准的先验相关性。GlycA值和风险相关性可以具有实质上连续的关系。增加风险可以与高于定义群体标准的NMR测量的GlycA值相关。考虑风险值或值的范围可以与由风险比所定义的四分位数3和4中、三分位数3或以上中或四分位数4或以上中的值相关。
所述方法还可以包括使用NMR子类测量值计算HDL-P(方框505)和LDL-P(方框508)。这些参数也可以被评价用于确定患者的CHD风险。
所述方法可以包括电子提供具有GlycA测量值和相关CHD风险概述的患者风险报道(方框512)。风险概述可以提供与定义群体标准的相对比较。
图21B是可以用于实施本发明的其他实施方案的示例性操作的流程图。如显示，体外血液样品中的GlycA使用定义去卷积方案和质子NMR谱中的定义峰进行电子测量(方框515)。所述方法然后基于测量的GlycA和(i)缬氨酸的测量值或(ii)HDL-P的测量值中的至少一个确定患者是否处于全因死亡(ACD)的增加风险中(方框520)。用于ACD评价的测量值可以使用相同样品的NMR信号而获得。
所述测定可以基于使用缬氨酸/GlycA和/或HDL-P/GlycA的比率计算ACD风险(方框516)。
所述测定可以基于使用(缬氨酸*HDL-P)/GlycA的比率计算ADC风险(方框518)。所述方法可包括将所述样品置于NMR波谱仪中且在测量步骤之前收集NMR谱(方框517)。
所述方法可以包括提供具有ACD测量值和相关风险概述的风险报道(方框522)。风险可以基于测量值相对于群体标准或标准(例如，MESA数据或另一个定义研究群体)的先验相关性。ACD的增加风险可以与低于定义群体标准的比率相关。考虑风险值或值的范围可以与由风险比所定义的比率的Q1中的值(与GlycA的Q4或Q5值和缬氨酸或HDL-P的Q1值和/或(缬氨酸*HDL-P)的Q1相关的最高风险)相关。
图22A是示例性患者测试报道100的示意图，其可以包括各种脂蛋白参数，诸如缬氨酸、HDL-P、LDL-P、VLDL 和GlycA 101中的一个或多个。GlycA数量101可以和与群体标准、典型范围和/或风险程度(例如，高、增加或低风险)相关的风险评价摘要101s一起提供，如图22B中的滑动刻度图所示。图22C是报道100与以下报道的实例，所述报道包括NMR测量的GlycA值101与风险概述101s，和GlycA/GlycB比率值102中的一个或两个，和缬氨酸的NMR量度103。可以提供这些和其他分析物或参数的比率或其他组合。
图22D是报道100的实例，其具有NMR测量的GlycA101，风险概述101s，和(i)至少一个其他定义的NMR测量的分析物101a与视觉通知处于风险的指示101v(需要的随访筛选的视觉标记或临床疾病状态的可能性)或(ii)矛盾治疗的通知，以便提示患者/临床医生以避免某些药物治疗。
图22E是报道100的实例，其具有计算的ACD风险101e，其表明处于相对于群体标准升高的ACD风险的人。
然而，可以使用其他风险概述配置，包括范围，高到低或低到高，或仅仅注意到相关风险是否低、中或增加的和/或高。
图23A说明可以提供随着时间的GlycA值的图130以说明由于年龄、医学干预或根据一些实施方案的治疗导致的随着时间的患者健康和/或炎症状态的变化。追踪该参数可以为患者提供治疗的功效的临床指标和/或CHD其他临床疾病状态或全因死亡风险的更好的风险预测。
如图23A所示，该分析可用于随着时间监测患者以便关联药物或其他治疗的已知起始或使用。可以在使用GlycA评价鉴定的患者中鉴定、筛选或测试未来药物或已知药物的使用。
图23B说明可以与单独的GlycA类似地随着时间监测使用分母中的GlycA计算的ACD风险比101r的图。考虑也可以监测两个值随着时间的变化，其反映健康状态的治疗或变化和/或评价患者的风险状态和/或状态的变化，治疗的临床功效，或甚至用于临床试验或否定计划的治疗。
图24是显示MESA (n=5712)中的全因死亡的预测的表格。对于各种参数和参数组合的全因死亡(n=346)的预测来自针对年龄、性别、种族、吸烟、收缩压、高血压药物、体重指数、糖尿病和LDL-P调整的逻辑回归分析。模型似然比(likelihood ratio)χ2统计值，当添加至回归模型中的9个共变量时，提供了该模型给出的风险预测的定量量度，允许比较每个参数在多大程度上改进事件死亡的预测。如显示，HDL-P、GlycA和缬氨酸都是ACD的所有强预测物，并且各自独立于其他。因此，单独的每个好于常规TC/HDL-C比率，并且组合的这些因素可以提供甚至更有效的方式，以便在它们的ACD风险方面将人分层(stratify)。
图25A说明死亡风险如何作为(HDL-P*缬氨酸)/GlycA的五分位数中计算的风险预测物的函数而不同。图25A是来自针对年龄、性别和吸烟调整的Cox比例风险回归分析的全因死亡(n=346)的风险比的图。第一五分位数(Q1)的值的风险是第二五分位数(Q2)中的几乎两倍(约1.8 X)。
图25B是作为GlycA四分位数(x-轴)和HDL-P*缬氨酸四分位数(y-轴)函数的调整死亡率(％)的三维图(16个亚组)。对于具有低GlycA (Q1)和高HDL-P*缬氨酸(Q4)的那些看到最低死亡率(4.4％)，然而对于具有高GlycA (Q4)和低HDL-P*缬氨酸(Q1)的那些看到最高死亡率(14.1%)。死亡率(％)基于针对年龄、性别和吸烟调整的7年随访期间。
图26A-26C是操作的示例性流程图，其可用于根据本发明的实施方案获得与缬氨酸相关的NMR信号。
图26A说明预分析评价(方框610)可以在测定NMR信号的缬氨酸区域(方框625)之前进行，然后去卷积(方框650)。图26B说明了示例性预分析评价610，其包括将进入流动室的样品递送验证为完全失败(方框612)或部分注射失败(方框613)、垫补验证(shimming verification)(方框615)、温度验证(方框617 )和柠檬酸盐管检测(失败)(方框619)，所有都使用与添加至样品的定义稀释剂相关的信号的定义特征。
再次参考图26A，一旦定义参数被证实在限值内，预分析质量控制分析可以结束(方框620)，并且可以鉴定缬氨酸区域的确定(方框625)并且去卷积波谱且计算缬氨酸水平(方框650)。任选地，可电子执行分析后质量控制(方框655)，并输出结果(方框660)。结果可以包括在测试报道中，所述测试报道具有评论，高或低等的视觉标记(方框665)。
参考图26C，显示可以用来定量缬氨酸的操作的方法/分析700。可以电子获得具有定义添加稀释剂的体外生物样品的NMR信号(方框702)。可以实施QC评价(方框710)。测定缬氨酸区域(方框725)。去卷积缬氨酸区域(方框750d)，且计算缬氨酸的NMR衍生值(750c)。
稀释剂可包括乙二胺四乙酸钙(Ca EDta) (方框703)或以可预测方式生成可靠峰和表现的其他合适的稀释剂。公认的化学位移或定量参考包括，例如，甲酸盐，三甲基甲硅烷丙酸盐(和同位素标记的异构体)，和EDTA。
预分析质量控制评价710可以基于CaEDTA参考峰的特征的检查，并且系统或处理器可以经配置以不进行缬氨酸测试，除非NMR谱已经在指定条件下获取，诸如图26B中显示的那些。对于NMR扫描/信号获取，流动室中的样品温度可以是47±0.5℃。所述样品可包含1:1比率(方框705)或其他定义比率(例如，更多样品，更少稀释剂或更多稀释剂；更少样品，例如，2:1或更多样品，更少稀释剂，例如1:2)的稀释剂。
对于任何获取的谱，如果CaEDTA高度> 140，则可以用定义错误代码拒绝测试样品(方框719)。该高值表明检测到柠檬酸盐峰以及CaEDTA峰。柠檬酸盐峰通过在不正确的柠檬酸盐管中收集样本而引入。通过破坏定位CaEDTA峰的精确位置的能力，柠檬酸盐峰可以破坏用于确定缬氨酸区域的过程。
缬氨酸区域位于相对于CaEDTA峰的位置的高磁场(upfield)。缬氨酸下方的宽峰是脂蛋白的各种甲基(-CH3-)质子。CaEDTA位置可以被确定为约22258 ± 398个数据点(方框721)。对于每个获取的波谱，可以独立地确定缬氨酸区域。缬氨酸信号可以使用合适的数据点来建模，使用，例如，对于四重峰的每个峰的25个数据点(中心±12个数据点)或对于两个双峰的缬氨酸区域的300个数据点，但可以使用其他数量的数据点。缬氨酸的测量可以使用缬氨酸峰四重峰中的一个、两个、三个或所有四个峰来实施。
在非负最小二乘算法利用之前，可以线性内插所有基础集合谱(basis set spectra)。在非负最小二乘算法利用之前，待分析的谱和基础集合谱可以具有零基线偏移修饰。
缬氨酸区域的开始可以(“缬氨酸区域偏移”)在CaEDTA峰的位置高磁场约2196-4355个数据点，通常当包括两个双峰时为后者(方框722)。在一些实施方案中，缬氨酸区域的开始是在CaEDTA峰的位置高磁场4355个数据点。
在一些实施方案中，缬氨酸定量通过将0.0-1.01 ppm之间的缬氨酸共振表征为两个双峰来实施。步阶两个数据点的三个或更多个缬氨酸实验谱可以被用作基础集合来建模缬氨酸信号。中心缬氨酸峰可以通过滑动三个缬氨酸分量+/-15个数据点来定位，并且通过最小二乘总和最小化(a least squares sum minimization)来确定。缬氨酸信号可以用总共约300个数据点来建模。
每个基础集合，包括用于基线但排除DC偏移的那些，是以下偏移，所述偏移使得从函数减去最低值(使最低点等于0)。这防止在它们代表的形状中包括DC偏移。
用一系列分析物和基线函数(其已经经处理为与获取谱相同的预处理类型)去卷积来自每个获取谱的缬氨酸区域。每个分量的去卷积系数都可以乘以相关转换因子。当前缬氨酸实施方案具有2271的转化系数，以便以μM单位报道缬氨酸；然而，该值可以变化±10％，而不会显著过度影响报道值。
对所得值进行求和。可以对每个获取的谱独立产生的结果值取平均值，以生成最终值以用于测量中。
数据可以使用来自1:1稀释样品的预饱和水抑制来获取，并且可以包括5-20次扫描，典型地约10次扫描，其被存储为2的5个方框(由各2次扫描组成的5个FID)(方框726)。
连同预饱和水抑制使用的脉冲序列可任选地包括预饱和(水抑制)脉冲和合适的激发脉冲。FID可以用9024个数据点来获取，扫描宽度为4496.4 Hz。
每个FID可以乘以移位高斯函数：
，或以计算机术语，exp(–((t–gfs)/gf)^2)，其中gfs = 0.2 秒且gf = 0.2秒。
这可以在用零填充(zero-filling)傅立叶变换之前进行，其对于由16,384个数据点组成的每个FID产生频域(frequency-domain)GM谱(方框627)。所述谱可以使用校准指定的相位值分阶段。所述谱可以(乘以)通过校准指定的比例因子缩放。在非负最小二乘算法利用之前，可以线性内插所有基础集合谱(basis set spectra)。在非负最小二乘算法利用之前，待分析的谱和基础集合谱可以具有零基线偏移修饰(例如，将分析的用于模型和谱的所有分量都可以线性内插)(方框728)。为了确定缬氨酸拟合区域的中心，可以表征作为两个双峰的0.9和1.0之间的缬氨酸共振，并且可以通过滑动三个缬氨酸分量±15个数据点来鉴定中心峰(方框729)。
使用单独或与其他参数和 / 或分析物组合的 GlycA 和 / 或 GlycB 的实施例
全因死亡(ACD)风险预测
ACD风险比
CHD风险评价
糖尿病评价
使用GlycA和HDL-P和/或LDL-P的CHD风险评价
大量筛选处于风险中的医学状况。NMR GlycA测量值可以是标准化测试参数，其可以生成自分析其他测试参数的血浆样品，包括例如镁、缬氨酸、脂蛋白颗粒诸如HDL-P或LDL-P等。
患者具有或处于具有临床疾病状态的风险的可能性的鉴定。
评价药物治疗的有意或无意的反应和/或矛盾。
评价临床试验中患者的反应。
评价药物开发/筛选中的动物反应。
使用GlycA/GlycB比率鉴定风险或临床疾病状态。
使用GlycA与一种或多种第二分析物(包括HDL-P、LDL-P、Mg或缬氨酸)来鉴定风险或临床疾病状态。
针对CHD风险生成使用HDL-P/LDL-P*GlycA的风险预测指标。
监测随着时间的患者的炎症状态来指示医疗干预何时是适当的(额外筛选或治疗)。
使用GlycA评价人发生痴呆的风险或是否具有痴呆。痴呆评价可以使用GlycA和缬氨酸测量值两者作为单独分量和/或作为比率。
基于GLycA和Mg的测量水平评价患者的中风风险。
使用GlycB评价结肠直肠癌的风险。
前述说明本发明，并且不视为对其的限制。尽管已经描述了本发明的几个示例性实施方案，但本领域技术人员将容易理解，在示例性实施方案中许多改变是可能的，而不显著背离本发明的新颖教导和优点。因此，所有此类修改均意欲包括在如在权利要求书中限定的本发明范围内。在权利要求书中，当使用时，方法加上功能条款意欲覆盖在实施所列举的功能时本文描述的结构，并且不仅包括结构等同方案，而且包括等同结构。因此，应理解，前述内容说明本发明，并且不应视为限于所公开的具体实施方案，并且对所公开的实施方案及其它实施方案的修饰改变意欲包括在所附权利要求书的范围内。本发明通过以下权利要求定义，权利要求书的等同方案包括在其中。

Claims (54)

1.测量GlycA的方法，其包括：
电子获得受试者的生物样品的拟合区域的复合NMR谱；
使用具有高密度脂蛋白(HDL)分量、低密度脂蛋白(LDL)分量、VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、和与至少一个GlycA峰区域相关的多个曲线拟合函数的定义去卷积模型电子去卷积所述复合NMR谱；和
使用曲线拟合函数电子生成GlycA的量度。
2.权利要求1的方法，进一步包括将转换因子应用于所述GlycA的量度，以提供以µmol/L计的量度。
3.权利要求1的方法，其中所述曲线拟合函数是重叠洛伦兹函数，并且其中所述GlycA的量度通过求和定义数量的洛伦兹函数而生成。
4.权利要求1的方法，其中所述去卷积模型进一步包含具有大于1.21 g/L的密度的蛋白的蛋白信号分量。
5.权利要求2的方法，其中所述去卷积模型进一步包含具有大于1.21 g/L的密度的蛋白的蛋白信号分量，并且其中所述方法进一步包括使用以下数学方程生成风险预测物：
HDL-P/LDL-P*GlycA，
其中HDL-P是HDL颗粒数量的NMR量度，且LDL-P是LDL颗粒数量的NMR量度，且方程中的GlycA是GlycA测量值，都以µmol/L计。
6.权利要求1的方法，进一步包括：去卷积与缬氨酸信号的四重峰相关的样品的NMR谱的另一部分和生成缬氨酸的NMR量度。
7.权利要求5的方法，进一步包括提供测试报道中的缬氨酸和GlycA测量值。
8.权利要求1的方法，其中所述多个曲线拟合函数是重叠洛伦兹函数，并且其中所述去卷积模型将所述洛伦兹函数应用于拟合区域的子集，所述拟合区域的子集从化学位移谱的GlycA峰区域的右侧延伸到GlycB峰区域的左侧。
9.权利要求1的方法，其中所述生物样品包含血浆或血清，其中所述电子获得包括当生物样品在NMR波谱仪的NMR流探针中处于47摄氏度+/-0.2度时获得所述生物样品的NMR信号，并且其中所述拟合区域从1.845 ppm延伸至2.080 ppm，并且其中所述GlycA峰区域集中于2.00 ppm，并且其中所述方法进一步包括求和定义数量的曲线拟合函数的不同集合，以生成GlycB的量度。
10.权利要求1的方法，其中将所述多个曲线拟合函数应用于拟合区域，所述拟合区域包括GlycA峰区域，并且延伸到具有约40-50个之间的曲线拟合函数的GlycB峰区域，并且其中生成GlycA的量度通过求和定义的曲线拟合函数的第一子集的值来实施，所述方法进一步包括使用多个曲线拟合函数的第二较小子集生成GlycB的量度。
11.权利要求1的方法，其中所述定义的去卷积模型包括代谢物A分量。
12.确定患者的冠心病(CHD)风险的方法，其包括：
电子评价与生物样品的GlycA相关的质子NMR谱的定义峰区域中的NMR信号，以确定GlycA的水平；和
基于GlycA的水平，至少部分基于GlycA的水平，确定患者的CHD风险。
13.权利要求12的方法，进一步包括电子提供基于参考范围具有相关CHD风险的GlycA值的电子参考范围，其中较高的值与增加的风险相关，并且其中确定CHD的风险使用参考范围实施。
14.权利要求12的方法，其中增加的风险与高于定义群体标准的水平相关。
15.权利要求12的方法，其中所述测量和确定步骤使用至少一个处理器实施。
16.权利要求12的方法，其中所述测量步骤包括电子获得体外血浆或血清患者生物样品的NMR谱和使用具有至少(i)高密度脂蛋白(HDL)分量、(ii)低密度脂蛋白(LDL)分量、(iii)VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量和(iv)定义的蛋白信号分量的定义去卷积模型将复合NMR信号去卷积为离散GlycA NMR信号。
17.权利要求16的方法，其中定义的蛋白信号分量与高于1.21 g/L的蛋白密度相关。
18.权利要求12的方法，其中所述测量步骤包括电子获得体外血浆或血清患者生物样品的NMR谱和使用具有高密度脂蛋白(HDL)分量、低密度脂蛋白(LDL)分量、VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、与高于1.21 g/L的蛋白密度相关的蛋白信号分量和应用于至少一个GlycA峰区域的曲线拟合函数的定义去卷积模型将复合NMR信号去卷积为具有在47摄氏度+/-0.2集中于2.00 ppm的峰的离散GlycA NMR信号。
19.权利要求18的方法，其中所述曲线拟合函数包含重叠洛伦兹函数。
20.权利要求12的方法，进一步包括电子生成患者报道和鉴定GlycA测量值和风险概述，其中GlycA的增加水平与CHD的增加风险和GlycA值的风险概述相关。
21.权利要求12的方法，进一步包括从生物样品的NMR谱电子计算LDL-P和HDL-P，并且其中当GlycA和LDL-P高于各自群体标准且HDL-P低于群体标准时所述测定步骤包括鉴定CHD的增加风险。
22.权利要求12的方法，进一步包括去卷积生物样品的复合NMR信号以生成单独的GlycA和GlycB峰区域，并且其中所述电子评价使用集中于2.00 ppm的峰区域的NMR信号用于确定GlycA的水平，并且使用集中于2.04 ppm的峰区域的NMR信号用于确定GlycB的水平。
23.用于评价体外患者生物样品的计算机程序产品，所述计算机程序产品包含：
具有在介质中体现的计算机可读程序代码的非瞬时计算机可读存储介质，所述计算机可读程序代码包含：
去卷积受试者的血浆样品的拟合区域的复合NMR谱的计算机可读程序代码，其中所述计算机可读程序代码使用具有(i)高密度脂蛋白(HDL)分量、(ii)低密度脂蛋白(LDL)分量、(iii)VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、(iv)另一定义蛋白信号分量和(v)应用于至少一个GlycA峰区域的曲线拟合函数的定义去卷积模型去卷积所述复合NMR谱；和
求和定义数量的函数以生成GlycA的测量值的计算机可读程序代码。
24.权利要求23的计算机程序产品，其中所述曲线拟合函数包含重叠洛伦兹函数。
25.权利要求23的计算机程序产品，其进一步包含计算机可读程序代码，其将转换因子应用于求和的洛伦兹函数以生成以µmol/L计的GlycA的测量值。
26.权利要求23的计算机程序产品，其进一步包含将GlycA测量值与具有相关程度的CHD风险的测量值的预定范围进行比较的计算机可读程序代码，和生成具有GlycA测量值和与风险评价的关联性的患者报道的计算机可读程序代码。
27.权利要求23的计算机程序产品，其中生成测量值的计算机程序代码经配置以使用具有集中于约2.00 ppm的峰的NMR信号评价体外血浆或血清患者样品的NMR谱。
28.系统，其包含：
NMR波谱仪，其用于获取体外生物样品的至少一个NMR谱；和
与所述NMR波谱仪通信的至少一个处理器，经配置以使用至少一个NMR谱获得GlycA的NMR测量值的至少一个处理器。
29.权利要求28的系统，其中所述至少一个处理器经配置以：(i) 获得体外血浆生物样品的拟合区域的复合NMR谱；(ii)使用具有高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、定义蛋白信号分量和与至少一个GlycA峰区域相关的曲线拟合函数的定义去卷积模型去卷积所述复合NMR谱；和(iii)基于所述曲线拟合函数电子生成GlycA的NMR测量值。
30.权利要求29的系统，其中所述曲线拟合函数包含重叠洛伦兹函数，并且其中所述至少一个处理器求和定义数量的函数以生成NMR测量值。
31.权利要求29的系统，其中所述至少一个处理器经配置以便将转换因子应用于求和的NMR测量值以生成以µmol/L计的GlycA测量值。
32.权利要求30的系统，其中所述生物样品是血浆或血清样品，并且其中所述至少一个处理器经配置以获得高密度脂蛋白颗粒(HDL-P)的浓度测量值和低密度脂蛋白颗粒(LDL-P)的浓度测量值。
33.权利要求28的系统，其中所述至少一个处理器经配置以去卷积与缬氨酸信号的四重峰相关的样品的NMR谱的另一部分且生成缬氨酸的NMR量度。
34.权利要求28的系统，其中所述至少一个处理器经配置以生成患者报道，所述患者报道汇总各自GlycA测量值和至少一个脂蛋白子类测量值和/或缬氨酸测量值。
35.权利要求28的系统，其中所述至少一个处理器经配置以便将GlycA测量值用作定义的全因死亡风险比的分母，并且生成与全因死亡的风险相关的风险数量。
36.患者报道，其包含：
多个脂蛋白测量值，其包括以µmol/L和/或任意单位计的GlycA的定量测量值。
37.权利要求36的患者报道，其中所述报道还包括以下中至少一个的NMR测量值：(i) 以浓度单位计的低密度脂蛋白颗粒数量(LDL-P)；(ii) 以浓度单位计的高密度脂蛋白颗粒(HDL-P)数量；(iii) 镁；或(iv) 缬氨酸。
38.患者报道，其包含使用 (缬氨酸*HDL-P)/GlycA的比率的缬氨酸、HDL-P和GlycA的测量值的计算比率。
39.NMR分析仪，其包含：
NMR波谱仪；
与所述波谱仪通信的流探针；和
与所述波谱仪通信的至少一个处理器，其经配置以获得与流探针中的流体样本的GlycA相关的NMR谱的定义单峰区域的NMR信号且生成提供GlycA水平的患者报道。
40.权利要求39的NMR分析仪，其中所述至少一个处理器经配置以实施以下或与经配置以实施以下的至少一个本地或远程处理器通信：(i) 使用具有高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、定义的蛋白信号分量和与至少一个GlycA峰区域相关的曲线拟合函数的定义去卷积模型去卷积复合NMR谱；和(ii) 电子生成GlycA水平。
41.权利要求39的分析仪，其中所述曲线拟合函数包含重叠洛伦兹函数，并且所述至少一个处理器经配置以求和定义数量的函数以生成GlycA水平。
42.权利要求39的系统，其中所述至少一个处理器经配置以应用转换因子来生成以µmol/L计的GlycA测量值。
43.权利要求39的系统，其中所述至少一个处理器经配置以(a)使用具有高密度脂蛋白(HDL)分量、低密度脂蛋白(LDL)分量、VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、和与至少一个GlycA峰区域相关的曲线拟合函数的定义去卷积模型去卷积复合NMR谱，和(b) 去卷积与缬氨酸信号的四重峰相关的样品的NMR谱的另一部分，且生成缬氨酸的NMR量度。
44.权利要求39的系统，其中所述至少一个处理器经配置以(i)使用具有高密度脂蛋白(HDL)分量、低密度脂蛋白(LDL)分量、VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、和代谢物A分量的定义去卷积模型去卷积NMR谱，和(ii) 求和与GlycA拟合区域相关的曲线拟合函数的定义子集的多个值以提供GlycA水平。
45.权利要求39的系统，其中所述至少一个处理器经配置以便将多个曲线拟合函数应用于拟合区域，所述拟合区域包括GlycA峰区域，并延伸到具有约40-60个曲线拟合函数的GlycB峰区域，并且其中所述GlycA水平通过求和曲线拟合函数的定义第一子集的值和应用定义转换值来计算。
46.权利要求39的系统，其中所述至少一个处理器经配置以便通过求和多个曲线拟合函数的第二较小子集和应用定义转换值来计算GlycB的量度。
47.权利要求39的系统，其中所述至少一个处理器经配置以便使用以下中至少一个计算测量值的比率：缬氨酸/GlycA、HDL-P/GlycA或(缬氨酸*HDL-P)/GlycA。
48.评价或预测人的全因死亡风险的方法，其包括：
电子计算以下中至少一个的测量值的比率：缬氨酸/GlycA、HDL-P/GlycA或(缬氨酸*HDL-P)/GlycA；和
评价人是否相对于定义群体具有全因死亡的增加风险，其中当计算的比率在群体的第一三分位数、第一四分位数或第一五分位数中时，各人相对于所述定义群体具有增加的风险。
49.权利要求48的方法，其中所述计算使用(缬氨酸*HDL-P)/GlycA的比率来实施。
50.定量生物样品中代谢物A的水平的方法，其包括：
去卷积具有与脂蛋白相关信号的质子NMR谱的定义代谢物A峰区域和与代谢物A相关的单峰；
将多个曲线拟合函数应用于代谢物A峰区域；和
使用应用的曲线拟合函数测量代谢物A的水平。
51.定量生物样品中的缬氨酸的方法，其包括：
使用脂蛋白和蛋白分量的去卷积模型去卷积NMR谱；
鉴定0.90-1.01 ppm之间的区域中的多重峰信号；和
计算所述生物样品中缬氨酸的水平。
52.权利要求51的方法，进一步包括在去卷积步骤之前，使用获取的NMR谱应用质量控制预分析分析。
53.测量GlycB的方法，其包括：
电子获得受试者的生物样品的拟合区域的复合NMR谱；
使用具有高密度脂蛋白(HDL)分量、低密度脂蛋白(LDL)分量、VLDL(极低密度脂蛋白)/乳糜微粒分量、和与至少一个GlycB峰区域相关的多个曲线拟合函数的定义去卷积模型电子去卷积所述复合NMR谱；和
使用曲线拟合函数电子生成GlycB的量度。
54.权利要求10-15中任一项的方法，进一步包括生成GlycA/GlycB或GlycB/GlycA的比率。
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