CN104502604A - Ncx1和nckx4作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物 - Google Patents

Ncx1和nckx4作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及NCX1和NCKX4作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物。本发明通过western blot、Qrt-PCR和免疫荧光三种方法对动脉导管闭合及开放的患者进行了蛋白表达差异的分析，首次证明NCX1、NCKX4蛋白在人动脉导管组织中表达，并且这些蛋白在闭合和开放的两组动脉导管组织中的相对表达量具有明显的差异，可能是调控动脉导管闭合或开放的关键因子，可用于动脉导管未闭的临床诊断，且诊断的准确度高。

Description

NCX1和NCKX4作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物
技术领域
本发明涉及分子生物学及医学的临床诊断技术领域，具体地说，涉及NCX1和NCKX4作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物。
背景技术
动脉导管是主动脉与肺动脉之间的一根管道，为胎儿循环的重要通路。小儿出生后，动脉导管即在功能上关闭，绝大多数婴儿生后3个月左右在解剖上逐渐闭合成为动脉韧带，若不闭合即称动脉导管未闭。动脉导管的闭合分为两期：1.第一期为生理闭合期。婴儿出生啼哭后第一口吸气，肺泡即膨胀，肺血管阻力随之下降，肺动脉血流开始直接进入肺脏，建立正常的肺循环，而不流经动脉导管，促进其闭合。动脉导管的组织学结构与两侧的主动脉、肺动脉不同，管壁主要由平滑肌而不是弹性纤维组织组成，中层含粘性物质。足月婴儿出生后血氧张力升高，作用于平滑肌，使之环形收缩，同时管壁粘性物质凝固，内膜垫突入管腔，造成血流阻滞，营养障碍和细胞分解性坏死，因而导管发生生理性闭合。一般在出生后10～15小时内完成，但在7～8天内有潜在性再开放的可能。2.此后内膜垫弥漫性纤维增生完全封闭管腔，最终形成导管韧带。导管纤维化一般起始于肺动脉侧，向主动脉延伸，但主动脉端可以不完成，因而呈壶腹状。纤维化解剖性闭合，88％婴儿于8周内完成。如这闭合过程延迟称动脉导管延期未闭。动脉导管出生后6个月未能闭合，将终生不能闭合，则称持续动脉导管闭锁不全，临床上简称动脉导管闭锁不全。
钠钙交换蛋白(NCX)是广泛存在于动物细胞膜上的一种离子转运蛋白，它在调节细胞内钙离子平衡中发挥着关键的作用。迄今为止，科学家已克隆出8个不同类型、两大家族的NCX，他们分别是NCX1、NCX2、NCX3以及钾以来的NCX NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4以及NCKX5。
有许多从左向右分流心内畸形在胸骨左缘可听到同样的连续性机器样杂音或接近连续的双期心杂音，难以辨识，在建立动脉导管未闭诊断进行治疗前必须予以鉴别。目前尚未见关于动脉导管闭合诊断标志物的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供用于诊断动脉导管未闭的标志物。
在本发明的第一方面，NCX1蛋白可用作诊断动脉导管未闭的标志物。
据此，本发明提供了NCX1蛋白或其特异性抗体的用途，用于制备诊断动脉导管未闭的试剂或试剂盒。
还提供了一种用于诊断动脉导管未闭的试剂盒，所述的试剂盒包含检测NCX1蛋白含量的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
优选地，所述的检测NCX1蛋白含量的试剂为NCX1蛋白的特异性抗体，所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
还提供了一种芯片或阵列，所述的芯片或阵列上具有检测NCX1蛋白的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
优选地，所述的检测NCX1蛋白含量的试剂为NCX1蛋白的特异性抗体，所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
在本发明的另一方面，NCKX4蛋白可用作诊断动脉导管未闭的标志物。
据此，本发明提供了NCKX4蛋白或其特异性抗体的用途，用于制备诊断动脉导管未闭的试剂或试剂盒。
还提供了一种用于诊断动脉导管未闭的试剂盒，所述的试剂盒包含检测NCKX4蛋白含量的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
优选地，所述的检测NCKX4蛋白含量的试剂为NCKX4蛋白的特异性抗体，所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
还提供了一种芯片或阵列，所述的芯片或阵列上具有检测NCKX4蛋白的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
优选地，所述的检测NCKX4蛋白含量的试剂为NCKX4蛋白的特异性抗体，所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
本发明优点在于：
本发明通过western blot、Qrt-PCR和免疫荧光三种方法对动脉导管闭合及开放的患者进行了蛋白表达差异的分析，首次证明NCX1、NCKX4蛋白在人动脉导管组织中表达，并且这些蛋白在闭合和开放的两组动脉导管组织中的相对表达量具有明显的差异，可能是调控动脉导管闭合或开放的关键因子，可用于动脉导管未闭的临床诊断，且诊断的准确度高。
附图说明
附图1是NCX1、NCKX3和NCKX4的Western-blot实验结果。
附图2是NCX1、NCKX3和NCKX4的Qrt-PCR实验结果，其中白色立柱为闭合组，黑色立柱为开放组。
附图3是NCX1、NCKX3和NCKX4的免疫荧光实验结果，其中白色立柱为闭合组，黑色立柱为开放组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.材料和方法
1.1分离人动脉导管组织
该实验所有步骤和过程均获得上海交通大学医学院伦理委员会批准。开放(n＝10，年龄＝30.2±6.3天)或闭合(n＝10，年龄＝25.3±7.9天)的动脉导管组织取自于手术过程中的动脉导管依赖的先天性心脏病患儿(患儿详细信息见表1)。所有病人在手术前均使用前列腺素E1，但闭合组的动脉导管在手术前依然闭合了。动脉导管的状态(开放或闭合)均经过心脏超声和CT确认，并在手术过程加以确认。所有样本用生理盐水冲洗后，分成四部分，并迅速冻存于液氮中。
表1 患儿临床信息
开放组 闭合组 P
体重(kg) 3.3±0.82 2.9±0.64 0.209
年龄(days) 30.2±6.3 25.3±7.9 0.141
性别(male/female) 7/3 8/2 1.000
氧饱和度(SO2) 79.6±5.7 71.1±4.7 0.002*
诊断
TGA/IVS 4 5
PA/IVS 2 3
IAA 3 1
PS 1 1
注：*P<0.05开放组vs闭合组；TGA/IVS：完全性大动脉转位/室间隔完整型；PA/IVS：肺动脉阻滞/室间隔完整型；IAA：主动脉弓中断；PS：肺动脉狭窄。
1.2 Western blotting分析
进行Western blotting分析所用一抗信息如下：Anti-NCX1(Abcam，ab2869)，anti-NCKX3(Santa Cruz,sc-50129)，anti-NCKX4(Abcam，ab105715)，和anti-β-actin(Abcam，ab8226)。
将提纯的蛋白用10％的分离胶进行分离，80伏，1小时。蛋白进行常规转膜，5％脱脂奶粉封闭1小时。按照抗体说明书，加入一抗，常温下孵育2小时后，加入相应的HRP耦合的二抗(1:5000；Thermo Scientific Pierce)孵育1小时后，加入ECL化学发光液(Merck，Milipore，USA)。条带的光密度用Chemi-Doc成像系统(Bio-Rad Laboratories)进行分析。
1.3实时荧光定量PCR分析
采用SYBR Green(Applied Biosystems)两步法检测上述蛋白的mRNA水平。用总RNA提取试剂盒(天根)从冰冻组织中提取RNA，而后用Takara反转录试剂盒反转录合成cDNA，再用SYBR Green Power Premix(ABI)进行聚合酶链反应。反应体系为10μl，DNA模板为1.0μl。ABI7900实时荧光定量PCR反应体系如下：95度10秒1个循环，95度15秒40个循环，60度60秒。引物由中国杰瑞生物科技有限公司合成，序列如下：
NCX1(sense,5’-GGTTGGGACTAACAGCTGGA-3’；antisense,5’-AATCTTTCAGGCCAATGGTG-3’)；
NCKX3(sense,5’-TCCTACATCCGGCTGAATAG-3’；antisense,5’-GCACAGGAACACACCATACA-3’)；
NCKX4(sense,5’-CCGTCCTCGGCATCCACCTA-3’；antisense,5’-TCGTCTTCCCGGCACATCG-3’)；
GAPDH(sense,5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’；antisense,5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’)。
所有样本均做3个复孔，复孔间Ct值的差异如果大于0.3，则该复孔不予考虑。
1.4免疫荧光分析
动脉导管组织经4％多聚甲醛4度过夜后，PBS洗涤，OCT包埋。莱卡冰冻切片机切片(5μm)。0.5％Triton破膜后，室温下10％胎牛血清封闭0.5小时后，加入一抗4度过夜。PBS洗涤3次，加入AF488荧光二抗，共聚焦显微镜检测。所用一抗信息如下：Anti-NCX1(Abcam，ab2869)，anti-NCKX3(SantaCruz，sc-50129)，和anti-NCKX4(Abcam，ab105715)。
1.5统计分析
结果以均数±标准差表示，成组设计定量资料t检验，P<0.05认为统计上有差异。
1.6制作受试者工作特征(ROC)曲线
对开放组作ROC曲线，以评价具有表达差异的蛋白的诊断效果。
2.实验结果
NCX1、NCKX3和NCKX4的Western-blot实验结果见图1，NCX1、NCKX3和NCKX4的Qrt-PCR实验结果见图2，NCX1、NCKX3和NCKX4的免疫荧光实验结果见图3。以上结果表明，NCX1、NCKX3和NCKX4蛋白在人动脉导管组织中表达，且在开放组和闭合组中，NCX1和NCKX4蛋白的相对表达量差异达到显著水平(*P<0.05)，NCX1和NCKX4蛋白的mRNA相对含量差异达到极显著水平(**P<0.01)，提示NCX1和NCKX4可能是调控动脉导管闭合或开放的关键因子。
针对10名开放组患者NCX1和NCKX4蛋白水平进行ROC曲线分析，两种蛋白的诊断价值如表2所示。结果表明NCX1和NCKX4蛋白对动脉导管未闭具有较高的诊断价值，AUC分别可达0.853和0.904。
表2 NCX1和NCKX4蛋白相对含量对动脉导管未闭的诊断价值
诊断指标 AUC 灵敏度 特异度
NCX1相对表达量＝6.20(NCX1/β-actin) 0.853 82.5％ 73.5％
NCX1相对表达量＝5.80(NCX1/β-actin) 0.736 73.0％ 67.2％
NCKX4相对表达量＝5.20(NCX1/β-actin) 0.904 90.1％ 88.4％
NCKX4相对表达量＝5.00(NCX1/β-actin) 0.815 75.3％ 68.1％
注：AUC为ROC曲线下面积；AUC越接近于1，说明诊断效果越好；AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。
实施例2
对20名疑似动脉导管未闭患者以NCX1和NCKX4蛋白相对含量为标志物进行诊断。采用Western blotting进行分析，具体方法同实施例1。以NCX1相对表达量＝6.20(NCX1/β-actin)以及NCKX4相对表达量＝5.20(NCX1/β-actin)为诊断临界值，高于以上临界值即判定为动脉导管未闭，NCX1蛋白标志物的诊断结果显示14名患者为动脉导管未闭，NCKX4蛋白标志物的诊断结果也显示相同的14名患者为动脉导管未闭。后期14名患者均实施了动脉导管闭合手术，手术中确认该14名患者均为动脉导管未闭。其他6名患者有5名进一步实施了心脏手术，手术中确认5名均非动脉导管未闭。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.NCX1蛋白或其特异性抗体的用途，其特征在于，用于制备诊断动脉导管未闭的试剂或试剂盒。
2.一种用于诊断动脉导管未闭的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含检测NCX1蛋白含量的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测NCX1蛋白含量的试剂为NCX1蛋白的特异性抗体，所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
4.一种芯片或阵列，其特征在于，所述的芯片或阵列上具有检测NCX1蛋白的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
5.根据权利要求4所述的芯片或阵列，其特征在于，所述的检测NCX1蛋白含量的试剂为NCX1蛋白的特异性抗体，所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
6.NCKX4蛋白或其特异性抗体的用途，其特征在于，用于制备诊断动脉导管未闭的试剂或试剂盒。
7.一种用于诊断动脉导管未闭的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含检测NCKX4蛋白含量的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测NCKX4蛋白含量的试剂为NCKX4蛋白的特异性抗体，所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
9.一种芯片或阵列，其特征在于，所述的芯片或阵列上具有检测NCKX4蛋白的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
10.根据权利要求9所述的芯片或阵列，其特征在于，所述的检测NCKX4蛋白含量的试剂为NCKX4蛋白的特异性抗体，所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
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