CN104483297B - 可视化校准激光诱导荧光检测设备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可视化校准激光诱导荧光检测设备，包括倾斜设置在色镜架内的二向色镜、位于二向色镜的激光入射方向的激光入射装置、位于二向色镜的激光折射方向的透镜以及位于二向色镜的荧光接收方向的发射滤光片，所述透镜外侧的焦点处放置有带窗口的毛细管，所述发射滤光片外侧依次设有可调狭缝和光电培增管所述色镜架在位于二向色镜的激光透射方向设有十字分划板，所述十字分划板外侧设有内窥镜。本发明具有激光入射光线准直、激光入射光线位置实时在线显示以及可视化校准的优点，可实现可变波长激光诱导荧光检测设备更换，保证不同波长激光器时的输出光路系统的稳定，提升检测器的适用性及稳定性。
Description
技术领域
本发明属于检测分析仪器，特别涉及一种主要适用于药物临床和生物科学等领域中的微量样品检测的激光诱导荧光检测设备。
背景技术
上世纪70年代Zare等首次提出了激光诱导荧光检测技术(LIF)，由于其具有的高检测灵敏度以及适合于微区检测的特点，LIF检测系统获得了快速迅猛的发展和广泛的应用。随着近年来微分离技术的快速发展，科技工作者们对现有分析手段的分离效率、分析速度、检测灵敏度有了更高的要求，特别是对其中检测技术的需求，更趋向于高灵敏度、高选择性的方向。激光诱导荧光检测技术(LIF)正是集中体现了这种发展趋势。由于可以检测超微样品体积，具有高特异性、高重现性以及极高的检测灵敏度(激光诱导荧光检测设备的最低检测浓度可达到1×10-12M，较之常规紫外/可见光检测器1×10-7M的最低检测浓度，灵敏度要高100000倍)，作为精密分析仪器检测器的激光诱导荧光检测设备自问世以来，倍受科技工作者的青睐，现已被广泛地应用于神经科学、核酸分析、生物工程等生命科学、环境保护、制药业、食品业及农业等多个领域，特别是在痕量检测、分析方面(如，医疗诊断、食品卫生检测、农药残留检测、水质检测等)，具有其他检测器无可比拟的优势。且这种检测技术与多种精密分析分离仪器有很好的匹配性，可以广泛用于毛细管电色谱仪、毛细管电泳仪、毛细管液相色谱仪、微径液相色谱仪、常规高效液相色谱仪等多种仪器，从而进一步拓展了其应用领域。
目前激光诱导荧光检测设备多为单一固定波长的检测器，只有与之波长相符的物质或可以与之波长相符的衍生试剂发生反应的物质才可以用其进行检测，这在很大程度上限制了激光诱导荧光检测设备的应用范围。可变波长激光诱导荧光检测设备在固定波长激光诱导荧光检测设备基础上，利用光纤技术，实现激光、二向色镜和滤光片组可更换，解决固定波长激光诱导荧光检测设备应用局限性的问题。但是，激光、二向色镜和滤光片组在更换过程会造成整个系统光路的偏移，而光路的调节没有一个参考标准进行光路校准。之前的做法为观察检测窗口荧光物质激发出荧光的亮度，此时激光直接照射到毛细管窗口会产生大量的散射光，很难分辨出亮度最大的位置，而且易损伤眼睛，操作麻烦；另外还可以根据光电倍增管的输出电信号的大小来进行光路校准，此时可根据电信号高斯曲线的最高点确认激光位置，但无法观察到激光照射到毛细管上的位置，若光路偏移量较大，操作时间也相应加长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够对激光光线位置进行可视化校准的激光诱导荧光检测设备，以克服现有技术存在的不足。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种可视化校准激光诱导荧光检测设备，包括倾斜设置在色镜架内的二向色镜、位于二向色镜的激光入射方向的激光入射装置、位于二向色镜的激光折射方向的透镜以及位于二向色镜的荧光接收方向的发射滤光片，所述透镜外侧的焦点处放置有带窗口的毛细管，所述发射滤光片外侧依次设有可调狭缝和光电培增管，其特征在于:所述色镜架在位于二向色镜的激光透射方向设有十字分划板，所述十字分划板外侧设有内窥镜，所述激光入射装置中的准直镜安装在二维调节装置上，所述二维调节装置包括水平调节机构、安装在水平调节机构上的垂直调节机构以及安装在垂直调节机构上的角度调节机构构成。
采用上述技术方案，在实际使用时，将内窥镜与图像显示装置(如PC机)相连。部分激光会经过二向色镜透射到十字分划板上形成光斑，而通过内窥镜借助图像显示装置就可以观察光斑位置进而判断光路是否准确，如果不够准确，还可以据此进行校准。
这种结构的激光入射装置准直镜可以对射入二向色镜的激光光纤进行准直，保证了激光输入稳定、位置可调。
所述准直镜中的输出镜与输入镜是虚共焦结构。
采用上述技术方案，本发明具有激光入射光线准直、激光入射光线位置实时在线显示以及可视化校准的优点，可实现可变波长激光诱导荧光检测设备更换，保证不同波长激光器时的输出光路系统的稳定，可视化成像能够降低校准难度，提升检测器的适用性及稳定性，以克服现有技术中存在的不足。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明：
图1为本发明的结构示意图；
图2为准直镜的结构示意图；
图3为二维调节装置的立体结构示意图；
图4为二维调节装置另一视角的立体结构示意图；
图5为二维调节装置再另一视角的立体结构示意图；
图6为三角支架的结构示意图；
图7为隐去底板和准直镜固定套的角度调节机构的结构示意图；
图8为激光光线入射位置校准前的示意图；
图9为激光光线入射位置校准后的示意图；
图10为经校准可变波长激光诱导荧光测量样品峰色谱图。
具体实施方式
如图1所示，本发明的激光诱导荧光检测设备，包括激光器1、光纤接头2、二维调节装置3、准直镜4、二向色镜架5、二向色镜6、十字分划板7、透镜8、带窗口的毛细管9、内窥镜套管10、内窥镜11、发射滤光片12、可调狭缝13以及光电倍增管14。
二向色镜6呈45°倾斜地安装的二向色镜架5上从而围绕该二向色镜6为中心以按顺序分别具有四个方向：激光入射方向、激光折射方向、激光透射方向以及荧光接收方向。其中，激光入射方向与激光透射方向相对、激光折射方向与荧光接收方向相对。
二向色镜6为300-700nm范围内匹配任意指定波长的二向色镜，且四个二向色镜模块与不同波长的激光器可以任意匹配，拆换方便。
激光器1、光纤接头2、二维调节装置3、准直镜4构成了本发明的激光入射装置，安装在二向色镜6的激光入射方向。其中，准直镜4安装在二维调节装置3上，光纤接头2连接在准直镜4的入射口，激光器1则与光纤接头2连接。装配时，二向色镜6安装在准直镜4的中心线上。
激光器1的波长范围为300-700nm任意波长的激光器,例如473nm固体激光器或561nm固体激光器或638nm半导体激光器或375nm半导体激光器。
透镜8安装二向色镜6的激光折射方向，而带窗口的毛细管9则安装在透镜8的外侧，位于透镜8的焦点处。透镜8与毛细管9的距离调节方式为旋转螺纹进行轴向旋进。
发射滤光片12安装在二向色镜6的荧光接收方向，可调狭缝13以及光电倍增管14则按次序安装在发射滤光片12的外侧。
十字分划板7则安装在二向色镜6的激光透射方向的二向色镜架5上，内窥镜套管10罩在该十字分划板7上，其出口则安装有内窥镜11。
大部分激光会在二向色镜6折射，经透镜8聚焦在毛细管9中心；有部分激光会透过二向色镜6照射在十字分划板7上。透射光线和折射光线之间的夹角是固定不变的，可以通过确定透射光线的位置作为参考基准来校准折射入透镜的光线。
如图3-5所示，二维调节装置3包括水平调节机构31、垂直调节机构32以及角度调节机构33。
水平调节机构31包括第一固定块311、第一运动框架312、第一调节螺纹旋钮313。其中，第一固定块311位于第一运动框架312内，在第一固定块311两侧面具有导轨，在第一运动框架312的两侧板内壁具有与第一固定块311导轨配合的导槽，在第一运动框架312的端板和第一固定块的端面之间连接有两根弹簧35。第一运动框架312的端板的中部位置还设有螺母，第一调节螺纹旋钮313位于该螺母中，该第一调节螺纹旋钮313的端头抵顶在第一固定块311的端面上。
在第一运动框架312的固定平面还固定有一个三角支架34，结合图6所示，该三角支架34具有水平安装面341和垂直安装面342，水平安装面341和垂直安装面342相互垂直。第一运动框架312的上表面安装在三角之间34的水平安装面上。
垂直调节机构32包括第二固定块321，第二运动框架322、第二调节螺纹旋钮323。其中，第二固定块321固定在三角支架34的垂直安装面342上，并位于第二运动框架322内，在第二固定块321两侧具有导轨，在第二运动框架322的两侧板内壁具有与第二固定块321的导轨配合的导槽。第二运动框架的端板和第二固定块321的端面之间也连接有两根弹簧35。第二运动框架的端板中间也设有螺母，第二调节螺纹旋钮323位于该螺母中，并且该第二调节螺纹旋钮313的端头抵顶在第二固定块321的端面上。
结合图7所示，角度调节机构33包括L型联接板331、底板332、前板333、准直镜固定套334以及两个角度螺纹调节旋钮335。其中，L型联接板331固定在第二运动框架323的固定平面上，底板332则固定在L型联接板331上，前板333位于底板332的前方，前板333和底板332之间通过两根分别设置在两边的弹簧35进行连接。底板332两边分别设置有螺母，两个角度螺纹调节旋钮335分别位于该两个螺母中，角度螺纹调节旋钮335的端头抵顶在前板333的表面。准直镜固定套334则固定在前板333的中心。而准直镜4安装在准直镜固定套334内。
该二维调节装置3在使用时，通过旋钮第一调节螺纹旋钮313就可以调节第一固定块311和第一运动框架312之间的弹簧35的松紧程度，从而造成第一运动框架312的水平移动；通过旋钮第二调节螺纹旋钮323就可以调节第二固定块321和第二运动框架322之间的弹簧35的松紧程度，从而造成第二运动框架322之间的弹簧35的松紧程度，从而造成第一运动框架322在垂直方向上运动；通过分别旋钮两个角度螺纹调节旋钮335就可以相对应侧底板332和前板333之间的弹簧35的松紧程度，从而造成前板333与底板332之间角度不同，进而调节准直镜固定套334内的准直镜4的光线发射角度。
以上就是本发明的激光诱导荧光检测设备，使用时，将光电倍增管14与数据工作站15连接，数据工作站15再连接到PC主机16，内窥镜11通过USB数据线与PC主机连接以实现实时在线成像。
该激光诱导荧光检测设备的工作原理是：光纤接头2通过调节二维调节装置3改变激光入射角度，激光大部分(>95％)经过二向色镜6折射到透镜8中心从而聚焦到毛细管9上，产生的荧光经透镜8、二向色镜6、发射滤光片12、可调狭缝13照射到光电倍增管14的感光窗口上并转变为模拟电信号，此信号经过数据工作站15将数据传输到PC主机16上进行处理，另外有部部分激光透射到十字分划板7上形成光斑，二向色镜架5上装有内窥镜套管10，通过内窥镜11则可以将光斑位置显示在PC主机16上以便观察。根据观察成像激光斑点位置，对可变波长激光诱导荧光检测激光位置进行可视化校准。
结合图2所示，准直镜4能够将入射光束17转变为平行出射光束20，降低激光束的发散角，进而使激光器光纤输出的聚焦光斑更小。针对不同的波长激光器，可以调节准直镜结构中的输出镜19与输入镜18之间的距离，进而保证输入镜将一个虚焦点光束传送给输出镜，即两个透镜是虚共焦结构。准直镜4与固定某一个波长激光器的光纤接头2是一对一匹配，准直镜4通过套圈固定到二维调节装置3上。
实验例：校准473nm波长激光，并用于检测异硫氰酸荧光素(FITC)。
实验条件：
激光器：473nm固体激光器(光纤输出)
二向色镜：ZT488rdc；
发射滤光片：ET525/50m；
空心石英毛细管：100μm I.D.*360μm O.D.*130cm长；
流动相：甲醇；
进样量：10μL。
泵流速：0.5mL/min；
样品：5×10-6～5×10-12mol/L FITC；
校准过程如图8和图9所示，图8为激光波长更换为473nm，相应的二向色镜和发散滤光片组模块后出现光路系统偏离情况，然后通过微调二维调节装置进行校准即可，校准结果如图9所示。
图10为校准荧光测试的色谱图，经过校准后，仪器性能指标稳定，可以看出峰高的RSD值小于6％，峰面积RSD值小于7％，检测限达到1.16×10-12mol/L。
通过以上描述可以看出，本发明具有如下优点：
1、在光路设计上吸收了其他光源仪器的优秀设计概念，采用最新型的光电元件，实现简单、高效的光路系统。激光的单色性强，目标波长外的杂光少，没有必要在光路中加入激发滤光片，去除激发滤光片，从而降低成本的同时保证产品有效技术性能。
2、通过光纤技术切换不同激光器波长，扩大了可检测物质的范围，有效解决了由于原发、继发荧光物质较少，导致传统激光诱导荧光检测设备可检测物质范围较窄的问题。采用光纤接头与准直系统设计，以及二维调节准直保证激发光输出稳定、位置可调。
3、采用模块化设计二向色镜和发散滤光片组，实现与相应波长激光器的匹配及更换，大大拓展了该检测器的使用范围。
4、采用可视化成像系统对激光位置进行准确定位，提高激发光和荧光的利用效率，同时又保证波长更换的方便，可靠的重复性和可靠的安全性。
综上所述，本发明具有激光入射光线准直、激光入射光线位置实时在线显示以及可视化校准的优点，可实现可变波长激光诱导荧光检测设备更换，保证不同波长激光器时的输出光路系统的稳定，可视化成像能够降低校准难度，提升检测器的适用性及稳定性，以克服现有技术中存在的不足。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本发明所提出的权利要求的保护范围内，利用本发明所揭示的技术内容所作出的局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属本发明技术特征的范围内。
Claims (6)
1.一种可视化校准激光诱导荧光检测设备，包括倾斜设置在色镜架内的二向色镜、位于二向色镜的激光入射方向的激光入射装置、位于二向色镜的激光折射方向的透镜以及位于二向色镜的荧光接收方向的发射滤光片，所述透镜外侧的焦点处放置有带窗口的毛细管，所述发射滤光片外侧依次设有可调狭缝和光电培增管，其特征在于:所述色镜架在位于二向色镜的激光透射方向设有十字分划板，所述十字分划板外侧设有内窥镜，所述激光入射装置中的准直镜安装在二维调节装置上，所述二维调节装置包括水平调节机构、安装在水平调节机构上的垂直调节机构以及安装在垂直调节机构上的角度调节机构构成；
所述水平调节机构水平调节机构包括第一固定块、第一运动框架、第一调节螺纹旋钮；所述第一固定块位于所述第一运动框架内，在所述第一固定块两侧面具有导轨，在所述第一运动框架的两侧板内壁具有与第一固定块导轨配合的导槽；在第一运动框架的端板和第一固定块的端面之间连接有两根弹簧，所述第一运动框架的端板的中部位置还设有螺母；所述第一调节螺纹旋钮位于所述螺母中，所述第一调节螺纹旋钮的端头抵顶在所述第一固定块的端面上。
2.根据权利要求1所述的可视化校准激光诱导荧光检测设备，其特征在于：所述激光入射装置中，所述准直镜入射口安装有光纤接头，所述光纤接头连接激光器。
3.根据权利要求1所述的可视化校准激光诱导荧光检测设备，其特征在于：所述十字分划板上罩有内窥镜套管，所述内窥镜安装于所述内窥镜套管出口处。
4.根据权利要求1所述的可视化校准激光诱导荧光检测设备，其特征在于：所述准直镜中的输出镜与输入镜是虚共焦结构。
5.根据权利要求1所述的可视化校准激光诱导荧光检测设备，其特征在于：所述垂直调节机构包括第二固定块，第二运动框架、第二调节螺纹旋钮；所述第二固定块固定在三角支架的垂直安装面上，并位于所述第二运动框架内；在所述第二固定块两侧具有导轨，在所述第二运动框架的两侧板内壁具有与第二固定块的导轨配合的导槽；所述第二运动框架的端板和所述第二固定块的端面之间也连接有两根弹簧；所述第二运动框架的端板设有螺母，第二调节螺纹旋钮位于该螺母中，并且所述第二调节螺纹旋钮的端头抵顶在第二固定块的端面上。
6.根据权利要求1所述的可视化校准激光诱导荧光检测设备，其特征在于：所述角度调节机构包括L型联接板、底板、前板、准直镜固定套以及两个角度螺纹调节旋钮；所述L型联接板固定在第二运动框架上，底板则固定在L型联接板上，前板位于底板的前方，前板和底板之间通过两根分别设置在两边的弹簧进行连接；所述底板两边分别设置有螺母，两个角度螺纹调节旋钮分别位于该两个螺母中，角度螺纹调节旋钮的端头抵顶在前板的表面；准直镜固定套则固定在前板上，所述准直镜安装在所述准直镜固定套内。
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