WO2017065257A1 - 撮像装置、フローサイトメータ及び撮像方法 - Google Patents

撮像装置、フローサイトメータ及び撮像方法 Download PDF

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probe beam
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fourier transform
dispersive
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圭介 合田
レイ チェン
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国立大学法人東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to an imaging device, a flow cytometer, and an imaging method.
  • Patent Document 1 discloses a flow including a flow cell in which a sample liquid containing a test object flows as a laminar flow maintained at a predetermined flow rate, and an imaging system including a high-speed camera having a strobe lamp and a burst type CCD image sensor. A cytometer is disclosed. The flow cytometer disclosed in Patent Document 1 measures a test object that flows in sequence in a flow cell in which a laminar flow is formed with a high-speed camera, and observes each test object.
  • auxiliary light such as a strobe
  • an object of the present invention is to provide an imaging apparatus, a flow cytometer, and an imaging method with high image generation throughput that suppresses the influence on the test object.
  • An imaging apparatus includes a probe beam generation unit that generates a probe beam, a dispersive Fourier transform unit that performs a dispersive Fourier transform on the probe beam, and maps a spectrum of the probe beam in a time domain, and a dispersive Fourier transform
  • a spatial mapping unit that spatially maps the probe beam thus applied and irradiates the test object
  • a beam detection unit that detects transmitted light transmitted through the test object or scattered light scattered by the test object
  • an image generation unit that generates an image of the test object based on the intensity of the transmitted light or scattered light.
  • a flow cytometer includes the imaging device according to any one of claims 1 to 3 and a microfluidic device including a flow path through which a test object can flow together with a fluid. An image of the test object flowing through the road is generated.
  • the imaging method of the present invention includes a probe beam generating step for generating a probe beam, a dispersive Fourier transform step for mapping the probe beam spectrum in the time domain, and a dispersive Fourier transform.
  • the probe beam that has been subjected to the Dispersive Fourier Transform by the Dispersive Fourier Transform unit is spatially mapped to irradiate the object to be detected, and the transmitted light or scattered light from the object to be detected is detected.
  • the object can be irradiated with a weak probe beam whose intensity has been attenuated by the dispersive Fourier transform unit, and the image can be detected simply by detecting transmitted light or scattered light from the object.
  • Can be generated, and an imaging apparatus, a flow cytometer, and an imaging method with high throughput of image generation with suppressed influence on the test object can be provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an overall configuration of an imaging apparatus according to an embodiment of the present invention. It is the schematic which shows the whole structure of the flow cytometer of embodiment which concerns on this invention.
  • 3A and 3B are images of beads flowing through the flow path generated by the imaging device.
  • an imaging device 1 includes a light source 2, a dispersion element 4, and a dispersive fiber. 3, first diffraction grating 5, second diffraction grating 8, first objective lens 6, second objective lens 7, introduction fiber 9, photodetector 10, oscilloscope 11, and personal computer (PC). 13.
  • the light source 2 as the probe beam generator is a laser light source such as a titanium sapphire (Ti: Al 2 O 3 ) femtosecond pulse laser (center wavelength 790 nm, bandwidth 40 nm, repetition frequency 75 MHz) that emits a broadband pulse laser.
  • a laser light source such as a titanium sapphire (Ti: Al 2 O 3 ) femtosecond pulse laser (center wavelength 790 nm, bandwidth 40 nm, repetition frequency 75 MHz) that emits a broadband pulse laser.
  • a laser light source such as a titanium sapphire (Ti: Al 2 O 3 ) femtosecond pulse laser (center wavelength 790 nm, bandwidth 40 nm, repetition frequency 75 MHz) that emits a broadband pulse laser.
  • an image of the test object 20 is generated to generate a probe beam 14 for exploring the test object 20.
  • the probe beam 14 is a broadband light pulse emitted from the light source 2 at a predetermined repetition rate.
  • a laser light source that emits a pulse laser generally used for optical communication can be used, and a laser light source that emits a pulse laser having a central wavelength of 720 to 1600 nm is used. be able to.
  • the probe beam 14 generated by the light source 2 is incident on the dispersion element 4 as a pre-dispersion part.
  • the dispersion element 4 causes group velocity dispersion in light transmitted through an element formed of, for example, glass.
  • the dispersion element 4 group velocity dispersion occurs in the probe beam 14 during the transmission of the probe beam 14, and the velocity of each wavelength component included in the probe beam 14 changes according to the wavelength. For this reason, the transmission time through the dispersion element 4 differs for each wavelength component, and when the probe beam 14 is emitted from the dispersion element 4, a delay corresponding to the length of the wavelength occurs in the phase of each wavelength component. As a result, in the probe beam 14 emitted from the dispersion element 4, the overlapping of the wavelength components contained in the probe beam 14 is changed compared to when the probe beam 14 is incident on the dispersion element 4, and the pulse width is widened. Thus, the dispersion element 4 widens the waveform of the probe beam 14.
  • the dispersion element 4 is formed in a rod shape having a length of 10 cm and a diameter of 0.5 cm, and is arranged so that the probe beam 14 is transmitted in the longitudinal direction.
  • the dispersion element 4 by disposing the dispersion element 4, it is possible to suppress the occurrence of an unfavorable nonlinear optical effect in the dispersive fiber 3 described below, and to more reliably disperse the probe beam 14 with the dispersive Fourier. Therefore, the image of the test object 20 can be captured more clearly.
  • the shape of the dispersion element 4 is not particularly limited, and may be a rectangular parallelepiped shape or a polygonal column shape in addition to the rod shape described above.
  • the diameter of the dispersion element 4 only needs to be sufficiently larger than the spot of the probe beam 14.
  • the length of the dispersion element 4 can be appropriately selected depending on how much the pulse width of the probe beam 14 is desired to be expanded, and is preferably 10 cm to 50 cm. When the length of the dispersion element 4 is 10 cm to 50 cm, it is possible to sufficiently suppress the occurrence of nonlinear effects in the dispersive fiber 3 that adversely affect the dispersive Fourier transform described later.
  • the probe beam 14 that has passed through the dispersion element 4 is incident on the dispersive fiber 3 as a dispersive Fourier transform unit.
  • the dispersive fiber 3 includes a fiber main body 3a and collimators 3b and 3c provided at both ends of the fiber main body 3a.
  • the collimator 3b collimates the probe beam 14 incident on the collimator 3b, and causes the probe beam 14 that has become collimated light (parallel light) to enter the fiber body 3a.
  • the fiber body 3a is a single mode optical fiber.
  • the propagation speed of light in the fiber main body 3a differs depending on the wavelength.
  • the pulse width of the probe beam 14 is widened when transmitted through the fiber body 3a as in the case of the dispersion element 4.
  • the difference in the delay time of each wavelength component increases and the pulse width greatly increases as it propagates through the fiber body 3a.
  • each wavelength component is separated on the time axis, and the pulse shape of the probe beam 14 becomes the same as the shape of the spectral spectrum of the probe beam 14. It is as if the beam 14 was Fourier transformed on the time axis.
  • the probe beam 14 is subjected to dispersive Fourier transform, and each wavelength component of the probe beam 14 transmitted through the fiber body 3a is mapped in the time domain.
  • the pulse intensity of the probe beam 14 subjected to the dispersive Fourier transform represents the intensity of light of the corresponding frequency component.
  • 630-HP manufactured by Nufern group velocity dispersion: 120 ⁇ ps / nm / km, core diameter: 3.5 ⁇ m
  • the probe beam 14 emitted from the other end is mapped in the time domain having a spectral spectrum of about 8 ns.
  • the spectral spectrum of the probe beam 14 is preferably mapped in a time region that is 5 ns or more and less than the pulse period of the probe beam 14, and the length of the fiber body 3a is such that the spectral spectrum of the probe beam 14 is 10 ns or more. It is preferable to select so as to be mapped in a time domain less than the period. By doing in this way, it can image with sufficient sensitivity.
  • the core diameter of the fiber body 3a is not particularly limited, but is preferably 3 to 4 ⁇ m.
  • an optical fiber having a core diameter of 3 to 4 ⁇ m as the fiber body 3a, even if a pulse laser having a center wavelength near 800 nm (more specifically, a center wavelength of 750 to 850 nm) is used as the probe beam 14, mode dispersion Is sufficiently induced, and the probe beam 14 can be subjected to a dispersive Fourier transform.
  • the spatial resolution can be improved by using a pulse laser having a center wavelength of around 800 nm.
  • the pulse laser having a central wavelength of about 800 nm does not include a wavelength that is easily absorbed by water, the pulse laser is less affected by moisture during imaging. This is advantageous when imaging, or when imaging the test object 20 flowing in water in flow cytometry.
  • the collimator 3c collimates the dispersive Fourier transformed probe beam 14 incident on the collimator 3c, and emits the probe beam 14 that has become collimated light.
  • known collimators can be appropriately selected and used in accordance with the fiber body 3a.
  • the dispersive fiber 3 performs dispersive Fourier transform on the probe beam 14 and maps the spectrum of the probe beam 14 in the time domain.
  • the probe beam 14 is attenuated in the process of passing through the dispersive fiber 3, and the peak intensity is reduced. Since the imaging apparatus 1 irradiates the test object 20 with the probe beam 14 having the reduced peak intensity in this way, the influence on the test object 20 due to imaging can be suppressed.
  • the probe beam 14 is a pulsed laser light pulse and has a high peak intensity. Therefore, when the algal cell is irradiated with the probe beam 14 that does not pass through the dispersive fiber 3, the algae is irradiated. It is likely that the cell will die or be severely damaged.
  • the imaging apparatus 1 since the imaging apparatus 1 irradiates the algal cells with the probe beam 14 that has passed through the dispersive fiber 3 and is attenuated and the peak intensity is reduced, the imaging apparatus 1 can suppress the influence of the imaging on the algal cells. Images of algae cells can be generated with the cells alive.
  • the probe beam 14 subjected to the dispersive Fourier transform emitted from the other end of the dispersive fiber 3 hits the first diffraction grating 5 as a space mapping unit.
  • the first diffraction grating 5 diffracts the probe beam 14 that hits it and spectrally separates it, and irradiates the object 20 with the probe beam 14 that has been split.
  • the diffraction angle of the probe beam 14 that hits the first diffraction grating 5 differs for each wavelength component, it becomes a one-dimensional spatially spread beam, and each wavelength component is spatially mapped (Fourier transform).
  • the shape of the region (hereinafter referred to as a spot) on the surface of the object 20 where the probe beam 14 hits is linear. Since the wavelength components of the probe beam 14 are spatially mapped, the wavelength of the hit beam differs depending on the position in the spot.
  • the wavelength component contained in the probe beam 14 and the position where the probe beam 14 strikes (transmits) can be associated, and the position where the probe beam 14 passes through the test object 20 can be labeled according to the wavelength.
  • the first diffraction grating 5 is a plate-like diffraction grating having grooves formed on the surface with a density of 1200 lines / mm.
  • a diffraction grating having a diffraction efficiency of 50 to 80% can be used.
  • the diffraction grating is used as the space mapping unit, but other spectral elements such as a prism can be used instead of the diffraction grating.
  • the probe beam 14 dispersed by the first diffraction grating 5 is condensed by the first objective lens 6 and irradiated onto the test object 20.
  • the probe beam 14 irradiated to the test object 20 is scattered and diffracted in the process of passing through the test object 20, and the intensity changes according to the structure of the test object 20 at the transmitted position. Therefore, the transmitted light 15 of the test object 20 includes information on the test object 20 as the intensity of the transmitted light 15.
  • a one-dimensional image of the test object 20 can be generated by detecting the transmitted light 15 and acquiring the intensity of each wavelength component.
  • the test object 20 is not particularly limited as long as it can transmit the probe beam 14, and may be cells, algae, or the like.
  • the test object 20 is represented as a plate-like object for convenience. Such a test object 20 is disposed at the focal position of the first objective lens 6.
  • the transmitted light 15 that has passed through the test object 20 passes through the second objective lens 7, is condensed, and strikes the second diffraction grating 8.
  • the second objective lens 7 is the same objective lens as the first objective lens, and is arranged so that the focal position overlaps with the focal position of the first objective lens 6.
  • the first objective lens 6 and the second objective lens 7 used an objective lens (manufactured by Olympus) having a magnification of 40 times and a numerical aperture of 0.6.
  • the size can be appropriately selected to change the size.
  • the second diffraction grating 8 diffracts the incident transmitted light 15 and multiplexes it to make the transmitted light 15 an optical pulse.
  • the second diffraction grating 8 is the same as the first diffraction grating 5.
  • Each wavelength component of the combined transmitted light 15 is mapped in the time domain in the same manner as the probe beam 14.
  • the transmitted light 15 that has been converted into a light pulse by the second diffraction grating 8 is guided to a photodetector 10 as a beam detector via an introduction fiber 9.
  • the introduction fiber 9 includes a fiber main body 9a and a collimator 9b.
  • the fiber main body 9a has a collimator 9b attached to one end and a photodetector 10 connected to the other end.
  • the fiber body 9a a general optical fiber can be used, and the collimator 9b can be appropriately selected according to the fiber body 9a.
  • the photodetector 10 detects the transmitted light 15 that has become a light pulse before the next light pulse is received, and converts the light pulse into an electric signal pulse.
  • Newport's New ⁇ 1580-B detection bandwidth 12 GHz
  • other photo A detector may be used.
  • the electric signal pulse of the transmitted light 15 generated by the photodetector 10 is sent to the oscilloscope 11 as a digitizer connected to the photodetector 10 via the wiring 12a, and converted into electronic data for each pulse.
  • the oscilloscope 11 detected an electric signal pulse with a detection bandwidth of 16 GHz and a sampling frequency of 12.5 GS / s.
  • the electronic data includes time and the intensity of the electric signal pulse.
  • Tektronix DPO71604B is used as the oscilloscope 11, but there is no particular limitation as long as pulse signals can be digitized sequentially.
  • the electronic data of the transmitted light 15 generated by the oscilloscope 11 is sent to the PC 13 connected via the wiring 12b and stored in a storage device (not shown in FIG. 1) of the PC 13.
  • the PC 13 serving as an image generation unit executes an image processing program stored in the storage device of the PC 13 by an arithmetic unit (not shown in FIG. 1) such as a processor, and is stored in the storage device of the PC 13.
  • a one-dimensional image of the test object 20 is generated based on the electronic data of the transmitted light 15.
  • the generated one-dimensional image is stored in the storage device of the PC 13 as one-dimensional image data.
  • the pulse intensity of the transmitted light 15 includes information on the test object 20 at the position where the transmitted light 15 is transmitted, and the position where the transmitted light 15 transmits the test object 20 corresponds to the wavelength component of the transmitted light 15. ing. Furthermore, since the wavelength component of the transmitted light 15 (probe beam 14) is mapped in the time domain and corresponds to the time of the detected pulsed light, the position and time at which the transmitted light 15 has transmitted through the test object 20 are determined. It corresponds. Therefore, an image of the test object 20 can be generated from the electronic data of time and pulse intensity stored in the storage device of the PC 13. The one-dimensional image is generated based on the pulse intensity of the transmitted light 15, in which the intensity of the pulse intensity of the transmitted light 15 is expressed as the gradation of the image.
  • the image processing program processes a plurality of one-dimensional image data obtained by imaging different positions of the test object 20 and synthesizes a plurality of one-dimensional images, thereby obtaining a two-dimensional image of the test object 20. Can be generated.
  • a one-dimensional image is continuously generated while moving the test object 20 in a direction orthogonal to the linear spot of the probe beam 14 and stored as image data. It is obtained by the method.
  • the generated two-dimensional image is also stored in the storage device of the PC 13 as two-dimensional image data. Note that the number of pixels of the generated one-dimensional image or two-dimensional image can be set as appropriate.
  • the imaging apparatus 1 can image the test object 20 and generate an image (a one-dimensional image and a two-dimensional image) of the test object 20.
  • the imaging apparatus 1 of the present invention includes a probe beam generation unit (light source 2) that generates a probe beam 14 that is a light pulse by emitting a pulse laser, and a probe beam 14
  • the first objective is spatially mapped with a dispersive Fourier transform unit (dispersive fiber 3) for mapping the spectrum of the probe beam 14 in the time domain, and the dispersive Fourier transform probe beam 14 is spatially mapped.
  • a spatial mapping unit (first diffraction grating 5) that irradiates the test object 20 via the lens 6, a beam detection unit (photodetector 10) that detects the transmitted light 15 that has passed through the test object 20, and the transmitted light 15
  • An image generation unit (PC 13) for generating an image of the test object 20 based on the pulse intensity of Configured.
  • the probe beam 14 that is an optical pulse is generated by the light source 2 (probe beam generation step), the probe beam 14 is subjected to dispersive Fourier transform by the dispersive fiber 3, and the spectrum of the probe beam 14 is converted. Mapping is performed in the time domain (dispersive Fourier transform step), and the probe beam 14 subjected to dispersive Fourier transform is spatially mapped by the first diffraction grating 5 and irradiated onto the test object 20 (spatial mapping step). 10, the transmitted light 15 transmitted through the test object 20 is detected (beam detection step), and an image of the test object 20 is generated based on the transmitted light 15 (image generation step).
  • the imaging apparatus 1 spatially maps the probe beam 14 dispersive Fourier transformed by the dispersive fiber 3 in one dimension and irradiates the test object 20 to detect the transmitted light 15 from the test object 20, Since an image is generated based on the transmitted light 15, an image can be generated simply by detecting transmitted light from the test object, and an image can be generated with high throughput.
  • the imaging apparatus 1 irradiates the test object 20 with the probe beam 14 that has passed through the dispersive fiber 3 and has been subjected to the dispersive Fourier transform. 20 and the influence of the imaging on the test object 20 can be suppressed. This will be described in more detail below.
  • the intensity of the beam is attenuated.
  • the dispersive fiber 3 is disposed behind the test object 20, it is necessary to emit a laser beam having a sufficient intensity in the light source 2 in order to obtain a sufficient light intensity for detection by the photodetector 10.
  • the test object 20 is irradiated before the light is attenuated.
  • the dispersive fiber 3 in front of the test object 20, the light after the intensity is attenuated is irradiated to the test object 20. Thereby, an effect of reducing damage to the test object 20 due to light can be obtained.
  • the configuration in which the dispersive fiber 3 is disposed in front of the test object 20 also has an effect of reducing the difficulty of coupling.
  • the angle at which the light irradiated to the test object 20 is scattered varies depending on the slight displacement of the test object 20, but it is difficult to precisely determine the position of the test object 20 using a flow cytometer or the like. There is a case.
  • a very thin fiber is generally used for the dispersive fiber 3
  • the transmitted light from the test object 20 is provided there. Need to be precisely coupled. This precise coupling becomes very difficult and problematic in the situation where the position of the test object 20 is not precisely determined as described above.
  • the dispersive fiber 3 In the configuration in which the dispersive fiber 3 is disposed in front of the test object 20, it is only necessary to couple the light irradiated from the light source 2 to the dispersive fiber 3, and the accuracy is the transmitted light from the test object 20. Therefore, the alignment of the position and its stable holding are easy. Further, since the transmitted light from the test object 20 can be coupled to a thicker fiber or directly collected on the photodetector 10, the accuracy required for position alignment can be greatly reduced. it can. From this, in the configuration in which the dispersive fiber 3 is arranged in front of the test object 20, the accuracy required for optical alignment can be greatly relaxed, thereby obtaining the effect of improving the stability of the apparatus. Can do.
  • the microfluidic device 16 includes a base portion 16a made of, for example, a glass substrate and a main body 16b made of, for example, polydimethylsiloxane (PDMS) and attached to the surface of the base portion 16a.
  • a base portion 16a made of, for example, a glass substrate
  • a main body 16b made of, for example, polydimethylsiloxane (PDMS) and attached to the surface of the base portion 16a.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the main body 16b has a groove 16c having a U-shaped cross section formed on one surface.
  • the groove 16c is formed linearly along the longitudinal direction of the main body 16b.
  • the groove 16c does not penetrate the main body 16b and has an end that is a terminal end of the groove 16c.
  • a through hole (not shown in FIG. 2) penetrating from the bottom of the groove 16c to the other surface facing the one surface where the groove 16c is formed is formed at the end of the groove 16c.
  • the main body 16b has a surface on which the groove 16c is formed bonded to the base portion 16a.
  • the space surrounded by both side surfaces and the bottom surface of the groove 16c and the surface of the base portion 16a becomes a flow path through which the test object 18 can flow together with the fluid.
  • the microfluidic device 16 injects fluid from the outside to the flow path through a through hole formed in the bottom of one end of the groove 16c, and from the flow path through the through hole formed in the bottom of one end of the groove 16c. Fluid can be discharged to the outside.
  • a fluid introduction pipe 16d made of, for example, a PEEK (registered trademark) tube manufactured by UpchurchchuScientific is connected to the through hole at one end of the groove 16c, and the fluid introduction pipe is connected to the through hole at the other end of the groove 16c.
  • a fluid discharge pipe 16f made of a PEEK (registered trademark) tube similar to 16d is connected.
  • the groove 16c is manufactured so as to have a rectangular shape with a cross-sectional shape of 80 ⁇ m (width) ⁇ 70 ⁇ m (depth), but the cross-sectional shape and the cross-sectional area are not particularly limited. It can be appropriately selected depending on the size.
  • the sizes and shapes of the through hole, the fluid introduction pipe 16d, the fluid discharge pipe 16f, the base portion 16a, and the main body 16b can also be appropriately selected according to the size of the flow path to be manufactured.
  • materials for the base portion 16a, the main body 16b, the fluid introduction pipe 16d, and the fluid discharge pipe 16f can be appropriately selected.
  • the microfluidic device 16 is not particularly limited as long as it can transmit the probe beam 14 and flow the test object 18 together with the fluid, and a commercially available microfluidic device or flow cell can also be used.
  • the algae as the test object 18 flows along with the water in the flow path of the microfluidic device 16.
  • such a microfluidic device 16 has the propagation direction of the probe beam 14 (transmitted light 15) from the first objective lens 6 to the second objective lens 7 as the X direction, orthogonal to the X direction, When the direction in which the probe beam 14 is spatially spread in one dimension is the Y direction, the Z direction perpendicular to the X direction and the Y direction is parallel to the direction in which the test object 18 flows through the flow path.
  • the beam 14 is disposed so as to penetrate in the thickness direction of the microfluidic device 16.
  • the microfluidic device 16 is arranged so that the focal points of the first objective lens 6 and the second objective lens 7 are in the flow path, and the probe beam 14 passes through the test object 18 in the vicinity of the focal position. .
  • the imaging device 1 In such a flow cytometer 21, the imaging device 1 generates an image of the test object 18 that flows along with the fluid in the flow path of the microfluidic device 16. Since the test object 18 flows through the flow path of the microfluidic device 16, the position at which the probe beam 14 passes through the test object 18 is opposite to the direction in which the test object 18 flows. It gradually shifts according to the flow rate. Therefore, when the probe beam 14 is continuously generated by the light source 2 of the imaging apparatus 1 and a one-dimensional image of the test object 18 is continuously generated, the imaging position of the test object 18 is set during the period of the probe beam 14. A one-dimensional image shifted by the amount of movement of the test object 18 can be sequentially generated.
  • the flow cytometer 21 can generate a two-dimensional image of the test object 18 by synthesizing such a one-dimensional image in which the imaging position of the test object 18 is shifted.
  • the flow cytometer 21 of the present embodiment includes the imaging device 1 and the microfluidic device 16 including a flow path through which the test object 18 can flow together with the fluid.
  • the apparatus 1 is configured to generate an image of the test object 18 flowing through the flow path.
  • the flow cytometer 21 since the flow cytometer 21 generates an image of the test object 18 by the imaging apparatus 1, the influence on the test object at the time of imaging can be suppressed, and an image can be generated with high throughput.
  • the imaging apparatus 1 spatially maps the probe beam 14 in one dimension by the first diffraction grating 5 to generate a one-dimensional image. Further, the probe beam 14 mapped to 1 is further dispersed using a spectroscopic element or the like, so that the probe beam 14 is spatially mapped in two dimensions and irradiated onto the test objects 18 and 20 to generate a two-dimensional image. You can also.
  • test objects 18 and 20 are scanned with the probe beam 14 in a direction orthogonal to the linear spot of the probe beam 14, and a plurality of one-dimensional images of different positions of the test objects 18 and 20 are generated.
  • a two-dimensional image can also be generated by synthesizing the one-dimensional image.
  • the transmitted light 15 is exclusively measured, but scattered light may be measured.
  • an aperture or a slit is appropriately disposed in front of the second objective lens 7 so that light transmitted through the test objects 18 and 20 does not enter the second objective lens 7.
  • a dispersion liquid in which beads having a diameter of 10 ⁇ m formed of polystyrene were dispersed in water was injected into a syringe, and the dispersion liquid was introduced into the flow path from the opening 16e of the fluid introduction pipe 16d using a syringe pump.
  • a syringe pump was appropriately set, and the flow rate of the dispersion liquid in the flow path was set to 1 m / s.
  • a container (not shown) was disposed below the opening 16g of the fluid discharge pipe 16f, and the fluid and beads discharged from the flow path through the fluid discharge pipe 16f were stored in the container.
  • beads that flow at a flow rate of 1 m / s were imaged by the imaging device 1 to generate an image.
  • the bead image is obtained by dividing the time domain of the detected light pulse of the transmitted light 15 into 15 pieces and generating 700 pieces of one-dimensional image data (15 pixels) in a direction parallel to the Y direction shown in FIG. It was generated by synthesizing 700 one-dimensional image data.
  • FIGS. 3A and 3B The generated images are shown in FIGS. 3A and 3B.
  • the imaging apparatus 1 can generate a clear image of beads flowing at 1 m / s.
  • FIG. 3B it is possible to generate an image that can determine that a plurality of beads are bound.
  • the image is blurred because the image is blurred due to insufficient shutter speed or insufficient sensitivity. It can be seen that the state of the beads can be determined accurately even when it is determined that large particles are mixed.
  • the imaging apparatus 1 can image the test object 18 flowing at 1 m / s, and can image the test object at high speed. Further, the beads flowing through the flow path at a flow rate of 1 m / s corresponds to passing 10,000 photographing positions of the imaging device 1 per second. As described above, since the imaging apparatus can generate an image for each bead, it was confirmed that the flow cytometer 21 can generate an image with a high throughput of 10,000 images / s.

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Abstract

本発明によれば、ディスパーシブフーリエ変換部でディスパーシブフーリエ変換したプローブビーム（１４）を空間的にマッピングして被検物（１８，２０）に照射し、被検物（１８，２０）からの透過光（１５）を検出し、当該透過光（１５）の強度をもとに画像を生成するので、ディスパーシブフーリエ変換部で強度が減衰した弱いプローブビーム（１４）を被検物（１８，２０）に照射でき、被検物（１８，２０）からの透過光（１５）を検出するだけで画像を生成でき、被検物（１８，２０）への影響を抑制した画像生成のスループットの高い撮像装置を提供できる。

Description

撮像装置、フローサイトメータ及び撮像方法
　本発明は、撮像装置、フローサイトメータ及び撮像方法に関する。
　医療の分野では、採取した血液に癌細胞が含まれているか否かを検出し、癌の検出を短時間で容易に行えるようにすることが求められている。このためには、血液中に含まれる多量の細胞の中から、微量の癌細胞を短時間で検出する必要がある。
　このように、膨大な数（例えば１兆個以上）の細胞集団から、稀少な細胞を、迅速・正確かつ低コスト・低侵襲に発見し解析する装置が求められている。
　多数の細胞を個々に観察する装置として、従来からフローサイトメータが知られている（特許文献１参照）。特許文献１には、被検物を含むサンプル液が所定の流速に保たれた層流として流れるフローセルと、ストロボランプ及びバースト型のCCDイメージセンサを有する高速度カメラを含む撮像系とを備えるフローサイトメータが開示されている。特許文献１に開示されているフローサイトメータは層流が形成されたフローセル中を順番に流れる被検物を高速度カメラで測定し、個々の被検物を観察する。
特開２０１３－１６７５８２号公報
　しかしながら、特許文献１に開示されているフローサイトメータのように、従来のカメラを用いた撮像では、フローセルを流れるサンプル液の流速を早くして短時間に多くの被検物を撮影しようとしても、カメラのシャッター速度が不足してぼやけた画像となる。
　また従来のカメラを用いた撮像では、シャッタースピードを速くしてより高速に撮像できるようにすると、撮像素子が受光する光量が減少して感度が不足してノイズの多い画像となる。
　さらに従来のカメラを用いた撮像では、ストロボなどの補助光を照射することで、撮像素子が受光する光量を増加させて感度を向上させることも可能であるが、補助光の強度が強くなると、被検物が破壊されるなど被検物に悪影響が及ぶ。
　このように、従来のカメラはシャッタースピードと感度とが両立せず被検物を撮像する速度に限界があるので、特許文献１に開示されるフローサイトメータは、被検物に影響を与えることなく、画像生成のスループットを高くできないという問題があった。
　そこで、本発明は、被検物への影響を抑制した画像生成のスループットが高い撮像装置、フローサイトメータ及び撮像方法を提供することを目的とする。
　本発明の撮像装置は、プローブビームを生成するプローブビーム生成部と、前記プローブビームをディスパーシブフーリエ変換し、前記プローブビームのスペクトルを時間領域にマッピングするディスパーシブフーリエ変換部と、ディスパーシブフーリエ変換された前記プローブビームを空間的にマッピングして被検物に照射する空間マッピング部と、前記被検物を透過した透過光もしくは前記被検物により散乱された散乱光を検出するビーム検出部と、前記透過光もしくは散乱光の強度に基づいて前記被検物の画像を生成する画像生成部とを備えることを特徴とする。
　本発明のフローサイトメータは、請求項１～３のいずれか１項に記載の撮像装置と、被検物が流体と共に流れ得る流路を備えるマイクロ流体装置とを備え、前記撮像装置が前記流路を流れる前記被検物の画像を生成することを特徴とする。
　本発明の撮像方法は、プローブビームを生成するプローブビーム生成ステップと、前記プローブビームをディスパーシブフーリエ変換し、前記プローブビームのスペクトルを時間領域にマッピングするディスパーシブフーリエ変換ステップと、ディスパーシブフーリエ変換された前記プローブビームを空間的にマッピングして被検物に照射する空間マッピングステップと、前記被検物を透過した透過光もしくは前記被検物により散乱された散乱光を検出するビーム検出ステップと、前記透過光もしくは散乱光の強度に基づいて前記被検物の画像を生成する画像生成ステップとを含むことを特徴とする。
　本発明によれば、ディスパーシブフーリエ変換部でディスパーシブフーリエ変換したプローブビームを空間的にマッピングして被検物に照射し、被検物からの透過光もしくは散乱光を検出し、当該透過光もしくは散乱光をもとに画像を生成するので、ディスパーシブフーリエ変換部で強度が減衰した弱いプローブビームを被検物に照射でき、被検物からの透過光もしくは散乱光を検出するだけで画像を生成でき、被検物への影響を抑制した画像生成のスループットの高い撮像装置、フローサイトメータ及び撮像方法を提供できる。
本発明に係る実施形態の撮像装置の全体構成を示す概略図である。 本発明に係る実施形態のフローサイトメータの全体構成を示す概略図である。 図３Ａ及び図３Ｂは撮像装置により生成した流路を流れるビーズの画像である。
（１）本発明の実施形態に係る撮像装置
（１－１）撮像装置の構成
　図１に示すように、本実施形態の撮像装置１は、光源２と、ディスパージョン素子４と、ディスパーシブファイバー３と、第１回折格子５と、第２回折格子８と、第１対物レンズ６と、第２対物レンズ７と、導入ファイバー９と、フォトディテクター１０と、オシロスコープ１１と、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）１３とを備えている。
　プローブビーム生成部としての光源２は、広帯域なパルスレーザーを放出する例えばチタンサファイア（Ti:Al2O3）フェムト秒パルスレーザー（中心波長７９０ｎｍ、バンド幅４０ｎｍ、繰り返し周波数７５ＭＨｚ）などのレーザー光源であり、被検物２０の画像を生成して被検物２０を探査するためのプローブビーム１４を生成する。プローブビーム１４は光源２から所定の繰返し周波数で放出された広帯域光パルスである。
　光源２としては、上記のレーザー光源に加えて、光通信に一般的に用いられるパルスレーザーを放出するレーザー光源も用いることができ、中心波長が７２０～１６００ｎｍのパルスレーザーを放出するレーザー光源を用いることができる。
　光源２で生成されたプローブビーム１４は、プリディスパージョン部としてのディスパージョン素子４に入射する。ディスパージョン素子４は、例えばガラスなどで形成された素子で透過する光に群速度分散を生じさせる。
　ディスパージョン素子４では、プローブビーム１４が透過する過程で、プローブビーム１４に群速度分散が生じ、プローブビーム１４に含まれる各波長成分の速度が波長に応じて変化する。そのため、ディスパージョン素子４を透過する時間が波長成分ごとに異なり、ディスパージョン素子４からプローブビーム１４が出射するとき、各波長成分の位相に波長の長さに応じた遅れが生じる。その結果、ディスパージョン素子４から出射したプローブビーム１４は、ディスパージョン素子４に入射したときと比較してプローブビーム１４に含まれる波長成分の重なり合いが変化し、パルス幅が広がる。このようにディスパージョン素子４は、プローブビーム１４の波形を広げる。
　本実施形態の場合、ディスパージョン素子４は、長さが１０ｃｍで、径が０．５ｃｍのロッド形状に形成されており、プローブビーム１４が長手方向に透過するように配置されている。
　本実施形態の撮像装置１は、ディスパージョン素子４を配置することで、以下で説明するディスパーシブファイバー３において不都合な非線形光学効果が生じることを抑制し、より確実にプローブビーム１４をディスパーシブフーリエ変換することができ、被検物２０の画像をより鮮明に撮像できる。
　なお、ディスパージョン素子４の形状は特に限定されず、上記のロッド形状に加え、直方体形状や多角柱形状等であってもよい。また、ディスパージョン素子４の径は、プローブビーム１４のスポットよりも十分大きければよい。ディスパージョン素子４の長さは、どの程度プローブビーム１４のパルス幅を広げたいかによって適宜選択することができ、特に１０ｃｍ～５０ｃｍであることが好ましい。ディスパージョン素子４の長さが１０ｃｍ～５０ｃｍであると、後述するディスパーシブフーリエ変換に悪影響を及ぼす非線形効果がディスパーシブファイバー３において生じることを十分に抑制できる。
　ディスパージョン素子４を透過したプローブビーム１４は、ディスパーシブフーリエ変換部としてのディスパーシブファイバー３へ入射する。ディスパーシブファイバー３は、ファイバー本体３ａと、ファイバー本体３ａの両端にそれぞれ備えられたコリメータ３ｂ、３ｃとでなる。
　コリメータ３ｂは、コリメータ３ｂに入射したプローブビーム１４をコリメートし、コリメート光（平行光）となったプローブビーム１４をファイバー本体３ａに入射させる。
　ファイバー本体３ａは、シングルモードの光ファイバーでなる。ファイバー本体３ａでは、ファイバー本体３ａにおける光の伝搬速度が波長によって異なるため、プローブビーム１４が透過する過程でプローブビーム１４に群速度分散が生じ、プローブビーム１４の各波長成分に速度差が生じる。その結果、ディスパージョン素子４と同様にファイバー本体３ａを透過するとプローブビーム１４はパルス幅が広がる。
　ファイバー本体３ａの一端から入射したプローブビーム１４は、ファイバー本体３ａを伝搬するほど各波長成分の遅延の時間の差が大きくなってパルス幅が大きく広がる。プローブビーム１４は、ファイバー本体３ａの他端から出射するときには、各波長成分が時間軸上で分離され、プローブビーム１４のパルス形状がプローブビーム１４の分光スペクトルの形状と同様の形状になり、プローブビーム１４があたかも時間軸上にフーリエ変換されたようになる。
　このようにして、プローブビーム１４はディスパーシブフーリエ変換され、ファイバー本体３ａを透過したプローブビーム１４は各波長成分が時間領域にマッピングされる。ディスパーシブフーリエ変換されたプローブビーム１４のパルス強度は、対応する周波数成分の光の強度を表している。ファイバー本体３ａの長さを調整することで、パルスの広がり、すなわち、プローブビーム１４の分光スペクトルがマッピングされる時間領域を適宜調整できる。
　本実施形態の場合、ファイバー本体３ａとしてNufern社製630‐HP（群速度分散：120 ps/nm/km、コア径：３．５μｍ）を用い、長さを２ｋｍとすることで、ファイバー本体３ａの他端から出射されたプローブビーム１４は、分光スペクトルが約８ｎｓの時間領域にマッピングされている。
　なお、プローブビーム１４の分光スペクトルが５ｎｓ以上プローブビーム１４のパルスの周期未満の時間領域にマッピングされていることが好ましく、ファイバー本体３ａの長さは、プローブビーム１４の分光スペクトルが１０ｎｓ以上パルスの周期未満の時間領域にマッピングされるように選定されることが好ましい。このようにすることで、感度良く撮像できる。
　ファイバー本体３ａのコア径は、特に限定されないが、３～４μｍであることが望ましい。ファイバー本体３ａとしてコア径が３～４μｍの光ファイバーを用いることで、プローブビーム１４として中心波長が８００ｎｍ近傍（より具体的には中心波長が７５０～８５０ｎｍ）のパルスレーザーを用いても、モードディスパージョンが十分に誘起されプローブビーム１４をディスパーシブフーリエ変換することができる。そして、中心波長が８００ｎｍ近傍のパルスレーザーを用いることで空間分解能を向上できる。
　また、中心波長が８００ｎｍ近傍のパルスレーザーは、水に吸収され易い波長を含んでいないので、撮像時に水分の影響を受けることが少なく、特に被検物２０として水分を含むもの、例えば、細胞を撮像する場合や、フローサイトメトリーにおいて水中を流れる被検物２０を撮像する場合などに有利である。
　コリメータ３ｃは、コリメータ３ｃに入射したディスパーシブフーリエ変換されたプローブビーム１４をコリメートし、コリメート光となったプローブビーム１４を出射する。コリメータ３ｂ、３ｃはファイバー本体３ａに合わせて公知のコリメータを適宜選択して用いることができる。
　このようにして、ディスパーシブファイバー３は、プローブビーム１４をディスパーシブフーリエ変換して、プローブビーム１４の分光スペクトルを時間領域にマッピングする。
　また、プローブビーム１４はディスパーシブファイバー３を透過する過程で減衰し、ピーク強度が低下する。撮像装置１では、このようにピーク強度が低下したプローブビーム１４を被検物２０に照射するので、撮像による被検物２０への影響を抑制することができる。
　例えば、被検物２０が藻類細胞などの場合、プローブビーム１４はパルスレーザーの光パルスでありピーク強度が高いので、ディスパーシブファイバー３を透過していないプローブビーム１４を藻類細胞に照射すると、藻類細胞が死ぬ又は大きなダメージを受ける可能性が高い。
　一方、撮像装置１は、プローブビーム１４がディスパーシブファイバー３を透過して減衰し、ピーク強度が低下したプローブビーム１４を藻類細胞に照射するので、撮像による藻類細胞への影響を抑制でき、藻類細胞が生きた状態で藻類細胞の画像を生成できる。
　ディスパーシブファイバー３の他端から出射したディスパーシブフーリエ変換されたプローブビーム１４は空間マッピング部としての第１回折格子５に当たる。第１回折格子５は、当たったプローブビーム１４を回折させて空間的に分光し、分光されたプローブビーム１４を被検物２０に照射する。
　第１回折格子５に当たったプローブビーム１４は、波長成分ごとに回折角が異なるため、１次元に、空間的に広がったビームとなり、各波長成分が空間的にマッピング（フーリエ変換）される。
　このようなプローブビーム１４を被検物２０に照射すると、被検物２０表面のプローブビーム１４が当たった領域（以下、スポットという。）の形状は直線状となる。プローブビーム１４は、波長成分が空間的にマッピングされているので、スポット内の位置によって当たっているビームの波長が異なる。
　よって、プローブビーム１４に含まれている波長成分とプローブビーム１４が当たる（透過する）位置とを関連付けることができ、プローブビーム１４が被検物２０を透過する位置を波長によってラベリングできる。
　本実施形態の場合、第１回折格子５は、表面に１２００本／ｍｍの密度で溝が形成された板状の回折格子である。第１回折格子５としては、回折効率５０～８０％の回折格子を用いることができる。なお、本実施形態では、空間マッピング部として回折格子を用いたが、回折格子に変えてプリズムなど他の分光素子を用いることができる。
　第１回折格子５で分光されたプローブビーム１４は第１対物レンズ６で集光されて被検物２０に照射される。被検物２０に照射されたプローブビーム１４は、被検物２０を透過する過程で、散乱され、回折され、透過した位置の被検物２０の構造に応じて強度が変化する。そのため、被検物２０の透過光１５には、被検物２０の情報が透過光１５の強度として含まれている。
　プローブビーム１４が透過する位置が波長によってラベリングされているので、透過光１５を検出して、各波長成分の強度を取得することで、被検物２０の１次元画像を生成することができる。
　本実施形態の場合、被検物２０は、プローブビーム１４を透過できるものであれば特に限定されず、細胞や藻類などであってもよい。図１では、便宜的に被検物２０を板状の物体として表している。このような被検物２０は、第１対物レンズ６の焦点位置に配置される。
　被検物２０を透過した透過光１５は、第２対物レンズ７を透過し、集光されて第２回折格子８に当たる。第２対物レンズ７は、第１対物レンズと同じ対物レンズであり、焦点位置が第１対物レンズ６の焦点位置と重なるように配置されている。本実施形態の場合、第１対物レンズ６及び第２対物レンズ７は倍率４０倍、開口数０．６の対物レンズ（オリンパス社製）を用いたが、被検物２０のサイズに合わせてスポットのサイズを変更するために適宜選択することができる。
　第２回折格子８は、当たった透過光１５を回折させて合波し、透過光１５を光パルスにする。本実施形態の場合、第２回折格子８は、第１回折格子５と同じものを使用している。合波された透過光１５は、プローブビーム１４と同様に、各波長成分が時間領域にマッピングされている。
　第２回折格子８で光パルスにされた透過光１５は、導入ファイバー９を介してビーム検出部としてのフォトディテクター１０に導かれる。導入ファイバー９は、ファイバー本体９ａとコリメータ９ｂとでなる。ファイバー本体９ａは、一端にコリメータ９ｂが取り付けられ、他端にフォトディテクター１０が接続されている。
　ファイバー本体９ａとしては、一般的な光ファイバーを用いることができ、コリメータ９ｂはファイバー本体９ａに合わせて適宜選択できる。
　フォトディテクター１０は、光パルスとなった透過光１５を次の光パルスがくるまでに検出し、当該光パルスを電気信号パルスに変換する。本実施形態の場合、フォトディテクター１０としてNewport社製New Focus 1580‐B（検出帯域幅１２ＧＨｚ）を用いたが、透過光１５のパルスを検出して電気信号に変換することができれば、他のフォトディテクターを用いてもよい。
　フォトディテクター１０で生成された透過光１５の電気信号パルスは、配線１２ａを介してフォトディテクター１０に接続されたデジタイザとしてのオシロスコープ１１に送出され、パルス毎に電子データに変換される。オシロスコープ１１では、検出帯域幅１６ＧＨｚ、サンプリング周波数１２．５ＧＳ／ｓで電気信号パルスを検出した。電子データには、時間と電気信号パルスの強度が含まれている。本実施形態の場合、オシロスコープ１１として、Tektronix社製のDPO71604Bを用いたが、パルス信号を順次デジタイズすることができれば、特に限定されない。
　オシロスコープ１１で生成された透過光１５の電子データは、配線１２ｂを介して接続されたＰＣ１３に送出され、ＰＣ１３の記憶装置（図１には図示せず）に保存される。
　画像生成部としてのＰＣ１３は、例えばプロセッサなどでなるＰＣ１３の演算部（図１には図示せず）によって、ＰＣ１３の記憶装置に保存された画像処理プログラムを実行し、ＰＣ１３の記憶装置に保存された透過光１５の電子データに基づいて被検物２０の１次元画像を生成する。生成された１次元画像は、１次元画像データとしてＰＣ１３の記憶装置に保存される。
　透過光１５のパルス強度に透過光１５が透過した位置の被検物２０の情報が含まれており、透過光１５が被検物２０を透過した位置と透過光１５の波長成分とが対応している。さらに、透過光１５（プローブビーム１４）の波長成分は時間領域にマッピングされており検出したパルス光の時間と対応しているので、透過光１５が被検物２０を透過した位置と時間とが対応している。よって、ＰＣ１３の記憶装置に保存した時間及びパルス強度の電子データから被検物２０の画像を生成することができる。１次元画像は、透過光１５のパルス強度の強弱が画像の階調として表され、透過光１５のパルス強度に基づいて生成される。
　さらに、画像処理プログラムは、被検物２０の異なる位置を撮像して得られた複数の１次元画像データを処理して複数の１次元画像を合成することで、被検物２０の２次元画像を生成することができる。
　合成に用いる複数の１次元画像データは、例えば、プローブビーム１４の直線状のスポットと直交する方向に被検物２０を動かしつつ１次元画像を連続して生成し、それぞれ画像データとして保存するなどの方法で得られる。生成された２次元画像も、２次元画像データとしてＰＣ１３の記憶装置に保存される。なお、生成する１次元画像又は２次元画像のピクセル数は、適宜設定することができる。
　このようにして、撮像装置１は、被検物２０を撮像し、被検物２０の画像（１次元画像及び２次元画像）を生成できる。
（１－２）作用及び効果
　以上の構成において、本発明の撮像装置１は、パルスレーザーを放出して光パルスであるプローブビーム１４を生成するプローブビーム生成部（光源２）と、プローブビーム１４をディスパーシブフーリエ変換し、プローブビーム１４のスペクトルを時間領域にマッピングするディスパーシブフーリエ変換部（ディスパーシブファイバー３）と、ディスパーシブフーリエ変換されたプローブビーム１４を空間的にマッピングし、第１対物レンズ６を介して被検物２０に照射する空間マッピング部（第１回折格子５）と、被検物２０を透過した透過光１５を検出するビーム検出部（フォトディテクター１０）と、透過光１５のパルス強度に基づいて被検物２０の画像を生成する画像生成部（ＰＣ１３）とを備えるように構成した。
　そして本発明の撮像装置１では、光源２で光パルスであるプローブビーム１４を生成し（プローブビーム生成ステップ）、ディスパーシブファイバー３でプローブビーム１４をディスパーシブフーリエ変換し、プローブビーム１４のスペクトルを時間領域にマッピングし（ディスパーシブフーリエ変換ステップ）、ディスパーシブフーリエ変換されたプローブビーム１４を第１回折格子５で空間的にマッピングして被検物２０に照射し（空間マッピングステップ）、フォトディテクター１０で被検物２０を透過した透過光１５を検出し（ビーム検出ステップ）、透過光１５に基づいて被検物２０の画像を生成する（画像生成ステップ）。
　よって撮像装置１は、ディスパーシブファイバー３でディスパーシブフーリエ変換したプローブビーム１４を１次元に空間的にマッピングして被検物２０に照射し、被検物２０からの透過光１５を検出し、当該透過光１５をもとに画像を生成するので、被検物からの透過光を検出するだけで画像を生成でき、画像を高スループットに生成できる。
　さらに撮像装置１は、ディスパーシブファイバー３を透過してディスパーシブフーリエ変換されたプローブビーム１４を被検物２０に照射するので、ディスパーシブファイバー３で強度が減衰した弱いプローブビーム１４を被検物２０に照射でき、撮像による被検物２０への影響を抑制できる。以下により詳しく説明する。ディスパーシブファイバー３を通過することでビームの強度は減衰する。ディスパーシブファイバー３を被検物２０の後に配置する構成では、フォトディテクター１０での検出に十分な光強度を得るために、光源２において十分な強度のレーザー光を発する必要があり、その高い強度の光が減衰される前に被検物２０に照射されることになる。このことは、特に被検物２０が生細胞などの場合において、被検物２０へのダメージが問題となることがある。ここではディスパーシブファイバー３を被検物２０の前に配置することで、強度が減衰した後の光が被検物２０に照射される。これによって光による被検物２０へのダメージを軽減する効果が得られる。
　また、ディスパーシブファイバー３を被検物２０の前に配置する構成では、カップリングの難しさを軽減する効果も有する。被検物20に照射された光は、その被検物20の微妙な位置のずれによって散乱される角度が変わるが、フローサイトメータなどにおいてその被検物２０の位置を厳密に定めることは難しい場合がある。他方、ディスパーシブファイバー３には一般に非常に細いものが用いられることが想定されるため、ディスパーシブファイバー３を被検物２０の後に配置する場合においては、そこに被検物２０からの透過光を精密にカップリングする必要がある。この精密なカップリングは、先に述べた通り被検物２０の位置が精密に定まらない状況においては非常に難しくなり問題となる。ディスパーシブファイバー３を被検物２０の前に配置する構成では、ディスパーシブファイバー３に対しては光源２から照射された光をカップリングすればよく、その精度は被検物２０からの透過光と比較して変動が少ないことから位置のアラインメントとその安定的な保持が容易となる。また被検物２０からの透過光は、より太いファイバーにカップリングするか、あるいは直接フォトディテクター１０に集光することができるため、位置のアラインメントに要求される正確性を大幅に緩和することができる。このことから、ディスパーシブファイバー３を被検物２０の前に配置する構成では、光学アライメントに要求される精度を大幅に緩和することができ、これによって装置の安定性向上などの効果を得ることができる。
（２）本発明の実施形態に係るフローサイトメータ
（２－１）フローサイトメータの構成
　図１と同様の構成には同様の符号を付した図２に示すように、フローサイトメータ２１は、本実施形態の撮像装置１とマイクロ流体装置１６とを備えている。
　マイクロ流体装置１６は、例えばガラス基板などでなる基部１６ａと、例えばポリジメチルシロキサン（PDMS）でなり、基部１６ａ表面に貼り付けられた本体１６ｂとを備えている。
　本体１６ｂは断面形状がコの字型の溝１６ｃが一表面に形成されている。溝１６ｃは、本体１６ｂの長手方向に沿って直線状に形成されている。溝１６ｃは、本体１６ｂを貫通しておらず、溝１６ｃの終端である端部を有している。溝１６ｃの端部には、溝１６ｃの底部から溝１６ｃが形成された一表面と対向する他表面へと貫通する貫通穴（図２には図示せず）が形成されている。本体１６ｂは、溝１６ｃが形成された面が基部１６ａと貼り合わされている。
　そのためマイクロ流体装置１６では、溝１６ｃの両側面及び底面と基部１６ａの表面とで囲まれた空間が、流体と共に被検物１８が流れることができる流路となる。マイクロ流体装置１６は、溝１６ｃの一端の底部に形成された貫通穴を介して外部から流路へと流体を注入し、溝１６ｃの一端の底部に形成された貫通穴を介して流路から外部へと流体を排出できる。
　本実施形態の場合、溝１６ｃの一端の貫通穴には例えばUpchurch Scientific社製のPEEK（登録商標）チューブでなる流体導入管１６ｄが接続され、溝１６ｃの他端の貫通穴には流体導入管１６ｄと同様のPEEK（登録商標）チューブでなる流体排出管１６ｆが接続されている。流体導入管１６ｄを設けることで、流体導入管１６ｄの一端の開口１６ｅから流体を導入でき、マイクロ流体装置１６の流路に流体を導入し易くしなっている。また、流体排出管１６ｆを設けることで、流体排出管１６ｆの一端の開口１６ｇから流体を排出でき、マイクロ流体装置１６の流路を流れた流体を回収し易くなっている。
　本実施形態の場合、溝１６ｃは、断面形状が８０μｍ（幅）×７０μｍ（深さ）の長方形状となるように作製したが、断面形状及び断面積は特に限定されず、被検物１８のサイズに応じて適宜選択できる。貫通穴、流体導入管１６ｄ、流体排出管１６ｆ、基部１６ａ、及び本体１６ｂのサイズや形状も作製する流路のサイズに合わせて適宜選択できる。また、基部１６ａ、本体１６ｂ、流体導入管１６ｄ、流体排出管１６ｆの素材も適宜選択できる。マイクロ流体装置１６としては、プローブビーム１４を透過でき、被検物１８を流体と共に流すことができれば特に限定されず、市販のマイクロ流体装置やフローセルを用いることもできる。
　なお、本実施形態では、マイクロ流体装置１６の流路を被検物１８としての藻類が水と共に流れている。
　フローサイトメータ２１では、このようなマイクロ流体装置１６が、第１対物レンズ６から第２対物レンズ７へのプローブビーム１４（透過光１５）の伝搬方向をＸ方向とし、Ｘ方向と直交し、プローブビーム１４が１次元に空間的に広がっている方向をＹ方向としたとき、Ｘ方向及びＹ方向に対して垂直なＺ方向と被検物１８が流路を流れる方向とが平行となり、プローブビーム１４がマイクロ流体装置１６の厚さ方向に透過するように配置されている。また、マイクロ流体装置１６は、第１対物レンズ６及び第２対物レンズ７の焦点が流路内にあり、プローブビーム１４が当該焦点位置近傍で被検物１８を透過するように配置されている。
　このようなフローサイトメータ２１では、撮像装置１は、マイクロ流体装置１６の流路を流体と共に流れる被検物１８の画像を生成する。被検物１８がマイクロ流体装置１６の流路を流れるので、プローブビーム１４が被検物１８を透過する位置が、被検物１８が流れる方向とは反対の方向に、流路を流れる流体の流速に応じて徐々にずれる。そのため、撮像装置１の光源２でプローブビーム１４を連続して生成し、被検物１８の１次元画像を連続して生成すると、被検物１８の撮影位置がプローブビーム１４の周期の間に被検物１８が移動した分だけずれた１次元画像を順次生成できる。
　フローサイトメータ２１では、このような被検物１８の撮影位置がずれた１次元画像を合成することで、被検物１８の２次元画像を生成できる。
（２－２）作用及び効果
　以上の構成において、本実施形態のフローサイトメータ２１は、撮像装置１と、被検物１８が流体と共に流れ得る流路を備えるマイクロ流体装置１６とを備え、撮像装置１が流路を流れる被検物１８の画像を生成するように構成した。
　よって、フローサイトメータ２１は、撮像装置１によって被検物１８の画像を生成するので、撮像時の被検物への影響を抑制でき、高スループットに画像を生成できる。
（３）他の実施形態
　上記の実施形態では、撮像装置１が第１回折格子５によってプローブビーム１４を１次元に空間的にマッピングし、１次元画像を生成した場合について説明したが、１次元にマッピングしたプローブビーム１４をさらに分光素子などを用いて分光することで、プローブビーム１４を２次元に空間的にマッピングして被検物１８，２０に照射して、２次元画像を生成することもできる。
　また、プローブビーム１４の直線状のスポットと直交する方向に、被検物１８，２０をプローブビーム１４で走査し、被検物１８，２０の異なる位置の１次元画像を複数生成し、複数の１次元画像を合成することでも２次元画像を生成することができる。
　上記の実施形態では、専ら透過光１５を測定したが、散乱光を測定してもよい。その場合には、被検物１８，２０を透過した光が第２対物レンズ７に入らないように適宜絞り又はスリットを第２対物レンズ７の前に配置する。
（４）検証試験
　本実施形態のフローサイトメータ２１を使用して被検物１８としてのビーズの画像を生成した。
　検証試験では、ポリスチレンで形成された直径１０μｍのビーズを水に分散させた分散液をシリンジに注入し、シリンジポンプを用いて流体導入管１６ｄの開口１６ｅから流路に分散液を導入した。このとき、シリンジポンプを適宜設定し、流路内の分散液の流速を１ｍ／ｓとした。図示しない容器を流体排出管１６ｆの開口１６ｇの下部に配置し、当該容器内に流路からから流体排出管１６ｆを介して排出された流体とビーズを貯め置いた。
　検証試験では、流路を１ｍ／ｓの流速で流れるビーズを撮像装置１によって撮像し、画像を生成した。ビーズの画像は、検出した透過光１５の光パルスの時間領域を１５分割し、図２中に示すＹ方向と平行な方向の１次元画像データ(１５ピクセル)を連続して７００個生成し、７００個の１次元画像データを合成することで、生成した。
　生成した画像を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａに示すように、撮像装置１は、１ｍ／ｓで流れるビーズの鮮明な画像を生成できることがわかる。また、図３Ｂに示すように、複数のビーズが結合していることが判別できる画像も生成でき、従来はシャッタースピードが足らなかったり、感度が足らなかったりして画像がぼやけているためにサイズの大きな粒子が混在していると判断されるような場合も、正確にビーズの状態を判別できることがわかる。
　このように撮像装置１は、１ｍ／ｓで流れる被検物１８を撮像でき、被検物を高速に撮像できることが確認できた。また、１ｍ／ｓの流速で流路を流れるビーズは、撮像装置１の撮影位置を毎秒１０，０００個通過することに相当する。上記の様に、撮像装置はビーズ１つ１つの画像を生成できるので、フローサイトメータ２１は、１０，０００画像／ｓの高スループットで画像を生成できることが確認できた。
　１　　撮像装置
　２　　光源
　３　　ディスパーシブファイバー
　４　　ディスパージョン素子
　５　　第１回折格子
　１０　フォトディテクター
　１３　ＰＣ
　１６　マイクロ流体装置
　１８　被検物
　２０　被検物
　２１　フローサイトメータ

Claims (6)

  1. 　プローブビームを生成するプローブビーム生成部と、
    　前記プローブビームをディスパーシブフーリエ変換し、前記プローブビームのスペクトルを時間領域にマッピングするディスパーシブフーリエ変換部と、
    　ディスパーシブフーリエ変換された前記プローブビームを空間的にマッピングして被検物に照射する空間マッピング部と、
    　前記被検物を透過した透過光もしくは前記被検物により散乱された散乱光を検出するビーム検出部と、
    　前記透過光もしくは散乱光の強度に基づいて前記被検物の画像を生成する画像生成部と
    　を備えることを特徴とする撮像装置。
  2. 　前記プローブビーム生成部で生成された前記プローブビームの波形を広げるプリディスパージョン部を備える
    　ことを特徴とする請求項１に記載の撮像装置。
  3. 　前記ディスパーシブフーリエ変換部は、光ファイバーを備え、
    　前記光ファイバーのコアの径が７５０～８５０ｍｍである
    　ことを特徴とする請求項１又は２に記載の撮像装置。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の撮像装置と、
    　被検物が流体と共に流れ得る流路を備えるマイクロ流体装置とを備え、
    　前記撮像装置が前記流路を流れる前記被検物の画像を生成する
    　ことを特徴とするフローサイトメータ。
  5. 　前記画像生成部が、前記流路を流れる前記被検物の１次元画像を連続して生成し、生成した複数の１次元画像を合成して前記被検物の２次元画像を生成する
    　ことを特徴とする請求項４に記載のフローサイトメータ。
  6. 　プローブビームを生成するプローブビーム生成ステップと、
    　前記プローブビームをディスパーシブフーリエ変換し、前記プローブビームのスペクトルを時間領域にマッピングするディスパーシブフーリエ変換ステップと、
    　ディスパーシブフーリエ変換された前記プローブビームを空間的にマッピングして被検物に照射する空間マッピングステップと、
    　前記被検物を透過した透過光もしくは前記被検物により散乱された散乱光を検出するビーム検出ステップと、
    　前記透過光もしくは散乱光の強度に基づいて前記被検物の画像を生成する画像生成ステップと
    　を含むことを特徴とする撮像方法。
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