CN104480053B - 一株根结线虫生防细菌、生防菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株根结线虫生防细菌、生防菌剂及其应用。该生防细菌为雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06，保藏编号为CGMCC No.10246。本发明利用雷氏普罗威登斯菌UN06菌株发酵获得的发酵液与菌渣、草炭等吸附载体和菌体生长所需的营养物质尿素混合均匀后造粒制成UN06颗粒剂。每亩施用100公斤UN06颗粒剂对番茄根结线虫、黄瓜根结线虫、烟草根结线虫的防效在分别为90.17％、88.66％和85.98％。本发明的根结线虫病生防菌剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是防治根结线虫病的高效生物农药。
Description
技术领域
本发明涉及一株根结线虫生防细菌、生防菌剂及其在防治根结线虫病防治中的应用，属于微生物农药技术领域。
背景技术
作物病原线虫引起的病害已成为农业生产中的第二大类病害。全球每年因作物病原线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元(Abad P,Gouzy J,Aury JM.etal.2008.Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyneincognita.Nat.Biotechnol.26(8):909-15.doi:10.1038/nbt.1482.)，其中危害最重、造成损失最大的是根结线虫，根结线虫可危害粮食、油料、蔬菜、烟草、水果等3000多种植物。根结线虫以二龄幼虫侵染作物根系并诱导植物组织线虫根瘤，根瘤的形成阻碍了植物从土壤中吸收营养和水分；此外，根结线虫的侵染造成伤口和降低植物抗性，有利于土壤中其它植物病原菌的侵染，因此容易导致根结线虫病与其它植物病害的复合发生，造成更大的损失(Bird DM and Kaloshian I.2003.Are roots special？Nematodes have theirsay.Physiol.Mol.Plant Pathol.62:115-123.)。
蔬菜是我国第一大经济作物和最大的出口创汇农产品。据不完全统计，2008年全国设施蔬菜面积已达5020万亩，面积仍在不断增加。由于设施大棚高温、多年连茬等因素，近年来大棚蔬菜根结线虫危害猖獗失控，给蔬菜生产带来严重损失。发病地块一般减产20％以上，严重的达75％甚至绝收。据估算，我国蔬菜每年因根结线虫危害造成的损失超过50亿元。
烟草是中国多个省份经济的重要支柱产业，2012年全国烟草种植面积2118万亩。目前，除东北外，烟草根结线虫在全国各主要产烟区都有发生，在云、贵、川等西南省份的山地烟区法宝尤为严重，一般发病田减产3～4成，重病田减产6～7成。
长期以来，对作物病原线虫的防治主要依靠化学农药，但由于化学杀线虫剂高毒性，造成农产品和生态污染问题非常突出。根据保护臭氧层的“蒙特利尔议定书”国际条约，发达国家已于2005年全面禁用使用最广泛的化学杀线虫剂溴甲烷，发展中国家将于2015年全面禁用(Ristaino J,Thomas W.1998.Agriculture,methyl bromide and the ozonehole:can we fill the gap Plant Dis.81:964-997.)。目前，灭线磷、溴甲烷、涕灭威等化学杀线虫剂在国内几乎都被禁用或限制使用。由此导致可选用的化学杀线虫剂种类更少，加剧了线虫防治的困难。
生物农药具有安全、有效、无污染等特点，利用生防微生物研发生物农药具有广阔的发展前景。目前国内外有不少防治线虫的生物农药品种问世，并且有些生物农药已经在局部地区使用。根结线虫和孢囊线虫侵染作物根部，由作物根际、病原线虫、土著微生物及其环境因子构成的复杂生态系统直接影响到生防微生物的根际定殖和防效。因土壤抑菌作用(fungistasis of soil)导致的防效不稳定已严重制约了病原线虫生物农药的产业化推广。如何克服土壤抑菌作用对生防制剂田间萌发、定殖生态的影响，是线虫生防乃至整个植物病虫害生物防治领域亟待解决的关键科学问题。雷氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)是一种具有异氧脱氮性能的细菌，在生物除氮和解决水体富营养化方面有应用前景(Taylor SM,He YL,Zhao B,Huang J.2009.Heterotrophic ammonium removalcharacteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifyingbacterium,Providencia rettgeri YL.Journal of Environmental Sciences,21:1336-1341.)。该微生物杀线虫方面的特性未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株对根结线虫病有高效杀灭活性的生防细菌—雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06。温室试验和田间试验的结果表明：该生防细菌对根结线虫病有很好的防治效果，具备研发成根结线虫病生物农药并产业化推广应用的前景。
本发明具体是这样实现的：本发明人从山东寿光大棚番茄健康植株的茎部分离到一株根结线虫生防细菌—雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06。该菌株已于2014年12月26日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.10246。该菌株具有以下生物学特性：在AMS培养基平板上，菌落乳白色，直径2mm、半透明、圆形、光滑。菌体杆状，大小为0.5μm×0.8-1.5μm，最适生长温度为28℃，最适生长pH值为7。
雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06的培养方法或繁殖方法为：
(1)普通培养保存采用牛肉膏蛋白胨固体培养基，配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，水1000mL，pH 7.2-7.4；
(2)实验室液体培养采用牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.2-7.4；
(3)大量发酵采用SRC培养基，配方为：蔗糖12.5g，大米粉50g，蟹壳粉37.5g，NaCl2.5g，MgSO41.25g，KH2PO42.5g，加水定容到1000ml，pH 6.5。
本发明还提供了一种包括上述雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06的生防菌剂。
上述生防菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)斜面种子培养：将雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06的菌体移到牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，15-40℃下培养1-5天后获得斜面种子；
(2)液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，15-40℃，50-350rpm条件下摇床培养2-7天；
(3)发酵罐大量培养：将液体种子按1-5％(V/V)的比例接入发酵罐中的SRC培养基中于发酵罐中培养；培养条件为：温度26-37℃，搅拌速度150-250rpm，发酵时间2-4天；上述发酵液可以制成各种生物防治制剂，如颗粒剂、可湿性粉剂等；
(4)颗粒剂的制备：每50升发酵液加入40-90公斤食用菌菌渣、10-30公斤尿素、5-20公斤草炭；充分混匀后用造粒机制成直径1-3mm，长度2-4mm的圆柱状颗粒，颗粒在65-100℃下烘干或自然晒干至水分含量小于10％，即制成UN06颗粒剂。
上述步骤(1)最适宜的培养条件是36℃下培养2天。
上述步骤(2)最适宜的培养条件为36℃，200rpm条件下摇床培养3天。
上述步骤(3)最适宜的培养条件为32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间3天。
上述步骤(4)最适宜的比例为：每50升发酵液加入70公斤食用菌菌渣、20公斤尿素和10公斤草炭。
本发明还提供了雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06制备的生防菌剂在防治根结线虫病方面的应用，上述根结线虫为番茄根结线虫、黄瓜根结线虫、丝瓜根结线虫、苦瓜根结线虫或者烟草根结线虫等。
本发明利用雷氏普罗威登斯菌UN06菌株制备的生防菌剂对防治番茄根结线虫，黄瓜根结线虫、丝瓜根结线虫、苦瓜根结线虫、烟草根结线虫的防效在80％以上。每亩施用100公斤UN06颗粒剂对番茄根结线虫、黄瓜根结线虫、烟草根结线虫的防效在分别为90.17％、88.66％和85.98％。利用雷氏普罗威登斯菌UN06菌株制备的生防菌剂主要在移栽期混土并结合穴施施用，也可在成株期穴施使用。使用时将雷氏普罗威登斯菌UN06菌株制备的生防菌剂施入作物根际周围或兑水灌根。雷氏普罗威登斯菌UN06菌株制备的生防菌剂对根结线虫病重灾区，移栽期和成株期分别施用一次效果最好。
本发明利用雷氏普罗威登斯菌UN06菌株制备的生防菌剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是茄科作物，特别是设施大棚的茄科蔬菜种植中防治根结线虫病的高效生物农药。
具体实施方式
实施例1：雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06菌株的分离
本发明人从山东寿光大棚番茄的茎部利用选择性培养基分离、纯化出一批内生细菌，经过对根结线虫的生物测定后筛选出高效杀灭根结线虫的雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06。该菌株已于2014年12月26日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.10246。
该菌株的生物学特性如下：在AMS培养基平板上菌落乳白色，直径2mm、半透明、圆形、光滑。菌体杆状，大小为0.5μm×0.8-1.5μm，最适生长温度为28℃，最适生长pH值为7。AMS培养基，配方为：牛肉膏5g，蛋白胨2g，MgSO4.7H2O 1g，CaCl20.2g，EDTA 0.004g，NH4Cl0.5g，FeSO4·7H2O 0.02g，MnCl2·H2O 0.01g，ZnSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，补水至1000ml，pH6.8。
该菌株的分子生物学特性如下：该菌株的16S rRNA基因(SEQ-1)，已提交到GeneBank公共数据库，其序列号为KP277112，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。
实施例2：雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06生防菌剂的制备
牛肉膏蛋白胨固体培养基，配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，水1000mL，pH 7.2-7.4；
牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.2-7.4；
SRC培养基，配方为：蔗糖12.5g，大米粉50g，蟹壳粉37.5g，NaCl 2.5g，MgSO41.25g，KH2PO42.5g，加水定容到1000ml，pH 6.5。
制备方法，具体包括以下步骤：
(1)斜面种子培养：将该菌株的菌体移到牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，36℃下培养2天后获得斜面种子；
(2)液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，36℃，200rpm条件下摇床培养3天；
(3)发酵罐大量培养：将液体种子按3％(V/V)的比例接入发酵罐中的SRC培养基中，在20-1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间3天；
(4)颗粒剂的制备：在50升经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物中加入70公斤食用菌菌渣、20公斤纯度为99.9％的尿素和10公斤草炭。混合物充分混匀后用造粒机制成直径1-3mm，长度2-4mm的圆柱状颗粒，颗粒在65-100℃下烘干或自然晒干至水分含量小于10％，即制成UN06颗粒剂。菌剂需保证UN06菌体的活菌数含量在1×109个/克以上。
实施例3：UN06颗粒剂防治大棚番茄根结线虫的田间试验
试验地点：山东省寿光市蔬菜大棚。
试验作物：番茄(品种：粉都-80)。
供试药剂：a.活菌数含量为3.6×109个/克的UN06颗粒剂；b.2％阿维菌素乳油。
试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复120株番茄。
处理1：100公斤/亩UN06颗粒剂。整地时，按75公斤/亩的用量将UN06颗粒剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中；移栽时每株10克UN06颗粒剂穴施于根部(每亩按2500株计算，穴施用量为25公斤/亩)。
处理2：2％阿维菌素乳油兑水稀释1000倍灌根。
处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照。
调查和统计方法：180天后调查植株根瘤病级指数(0级：无根瘤；1级：1-20％的根系有根瘤；2级：21-40％的根系有根瘤；3级：41-60％的根系有根瘤；4级：61-80％的根系有根瘤；5级：81-100％的根系有根瘤)，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100，n1-n5分别代表根瘤病级指数1-5级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别处理和对照的病情指数。
试验结果：表1显示每亩施用100公斤UN06颗粒剂对番茄根结线虫的防效高达90.17％，显著高于施用2％阿维菌素乳油的对照(81.68％)。
表1 UN06颗粒剂对大棚番茄根结线虫的防效
实施例4：UN06颗粒剂防治大棚黄瓜根结线虫的田间试验
试验地点：山东省寿光市蔬菜大棚。
试验作物：黄瓜(品种：中农203)。
供试药剂：a.活菌数含量为3.6×109个/克的UN06颗粒剂；b.2％阿维菌素乳油。
试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复120株番茄。
处理1：100公斤/亩UN06颗粒剂。整地时，按85公斤/亩的用量将UN06颗粒剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中；移栽时每株10克UN06颗粒剂穴施于根部(每亩按1500株计算，穴施用量为15公斤/亩)。
处理2：2％阿维菌素乳油兑水稀释1000倍灌根。
处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照。
调查和统计方法：150天后调查植株根瘤病级指数(0级：无根瘤；1级：1-20％的根系有根瘤；2级：21-40％的根系有根瘤；3级：41-60％的根系有根瘤；4级：61-80％的根系有根瘤；5级：81-100％的根系有根瘤)，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100，n1-n5分别代表根瘤病级指数1-5级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别处理和对照的病情指数。
试验结果：表2显示每亩施用100公斤UN06颗粒剂对黄瓜根结线虫的防效高达88.66％，与施用2％阿维菌素乳油的对照防效(86.69％)相当。
表2 UN06颗粒剂对大棚黄瓜根结线虫的防效
实施例5：UN06颗粒剂防治烟草根结线虫的田间试验
试验地点：云南省玉溪市峨山县。
试验作物：烟草(品种：K326)。
供试药剂：a.活菌数含量为3.6×109个/克的UN06颗粒剂；b.2％阿维菌素乳油。
试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复120株番茄。
处理1：100公斤/亩UN06颗粒剂。整地时，按87公斤/亩的用量将UN06颗粒剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中；移栽时每株10克UN06颗粒剂穴施于根部(每亩按1300株计算，穴施用量为13公斤/亩)。
处理2：2％阿维菌素乳油兑水稀释1000倍灌根。
处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照。
调查和统计方法：120天后调查植株根瘤病级指数(0级：无根瘤；1级：1-20％的根系有根瘤；2级：21-40％的根系有根瘤；3级：41-60％的根系有根瘤；4级：61-80％的根系有根瘤；5级：81-100％的根系有根瘤)，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100，n1-n5分别代表根瘤病级指数1-5级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别处理和对照的病情指数。
试验结果：表3显示每亩施用100公斤UN06颗粒剂对烟草根结线虫的防效高达85.98％，约高于施用2％阿维菌素乳油的对照(83.42％)。
表3 UN06颗粒剂对烟草根结线虫的防效
Claims (10)
1.一株根结线虫生防细菌，它为雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株UN06，该菌株的保藏编号为CGMCC No.10246。
2.一种生防菌剂，包括权利要求1所述的雷氏普罗威登斯菌菌株UN06。
3.权利要求2所述的生防菌剂的制备方法，其特征是，具体包括以下步骤：
(1)斜面种子培养：将雷氏普罗威登斯菌菌株UN06的菌体移到牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，15-40℃下培养1-5天后获得斜面种子；
(2)液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，15-40℃，搅拌转速50-350rpm条件下摇床培养2-7天；
(3)发酵罐大量培养：将液体种子按体积比1-5％的比例接入发酵罐中的SRC培养基中于发酵罐中培养；培养条件为：温度26-37℃，搅拌速度150-250rpm，发酵时间2-4天；所述SRC培养基为：蔗糖12.5g，大米粉50g，蟹壳粉37.5g，NaCl 2.5g，MgSO41.25g，KH2PO42.5g，加水定容到1000ml，pH 6.5。
4.如权利要求3所述的生防菌剂的制备方法，其特征是，每50升发酵液加入40-90公斤食用菌菌渣、10-30公斤尿素和5-20公斤草炭；混匀后用造粒机制成直径1-3mm，长度2-4mm的圆柱状颗粒，颗粒在65-100℃下烘干或自然晒干至水分含量小于10％，即制成生防菌剂的颗粒剂。
5.如权利要求4所述的生防菌剂的制备方法，其特征是，每50升发酵液加入70公斤食用菌菌渣、20公斤尿素和10公斤草炭。
6.如权利要求3-5中任意一项所述的生防菌剂的制备方法，其特征是，所述步骤(1)培养条件为：36℃下培养2天。
7.如权利要求3-5中任意一项所述的生防菌剂的制备方法，其特征是，所述步骤(2)的培养条件为：36℃，搅拌速度200rpm条件下摇床培养3天。
8.如权利要求3-5中任意一项所述的生防菌剂的制备方法，其特征是，所述步骤(3)的培养条件为：32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间3天。
9.权利要求2所述的生防菌剂在防治根结线虫病方面的应用。
10.如权利要求9所述的生防菌剂在防治根结线虫病方面的应用，其特征是，所述根结线虫为番茄根结线虫、黄瓜根结线虫、丝瓜根结线虫、苦瓜根结线虫或者烟草根结线虫。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Private Industrial Park in Yiyuan County of Shandong Province, Zibo City, 256100 Applicant after: SHANDONG TAIBAO BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 250014 Shandong Province, Lixia District of Ji'nan City Ring Road No. 37 Applicant before: SHANDONG TAIBAO BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Biocontrol Bacterium, biocontrol agent and application of root knot nematode Effective date of registration: 20211122 Granted publication date: 20180724 Pledgee: Commercial Bank of China Yiyuan branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: SHANDONG TAIBAO BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021980012964 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20220928 Granted publication date: 20180724 Pledgee: Commercial Bank of China Yiyuan branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: SHANDONG TAIBAO BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021980012964 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230118 Address after: 530100 Panlong Brick Factory, Jiuxu Village, Luowei Town, Wuming District, Nanning City, Guangxi Zhuang Autonomous Region Patentee after: Guangxi Taibao Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 256100 Private Industrial Park, Yiyuan County, Zibo City, Shandong Province Patentee before: SHANDONG TAIBAO BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |