CN104474590A - 一种可注射活性骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可注射活性骨修复材料及其制备方法，其由半水硫酸钙和经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石组成，通过高能球磨分散技术制备而成。本发明的可注射活性骨修复材料具有有利于细胞长入、新骨的形成的特点，而且能够促进体内成骨细胞的贴附生长、加快新骨的形成，同时还具有可注射、不会引起免疫排斥反应的优点，可满足临床骨缺损的治疗需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种可注射活性骨修复材料及其制备方法，属于植骨手术用材料领域。
背景技术
我国每年有数百万例因创伤引起的骨不连、骨缺损的处理、骨肿瘤的保肢治疗，以及一些重建手术患者需要使用植骨材料。目前临床应用的骨移植材料主要有自体骨、同种异体骨和各种人工骨移植材料替代物。自体骨移植因其具有良好的骨传导性、诱导性和成骨能力，且无传播疾病的风险，而被认为是骨移植的金标准。但是自体骨的治疗方法会造成取骨区的继发畸形，增加患者痛苦。异体骨移植和异种骨移植在应用时存在免疫排斥反应，影响骨缺损的修复效果，此外如果所提供骨源存在某种疾病，还存在感染疾病的危险，而且来源有限，临床使用也受限。因而，目前临床上大量使用的植骨材料还是以单纯的骨移植材料为主，这些材料因为只具有骨引导活性，缺乏骨诱导活性而不能获得令人满意的治疗效果。
在多种人工骨修复材料中，α-半水硫酸钙因其良好的生物相容性、生物降解作用、无毒性作用、良好的止血和血管生成作用及骨引导与骨诱导作用，已经作为一种骨移植替代材料及引导组织再生材料得到了广泛的认同。但是根据临床上的观察，α-半水硫酸钙在植入时，通常会表现出良好的初期稳定性，但是当最初几周骨改建开始后，骨的早期吸收就会导致初期稳定性下降。此外单纯采用硫酸钙材料的孔径和孔隙率较小而不利于成骨细胞的迁入和血管生成。
发明内容
为了解决现有技术中半水硫酸钙骨修复材料后期强度低，降解速度与骨重建速度匹配性差，孔径和孔隙率小，不利于成骨细胞长入和血管生长的问题，本发明提供了一种可注射活性骨修复材料，该可注射活性骨修复材料中组合使用了半水硫酸钙和经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石。
具体而言，本发明涉及一种可注射活性骨修复材料，其特征在于所述可注射活性骨修复材料由半水硫酸钙和经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石组成，其中经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石与半水硫酸钙的重量比例为5∶95～15∶85；
优选地，所述多孔羟基磷灰石选自自然体烧结法、造孔剂法、有机泡沫浸渍法、溶胶凝胶法或模板法所获得的多孔羟基磷灰石中的一种
优选地，所述的多孔羟基磷灰石的孔隙率为50%~70%。
在一些实施方式中，其特征在于所述的羟基磷灰石的孔径为200~300μm。
优选地，所述的半水硫酸钙为α型。
在一些实施方式中，所述的半水硫酸钙的粒径为50~150μm。
本发明的另一方面涉及制备所述可注射活性骨修复材料的方法，所述方法包括如下步骤：
a. 配置5~15mg/ml的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液；
b. 加入5~15mg/ml的多孔羟基磷灰石，然后均匀混合；
c. 然后离心并冷冻干燥，得到经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石；
d. 将上面得到的经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石与半水硫酸钙以5∶95～15∶85的重量比例混合，通过高能球磨分散技术进行分散得到所述可注射活性骨修复材料。
本发明一种可注射活性骨修复材料在使用时需要加入固化液。本发明常用的固化液包括但不限于 ：生理盐水、注射用水等。本发明一种可注射活性骨修复材料其中所述固化液与所述可注射骨修复材料的比例为 0.5~1.0ml 固化液 ：1g可注射活性骨修复材料。通过调整成分的比例，本发明可注射活性骨修复材料可具有灵活的可注射时间和固化时间。
羟基磷灰石是脊椎动物骨骼和牙齿的主要组成成分，具有良好的生物活性和生物相容性。相对于传统的金属（不锈钢、钛合金）和陶瓷（氧化铝、氮化硅）类骨替代材料，羟基磷灰石不仅抗腐蚀性强、骨诱导生成性强，而且它在体内的降解也消除了前者的安全隐患。
多孔羟基磷灰石的作用有：
①多孔羟基磷灰石植入骨后，因其对骨组织有亲和作用，能诱导未分化间充质细胞分化成骨细胞，后者直接附着于羟基磷灰石表面。
②从化学构成上讲羟基磷灰石是由钙磷构成，这两种成份是骨组织最常见成份，且骨组织钙盐是以结晶基磷灰石和无定型磷酸构成，因而羟基磷灰石骨代用材料不仅在成份上，而且在结构上与人体骨组织中钙盐是一致的。
③多孔羟基磷灰石内部有规格不等的小孔通连，骨组织可长入材料内，可与HA形成骨性结构，从而使其具有骨传导性。多孔羟基磷灰石的缺点是脆弱，缺乏足够的强度和坚韧的耐磨性，用于应力集中部位易发生破折。
本申请人发现通过生物活性短肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列固定在骨修复材料的表面，可以改善骨修复表面结构特征，提高材料表面的生物活性，加强细胞的亲和力，为细胞粘附、增殖、伸展和分化提供仿生界面，促进骨修复材料与人体骨整合。RGD 序列是各种细胞外基质中最常见的基本结构部分，也是广泛存在于细胞识别系统的基本单位。RGD序列是由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的一段短肽序列，存在于多种细胞外基质 (ECM)中，例如层粘连蛋白、纤粘连蛋白、胶原、玻粘连蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白等。
本发明可注射活性骨修复材料由于含有经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石与半水硫酸钙组合，使得该可注射活性骨修复材料在固化之后的孔隙率和孔径得到了显著提高。而且该可注射活性骨修复材料在材料表面接上RGD 序列有助于成骨细胞的粘附，进一步促进骨修复材料周围骨形成。
而且，本发明的所述可注射活性骨修复材料具有良好的骨传导性和骨引(诱)导活性；具有良好的表面活性和生物相容性；生物降解可控性;良好的可塑性和力学强度；降解后不产生有害成分；适用范围广，可用于各种骨伤的腔隙填充；还可以用于脊柱融合等。
本发明的所述可注射活性骨修复材料的临床适应症主要包括：车祸或其他重大事故导致的大面积骨缺损和骨损伤；肿瘤术后和颅脑手术后的凹陷、孔洞的支撑和填充；骨折早期的快速愈合和延迟愈合的骨折治疗；整形、美容手术中骨的改形、再造等。
附图说明
图1：本发明可注射活性骨修复材料术后4周的兔股骨X线放射学检查结果；
图2：羟基磷灰石术后4周的兔股骨X线放射学检查结果；
图3：α-半水硫酸钙组术后4周的兔股骨X线放射学检查结果；
图4：空白对照术后4周的兔股骨X线放射学检查结果。
具体实施方式
下面结合实施例及动物实验对可注射活性骨修复材料及其制备方法做进一步的解释说明。
实施例1
配置精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的1L磷酸缓冲盐 (PBS)溶液，其中含有10g精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，搅拌均匀，然后加入10g的溶胶凝胶法多孔α型羟基磷灰石(孔隙率60%且孔径为250μm)。将所得混合物进一步混合均匀，随后离心，冷冻干燥，得到经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石。将得到的经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石与α-半水硫酸钙(粒径为100μm)按10∶90重量比例混合，通过高能球磨分散技术分散，从而制备得到可注射活性骨修复材料，其为粉末状。
实施例1的可注射活性骨修复材料的使用
将所得的粉末状可注射活性骨修复材料与注射用水以0.8ml/g( 液固比 ) 的比例充分调和，成为达到符合注射要求的具有适当粘稠度的糊状可注射活性骨修复材料体后，即用相应的注射器以注射方式使用。
实验的结果显示，所述的可注射活性骨修复材料的初凝时间 ( 可注射时间 ) 一般为5min～6min，终凝时间 ( 固化时间 ) 为 15min。
实验检测的结果表明，所述可注射活性骨修复材料固化后的抗压强度可达到 28MPa，超过人体松质骨的抗压强度。实验检测的结果表明，固化后的孔隙率介于 20%-30％之间，孔隙直径介于100～400微米之间。
实施例2
配置精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的1L磷酸缓冲盐(PBS)溶液，其中含有5g精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，搅拌均匀，然后加入5g的溶胶凝胶法多孔α型羟基磷灰石(孔隙率50%且孔径为200μm)。将所得混合物进一步混合均匀，随后离心，冷冻干燥，得到经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石。将得到的经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石与α-半水硫酸钙(粒径为50μm)按15∶85重量比例混合，通过高能球磨分散技术分散，从而制备得到可注射活性骨修复材料，其为粉末状。
实施例2的可注射活性骨修复材料的使用
将所得的粉末状可注射活性骨修复材料与注射用水以0.8ml/g( 液固比 ) 的比例充分调和，成为达到符合注射要求的具有适当粘稠度的糊状可注射活性骨修复材料体后，即用相应的注射器以注射方式使用。
实验的结果显示，所述的可注射活性骨修复材料的初凝时间 ( 可注射时间 ) 一般为5min～6min，终凝时间 ( 固化时间 ) 为 16min。
实验检测的结果表明，所述可注射活性骨修复材料固化后的抗压强度可达到 28MPa，超过人体松质骨的抗压强度。实验检测的结果表明，固化后的孔隙率介于20%-30％之间，孔隙直径介于100～400微米之间。
实施例3
配置精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的1L磷酸缓冲盐(PBS)溶液，其中含有15g精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，搅拌均匀，然后加入15g的溶胶凝胶法多孔α型羟基磷灰石(孔隙率70%且孔径为300μm)。将所得混合物进一步混合均匀，随后离心，冷冻干燥，得到经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石。将得到的经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石与α-半水硫酸钙(粒径为150μm)按5∶95重量比例混合，通过高能球磨分散技术分散，从而制备得到可注射活性骨修复材料，其为粉末状。
实施例3的可注射活性骨修复材料的使用
将所得的粉末状可注射活性骨修复材料与注射用水以0.8ml/g( 液固比 ) 的比例充分调和，成为达到符合注射要求的具有适当粘稠度的糊状可注射活性骨修复材料体后，即用相应的注射器以注射方式使用。
实验的结果显示，所述的可注射活性骨修复材料的初凝时间 ( 可注射时间 ) 一般为5min～6min，终凝时间 ( 固化时间 ) 为 16min。
实验检测的结果表明，所述可注射活性骨修复材料固化后的抗压强度可达到 28MPa，超过人体松质骨的抗压强度。实验检测的结果表明，固化后的孔隙率介于 20%-30％之间，孔隙直径介于100～400微米之间。
动物实验
健康新西兰大白兔24只，雌雄不限，体重2.5-3.0Kg，。按三个取材时间分成3组，每组8只，每组共16个实验部位。将本发明实施例1的可注射活性骨修复材料、半水硫酸钙、多孔羟基磷灰石三种实验材料每种取4个试件随机植入上述三组动物下肢的骨缺损中，同时在每组动物剩余的4条下肢中制作4个空白对照骨缺损模型。于手术后当天、4周、8周和12周行兔股骨X线放射学检查。
附图1-4以4周兔股骨X线放射学检查结果为例说明，从图1可以看出，使用本发明的可注射活性骨修复材料术后4周的兔股骨X线放射学检查结果表明植入材料外形仍可辨认，但材料与骨交界变模糊。而从图2可以看出，使用羟基磷灰石术后4周的兔股骨X线放射学检查结果植入材料无明显吸收现象，材料与骨交界无明显变化。从图3可以看出，使用α-半水硫酸钙组术后4周的兔股骨X线放射学检查结果显示植入材料降解消失，骨缺损边缘变模糊。从图4中可以看出，空白对照术后4周的兔股骨X线放射学检查结果显示缺损部位仍清晰可见，缺损边缘模糊。
通过将本发明的可注射活性骨修复材料和半水硫酸钙、多孔羟基磷灰石进行对比，充分显示本发明解决了现有技术中半水硫酸钙骨修复材料后期强度低，降解速度与骨重建速度匹配性差，孔径和孔隙率小，不利于成骨细胞长入和血管生长的问题。
Claims (7)
1.一种可注射活性骨修复材料，其特征在于所述可注射活性骨修复材料由半水硫酸钙和经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石组成，其中经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石与半水硫酸钙的重量比例为5∶95～15∶85。
2.权利要求1的可注射活性骨修复材料，其特征在于所述多孔羟基磷灰石选自自然体烧结法、造孔剂法、有机泡沫浸渍法、溶胶凝胶法或模板法所获得的多孔羟基磷灰石中的一种。
3.权利要求1或2的可注射活性骨修复材料，其特征在于所述的多孔羟基磷灰石的孔隙率为50%~70%。
4.权利要求1-3中任一项的可注射活性骨修复材料，其特征在于所述的羟基磷灰石的孔径为200~300μm。
5.权利要求1-4中任一项的可注射活性骨修复材料，其特征在于所述的半水硫酸钙为α型。
6.权利要求1-5中任一项的可注射活性骨修复材料，其特征在于所述的半水硫酸钙的粒径为50~150μm。
7.制备权利要求1-6中任一项的可注射活性骨修复材料的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
a. 配置5~15mg/ml的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液；
b. 加入5~15mg/ml的多孔羟基磷灰石，然后均匀混合；
c. 然后离心并冷冻干燥，得到经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石；
d. 将上面得到的经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的多孔羟基磷灰石与半水硫酸钙以5∶95～15∶85的重量比例混合，通过高能球磨分散技术进行分散得到所述可注射活性骨修复材料。
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