CN104471400B - 酶检测装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测测试样品中酶活性的酶检测装置。本发明也涉及用于检测测试样品中的酶活性特别是酶裂解活性的指示分子，和用于检测酶活性存在的方法。

Description

酶检测装置
技术领域
本发明涉及一种酶检测装置，尽管并非是专门地，特别涉及一种用于检测测试样品中酶活性的装置。本发明也涉及用于检测测试样品中酶活性的指示分子和用于检测测试样品中酶活性存在的方法。
发明背景
酶组成参与生物体内催化化学反应的蛋白质家族。由于它们的重要性，大量情形中测量酶水平，以及重要地，酶活性是必须和/或有益的。
特别是已发现酶活性的增加与特定的健康状况和/或疾病相关。例如，升高的蛋白酶活性与癌症进展的许多方面有关联。因此，测量取自具有特别健康状况或疑似具有特定健康状况或疾病的个体的样品中的酶活性可能对预后目的或诊断目的是有用的。
在酶家族内，有六个酶的主要类别：氧化还原酶；转移酶；水解酶；裂解酶；异构酶和连接酶。这种分类是基于每个类别内的酶催化的反应类型。例如，水解酶通常催化它们底物内的化学键的水解，尤其(inter alia)包括例如蛋白酶、肽酶、脂酶和核酸酶的酶。
之前已经建立了测量酶活性的试验；然而，经常关联有问题或局限。例如，一些酶检测装置仅用于测量裂解其底物的酶的活性。US2006/0003394中描述了这样的装置，包括试剂盒，含有底物-报告子“反应复合物”，其被加至已知或疑似含有所述酶的测试样品。所述酶-反应复合物施加至层析介质，于是在一个上游位置出现反应复合物的固定。如果所述底物被测试样品内存在的酶裂解，反应复合物的报告部分被释放并流动至下游位置，在那里它能够被单独检测。由于酶活性的检测是基于来自原反应复合物的报告“离开基团”的测量，因此这种装置一点也不适合于测量修饰其底物，而不是裂解其底物的酶的活性。例如，转移酶催化转移例如磷酸基团的功能基团至它们的底物，这样就不能够使用US2006/0003394描述的装置检测。
已经描述了不同的适合于检测修饰底物的酶的活性的装置。WO2009/024805中描述了一种这样的装置，其基于使用携带可检测标记的“底物识别分子”(SRM)，其中所述SRM特异地结合至未修饰或修饰状态的酶底物。
如WO2009/024805中描述的测定，经常需要适合于区分修饰和未修饰两种形式的酶底物和有效检测的非常特异的检测试剂。使用这种装置获得的测定结果的精确性和可靠性因此受合适试剂的可用性所限。
发明概述
本发明通过提供一种用于精确检测测试样品中酶活性的标准化、鲁棒装置，寻求解决与现有酶检测装置相关的至少有些问题。
本发明特别提供一种装置，其中在两相中有效进行酶活性的检测。在第一相中，试剂用于区分酶底物的修饰的和未修饰形式，在第二相，测量这其中任一种或两种形式的检测以确定酶活性。本装置给出一种测量测试样品中酶活性的标准分析模式，其能够容易地适配于测量任意相关酶的活性。
本发明也提供一种指示分子，用于检测测试样品中的酶活性。
根据本发明的第一方面，提供一种用于检测测试样品中酶活性的指示分子，包括：
(i)酶可修饰区域(an enzyme modifiable region)，能够被所述酶修饰，引起该区域从未修饰状态向修饰状态的转变；
(ii)间隔开的捕获位点，不论酶可修饰区域的修饰状态如何，该捕获位点可以被捕获分子结合；和
(iii)间隔开的检测位点。
在某些实施方式中，所述指示分子的酶可修饰区域包括裂解位点，以使得该指示分子用于检测能够裂解其底物的酶的活性。在裂解位点的裂解引起酶可修饰区域从未修饰状态转变至修饰状态，也引起指示分子的片段的释放，该片段由所述检测位点组成，基本由其组成，或包括所述检测位点。所述酶或待检测酶可选自如下种类：氧化还原酶、水解酶和裂解酶，并包括蛋白酶、肽酶、脂酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶(phosphatase)、硫酸酯酶、神经氨酸苷酶、酯酶、DNA酶和RNA酶的亚种。在优选实施方式中，所述指示分子用于检测蛋白酶活性。
在本发明的某些实施方式中，所述酶可修饰区域可以包括多个裂解位点，其中在任何一个位点的裂解引起检测位点从指示分子的捕获位点分离。在本发明的文本中，术语“多个”指至少两个、至少三个、至少四个等等。
因此，本发明提供一种用于测试样品中酶裂解活性检测的指示分子，包括：
(i)包括多个裂解位点的酶可修饰区域，其中任何一个裂解位点的裂解引起该区域从非修饰状态向修饰状态的转变；
(ii)间隔开的捕获位点，不论该酶的可修饰区域的修饰状态如何，该捕获位点可以被捕获分子结合；和
(iii)间隔开的检测位点。
在某些实施方式，所述指示分子包括2、3、4、5和10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、100、500或1000个之间的裂解位点。在某些实施方式，所述指示分子包括2和5、6、7、8、9或10个之间的裂解位点。
在一个实施方式中，多个裂解位点可以都是相同的。在这种配置中，重复的裂解位点可以相对非特异或可以对如上限定的一种酶或酶亚型高度特异。此外，使用这种类型的指示分子可以通过提供增加测试样品内存在的裂解位点的浓度的方式而有助于提高所述酶检测装置的灵敏性。
在其他实施方式中，所述指示分子可以包括多个裂解位点，其中在相同指示分子内存在至少两个不同的裂解位点。在本发明的优选实施方式中，所述指示分子可以包括至少3个、至少4个、至少5个，和达至少8个不同的裂解位点。
在进一步优选的实施方式中，所述不同的裂解位点被如上定义的不同的酶或不同的种类、亚种或亚型的酶识别，以使得本发明的装置能够用于检测多种不同的酶的活性。所述活性可以分组，以使酶活性的检测提供有用的结果。例如，可以是涉及疾病状态的一组酶，这样所述酶组的一个或多个的相关活性的检测具有诊断意义。
使用多个裂解位点(不论相同或不相同)可以对待检测测试样品中酶活性非常低的情况特别有用。例如，以上定义的具有多个裂解位点的指示分子可以用于检测含有低水平蛋白酶的尿液样品中的酶活性。
一旦根据本发明第一方面的指示分子被裂解，可使用本领域技术人员已知的合适方式检测所述检测位点。在某些实施方式中，所述检测位点本身可包括报告基团(moiety)，其中报告基团这里定义为任意能够生成或产生信号的基团。在本发明的优选实施方式中，所述报告基团从如下选择：-金颗粒、发色团、发光化合物、荧光分子、放射化合物、可视化合物、脂质体或其他包含信号生成物质的囊泡、电活性物质、或酶和其底物的组合。用作报告基团的合适的酶-底物组合可以是碱性磷酸酶和底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐。可选地，或另外地，检测位点可以被本文下述的单独的报告分子结合。
这里描述的指示分子可以与根据本发明的酶检测装置协同使用。
根据本发明的第二方面，提供一种用于检测测试样品中酶活性的酶检测装置，包括：
(i)加入样品中的指示分子，所述指示分子包括：
(a)酶可修饰区域，能够被所述酶修饰，引起该区域从非修饰状态到修饰状态的转变；和
(b)检测区域，不论该酶修饰区域的修饰状态如何，该检测区域不被该酶修饰和能够被报告分子结合；
(ii)接收测试样品的选择性捕获区域(detection zone)，其中，该选择性捕获带包含能够选择性地结合处于修饰或非修饰的任一种状态的指示分子的酶可修饰区域的选择性识别分子；和
(iii)接收与选择性捕获带接触后的测试样品的检测带，其中，检测带与选择性捕获带空间上间隔开，以使得测试样品对检测带的暴露发生在测试样品对选择性捕获带的预暴露后，其中只有那些不结合选择性捕获带中的选择性识别分子的指示分子进入检测带，其中在选择性捕获带和/或检测带检测指示分子。
在使用中，测试样品首先与选择性捕获带接触，其中修饰的或未修饰的指示分子通过结合至选择性识别分子被捕获，随后与检测带接触，其中只有那些不结合选择性捕获带中的选择性识别分子的指示分子进入检测带。可以使用本领域技术人员已知的合适的方式，按照下述方式在检测带检测在选择性捕获带没有被捕获的指示分子。
与本发明的装置联合使用的测试样品可以是任意已知材料，或疑似含有酶，和可以是来源于任意来源。在某些实施方式中，测试样品可以来源于包括液体的生物来源，例如血液、唾液、尿液、牛奶、创面积液、腹水、腹膜液、羊水等等。在优选实施方式中，所述测试样品是创面积液，所述装置用于检测在创面积液中的酶活性，优选蛋白酶活性，作为评估伤口的状况和/或愈合率的措施。在更优选的实施方式中，所述测试样品是尿液，所述装置用于检测尿中的酶活性，尤其是蛋白酶的活性。
所述测试样品可通过任意合适方式收集，并存在于任意适合于本装置使用的形式，包括固体或液体形式。此外，作为从其最初来源获得测试样品的一部分，所述样品可以在使用本发明的装置测试前进行一种或多种处理或预处理步骤。在一个实施方式中，可以处理固体样品以产生用于测试的溶液或悬浮液。此外，在某些实施方式中，可以在使用本发明的装置测试前储存测试样品任意给定长度的时间，例如以大约-20℃冷冻作为保存样品的方式。
本发明的装置用于特异性检测测试样品中的酶活性。因此所述装置可以用于间接测量任意给定的测试样品中是否实际存在或不存在一种酶。或者，已知提供的测试样品中存在酶，使用本发明的装置可以测量所述酶的活性。例如，含有已知量的酶和酶活性的一种或多种调节剂或疑似调节剂的测试样品可与本装置联合使用。在本发明的一种实施方式中，所述装置用于测试酶活性的潜在调节剂或抑制剂。
本装置基于使用加入至测试样品中的指示分子。所述指示分子首先包含“酶可修饰区域”，其作为适合于被待检测的相关酶修饰的底物被选择。由相关的酶―如果存在于测试样品内―对酶可修饰区域的修饰引起这个区域从未修饰状态向修饰状态的转变。
在本发明的文本中，“酶可修饰区域的修饰”是指能够由任意相关酶的作用带来的这个底物区域的任何改变。在本发明的某些实施方式中，修饰可以包括例如酶可修饰区域的裂解或分别向该区域加入或从该区域去除一个化学基团的事件。此外，从未修饰状态向修饰状态的转变必须是所述酶可修饰区域的两种形式通过如下进一步描述的所述装置的选择性识别分子可区分的。
在本发明的优选实施方式中，指示分子的酶可修饰区域包括多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质或核酸。此外，使用本发明所述装置的待检测酶可以选自如下种类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶，包括蛋白酶；肽酶；脂酶；核酸酶；糖酶；磷酸酶；硫酸酶；神经氨酸苷酶；酯酶；DNA酶；RNA酶；激酶；糖基转移酶；氧化酶；还原酶；和转氨酶的亚种。
在优选实施方式中，本发明的装置用于检测来源于创伤的液体中的酶活性。在这样的实施方式中，待检测的酶优选蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶(MMP)和人中性粒细胞来源的弹性蛋白酶(HNE)。在优选实施方式中，待检测酶是组织蛋白酶，特别是组织蛋白酶G。
在更优选实施方式中，本发明的装置用于检测收集自受试者尿液样品的酶活性。在这种实施方式中，待检测酶优选蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶(MMP)和人中性粒细胞来源的弹性蛋白酶(HNE)。
在某些实施方式中，指示分子的酶可修饰区域可以包含或由与酶的天然底物或其片段相同的一个区域组成。在另一实施方式中，酶可修饰区域可以是工程化的，以使其包含非天然的酶底物。例如，酶可修饰区域可以是工程化的或突变的，以使所述相关酶显示的酶活性的速率和/或特异性相对于其天然底物升高(或如果合适的话下降)。
此外，可以这样选择酶可修饰区域，即其是相对非特异性的，意味着多于一种如上定义的酶或酶的亚类识别或作用于其上。例如，包括多肽底物或由其组成的酶可修饰区域，可以受蛋白酶和肽酶两者或蛋白酶和/或肽酶的亚组裂解，在酶可修饰区域被多于一种的酶识别或作用的情况中，所述装置可以用于检测测试样品中任意能够修饰指示分子的这样酶(例如酶的个别的组或亚类)的存在。
或者，可以这样选择酶可修饰区域，即其是高度特异性的，意味着只有一种酶或一种亚型的酶能够识别和修饰这个区域。这种情况中，亚型定义为落入以上定义的亚类的酶的子类。在这样的实施方式中，所述装置可以满足于测试样品内单一的酶或单一的酶亚型。
在某些实施方式中，酶可修饰区域可以只包含单一的修饰位点，即酶能够作用的单一位点或位置。例如，酶可修饰区域可以含有被一种或多种蛋白酶识别的单一的裂解位点。在该特别位点或位置的修饰负责所述酶可修饰区域从其未修饰状态至修饰状态的转变。或者，酶可修饰区域可以含有多个这样的修饰位点，这样这些位点之一(或多个)的修饰导致该区域从未修饰状态至修饰状态。在本发明的文本中，术语“多个”指至少两个、至少三个、至少四个等等。例如酶可修饰区域可以包含多个被一种或多种激酶识别的磷酸化位点。
在某些实施方式中，指示分子包括2、3、4、5和10、11、12、13、14、15、25、50、100、500或1000之间的修饰位点。在一些实施方式，指示分子包括2和5、6、7、8、9或10个之间的修饰位点。
多个修饰位点存在于酶可修饰区域内时，这些位点可以都是相同的。例如酶可修饰区域可以包含多个相同的裂解位点。重复的裂解位点可以是相对非特异的或可以高度特异于以上定义的一种酶或酶亚型。
在其他实施方式中，酶可修饰区域可以包含多个修饰位点，其中在相同的指示分子内至少存在两个不同的修饰位点。在本发明的优选实施方式中，指示分子可以包含至少三个、至少四个、至少五个，和到至少五十个不同的修饰位点。在这些位点的任意一个的修饰可以导致该区域从未修饰至修饰状态的转变。在更优选的实施方式，不同的修饰位点被以上定义的不同的酶或不同种类、亚类或亚型的酶识别，这样品发明的装置能够用于检测测试样品内多种不同的酶的活性。
在指示分子内使用多个修饰位点(无论相同或不相同)可以通过提供增加存在于测试样品内的修饰位点的浓度的方式有助于增加所述酶检测装置的灵敏性。这对测试样品中待测的酶活性非常低的情况可能特别有用。例如，以上定义的具有多个修饰位点的指示分子可以用于检测含有低水平蛋白质的尿液样品中的酶活性。
除了酶可修饰区域外，本发明的指示分子还包含检测区域，检测区域不受待检测酶的任何修饰。指示分子的检测区域可以通过任何合适的方式连接于酶可修饰区域。在一个实施方式，附着是通过直接共价连接。在另一实施方式中，指示分子的检测区域通过连接子(linker)或转运蛋白(carrier protein)连接于酶可修饰区域。在指示分子的优选实施方式，检测区域和酶可修饰区域由不同的肽组成，转运蛋白(carrier protein)由牛血清白蛋白组成。对于酶可修饰区域和检测区域通过转运蛋白(carrier protein)相联的实施方式中，指示分子可以包括多个酶可修饰区域和/或检测区域。
在本发明的更优选实施方式中，指示分子的检测区域包含捕获位点，并且所述装置的检测带包含捕获分子，指示分子―如果存在的话―的捕获位点能够结合至捕获分子。在更优选的实施方式中，指示分子的检测区域包含与捕获位点间隔开的检测位点。
这样，在本发明的第三方面，提供一种用于测试样品中酶活性的检测的指示分子，包括：
(i)酶可修饰区域，能够被所述酶修饰，引起该区域从未修饰状态至修饰状态的转变，就被选择性识别分子结合而言，未修饰和修饰状态结构上可区分；
(ii)间隔的捕获位点，无论酶可修饰区域的修饰状态如何，捕获位点能够被捕获分子结合；和
(iii)间隔的检测位点，无论酶可修饰区域的修饰状态如何和无论预先或同时捕获分子结合至捕获位点，检测位点能被报告分子结合。
根据本发明第三方面的指示分子可以与本文描述的酶检测装置联合用于检测酶活性，或者可以与其他酶检测分析联合应用。关于指示分子的所有实施方式，与本文描述的酶检测装置联合使用时，等同适用于本发明第三方面的指示分子。
在某些实施方式，指示分子的酶可修饰区域包含一个或多个裂解位点，这样指示分子能够被用于检测能够裂解其底物的酶的活性。待检测的酶可选自如下种类：氧化还原酶、水解酶和裂解酶，并包括蛋白酶，肽酶、脂酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶、硫酸酯酶、神经氨酸苷酶、酯酶、DNA酶和RNA酶的亚种。在优选实施方式中，指示分子用于检测蛋白酶活性。
在本发明的某些实施方式，酶可修饰区域可以包含多个裂解位点，其中在这些位点的任意一个的裂解导致所述检测位点从指示分子的捕获位点分离。在本发明的文本中，术语“多个”指至少两个、至少三个、至少四个等等。
在某些实施方式中，指示分子包括2、3、4、5和10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、25、50、100、500或1000个之间的裂解位点。在一些实施方式，指示分子包括2和5、6、7、8、9或10个之间的裂解位点。
在一个实施方式中，所述多个裂解位点可以都是相同的。在这种配置中，重复裂解位点可以是相对非特异的或可以对如上限定的一种酶或酶亚型高度特异。此外，使用这种类型的指示分子可以通过提供增加测试样品内存在的裂解位点的浓度的方式提高所述酶检测装置的灵敏性。
在其他实施方式中，所述指示分子可以包括多个裂解位点，其中在相同指示分子内存在至少两个不同的裂解位点。在本发明的优选实施方式中，所述指示分子可以包括至少3个、至少4个、至少5个，和到至少8个不同的裂解位点。
在进一步优选实施方式中，所述不同的裂解位点被如上定义的不同的酶或不同的种类、亚类或亚型的酶识别，以使得本发明的装置能够用于检测多种不同的酶的活性。所述活性可以分组，以使酶活性的检测提供有用的结果。例如，可能涉及疾病状态的一组酶，这样检测所述酶组的一个或多个的相关活性具有诊断意义。
使用多个裂解位点(不论相同或不相同)可以对测试样品中酶活性非常低的情况特别有用。例如，以上定义的具有多个裂解位点的指示分子可以用于检测含有低水平蛋白酶的尿液样品中的酶活性。
一旦根据本发明第三方面的指示分子被裂解，可用本领域技术人员已知的任意合适方式检测所述检测位点。在某些实施方式，所述检测位点本身可包括报告基团，其中报告基团这里定义为任意能够生成或产生信号的基团。在本发明的优选实施方式中，所述报告基团从如下选择：-金颗粒、发色团、发光化合物、荧光分子、放射化合物、可视化合物、脂质体或其他包含信号生成物质的囊泡、电活性物质、或酶和其底物的组合。用作报告分子的合适的酶底物组合可以是碱性磷酸酶和底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐。
除了指示分子，本发明的装置还包含选择性捕获带，选择性捕获带包含能够选择性结合至处在修饰或未修饰的任一种状态的指示分子的酶可修饰区域的选择性识别分子。因此选择性识别分子是本装置的能够结构上区分指示分子的修饰和未修饰形式的成分，促进这两种形式的分离。
选择性识别分子可以仅识别指示分子的未修饰形式。或者，可以这样选择选择性识别分子，即其仅识别指示分子的修饰形式。在选择性识别分子识别指示分子的修饰形式和待检测酶的修饰导致指示分子以任何方式裂解或片段化的实施方式中，本装置需要选择性识别分子至少结合包含检测区域的指示分子的片段。
在指示分子的酶可修饰区域包括多个修饰位点的情况中，所述装置的选择性捕获带可以包含不同的选择性识别分子，每一个能够识别酶可修饰区域采取的修饰的或未修饰的形式的至少一种。其中，所述装置的选择性捕获带包含不同的选择性识别分子，每个定制成区分酶可修饰区域关于特定位点的特定修饰的修饰和未修饰形式，为了装置的运行，优选不同的选择性识别分子都识别指示分子的修饰的或未修饰的形式。
所述选择性识别分子可以是任意能够结构性地区分指示分子的酶可修饰区域的修饰和未修饰形式的分子。在本发明的优选实施方式中，选择性识别分子是抗体或其抗原结合片段、亲和素、链霉亲和素或其衍生物、凝集素、核酸分子、受体分子、或激素结合蛋白质。在特别优选实施方式中，选择性识别分子是能够仅选择性识别酶可修饰区域的修饰或未修饰形式的一种的抗体。在本发明的文本中，术语抗体涵盖来自任意种类的天然免疫球蛋白、嵌合抗体、人源化抗体、F(ab')2片段、Fv片段、sFv片段和高度相关分子，例如那些基于保留特异性结合亲和力的抗体域(例如，单一域抗体)。
选择性识别分子的首要作用是结合指示分子的未修饰或修饰的任一种形式，从而在装置的选择性捕获带保留指示分子的未修饰或修饰的任一种形式，这样使得采用另一种形式的指示分子进入检测带。在优选实施方式中，选择性捕获带包含固相支撑，指示分子以未修饰或修饰状态的任一种选择性结合的选择性识别分子位于固相支撑之上或之中。
在本发明的文本中，优选指示分子以相对高的亲和力结合至选择性识别分子。在优选实施方式中，指示分子的解离速率(kd)相对低并且优选在0M和1x10-7M之间(依赖于分析所需要的灵敏性)。在本发明特别优选的实施方式中，指示分子的解离速率在1x10-15M和1x10-9M之间。特别优选选择性识别分子比待检测酶对指示分子具有较低的解离速率(kd)，和较高的结合速率(ka)。
在本发明更优选的实施方式中，一旦指示分子被选择性识别分子结合后，所述酶可修饰区域不能够被任何酶修饰或进一步修饰。在选择性识别分子选择性结合至指示分子的未修饰形式的情况中，这尤其相关和有益。
含有指示分子的测试样品与装置的选择性捕获带接触后，测试样品暴露于装置的检测带。任何没有藉由结合至位于选择性捕获带内的选择性识别分子而保留在选择性捕获带的指示分子将被转移至检测带。
在指示分子的检测区域包含捕获位点的情况中，检测带可以包含能够结合至存在于检测带的任何指示分子的捕获位点的捕获分子。在本发明的某些实施方式中，由于指示分子的捕获位点直接结合至存在于检测带内的捕获分子，可以达到这样的结合反应。在本文中，直接结合指指示分子不需要任何中间因子(intermediary)结合至捕获分子。
在本发明的优选实施方式中，指示分子的捕获位点和存在于装置的检测带的捕获分子是结合对的两半。在本文中，结合对由能够相互结合的两个分子或实体(entities)组成。在本发明的优选实施方式中，所述结合反应是特异的，这样结合对的每个成员仅能够结合其各自的配对物、或有限数量的配对物。优选结合对显示相对高的亲和力。这种结合对可以是在自然界中发现的结合对或者是人工生成的相互作用分子或实体对。
在本发明的更优选实施方式中，指示分子的捕获位点和捕获分子是结合对的两半，其中结合对从如下选择：抗原和抗体或其抗原结合片段；生物素和亲和素、链霉亲和素、中性亲和素或核心生物素(captavidin)；免疫球蛋白或其合适的域和蛋白A或G；碳水化合物和凝集素；互补的核苷酸序列；配体和受体分子；激素和激素结合蛋白质；酶辅助因子和酶；酶抑制因子和酶；纤维素结合域和纤维素纤维；固定化氨基苯硼酸和具有顺式二醇的分子(cis-diol bearing molecules)；木葡聚糖和纤维素纤维和其类似物、衍生物和片段。
在本发明的装置的特别优选实施方式中，结合对由生物素和链霉亲和素组成。在本发明更特别优选的实施方式中，指示分子的捕获位点包含表位，并且检测带内的捕获分子包含特异性结合至存在于捕获位点的该表位的抗体。
在本发明的某些实施方式中，指示分子的捕获位点与装置的检测带内的捕获分子的结合可以是间接的。在本发明的文本中，“间接结合”指由一些能够桥连指示分子和捕获分子的中间实体(intermediate entity)介导的结合，例如能够同时结合指示分子的捕获位点和捕获分子的“适配子”。
其中指示分子与捕获分子的结合是间接的并且由适配子介导，可以是复数个指示分子结合至每个捕获分子。在本文中，复数个指至少两个、至少三个、至少四个，等等。
这可以通过合并多价适配子分子而达到，例如能够同时结合至多个含生物素的指示分子的链霉亲和素分子和含生物素的捕获分子。
指示分子的检测区域可以是适合于通过本领域技术人员已知的任意方式检测的物质或基团。在本发明的一个实施方式中，检测区域本身可以包含报告基团，其中报告基团这里被定义为能够生成或产生信号的任意基团。在本发明的优选实施方式中，所述报告基团从如下选择：-金颗粒、发色团、发光化合物、荧光分子、放射化合物、可视化合物、脂质体或其他包含信号生成物质的囊泡、电活性物质、或酶和其底物的组合。用作报告基团的合适的酶底物组合可以是碱性磷酸酶和底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐。在本发明的特别优选实施方式中，报告基团是金颗粒。
或者，或除了以上实施方式，所述装置可以包含一个或多个结合至或能够结合至指示分子的检测区域的报告分子，并且使用由报告分子生成的信号进行检测。不论酶可修饰区域的修饰状态如何，任何报告分子与指示分子的检测区域的结合都发生。
如上所述，报告分子可以在特定的“检测位点”结合至指示分子的检测区域，其与检测区域内存在的捕获位点不同，并且空间上间隔开。检测位点可以包含定位于直接相邻于或接近于捕获位点的残基。或者，检测位点可以包含指示分子的不连续部分，空间上与捕获位点间隔开，例如藉由连接体或间隔子区域或转运蛋白(carrier protein)。
在指示分子的捕获位点直接结合至检测带中的捕获分子的装置的实施方式中，检测位点不同于和/或空间上与捕获位点间隔开可能是有利的，以免妨碍捕获分子和报告分子同时结合至指示分子。
此外，在一些情况中，尽管检测位点和捕获位点两者都定义为存在于指示分子的“检测区域”内，但是这两个位点可以包含或由联合的不同的化学实体组成，以便形成所述分子的检测区域。例如，捕获位点可以包含第一肽抗原，同时检测位点可以包含生物素部分。在本发明的优选实施方式中，检测位点包含表位，与捕获位点内存在的表位不同，报告分子包含特异地结合于所述表位的抗体。
在本发明某些其他实施方式中，检测区域可以不具有间隔的检测位点，并且报告分子结合至捕获位点不损坏捕获位点结合至检测带内捕获分子的能力，报告分子可以通过提供的捕获位点结合至指示分子的检测区域。在本发明优选实施方式中，捕获位点是生物素，报告分子包含能够结合生物素的基团，例如抗生物素抗体或链霉亲和素或其衍生物。
本发明的报告分子包含任意能够生成用于检测目的的信号的报告基团。在本发明的优选实施方式中，报告基团从如下选择：-金颗粒、发色团、发光化合物、荧光分子、放射化合物、可视化合物、脂质体或其他包含信号生成物质的囊泡、电活性物质、或酶和其底物的组合。
此外，报告分子与指示分子的结合可以是间接的，通过能够同时结合检测区域和报告分子的适配子介导。在本发明的报告分子藉由适配子分子结合至指示分子的实施方式中，在测试样品加入至指示分子前，所述适配子可以与检测区域预复合。
适配子可以是能够介导指示分子的检测区域和报告分子间接相互作用的任意材料或分子。在优选实施方式中，所述适配子是链霉亲和素，并且检测区域包含生物素。所述适配子也可以是“适配子结合对”，其中所述结合对包含：
(i)能够结合至指示分子的检测区域的第一成员；和
(ii)能够结合至所述对的第一成员和报告分子的第二成员。在本发明的特别优选实施方式中，指示分子的检测区域包含生物素，适配子结合对的第一成员是亲和素或链霉亲和素，适配子结合对的第二成员是生物素，报告分子包含能够结合生物素的基团。
适配子分子或适配子结合对的加入可以促进多个报告分子结合至每个指示分子。例如，使用多价链霉亲和素作为适配子将允许除了结合多个含有生物素的报告分子外，又同时结合含有生物素的指示分子。
在报告分子通过适配子或适配子结合对结合至指示分子的检测区域的装置的实施方式中，该相同的适配子或适配子结合对可用于介导捕获位点与存在于所述装置的检测带中的捕获分子的间接结合。
在优选实施方式中，指示分子的捕获位点包含生物素并结合含有链霉亲和素的适配子。链霉亲和素适配子介导与含有生物素的报告分子和也含有生物素的捕获分子两者的结合。这样，相同的适配子显示三向结合以连接指示分子的检测区域至报告分子和装置的检测带中的捕获分子两者。
为使所述装置按照预定运行，选择性捕获带必须与检测带空间上间隔开。必须是这样的空间间隔，即允许组合指示分子的测试样品首先与选择性捕获带内的选择性识别分子接触，随后转移至装置的检测带。在一个实施方式中，选择性捕获带和检测带两者被间隔的固相支撑限定，并且选择性识别分子和捕获分子―如果存在的话―位于它们各自固相支撑之上或之中。
在本发明的优选实施方式中，所述装置配置为流体装置，并且选择性捕获带和检测带存在于沿层析介质的顺序位置。层析介质可以安装在固相支撑上。在本发明的特别优选实施方式中，所述装置配置为侧流装置，但是也可以配置为例如垂直流装置。在某些实施方式中，所述装置可以选择测试条的形式。
可以通过固定在其中或其上的能够结合至指示分子的修饰或未修饰状态的任一种的选择性识别分子形成(be defined by)选择性捕获带。可以通过固定于其中或其上的能够结合至在测试样品先前暴露于选择性捕获带内的选择性识别分子后留在测试样品中的指示分子的捕获分子形成(be defined by)检测带。可以通过任意合适方式固定选择性识别分子和/或捕获分子。其中所述装置是包含层析介质的流体装置，选择性识别分子和/或捕获分子可以通过直接结合至介质固定，或者通过结合至与介质相连的载体分子如蛋白质而间接固定。
可以在选择性捕获带的上游位点将测试样品施加至层析介质，这样测试样品通过例如毛细管作用吸收，穿过选择性捕获带接着检测带。层析介质可以由液体能够穿过的任意材料制成，例如流体通道或多孔膜。在本发明的优选实施方式中，层析介质包含硝酸纤维素条或膜。如此，本发明的装置可以包括样品施加带。样品施加带可以与选择性捕获带间隔开，或者在其他实施方式中，包括选择性捕获带。
如上描述，本发明的装置包含能够结合至指示分子检测区域的报告分子，所述装置还可以包括含有控制捕获分子的控制捕获带。控制捕获带与选择性捕获带和检测带空间上间隔开。
在某些实施方式中，控制捕获带内的控制捕获分子可以结合至任意不结合至指示分子的报告分子。在优选实施方式中，控制捕获分子是能够识别报告分子内的表位的抗体，其中所述表位与指示分子内的任何表位不同。检测至控制捕获带内的控制捕获分子的报告分子可以用于确定装置内功能化的报告分子的存在。
在本发明进一步的实施方式中，除了报告分子，所述装置还可以包含一个或多个“控制报告分子”。通常，控制报告分子将包含与报告分子相同的报告基团，但将不会结合至指示分子的检测区域。这种控制报告分子可以用于间接评估装置内报告分子的运行。在这些情况下，所述装置也可以包含控制捕获带，与选择性捕获带和检测带空间上间隔开，包含控制捕获分子，其中如果存在控制报告分子的话，所述控制捕获分子能够结合控制报告分子。在优选实施方式中，控制捕获分子是能够识别控制报告分子内表位的抗体，其中所述表位与指示分子或报告分子内的任何表位不同。检测结合至控制捕获带内的控制捕获分子的报告分子可以用于间接评估装置内功能化的报告分子的存在。
其中本发明的装置配置为包含层析介质的流体装置，选择性捕获带、检测带和控制捕获带(如果存在的话)可以包含在塑料壳体内，配备有能够检测固定于一个或多个所述不同的带的报告分子的方式。例如，塑料壳体可以包含允许可视化观察结合在选择性捕获带、检测带和控制捕获带的一个或多个的报告分子生成的信号的窗口。在某些实施方式中，尤其是选择性识别分子结合至指示分子的未修饰形式的实施方式中，所述塑料壳体可以将选择性捕获带隐藏不可见，这样只有结合在检测带的报告分子能被检测到。这有助于终端用户仅在存在酶时(在检测带)见到阳性测试线。
根据本发明的另一方面，本文提供一种用于检测测试样品中酶活性存在的方法，所述方法包含步骤：(i)提供酶检测装置，包含
用于加至测试样品的指示分子，所述指示分子包含
(a)酶可修饰区域，能够被所述酶修饰，引起该区域从未修饰至修饰状态的转变；和
(b)检测区域，不被酶修饰，并且不论酶可修饰区域的修饰状态如何，该区域能够被报告分子结合；
接收测试样品的选择性捕获带，其中选择性捕获带包含能够选择性结合至指示分子的酶可修饰区域的修饰或未修饰状态的任一种的选择性识别分子；和
测试样品与第一捕获带接触后接收测试样品的检测带，其中所述检测带与第一捕获带空间上间隔开，
(ii)提供疑似含有酶活性的测试样品；
(iii)在如果存在酶活性能够修饰酶可修饰区域的条件下，将装置的指示分子加入至测试样品；
(iv)使测试样品与装置的选择性捕获带接触，从而处于修饰或未修饰状态的任一种的指示分子与选择性识别分子结合，从而如果存在的话，允许指示分子的修饰或未修饰形式与相反状态的指示分子分离；
(v)使测试样品与检测带接触，其中只有不结合至选择性捕获带内的选择性识别分子的指示分子进入检测带；和
(vi)检测存在于选择性捕获带和/或检测带内的任何指示分子。
以上详述的方法涉及使用本文其他地方详述的本发明的酶检测装置。所有已描述的关于本发明的酶检测装置和指示分子的所有实施方式参照适用于本发明的方法的这些方面，因简洁的缘由不再重复。
本发明的方法需要在酶－如果存在(并且有活性)－能够修饰酶可修饰区域的条件下将装置的指示分子加入至测试样品。用于进行所述方法的条件可以视待检测的相关酶而定，也可以包括例如指示分子与测试样品的孵育时间、温度、pH参数的变化。并且，所述条件可以调整，以便改进所述分析的灵敏性；例如，更长的孵育时间可能增加测试样品中修饰的指示分子的比例。在某些实施方式中，本发明的装置和方法可以用于优化相关酶的分析条件。
根据待检测的酶，加入至测试样品中的指示分子的量或浓度也可以不同。优选将充足的指示分子加入至测试样品，以使酶底物过量存在。
在本发明的某些实施方式中，可优选在使测试样品与装置的选择性捕获带接触前孵育指示分子与测试样品。特别是对于存在于选择性捕获带内的选择性识别分子识别指示分子的未修饰形式的实施方式的情况，并且一旦指示分子被选择性识别分子结合，酶可修饰区域不能够被酶修饰。
进行本方法获得的结果也将受到存在于装置的选择性捕获带内的选择性识别分子的量与加入至测试样品的识别分子的量之间关系的影响。在本发明的某些实施方式中，存在充足的选择性识别分子，从而，如果指示分子保持在被选择性识别分子识别的形式，在选择性捕获带捕获测试样品中指示分子的所有量。本领域技术人员能够容易地试验确定捕获所有指示分子需要的选择性识别分子的量，或者使装置的选择性捕获带内的所有选择性识别分子结合位点饱和的指示分子的量。
如果选择性识别分子少于捕获所有任一形式的指示分子所需，特别是在选择性识别分子结合至酶可修饰区域的未修饰形式的情况中，存在于选择性捕获带的任何未结合的指示分子可以随后被转移至检测带。如果在装置的检测带检测到指示分子的存在，其中这些指示分子本该保留在所述选择性捕获带，可能导致假阳性结果。然而，根据所需分析灵敏度的程度，一定程度的未结合指示分子“泄露”至检测带是可以容许的，其中这样的指示分子本该藉由其未修饰/修饰状态保留在选择性捕获带。此外，可以测量这种“泄露”，并藉由合适的控制反应而被考虑在内。
如上所详述，选择性识别分子的作用首先是在装置的选择性捕获带内选择性保留未修饰或修饰形式的指示分子。这样，为了将指示分子保留在该带内，选择性识别分子必须定位于选择性捕获带内，这样它们不与测试样品一起被转移至检测带。可以通过将选择性识别分子附着于固相支撑达到定位。在本发明的优选实施方式中，所述装置是流体装置，选择性识别分子固定于延层析介质长轴的离散位置。可通过本领域技术人员已知的合适方式固定选择性识别分子。
在使测试样品与选择性捕获带接触后，任一种修饰或未修饰形式的指示分子已结合至捕获带的选择性识别分子，接着测试样品被转移至检测带。如果所述装置配置为选择性识别分子结合至酶可修饰区域的未修饰形式，任何修饰形式的指示分子将被转移至检测带。如果所述装置配置为选择性结合至酶可修饰区域的修饰形式，未修饰指示分子将被转移至检测带。
根据所述装置的配置和用户期望的读出，本发明的方法可以包含检测选择性捕获带或检测带内或两者内的指示分子的存在和/或水平。例如，如果装置是选择性识别分子结合至指示分子的未修饰形式，检测带内的修饰的指示分子的存在―如果有―将指示测试样品内存在酶活性。或者，如果装置的选择性识别分子结合至指示分子的修饰形式，选择性捕获带内的修饰的指示分子的存在―如果有―将指示测试样品内酶活性的存在。在某些实施方式，测量与检测带比较的选择性捕获带内结合的指示分子的相对量或许是有用的。鉴于指示分子在这些位点的任意一个存在，在选择性捕获带生成的信号和检测带生成的信号通常存在负相关。
以上描述的方法可以用于确定任意给定的测试样品中存在或缺失酶活性。所述方法也可以用于基于比较两种或多种样品确定测试样品中酶活性的相对量。为了进行这样的比较分析，将使用第一样品执行本发明的方法获得的结果与使用一种或多种其他测试样品重复所述方法获得的结果比较。
例如，在本发明的选择性识别分子结合至指示分子的未修饰形式的实施方式中，存在于检测带的修饰的指示分子生成的信号强度可以与测试样品内的酶活性的水平成正比。这样，比较两个或多个测试样品中的单个在检测带生成的信号强度可以用于计算每一样品中酶活性的相对水平。
此外，根据存在于选择性捕获带和检测带两者的指示分子计算的信号强度的比率可以与酶活性的水平成正比。这样，两个或多个样品的该比率的比较可以用于确定每一样品中酶活性的相对水平。
使用本发明的所述方法的这种比较分析可以用于多种目的。首先，测量两个或更多样品之间酶活性的相对水平可以用作不同样品内存在的所有酶的相对量的间接测量。与此相关，本方法可以首先针对含有已知量的酶的系列测试样品进行。获得的结果可以用于生成酶活性相对于酶浓度的标准曲线。此后，可以测试含有未知量的酶的另一测试样品的酶活性，并且基于来自标准曲线的数据，可以确定测试样品内的酶的绝对量。
在目前方法的另一应用中，比较两样品之间的相对酶活性，例如对照样品和试验样品，可以用于评估潜在的调节剂或抑制剂对酶活性的影响。
可通过本领域技术人员可用的任意方式进行存在于选择性捕获带、检测带或两者的指示分子的检测。如上所述，可以通过检测检测区域内存在的报告基团进行指示分子的检测。
在本发明的优选实施方式中，通过加入能够结合至检测区域的报告分子进行指示分子的存在的检测。所述报告分子可以取自以上已经描述的形式，可以与指示分子的检测区域以任意在此已详述的方式相关联。
在本发明的优选实施方式中，指示分子的存在的检测是通过使用含有能够结合指示分子的检测区域的抗体的报告分子的免疫分析进行的。在特别优选的实施方式中，指示分子的检测是通过如下技术之一进行的：ELISA、荧光免疫分析或放射免疫分析。
在使用单独的报告分子进行检测的实施方式中，可以在将指示分子加入至测试样品前，将所述报告分子加入至指示分子。在这些情况下，优选报告子不影响酶对指示分子的修饰，例如裂解。或者，可以在不存在报告分子时，将指示分子加入至测试样品，并且当测试样品暴露于选择性捕获带内的选择性识别分子时存在或加入报告分子。在另一选择实施方式中，可以在含有指示分子的测试样品已经暴露于选择性捕获带内的选择性识别分子并且随后被转移至检测带后加入报告分子。
可以籍由存在于指示分子的检测区域内的捕获位点将指示分子结合至存在于检测带内的捕获分子，促进检测带内存在的指示分子的检测。更具体地，任何指示分子与固定于检测带内的离散位置的捕获分子的结合可以允许执行所述方法的人集中于在该离散位置的水平的指示分子的检测。指示分子结合至检测带内存在的捕获分子可以籍由捕获位点和捕获分子之间的直接相互作用而发生，或者可以是间接的，例如通过本文其他地方描述的适配子分子介导。
在适配子用于介导指示分子与报告分子或捕获分子或两者的间接结合的实施方式中，该适配子可以在将指示分子加入至测试样品前加入到指示分子，即可以与指示分子预复合。或者，可以在指示分子暴露于装置的选择性捕获带或检测带时加入适配子。
如上详述，在本发明的优选实施方式中，所述装置配置为流体装置，具有沿层析介质由离散位置形成的选择性捕获带和检测带。测试样品可以在选择性捕获带的上游位点暴露于层析介质，例如样品接收带。该位点或带可以由施加样品的样品垫的存在而形成。在某些实施方式中，该样品垫可以执行血液分离器功能，这样测试样品的某些成分，例如一种或多种类型的血液细胞，留存在样品垫的材料内，从而被防止进入层析条。
测试样品施加到样品接收带后，所述样品可以流过选择性捕获带并进入检测带。所述样品施加带可以通过例如可溶性屏障的方式与选择性捕获带间隔开，这样包含指示分子的测试样品在流入选择性捕获带前与例如硝酸纤维素条的层析介质的接触一段时间。层析介质也可以具有与其附着的位于选择性捕获带和检测带下游的吸收垫。这可以作为储存池以促进测试样品流动通过层析介质的带。
可以在测试样品已被允许穿过或沿介质通过后，将报告分子加入至层析介质。在优选实施方式中，当测试样品施加至介质时，报告分子可以以干燥形式与层析介质预先关联。一旦测试样品离开一段时间，以流过装置的选择性捕获带和检测带，所述报告分子可以通过例如加入合适的缓冲液重复原，接着流过层析介质，这样任何结合的指示分子被随后结合的报告分子标记。
如上所述，本发明的装置还可以包含含有控制捕获分子的控制捕获带。在某些实施方式中，控制捕获分子可以结合任何不结合至指示分子的报告分子。
在这样的装置使用中，本发明的方法还可以包含检测结合至控制捕获带内的控制捕获分子的任意报告分子。
如上定义，对于使用报告分子检测指示分子存在的实施方式，所述装置也可以包含控制报告分子。这样的控制报告分子可以在与报告分子加入至装置的相同时间加入至装置。其中所述装置是包含层析介质的流体装置，报告分子和控制报告分子两者都可以在测试样品施加至介质时以干燥形式与层析介质预先关联。报告分子的复原，例如使用合适的缓冲液，可以伴随着控制报告分子的复原。在这些情况下，本发明的装置可以进一步包含含有能够结合控制报告分子的控制捕获分子的控制捕获带。当使用这样的装置时，本发明的方法还可以包含检测结合至控制捕获带内的控制捕获分子的控制报告分子的存在。该“控制”读出对于间接确认报告分子在装置内存在和/或有功能或许是重要的。
本发明将参照以下条款得以进一步理解：
1.用于检测测试样品中酶活性的酶检测装置，包括：
(i)加入样品中的指示分子，该指示分子包括：
(a)酶可修饰区域，该区域能够被所述酶修饰，引起该区域从非修饰到修饰状态的转变；
(b)检测区域；不论所述酶可修饰区域的修饰状态如何，该区域不被所述酶修饰和能够被报告分子结合，和
(ii)接收测试样品的选择性捕获带，其中，该选择性捕获带包括能够选择性地结合至处于修饰或非修饰的任一种状态的指示分子的酶可修饰区域的选择性识别分子；和
(iii)接收与选择捕获区域接触后的测试样品的检测带，其中，检测带与选择性捕获带空间上间隔开从而测试样品向检测带的暴露发生在测试样品向选择性捕获带的暴露之后，和其中，只有那些不结合至选择性捕获带中的选择性捕获分子的指示分子进入检测带，其中，在所述选择性捕获带和/或检测带上检测所述指示分子。
2.条款1的装置，其中所述指示分子的检测区域包括捕获位点，所述检测带包括能够特异地结合至指示分子的捕获位点的捕获分子，如果所述指示分子存在的话。
3.条款1或2的装置，其中所述指示分子的酶可修饰区域包括肽、蛋白、碳水化合物，脂质或核酸。
4.条款1-3之一的装置，其中所述待检测酶选自如下种类：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶和连接酶，和包括蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶、硫酸酯酶、神经氨酸苷酶,唾液酸苷酶、脂酶，脱氧核糖核酸酶(DNAse)和核糖核酸酶(RNAse)，激酶；甘油转移酶；氧化酶；还原酶和转氨酶的亚种。
5.条款1-4之一的装置，其中所述待检测的酶为金属蛋白酶或者人中性粒细胞衍生的弹性蛋白酶。
6.条款1-5之一的装置，其中所述选择性识别分子为抗体或其抗原结合片段；生物素，链霉亲和素或他们的衍生物，血凝素，核酸分子，受体分子或激素结合蛋白。
7.条款1-6之一的装置，其中选择性捕获带包含固相支撑和位于固相支撑之上或之中的选择性识别分子，指示分子以修饰状态的任一种选择性结合于选择性识别分子。
8.条款1-7之一的装置，其中，一旦所述指示分子被选择性识别分子结合，所述酶可修饰区域不能够被所述酶修饰。
9.条款2-8之一的装置，其中所述指示分子的捕获位点直接结合至所述装置的检测带内存在的捕获分子。
10.条款9的装置，其中所述捕获位点和捕获分子是结合对的两半。
11.条款10的装置，其中结合对选自选自如下的结合对：抗原和抗体或者他们的结合片段；生物素和亲和素，链霉亲和素，中性亲和素或captavidin；免疫球蛋白或者片段和蛋白A或G；碳水化合物和血凝素；与核苷酸序列互补的序列；配体和受体分子；激素和激素结合蛋白；酶辅助因子和酶；酶的抑制剂和酶；纤维素结合区域和纤维素纤维；固定的氨基苯基硼酸和具有顺式-二醇分子；木葡聚糖和纤维素纤维及其类似物、衍生物以及片段。
12.条款10的装置，其中所述结合对是生物素和链霉亲和素。
13.条款10的装置，其中所述指示分子的捕获位点包含表位，并且捕获分子包含特异地结合至所述表位的抗体。
14.条款1-13之一的装置，其中所述指示分子的检测区域包含报告基团。
15.条款14的装置，其中所述报告基团从如下选择：金颗粒、发色团、发光化合物、荧光分子、放射化合物、可视化合物、脂质体或其他包含信号生成物质的囊泡、电活性物质、或酶和其底物的组合。
16.条款1-13之一的装置，还包括可以结合至或者能够结合至所述指示分子的检测区域的报告分子。
17.条款16的装置，其中所述指示分子的检测区域包括检测位点，与捕获位点不同并且空间上间隔开，所述报告分子通过所述检测位点结合至检测区域。
18.条款17的装置，其中所述检测位点包含表位，与捕获位点内存在的任意表位不同，并且所述报告分子包含特异地结合于所述表位的抗体。
19.条款18的装置，其中所述报告分子通过捕获位点结合至检测区域，其中所述报告分子与捕获位点的结合不损害捕获位点结合捕获分子的能力。
20.条款16-19之一的装置，其中所述报告分子包含报告基团，从如下选择：-金颗粒、发色团、发光化合物、荧光分子、放射化合物、可视化合物、脂质体或其他包含信号生成物质的囊泡、电活性物质、或酶和其底物的组合。
21.条款16-20之一的装置，其中所述报告分子与捕获区域的结合是间接的，通过能够同时结合检测区域和报告分子的适配子介导。
22.条款21的装置，其中在将测试样品加入至所述指示分子前，所述适配子与检测区域预复合。
23.条款21或22的装置，其中所述适配子是链霉亲和素并且所述检测区域包含生物素。
24.条款21或22的装置，其中所述适配子是适配子结合对，所述结合对包含：
(i)能够结合至所述指示分子的检测区域的第一成员；和
(ii)能够结合至所述对的第一成员和所述报告分子的第二成员。
25.条款24的装置，其中所述指示分子的检测区域包含生物素，所述适配子结合对的第一成员是亲和素或链霉亲和素，所述适配子结合对的第二成员是生物素，并且所述报告分子包含能够结合生物素的基团。
26.条款21-25的装置，其中多个报告分子可以结合每个指示分子。
27.条款21-26的装置，其中所述适配子结合至指示分子的检测区域中的捕获位点，从而捕获位点通过适配子间接地结合至存在于装置的检测带中的捕获分子。
28.条款27的装置，其中所述适配子是链霉亲和素并且所述捕获分子是生物素。
29.条款1-28之一的装置，其中所述检测带包括固相支撑，和所述捕获分子位于固相支撑之上或之中。
30.条款1-29的装置，其中所述装置为流体装置，和所述选择性捕获带和检测带沿着层析介质顺序存在。
31.条款16-30的酶检测装置，其中所述检测区域另外还包括固定的识别分子，在指示分子不存在时，报告分子结合至识别分子。
32.用于测试样品中酶活性检测的指示分子，包括：
(i)酶可修饰区域，该区域被所述的酶修饰，引起该区域从未修饰到修饰状态的转变，所述未修饰和修饰状态就被选择性识别分子结合而言是为结构上可区分的；
(ii)间隔开的捕获区域，不论所述酶可修饰区域的修饰状态如何，该区域被捕获分子结合；
(iii)间隔开的检测位点，不论所述酶可修饰区域的修饰状态如何和不论捕获位分子与捕获位点为之前或同时结合，该位点都能够被报告分子结合。
33.根据条款32的指示分子在条款1-30限定的酶检测装置中的应用。
34.用于检测测试样品中酶活性存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供一种酶检测装置，包括：
加入至测试样品中的指示分子，该指示分子包括：
(a)酶可修饰区域，能够被所述酶修饰，引起该区域从非修饰状态到修饰状态的转变；
(b)检测区域，不论所述酶可修饰区域的修饰状态如何，该检测区域不被酶修饰和能够被报告分子结合；
接收测试样品的选择性捕获带，其中，该选择性捕获带包括能够选择性地结合修饰或非修饰的任一种状态的指示分子的酶修饰区域的选择性识别分子；和
接收与选择捕获带接触后的测试样品的检测带，其中，检测带与选择性捕获带空间上间隔开；
(ii)提供怀疑有酶活性的测试样品；
(iii)在酶的活性－如果存在－能够修饰酶的修饰区域的条件下，将装置的指示分子加入至测试样品；
(iv)使测试样品与装置的选择性获带接触，使处于修饰或未修饰的任一种状态的指示分子与选择性捕获分子结合，从而，如果存在，使得修饰状态或非修饰状态中的指示分子与相反状态的指示分子分离；
(v)使测试样品与检测带接触，其中，只有不与选择性捕获带中的选择性捕获分子结合的指示分子进入检测带；和
(vi)检测存在于检测带和或选择性带中的任何指示分子。
35.条款34的方法，其中所述酶检测装置是条款1-31之一所述的酶检测装置。
36.条款34或35的方法，其中通过免疫分析方法进行检测带中任何指示分子的检测。
37.条款36的方法，其中通过ELISA、荧光免疫或者放射性免疫方法进行检测区域中任指示分子的检测。
38.条款34-37之一的方法，其中所述指示分子的检测区域包括捕获位点，并且所述检测带包括能够结合至指示分子的捕获位点的捕获分子，如果所述指示分子存在。
39.条款34-38之一的方法，其中所述选择性识别分子结合至处于未修饰状态的指示分子，并且检测带中指示分子的存在表示酶存在于测试样品中。
40.如条款1-31之一所述的酶检测装置在检测测试样品中酶活性中的用途。
41.一种参考附图酶在此充分描述的酶检测装置。
42.一种参考附图在此充分描述的检测测试样品中酶活性的存在的方法。
43.参考附图在此充分描述的酶检测装置的用途。
附图说明
现在通过关于附图的非限制性的实施例描述本发明，其中：
图1是根据本发明的一个实施方式的指示分子的示意图。
图2是根据本发明的一个实施方式的包含图1的指示分子的酶检测装置的示意图。
图3是根据本发明另一实施方式的指示分子的示意图。
图4是根据本发明另一实施方式的包含图3的指示分子的酶检测装置的示意图。
图5显示与本发明的酶检测装置联合使用的层析条的装配。
图6显示使用根据本发明的酶检测装置检测人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)活性产生的结果。
图7显示使用根据本发明的含有1、2、3、5和7个裂解位点的指示分子产生的结果，用于检测MMP9活性。
图8显示使用根据本发明的含有1、2、3和4个裂解位点的指示分子产生的结果，用于检测MMP9活性。
优选实施方式描述
图1显示根据本发明的优选实施方式的指示分子。所示的指示分子(1)包含酶可修饰区域(2)和含有捕获位点(4)和分隔的检测位点(5)的检测区域(3)。酶可修饰区域(2)的修饰引起该区域从未修饰状态至修饰状态的转变，其中这些不同的状态是被本装置(在此详细讨论的)的选择性识别分子结构上可区分的。在图1，可修饰区域(2)显示处于修饰中，藉由转移酶家族内的酶的作用加入化学基团“X”至该区域。
图2显示根据本发明优选实施方式的酶检测装置。所述装置包含如图1所述的指示分子(1)，和包含上游选择性捕获带(7)和下游的检测带(8)的层析测试条(6)。
在所示装置的实施方式中，通过结合至测试条(6)的固相支撑而固定的选择性识别分子(9)的存在形成选择性捕获带(7)。通过在第一位点固定的捕获分子(10)和在第二离散位点固定的另一识别分子(11)的存在形成检测带(8)。此外，检测带(8)与选择性捕获带(7)空间上间隔开，藉由沿着层析测试条(6)长轴的离散位置处各自的分子的固定形成每一条带。
使用中，可以在使测试样品与所述装置的选择性捕获带(7)接触前，将指示分子(1)加入至测试样品。一旦出现在选择性捕获带(7)，处于未修饰或修饰的任一种状态的指示分子(1)仅被那里存在的选择性识别分子结合。在图2所示的(优选)实施方式中，存在于选择性捕获带(7)的选择性识别分子(9)仅能够结合未修饰的指示分子(14)。如果存在任何修饰的指示分子(12)，则以“自由”或“未结合”形式在选择性捕获带(7)内。
在所述装置的优选实施方式中，选择性识别分子(9)以高亲和力结合至指示分子(1)，尤其是亲和力高于待检测酶对指示分子(1)的亲和力。此外，优选结合至选择性识别分子(9)的指示分子(1)不能被存在于测试样品内的酶(待检测)进行任何随后的修饰。在一旦测试样品施加至选择性捕获带(7)，便没有进一步的指示分子(1)的酶修饰发生的情况下，在装置的任何一个带测量的信号将不因指示分子的继续修饰而随时间改变。这样，本发明的装置可以用作可靠的和精确的终点分析。
在图2所示的优选实施方式中，装置配置为侧流装置。在这种实施方式中，测试样品通常在选择性捕获带(7)上游的位置施加至层析测试条(6)，从而通过毛细作用沿测试条(6)箭头所示方向被吸取。这样，在选择性捕获带(7)没有被捕获的任何指示分子将进入检测带(8)。
在装置的检测带(8)中，任何存在的修饰的指示分子(12)可以藉由指示分子的捕获位点(4)和检测带(8)内存在的捕获分子(10)之间的结合相互作用而定位。在图2，显示捕获分子(10)固定于层析测试条形成检测带(8)的区域内的离散位置。在本发明的优选实施方式中，指示分子的捕获位点包含表位，并且检测带内的捕获分子包含抗体，其特异地结合至存在于捕获位点的所述表位。
可以通过检测区域在所述装置的任一带测量指示分子(1)的存在。可以通过测量已经存在于检测区域内的报告基团生成的信号，或者通过测量特异地结合至检测区域的报告分子生成的信号进行检测。
在图2中，指示分子的检测区域包含明显的检测位点(5)，并且显示报告分子(13)在装置的检测带(8)内结合至该位点。在本发明的优选实施方式中，指示分子的检测位点(5)包含不同于在捕获位点发现的任何表位的表位，并且报告分子包含抗体，其特异地结合至存在于检测位点的所述表位。
报告分子本身可以通过任意本领域技术人员已知的合适方式包含有任意能够生成用于检测的信号的基团。在本发明的优选实施方式中，报告分子包含缀合至能够特异地结合指示分子的检测区域的分子的金颗粒，例如以上所述的抗体。
图2也显示另一识别分子(11)在检测带(8)内捕获分子(10)下游的位置固定于层析条上。如示，该另一识别分子(11)能够结合任意未结合至指示分子的报告分子(13)。在选择性捕获带(7)或检测带(8和10)缺失来自任意报告分子(13)的信号时，在检测带(8)内的该下游位置的报告分子信号的检测可以用于确认装置的报告分子能够生成阳性信号。
图3显示根据本发明第二优选实施方式的指示分子。所示的指示分子(16)包括含有单一裂解位点(18)的酶可修饰区域(17)。此外，指示分子具有检测区域(19)。在所示实施方式中，检测区域(19)由生物素部分(B)组成，从而能够结合至多价链霉亲和素适配子分子(20)。可以在暴露于疑似含有所述酶(如示)测试样品前，将指示分子与适配子分子预复合。或者，可以在酶裂解发生后，将适配子分子(20)加入至测试样品。
一旦本发明的指示分子(16)加入至测试样品，任何特异地识别存在的裂解位点(18)的酶，可以裂解指示分子(16)，导致该区域从未修饰(17)至修饰(21)状态的转变，其中这些不同的状态被本装置的选择性识别分子结构上区分。
图4显示根据本发明第二优选实施方式的酶检测装置。所述装置包含如图3所示的指示分子(16)，和包含上游选择性捕获带(23)和下游检测带(24)的层析测试条(22)。
在所示装置的实施方式中，通过结合至测试条(22)的固相支撑而固定的选择性识别分子(25)的存在形成选择性捕获带(23)。通过捕获分子(26)的存在形成检测带(24)，并且藉由在沿着层析测试条(22)长轴的离散下游位置处固定捕获分子(26)与选择性捕获带(23)空间上间隔开。
在使用中，在使测试样品与装置的选择性捕获带(23)接触前，将指示分子(16)加入至测试样品。如图4所示，一旦出现于装置的选择性捕获带(23)，指示分子能够以未修饰形式结合选择性识别分子(25)，而不是修饰的状态。在图4，由测试样品中存在的任意酶对指示分子的裂解位点(18)的裂解防止酶可修饰区域(17)被选择性捕获带内的选择性识别分子(25)识别。
在所示优选实施方式中，所述装置配置为包含层析测试条(22)的侧流装置。在该实施方式中，测试样品通常在选择性捕获带上游的位置施加至层析测试条，之后通过毛细作用沿测试条箭头所示方向被吸取。这样，在选择性捕获带(23)没有被捕获的任何指示分子(28)将进入检测带(24)。
在所述装置的检测带(24)，包含检测区域(28)的裂解的指示分子片段藉由检测区域(28)内的捕获位点(B)和存在于检测带(24)内的捕获分子(26)之间的相互作用而定位。
图4所示的装置的实施方式中，指示分子的检测区域包含生物素基团(B)，并且被多价链霉亲和素适配子分子(20)结合。该链霉亲和素适配子(20)用作指示分子的检测区域(19)和也包含生物素基团的捕获分子(26)之间的桥梁。
在本发明的方法中，可以在选择性捕获带、检测带或两者进行结合的未修饰指示分子或其裂解的“修饰的”片段的检测。可以通过测量检测区域内已经存在的报告基团生成的信号，或者测量特异地结合至检测区域的报告分子生成的信号进行检测。
在图4，显示报告分子(29)通过链霉亲和素适配子分子(20)结合至指示分子的检测区域。报告分子本身包含生物素基团(30)，其介导与链霉亲和素适配子的结合，并且金颗粒(31)缀合至所述生物素基团。以上详述了偶联报告分子至指示分子的检测区域的选择方式。
在所示实施方式中，结合至指示分子(19)的检测区域的链霉亲和素适配子分子(20)在检测带达到双重目的，其介导指示分子(16)与捕获分子(26)和报告分子(29)两者通过它们各自的生物素基团的结合。
参考如下实施例将进一步理解本发明。
实施例
实施例1 使用多聚链霉亲和素：多肽复合物指示分子的反相ELATABS平台
包含如下成分的试剂盒：-
1)用于收集样品的装置(例如用于尿液)
2)用于使金缀合物复水的chase缓冲液(chase buffer)，由pH 8.0的tris盐缓冲液(TBS)和1％TweenTM20组成。
3)侧流测试条，其固定在塑料盒内。测试条具有隐藏的捕获带，其包含四条预吸附线(PA线)形式的羊抗体，第二捕获带，包含缀合至转运蛋白(carrier protein)的生物素作为横穿测试条流动路径的第一测试线，和第三捕获带，在测试线的下游，包含吸附的抗鸡抗体，作为横穿测试条流动路径的控制线。在塑料盒中有观察窗，通过观察窗观察测试和控制线。在第一测试线的上游，还有整合的样品接收垫。此外，测试条有带有生物素的金颗粒，干燥进入测试条的样品接收垫上游，其可以通过在金缀合垫上游接收chase缓冲液的第二孔中加入缓冲液而被复原。
4)管，其中可设置样品收集装置，和指示分子。
5)连接至适配子分子(其可以合并进样品收集装置)的指示分子。指示分子含有可修饰区域，其携带末端生物素基团，通过聚乙二醇甘油间隔子/连接子连接，这允许其与适配子分子链霉亲和素形成复合物。所述可修饰区域被固定于隐藏的捕获带的羊抗体识别。
测试条
如下所述，根据本发明构建用于检测液体样品中蛋白酶活性的测试条。所述分析基于在丝氨酸蛋白酶人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)存在时指示分子的修饰，这使其与测试线形成复合物。用试条测试了包括创面积液样品的各种样品，用于检测蛋白酶活性。
A.制备金-浸渍缀合垫
使用Isoflow分样仪(喷射高度7mm)以0.9μl/mm用稀释于金干燥缓冲液(50mMTris，150mM氯化钠，20mM叠氮钠，1％BSA，10％海藻糖，1％Tween20，pH8.0)的OD4生物素:40nm金缀合物(Innova Bioscience)、OD2鸡IgY金缀合物(Mologic)喷射Whatman玻璃纤维垫(Whatman,Rapid 24Q,12mm×300mm)。处理的缀合物条在隧道式干燥室内在60℃以10mm/sec的速度干燥。在室温，将干燥的金缀合-浸渍缀合垫干燥保存于有干燥剂的密封铝箔袋。
B.制备抗体-浸渍的硝酸纤维素膜
以0.05μl/mm的分配速率将所有试剂条带化于Millipore HF090膜(Millipore,HF09004S40,40×300mm)上。PA线由距离膜的基线10、12、14和16mm处的1mg/ml CF1060(Mologic)构成，测试线由距离膜的基线23mm处的浓度为0.4mg/mlBSA的生物素(Mologic)构成，控制线由距离膜的基线28mm处的浓度为0.5mg/ml的羊抗鸡IgY(Lampire，7455207)构成。处理的膜在隧道式干燥室内在60℃以10mm/sec的速度干燥。干燥的抗体-浸渍的硝酸纤维素膜室温保存于有干燥剂的密封铝箔袋。
C.chase缓冲液
50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮钠、1％vol/vol Tween 20，pH8.0的水溶液。
D.卡装配
根据详细说明了每个卡部件的确切纵向维度和位置的如下步骤和图5装配测试卡。准备后，修剪所述卡，获得多个用于蛋白酶分析的试条。
·1.一张75×300mm的清洁的具有离型膜保护胶的塑料膜作为衬片(51)(G&LPrecision Die Cutting,28840)，放置于工作台上。撕去离型膜以暴露胶带的粘性面。
·2.将按照B部分准备的反应膜(52)附着于底衬(51)的粘性面上，距离低末端16mm。
·3.将按照A部分准备的浸渍的缀合垫(53)附着于底衬(51)上，在反应膜(52)上交叠1mm。
·4.将缓冲垫(54,Whatman,CF5,11×300mm)放置于底衬(51)上，于缀合垫(53)上交叠6mm。
·5.双面胶(55,G&L Precision Die Cutting,GL-187)附着覆盖于缀合垫(53)上，距离低末端15mm。
·6.样品接收垫/血液分离膜(56,Spectral SG membrane,Primecare)覆盖放置于去掉覆盖层的胶带(55)上，距离低末端15mm。
·7.吸收垫(57,Gel blotting paper,Ahlstrom,grade 222,23×300mm)放置于底衬(51)上侧上，于反应膜(52)上交叠3mm。
使用自动化冲压裁剪机(Kinematic,2360)修剪所述卡至4mm宽的试条，并组装进入2孔塑料壳体(BBI Dundee,vision)。使用在Mologic专门为该装置生产的气动压板装置封闭所述装置。
在以下描述的实施例中，制备缓冲液标准品，含有从2000ng/ml低至62.5ng/m的不同浓度的HNE(Lee biotech,342-40)。
步骤1：液体样品(测试样品)放于具有固定量的与适配子蛋白质(100ng/test)预复合的多肽(6ng/test)的收集装置中。预确定多肽与适配子蛋白质的比率以保证最佳结合。剧烈旋转所述收集装置以使样品与底物溶液充分混合。在室温下孵育该反应混合物固定的时间段(例如10分钟)。
步骤2：在孵育期结束时，滴加固定体积的液体至样品接收垫(56)。当液体迁移至测试条上，任何完整的指示分子被隐藏的捕获带中的预-吸附线识别并捕获。在那里，样品中的HNE已经破坏底物区域，指示分子超生物素测试线迁移，通过多聚链霉亲和素适配子蛋白质固定在那里。
步骤3：一旦样品在用作储存池的吸收垫(57)帮助下已经通过测试条(52)，加入两滴试剂盒中提供的chase缓冲液至缓冲垫(54)，与干燥的附着于金颗粒的生物素接触并使其复水。当缀合的金颗粒进入隐藏的捕获带，任何结合至预吸附线的完整的指示分子籍由多聚链霉亲和素适配子蛋白质被标记。那些没有在隐藏的捕获带结合至完整指示分子的沿试条向下迁移，并标记任何被测试线捕获的指示分子。使用单独的控制系统，其包含结合至羊抗鸡IgY控制线的连接于金颗粒的鸡IgY。存在线表示测试完成。
通过其相对强度评估形成的线。存在测试线并且存在完全强度的控制线表示在测试样品内存在蛋白酶。阴性测试线指示没有或低于检测限的低水平的蛋白酶。这两项极端之间的阶段指示测试样品内不同水平的蛋白酶。用视觉和NES侧流装置读取仪测量产生的有颜色的线的强度。具有0-10数值范围的半定量评分系统用于视觉读取，其中1是最低的可检测颜色强度，10是观测到的最高颜色强度。
图6显示出当运行加入了HNE标准的缓冲液样品时分析的灵敏性。使用20μl体积的样品，对HNE的检测限大约在500-1000ng/ml。显示读取仪单位，高于1的数值被认为是阳性的。
实施例2 使用具有一个或多个裂解位点的多聚链霉亲和素：多肽复合物指示分子 的反相ELTABA平台用于检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)
包含如下成分的试剂盒：-
1)用于收集样品的装置(例如用于尿液)
2)用于使金缀合物复水的chase缓冲液，由pH 8.0的tris盐缓冲液(TBS)和1％TweenTM20组成。
3)侧流测试条，其固定在塑料盒内。测试条具有隐藏的捕获带，捕获带包含四条预吸附线(PA线)形式的羊抗体，第二捕获带，包含缀合至转运蛋白(carrier protein)的生物素作为横穿测试条流动路径的第一测试线，和第三捕获带，在测试线的下游，包含吸附的抗鸡抗体，作为横穿测试条流动路径的控制线。在塑料盒中有观察窗，通过观察窗观察测试和控制线。在第一测试线的上游，还有整合的样品接收垫。此外，测试条有带有生物素的金颗粒，干燥进入测试条的样品接收垫上游，其可以通过在金缀合垫上游接收chase缓冲液的第二孔中加入缓冲液而被复原。
4)管，其中可设置样品收集装置，和指示分子。
5)指示分子(其可以合并进样品收集装置)。指示分子由包含MMP-9偏好的氨基酸序列―GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)―组成。指示分子携带末端生物素基团，通过聚乙二醇甘油间隔子/连接子连接，这允许其与适配子分子链霉亲和素形成复合物。也包括能够被固定于隐藏的捕获带中的羊抗体识别的第一捕获区域(ALP)。使用了具有不同数量的MMP9裂解位点的不同指示分子，特别是1、2、3、5和7个MMP9裂解位点。
6)适配子分子，例如含有能够与含有裂解位点的指示分子形成复合物的多个结合区域的多聚链霉亲和素。
测试条
如下所述，根据本发明构建用于检测液体样品中蛋白酶活性的测试条。所述分析基于在MMP-9存在时指示分子中的裂解产生将结合至测试线的片段。用试条测试了包括创面积液样品的各种样品，用于检测蛋白酶活性。
A.制备金-浸渍缀合物垫
使用Isoflow分样仪(喷射高度7mm)以0.9μl/mm用稀释于金干燥缓冲液(50mMTris，150mM氯化钠，20mM叠氮钠，1％BSA，10％海藻糖，1％Tween20，pH8.0)的OD4生物素:40nm金缀合物(Innova Bioscience)、OD2鸡IgY金缀合物(Mologic)喷射Whatman玻璃纤维垫(Whatman,Rapid 24Q,12mm×300mm)。处理的缀合物条在隧道式干燥室内在60℃以10mm/sec的速度干燥。在室温，将干燥的金缀合-浸渍缀合垫干燥保存于有干燥剂的密封铝箔袋。
B.制备抗体-浸渍的硝酸纤维素膜
以0.05μl/mm的分配速率将所有试剂条带化于Millipore HF090膜(Millipore,HF09004S40,40×300mm)上。PA线由距离膜的基线10、12、14和16mm处的1mg/ml CF1060(Mologic)构成，测试线由距离膜的基线23mm处的浓度为0.4mg/mlBSA的生物素(Mologic)构成，控制线由距离膜的基线28mm处的浓度为0.5mg/ml的羊抗鸡IgY(Lampire，7455207)构成。处理的膜在隧道式干燥室内在60℃以10mm/sec的速度干燥。干燥的抗体-浸渍的硝酸纤维素膜室温保存于有干燥剂的密封铝箔袋。
C.Chase缓冲液
50mM Tris，150mM氯化钠，20mM叠氮钠，1％vol/vol Tween 20，pH8.0的水溶液。
D.装配卡
根据详细说明了每个卡成分的确切纵向维度和位置的如下步骤和图5组装测试卡。准备后，修建所述卡，获得多个用于蛋白酶分析的试条。
·1.一张75×300mm的清洁的具有离型膜保护胶的塑料膜作为衬片(51)(G&LPrecision Die Cutting,28840)，放置于工作台上。撕去离型膜以暴露胶带的粘性面。
·2.将按照B部分准备的反应膜(52)附着于底衬(51)的粘性面上，距离低末端16mm。
·3.将按照A部分准备的浸渍的缀合垫(53)附着于底衬(51)上，在反应膜(52)上交叠1mm。
·4.将缓冲垫(54,Whatman,CF5,11×300mm)放置于底衬(51)上，于缀合垫(53)上交叠6mm。
·5.双面胶(55,G&L Precision Die Cutting,GL-187)附着覆盖于缀合垫(53)上，距离低末端15mm。
·6.样品接收垫/血液分离膜(56,Spectral SG membrane,Primecare)覆盖放置于去掉覆盖层的胶带(55)上，距离低末端15mm。
·7.吸收垫(57,Gel blotting paper,Ahlstrom,grade 222,23×300mm)放置于底衬(51)上侧上，于反应膜(52)上交叠3mm。
使用自动化冲压裁剪机(Kinematic,2360)修剪所述卡至4mm宽的试条，并组装进入2孔塑料壳体(BBI Dundee,vision)。使用在Mologic专门为该装置生产的气动压板装置封闭所述装置。
在以下描述的实施例中，制备缓冲液标准品，含有从2000ng/ml低至31.25ng/m的不同浓度的MMP-9(Mologic)。
步骤1：液体样品(测试样品)放于具有固定量多肽(6ng/test)的收集装置中。剧烈旋转所述收集装置以使样品与指示分子充分混合。在室温下孵育该反应混合物固定的时间段(例如10分钟)，之后加入适配子分子(100ng/test)，其与指示分子上的生物素形成复合物。
步骤2：在孵育期结束时，滴加固定体积的液体至样品接收垫(56)。孵育期前加入至样品的指示分子能够通过第1捕获区域结合至隐藏的捕获带中的羊抗体(CF1060)。存在于样品中的任何MMP-9在裂解位点裂解指示分子，使裂解的片段从隐藏的捕获带释放。裂解的片段超生物素测试线迁移，通过多聚链霉亲和素适配子分子固定在那里。
步骤3：一旦样品在用作储存池的吸收垫(57)帮助下已经通过测试条(52)，加入两滴试剂盒中提供的chase缓冲液至缓冲垫(54)，与干燥的连接于金颗粒的生物素接触并使其复水。当缀合的金颗粒进入隐藏的捕获带，任何结合至预吸附线的完整的指示分子籍由多聚链霉亲和素适配子蛋白质被标记。那些没有在隐藏的捕获带结合至完整指示分子的沿试条向下迁移，并标记任何被测试线捕获的指示分子。使用单独的控制系统，其包含结合至羊抗鸡IgY控制线的连接于金颗粒的鸡IgY。存在线表示测试完成。
通过其相对强度评估形成的线。存在测试线并且存在完全强度的控制线表示在测试样品内存在蛋白酶。阴性测试线指示没有或低于检测限的低水平的蛋白酶。这两项极端之间的阶段指示测试样品内不同水平的蛋白酶。用视觉和NES侧流装置读取仪测量产生的有颜色的线的强度。
结果显示于表1和图7。
表1
图7显示当运行加入了MMP9标准的缓冲液样品并且指示分子具有1、2、3、5和7个MMP9裂解位点时分析的灵敏性。灵敏性从指示分子具有1个裂解位点时可见的250-500ng/ml MMP9，至指示分子具有7个裂解位点时的<31.25ng/ml。
实施例3 使用具有一个或多个裂解位点的合成多肽指示分子反相ELTABA平台用 于检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)
包含如下成分的试剂盒：-
1)用于收集样品的装置(例如用于尿液)
2)用于复水金缀合物的chase缓冲液，由pH 8.0的tris盐缓冲液(TBS)和1％TweenTM20组成。
3)侧流测试条，其固定在塑料盒内。测试条具有隐藏的捕获带，捕获带包含四条预-吸附线(PA线)形式的多聚链霉亲和素，第二捕获带，包含抗-DNP作为横穿测试条流动路径的第一测试线，和第三捕获带，在测试线的下游，包含吸附的抗鸡抗体，作为横穿测试条流动路径的控制线。在塑料盒中有观察窗，通过观察窗观察测试和控制线。在第一测试线的上游，还有整合的样品接收垫。此外，测试条具有带有抗-FITC的金颗粒，干燥进入测试条的样品接收垫上游，其可以通过在金缀合垫上游接收chase缓冲液的第二孔中加入缓冲液而被复原。
4)测试管，其中可设置样品收集装置，和指示分子。
5)指示分子(其可以合并进样品收集装置)。指示分子由包含MMP-9偏好的氨基酸序列－即GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)、用作第2捕获位点的DNP和最后作为检测位点的荧光标记组成。所述肽携带末端生物素基团，通过聚乙二醇甘油间隔子/连接子连接，被固定于隐藏的捕获带中的多聚链霉亲和素识别。此外，也使用了包含2、3和4个MMP9裂解位点的识别分子。为了测试使用具有多个裂解位点的指示分子的分析的灵敏性，进行了这些试验。
测试条
如下所述，根据本发明构建用于检测液体样品中蛋白酶活性的测试条。所述分析基于在MMP-9存在时指示分子中的裂解产生将结合至测试线的片段。用试条测试了包括创面积液样品的各种样品，用于检测蛋白酶活性。
A.制备金-浸渍缀合物垫
使用Isoflow分样仪(喷射高度7mm)以0.9μl/mm用稀释于金干燥缓冲液(50mMTris，150mM氯化钠，20mM叠氮钠，1％BSA，10％海藻糖，1％Tween20，pH8.0)的OD4抗FITC金缀合物(Mologic)、OD2鸡IgY金缀合物(Mologic)喷射Whatman玻璃纤维垫(Whatman,Rapid24Q,12mm×300mm)。处理的缀合物条在隧道式干燥室内在60℃以10mm/sec的速度干燥。在室温，将干燥的金缀合-浸渍缀合垫干燥保存于有干燥剂的密封铝箔袋。
B.制备抗体-浸渍的硝酸纤维素膜
以0.05μl/mm的分配速率将所有试剂条带化于Millipore HF090膜(Millipore,HF09004S40,40×300mm)上。PA线由距离膜的基线10、12、14和16mm处的1mg/ml多聚链霉亲和素(BBI,Dundee,01041049L)构成，测试线由距离膜的基线23mm处的浓度为1mg/ml羊抗DNP(Bethyl labs,A150117A)构成，控制线由距离膜的基线28mm处的浓度为0.5mg/ml的羊抗鸡IgY(Lampire，7455207)构成。处理的膜在隧道式干燥室内在60℃以10mm/sec的速度干燥。干燥的抗体-浸渍的硝酸纤维素膜室温保存于有干燥剂的密封铝箔袋。
C.Chase缓冲液
50mM Tris，150mM氯化钠，20mM叠氮钠，1％vol/vol Tween 20，pH8.0的水溶液。
D.卡装配
根据详细说明了每个卡成分的确切纵向维度和位置的如下步骤和图5组装测试卡。准备后，修建所述卡，获得多个用于蛋白酶分析的试条。
·1.一张75×300mm的清洁的具有离型膜保护胶的塑料膜作为衬片(51)(G&LPrecision Die Cutting,28840)，放置于工作台上。撕去离型膜以暴露胶带的粘性面。
·2.将按照B部分准备的反应膜(52)附着于底衬(51)的粘性面上，距离低末端16mm。
·3.将按照A部分准备的浸渍的缀合垫(53)附着于底衬(51)上，在反应膜(52)上交叠1mm。
·4.将缓冲垫(54,Whatman,CF5,11×300mm)放置于底衬(51)上，于缀合垫(53)上交叠6mm。
·5.双面胶(55,G&L Precision Die Cutting,GL-187)附着覆盖于缀合垫(53)上，距离低末端15mm。
·6.样品接收垫/血液分离膜(56,Spectral SG membrane,Primecare)覆盖放置于去掉覆盖层的胶带(55)上，距离低末端15mm。
·7.吸收垫(57,Gel blotting paper,Ahlstrom,grade 222,23×300mm)放置于底衬(51)上侧上，于反应膜(52)上交叠3mm。
使用自动化冲压裁剪机(Kinematic,2360)修剪所述卡至4mm宽的试条，并组装进入2孔塑料壳体(BBI Dundee,vision)。使用在Mologic专门为该装置生产的气动压板装置封闭所述装置。
制备缓冲液标准品，含有从2000ng/ml低至7.8ng/m范围的不同浓度的MMP-9(Mologic)。
步骤1：液体样品(测试样品)放于具有固定量的指示分子(400pg/test)的收集装置中。剧烈旋转所述收集装置以使样品与指示分子充分混合。在室温下孵育该反应混合物固定的时间段(例如10分钟)。
步骤2：在孵育期结束时，滴加固定体积的液体至样品接收垫(56)。孵育期前加入至样品的指示分子能够通过第1捕获区域结合至隐藏的捕获带中的多聚链霉亲和素。存在于样品中的任何MMP-9在裂解位点裂解指示分子，使裂解的片段从隐藏的捕获带释放。裂解的片段超抗-DNP测试线迁移，通过DNP捕获位点固定在那里。
步骤3：一旦样品在用作储存池的吸收垫(57)帮助下已经通过测试条(52)，加入两滴试剂盒中提供的chase缓冲液至缓冲垫(54)，与干燥的连接于金颗粒的抗-FITC接触并使其复水。当缀合的金颗粒进入隐藏的捕获带，任何结合至预吸附线的完整的指示分子籍由荧光标记检测位点被标记。那些没有在隐藏的捕获带结合至完整指示分子沿试条向下迁移，并标记任何被测试线捕获的指示分子。使用单独的控制系统，其包含结合至羊抗鸡IgY控制线的连接于金颗粒的鸡IgY。存在线表示测试完成。
通过其相对强度评估形成的线。存在测试线并且存在完全强度的控制线表示在测试样品内存在蛋白酶。阴性测试线指示没有或低于检测限的低水平的蛋白酶。这两项极端之间的阶段指示测试样品内不同水平的蛋白酶。用视觉和NES侧流装置读取仪测量产生的有颜色的线的强度。结果显示于表2和图8。
表2
图8显示当运行加入了MMP9标准的缓冲液样品和指示分子具有1、2、3和4个MMP9裂解位点时分析的灵敏性。所有指示分子的取舍值低于<31.25ng/ml，包含具有4个裂解位点的肽的分析显得更灵敏。信号强度随裂解位点的数量而增加，特别是在低水平MMP9，显示更清晰的取舍值。
本发明的范围并不限于本文所述的具体实施方式。事实上，根据前面的描述和附图，除了本文所述的以外，本发明的各种修改对本领域技术人员来说是显而易见的。这样的修改都将落入所附权利要求书的范围内。此外，本文所描述的本发明的所有方面和实施方案都被认为是广泛适用的，并可与任何且所有其他兼容的实施方式合并，包括酌情取自本发明的其他方面(包括分离)的实施方案。本文引用了各种出版物，其公开的内容通过引用整体并入。
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<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide
<400> 1
Gly Pro Gln Gly Ile Phe Gly Gln
1 5

Claims (23)

1.用于检测测试样品中酶活性的酶检测装置，包括：
(i)加入样品中的指示分子，该指示分子包括：
(a)酶可修饰区域，该区域能够被所述酶修饰，引起该区域从非修饰到修饰状态的转变；
(b)检测区域；不论该酶可修饰区域的修饰状态如何，该区域未被所述酶修饰和能够被报告分子结合，其中，不论该酶可修饰区域的修饰状态如何，该检测区域还包括一捕获位点，该捕获位点能够被捕获分子结合；和
(ii)用来接收测试样品的选择性捕获区域，其中，该选择性捕获区域包括能够选择性地结合处于修饰或未修饰任一状态中的指示分子的酶可修饰区域的选择性识别分子；和
(iii)用来接收与选择捕获区域接触后的测试样品的检测区域，其中，检测区域与选择性捕获区域空间上间隔开从而向检测区域暴露测试样品发生在先向选择性捕获区域暴露测试样品之后，其中，检测区域包括能够特异结合指示分子的捕获位点的捕获分子，如果指示分子存在的话，和其中，只有那些不结合选择性捕获区域中的选择性识别分子的指示分子进入检测区域，其中，所述指示分子在选择性捕获区域和/或检测区域上被检测。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，指示分子的酶可修饰区域包括肽、蛋白、碳水化合物、脂质或核酸。
3.根据权利要求1所述的装置，其中被检测的酶选自如下种类：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶和连接酶。
4.根据权利要求1所述的装置，其中被检测的酶选自如下种类：蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶、神经氨酸苷酶、唾液酸苷酶、酯酶、激酶、甘油转移酶、氧化酶、还原酶和转氨酶的亚种。
5.根据权利要求1所述的装置，其中，被检测的酶为金属蛋白酶或者人中性粒细胞衍生的弹性蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的装置，其中，选择性识别分子为抗体或其抗原结合片段；生物素，链酶亲和素或它们的衍生物；凝集素；核酸分子；受体分子或激素结合蛋白。
7.根据权利要求1所述的装置，其中，一旦所述指示分子被选择性识别分子结合，所述酶可修饰区域不能够被所述酶修饰。
8.根据权利要求1所述的装置，其中，捕获位点和捕获分子为结合对中的两半，其中，所述的结合对的两半选自如下的结合对：抗原和抗体或者它们的结合片段；生物素和亲和素，链霉亲和素，中性亲和素或captavidin；免疫球蛋白或其合适的域和蛋白A或G；碳水化合物和凝集素；核苷酸序列互补的序列；配体和受体分子；激素和激素结合蛋白；酶辅助因子和酶；酶的抑制剂和酶；纤维素结合区域和纤维素纤维；固定的氨基苯基硼酸和具有顺式-二醇的分子；木葡聚糖和纤维素纤维；和它们的类似物，衍生物以及片段。
9.根据权利要求1所述的装置，其中，另外包括结合至指示分子的检测区域或者能够结合指示分子的检测区域的报告分子。
10.根据权利要求9所述的装置，其中，所述指示分子的检测区域包括与捕获位点不同并且空间上间隔开的检测位点，和所述报告分子通过所述检测位点结合至检测区域。
11.根据权利要求9所述的装置，其中，所述报告分子通过捕获位点结合到检测区域上，其中报告分子与捕获位点的结合不消弱捕获位点结合捕获分子的能力。
12.根据权利要求9所述的装置，其中，所述报告分子与检测区域的结合是间接的，并且通过能够同时结合所述检测区域和所述报告分子的适配子作为媒介完成。
13.根据权利要求9所述的装置，其中，多个所述的报告分子可以结合每一个指示分子。
14.根据权利要求12所述的装置，其中，所述适配子结合到指示分子中的检测区域中的捕获位点，从而捕获位点通过适配子间接地结合存在于装置的检测区域中的捕获分子。
15.根据权利要求1所述的装置，其中，检测区域包括固相支撑，和捕获分子位于固相支撑之上或之中。
16.根据权利要求1所述的装置，其中，所述装置为流体装置，和所述的选择性捕获区域和检测区域沿着层析介质顺序存在。
17.根据权利要求9所述的酶检测装置，其中，所述检测区域另外还包括固定的识别分子，在指示分子不存在的时候，报告分子结合至识别分子。
18.用于检测测试样品中酶活性存在的方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供一种酶检测装置，包括：
加入样品中的指示分子，所述指示分子包括：
(a)酶可修饰区域，能够被所述酶修饰，引起该区域从非修饰状态到修饰状态的转变；
(b)检测区域，不论该酶可修饰区域的修饰状态如何，该检测区域不被酶修饰和能够被报告分子结合；其中，不论该酶可修饰区域的修饰状态如何，该检测区域还包括一捕获位点，该捕获位点能够被捕获分子结合；
用来接收测试样品的选择性捕获区域，其中，该选择性捕获区域包括能够选择性地结合处于修饰或未修饰任一种状态的指示分子的酶可修饰区域的选择性识别分子；和
用来接收与选择性捕获区域接触后的测试样品的检测区域，其中，检测区域与选择性捕获区域空间上间隔开；其中，检测区域包括能够特异结合指示分子的捕获位点的捕获分子，如果指示分子存在的话，
(ii)提供怀疑有酶活性的测试样品；
(iii)在如果存在所述酶的活性能够修饰所述酶可修饰区域的条件下，把装置的指示分子加入到测试样品中；
(iv)让测试样品与装置的选择性捕获区域接触，从而让处于修饰或未修饰的任一状态的指示分子与选择性识别分子结合，从而，如果存在，允许修饰形式或未修饰形式的指示分子与相反状态的指示分子分离；
(v)让测试样品与检测区域接触，其中，只有不结合至选择性捕获带内的选择性识别分子的指示分子进入检测区域；其中，进入检测区域的指示分子被位于检测区域中的捕获分子所捕获和
(vi)检测任何存在于检测区域和/或选择性捕获区域中的任何指示分子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述酶检测装置为如权利要求1-17之一所述的装置。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，通过免疫分析方法进行检测区域中任何指示分子的检测。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，通过ELISA，荧光免疫或者放射性免疫方法进行检测区域中任何指示分子的检测。
22.根据权利要求18-21任一项所述的方法，其中，所述选择性识别分子结合至未修饰状态的指示分子，和检测区域中指示分子的存在表示酶存在于测试样品中。
23.如权利要求1-17之一所述的酶检测装置在测试样品中酶活性中的用途。
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