CN104470975B - 可用于治疗诊断学的聚合纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

描述了用于受控药物递送的基于淀粉的pH‑响应性纳米颗粒的合成和表征。通过新的一锅法合成了具有不同的淀粉与MAA摩尔比的聚甲基丙烯酸接枝的淀粉(PMAA‑g‑St)纳米颗粒，所述一锅法能够同时在水性介质中实现PMAA的接枝和纳米颗粒形成。NMR数据表明，聚山梨醇酯80聚合成接枝聚合物。纳米颗粒是相对球形的，具有狭窄的尺寸分布和多孔的表面形态，且在生理pH范围表现出pH依赖性膨胀。颗粒尺寸和体积相变的量级依赖于PMAA含量和制剂参数，诸如表面活性剂水平、交联剂量和总单体浓度。结果表明，新的pH‑响应性纳米颗粒具有对受控药物递送有用的性能。

Description

可用于治疗诊断学的聚合纳米颗粒
技术领域
本发明涉及可用于递送治疗剂和/或诊断剂的聚合纳米颗粒。
背景技术
许多天然的多糖(诸如淀粉和海藻酸盐)存在于食品中或被用作食品成分。淀粉是在自然界中存在的最丰富的多糖之一。该生物聚合物具有(C6H10O5)n的分子式，其中n的范围为300-1000[1]。淀粉由2种被称作直链淀粉和支链淀粉的聚合物的混合物组成[1,2]。直链淀粉分子由通过α-1,4缩醛键连接的α-D-吡喃葡萄糖单元组成。支链淀粉分子大得多且高度支化。所述分子含有α-1,4直链键，且通过α-1,6键支化[1,2]。大多数在工业中使用的淀粉经常含有20-30％直链淀粉，余量为支链淀粉(70-80％)和诸如脂质和蛋白的次要组分(小于1％)[3]。
淀粉会提供独特的优势。淀粉是相对安全的，具有十分适用于体内应用的生物相容性和生物可降解谱。在胶体系统的情形下，淀粉具有稳定性能，从而使它成为生物分子开发的有用候选物。淀粉含有许多羟基，所述羟基能够发生醇特有的各种化学反应。这可以将多种药物、靶向部分、金属螯合剂、荧光探针等与基于淀粉的材料结合。基于淀粉的材料还可以是非常有成本效益的。尽管具有这些优势，但淀粉作为生物材料和在药物递送应用中具有有限的应用。天然淀粉由于它的较差机械和化学性能而具有有限的应用；但是，可以做出各种修饰来改善淀粉的性能和拓宽它的应用。最常见的化学修饰是接枝、氧化、酯化、醚化和水解。由于淀粉的可生物降解性能和稳定性能与丙烯酸聚合物的pH响应特性的组合，用基于丙烯酸的单体接枝淀粉可以产生具有潜在药物递送和生物医学应用的材料。
已经合成淀粉-黄原胶水凝胶用于通过由三偏磷酸钠交联淀粉和黄原胶进行受控药物递送[4]。已经使用辐射、光解或催化剂和引发剂如金属离子、过氧化物或过硫酸盐[5-12]通过不同乙烯基单体的接枝聚合来修饰淀粉[5]。乙烯基单体在淀粉上的接枝通常通过自由基引发来实现。已经将淀粉接枝共聚物用作水凝胶、絮凝剂、离子交换剂、超级吸收剂等[13-18]。
亲水丙烯酸单体可以形成具有可调节的膨胀动力学的水凝胶，且已经用于药物递送和其它生物医学应用，诸如改善成骨细胞粘附[19-21]。淀粉的可生物降解性能与基于丙烯酸的聚合物的pH响应特性的组合可以导致在生物医学和药物递送中具有潜力的受关注的水凝胶。以前公开的工作已经证实，过硫酸钾能够引发甲基丙烯酸向淀粉上的接枝；但是，形成大量的同聚物[22]。通过使用过硫酸钾/硫代硫酸钠氧化还原引发系统，Hebeish等人能够有效地将聚甲基丙烯酸接枝到淀粉上，同时使同聚物形成最小化[6,7]。
在许多应用中，响应于环境刺激(诸如pH)的快速相变是受期望的。但是，大尺寸的大块水凝胶通常经历缓慢的尺寸变化，因为聚合网络中的构象变化以及溶质和水穿过所述网络的扩散需要时间。由于响应时间与扩散距离的平方成比例，通过调节水凝胶尺寸可以控制相变速率[23]。通常，纳米尺寸的聚合物会经历膨胀平衡和微秒级的相变。因此，刺激响应性纳米颗粒可以潜在地用在刺激响应性药物递送中，且可以因为它们对刺激的极快响应而充当传感器或微开关。
尽管存在关于乙烯基单体的接枝聚合的众多出版物，但关于基于纳米尺寸淀粉的pH敏感颗粒的开发和表征的公开数据非常有限。Saboktakin等人最近已经描述了聚甲基丙烯酸向羧甲基淀粉上的接枝以产生本体聚合物[24]。该作者随后使用冷冻干燥法来生产纳米粉末；但是，他们的方法没有产生纳米颗粒在水性介质中的稳定胶体分散体。Saboktakin等人还已经描述了聚甲基丙烯酸向作为紫杉醇的递送系统的壳聚糖纳米颗粒上的接枝[24(a)]。Hirosue等人已经在国际专利公开WO 2010/084060中描述了具有淀粉骨架的聚合物，在所述淀粉骨架上，在用连接物(诸如2-溴异丁酰基溴)修饰骨架以后通过原子转移自由基聚合(ATRP)来接枝甲基丙烯酸酯单体。通过乳剂扩散法用所述淀粉聚合物配制纳米颗粒。
发明内容
本文描述的发明包括用于合成纳米颗粒的方法。
本发明的纳米颗粒包括聚合物骨架，其具有接枝在其上的含有羧基或氨基的聚合链。在纳米颗粒外表面上存在的聚乙氧基化物部分共价连接以作为纳米颗粒的一部分。
本发明的纳米颗粒特别可用作例如治疗剂和/或信号分子的载体。
优选地，在“一锅”合成过程中在水溶液中形成本发明的纳米颗粒，其中单体接枝聚合在骨架聚合物上，并且聚乙氧基化物部分参与所述聚合以共价地合并为纳米颗粒的一部分。
在公开的实施方案中，所述聚合物骨架由淀粉提供，所述单体是甲基丙烯酸(MAA)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAEM)，且所述聚乙氧基化部分由聚山梨醇酯80(吐温80)提供。
本发明的纳米颗粒特别可用作载体纳米颗粒。所述载体的货物(cargo)或净荷(playload)可以是治疗剂，诸如药物、信号分子如荧光团(例如荧光素胺)、钆等。
可以在纳米颗粒形成之后，向纳米颗粒加载治疗剂。可替换地，且特别是在颗粒货物包括当在患者中存在时不希望从载体颗粒逐出的信号分子或其它分子的情况下，可以在纳米颗粒产生之前通过与聚合物共价连接而用所述分子将所述聚合物官能化。在公开的实例中，将有机螯合剂二亚乙基三胺五乙酸二酸酐(DTPA二酸酐)与纳米颗粒共价连接。在一个实例中，在纳米颗粒产生之前，将DTPA与多糖聚合物骨架共价连接；在另一个实例中，将DTPA与已经形成的纳米颗粒连接。将Gd+3加载入作为纳米颗粒的一部分预安装的螯合剂中。
在另一个实例中，将已知为水溶性的药物盐酸多柔比星加载入本发明的纳米颗粒中，并表征体内行为。
可能得到具有相对低的多分散性指数(PDI)的本发明的纳米颗粒。提供了单分散体的一个实例，即其中纳米颗粒具有小于0.12的PDI的组合物。
本发明的纳米颗粒(其中存在多个羧基或氨基)是pH敏感的，并且提供了解释毫秒级相变的实例。在一个方面，已经检查了例示的颗粒的尺寸，其依赖于各种加工参数和pH。在本文中例示了其中平均直径从100nm变化至超过300nm的纳米颗粒组合物。
在抗癌药物多柔比星的情况下，一个实例示出加载药物的纳米颗粒，其提供在药物抗性细胞系中的IC50下降，观察到多达19倍的下降。因此，载体纳米颗粒的潜在应用是用于治疗药物抗性乳腺癌的多柔比星受控递送。
加载Gd+3的纳米颗粒可以用在磁共振成像(MRI)造影剂中，并且在本文中例示了该用途。
还通过荧光素胺异构体I例示了具有与所述颗粒共价连接的有机荧光探针的纳米颗粒的用途。
本发明的纳米颗粒具有体外和体内应用。例如，本文描述的体外研究指示癌细胞对所述颗粒的细胞摄取和针对肝细胞的微小细胞毒性，从而表明可用于药物递送和诊断应用。
例示的颗粒的NMR研究指示，聚山梨醇酯80(PS80)被聚合入聚甲基丙烯酸接枝的淀粉纳米颗粒且存在于颗粒表面上。使聚乙氧基化的聚山梨醇酯(已知其表现出表面活性剂性能)与纳米颗粒共价结合，会向所述载体提供在生物系统中的稳定性。此外，已知PS80会结合血液中的低密度脂蛋白(LDL)，从而经由LDL受体介导的胞吞转运作用促进纳米颗粒穿过血脑屏障。共价结合的PS80可以给这样的颗粒赋予有利的脑靶向潜力。除了本文描述的我们的离体研究以外，成像数据会提供纳米颗粒穿过血脑屏障之能力的证据。
因此，本发明的一个实施方案是生产纳米颗粒的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将聚合物溶解在液体溶液中；
(b)提供包含羧酸侧基的可聚合单体；
(c)将所述单体接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合链，
(d)提供乙氧基化分子，其具有可与形成的链反应的官能团，其中：
步骤(c)在乙氧基化分子的存在下进行，以使所述乙氧基化分子与所述聚合链共价连接。
所述液体溶液可以包括羟基溶剂诸如水，一种或多种醇，特别是乙醇，或水和醇的混合物，特别是水和乙醇的混合物。
所述聚合物可以是具有0.05-3(或0.5-3、或1-3、或2-3)取代度/聚合物单元的多羟基聚合物，所述单体可以包括烯基，且所述接枝聚合步骤可以在有交联剂的存在下进行。
根据一个实施方案，步骤(c)的单体以交联剂的量的1-20倍(mol/mol)的量存在。
所述聚合步骤可以是在自由基引发剂的存在下进行的自由基接枝聚合过程。所述引发剂可以基本上不含过渡金属。特定的引发剂是过硫酸盐或其功能等效物。
乙氧基化分子的乙氧基化物基团可以用游离羟基封端。所述乙氧基化分子可以包括烯基，所述烯基发生化学反应以将表面活性剂分子与聚合链共价连接。在一个特定实施方案中，乙氧基化分子是具有R(C9-C31)-C(O)O-基团的聚乙氧基化脱水山梨糖醇，其中所述脱水山梨糖醇在所述聚合步骤中通过R(C9-C31)-C(O)O-基团的C-C共价键与第二种聚合物连接。所述R(C9-C31)-C(O)O-基团可以含有至少一个C-C不饱和性，其在所述聚合步骤中反应以形成C-C共价键。
可以选择聚合物的量和步骤(c)的单体的量，以产生这样的纳米颗粒：其中聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是0.1-10。
所述聚合步骤可以在表面活性剂(通常是阴离子表面活性剂)的存在下进行。
实施方案包括：产生用于递送生物试剂的纳米颗粒，其中所述试剂与步骤(a)的聚合物共价连接。所述聚合物可以是多羟基化聚合物，其中所述试剂通过其羟基氢原子的置换而与所述聚合物共价连接。所述试剂可以是能够络合金属的有机部分，且所述方法可以包括形成金属-有机部分络合物。可以选择金属，以提供在磁共振成像中的信号，例如，可以是Gd+3。
可以将步骤(c)的单体的量选择为足够高的，以使在pH 7.4和10mM的离子强度测量的所产生的纳米颗粒的水溶液的ζ电位的绝对值为至少15mV。
通过将所述试剂和从本发明的方法得到的纳米颗粒分散在液体介质中以将所述试剂并入所述纳米颗粒，可以产生用于递送生物试剂的纳米颗粒。
通过共价连接至从本发明的方法产生的纳米颗粒和将所述试剂共价连接至所述纳米颗粒的聚合链的羧酸基团，可以产生用于递送生物试剂的纳米颗粒。
根据一个实施方案，本发明是产生载体纳米颗粒的方法，所述方法包括下述步骤：
(i)将聚合物溶解在水溶液中；
(ii)提供包含羧酸侧基的可聚合单体；
(iii)将所述单体接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合链，
(iv)提供聚乙氧基化分子，其具有可与形成的链反应的官能团，其中：
聚合步骤(iii)在聚乙氧基化分子的存在下进行，以将所述聚乙氧基化分子与形成的链共价连接，且聚合的产物形成所述纳米颗粒，其中聚乙氧基化部分在所述纳米颗粒的外部上。
本发明包括纳米颗粒，其包含：(a)第一聚合物；(b)与所述第一聚合物接枝的第二聚合物；和(c)与所述第二聚合物共价结合的聚乙氧基化部分。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒的第二聚合物可以包括聚合的乙烯基，所述第二聚合物的骨架的每2个碳具有约1个羧基。所述第二聚合物可以是聚烯基聚合物。所述聚烯基聚合物可以是聚丙烯酸。根据一个特定实施方案，所述聚丙烯酸是聚甲基丙烯酸。
所述聚乙氧基化部分可以是具有R(C9-C31)-C(O)O-基团的脱水山梨糖醇，其中所述脱水山梨糖醇通过R-基团的C-C共价键与第二聚合物连接。
所述纳米颗粒的第一聚合物可以包括多羟基聚合物。
所述第二聚合物可以是交联的。
实施方案包括含有多个纳米颗粒的组合物，组合物可以包括药学活性剂。这样的试剂可以例如吸附至纳米颗粒。
组合物可以包括纳米颗粒和信号分子。所述信号分子可以是被有机部分螯合的金属，其中所述部分与纳米颗粒共价结合。有机部分可以与所述第一聚合物共价结合。
所述信号分子可以与所述纳米颗粒共价结合，优选地与羧酸侧基共价连接。信号分子的一个实例是荧光团。
含有纳米颗粒的组合物可以进一步包括药学活性剂。
一个实施方案包括这样的纳米颗粒，其含有：(I)第一聚合物，其包含多糖；(II)第二交联聚合物，其包含与所述第一聚合物接枝的聚甲基丙烯酸；和(III)聚山梨醇酯，其包含与所述第二聚合物共价结合的(C9-C31)R-C(O)O-基团，所述共价结合通过所述第二聚合物的碳骨架与所述R基团之间的C-C键实现。
纳米颗粒的(C9-C31)R-C(O)O-基团可以是-(C17)R-C(O)O-，其中R是直链烷基。所述聚山梨醇酯可以包括基团-O(CH2CH2O)w-C(O)(C17)R、HO(CH2CH2O)x-、-HO(CH2CH2O)y-和-HO(CH2CH2O)z-，其中w+x+y+z＝20。所述多糖的分子量可以是约2,600至约4,500Da。
所述多糖的单体单元与所述聚甲基丙烯酸的单体甲基丙烯酸酯单元的摩尔比可以是在0.2-8.0之间。
所述聚山梨醇酯与所述聚甲基丙烯酸的单体甲基丙烯酸酯单元的摩尔比可以是在0.002-0.03之间。
本发明的一个实施方案是生产纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：
(a)将聚合物溶解在液体溶液中；
(b)提供包含烷基氨基烷基酯侧基的可聚合单体；
(c)提供交联剂；和
(d)将所述单体接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合链，以形成所述纳米颗粒。
所述聚合物可以是具有0.05-3取代度/聚合物单元的多羟基聚合物，所述单体可以包括烯基，且所述接枝聚合步骤可以在交联剂的存在下进行。所述多羟基聚合物可以具有1-3取代度/聚合物单元。
所述可聚合单体可以是甲基丙烯酸的烷基氨基烷基酯，例如，甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯。
所述交联剂可以是乙二醇二甲基丙烯酸酯。
步骤(d)的单体可以以交联剂的量的1-200倍(mol/mol)的量存在。
可以选择聚合物的量和步骤(c)的单体的量，以产生这样的纳米颗粒：其中聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是0.05-20，例如，2-4。
聚山梨醇酯可以存在于步骤(d)中。
所述可聚合单体可以以所述聚山梨醇酯的量的5-50倍(mol/mol)、或约10-40、或约15-35、或约20-30(mol/mol)的量存在。
非离子稳定剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮)可以存在于步骤(d)中。
本发明包括纳米颗粒，其含有：(i)第一聚合物，其包含多糖；和(ii)第二交联聚合物，其包含与所述第一聚合物接枝的甲基丙烯酸的烷基氨基烷基酯，其中所述第二聚合物是交联的。
所述第二聚合物可以是聚合的甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯。
所述第二聚合物可以包括聚合的乙烯基，所述第二聚合物的骨架的每2个碳具有约1个羧基。所述多糖可以是淀粉。可以产生这样的纳米颗粒：当将它们的环境溶液的pH从约4变为约7.4时，其表现出500-1500倍的增加的体积变化，或当将它们的环境溶液的pH从约4变为约7.4时，则呈现约600至1400倍，或约700至约1300倍，或约500至约1300倍，或约400至1100倍，或约700至1100倍，或约800倍，或约900倍，或约1000倍，或约1100倍。
附图和表格简述
图1显示了最大化学计量为1的多柔比星和纳米颗粒的羧酸基团之间的相互作用的图解数据。(A)在不同pH的缓冲液中滴定8.5mM多柔比星的空白示差焓曲线。(B)在不同pH的缓冲液中将8.5mM多柔比星滴定进0.1mg/ml PMAA-g-St-PS80纳米颗粒中的示差焓曲线。通过加入NaCl，将离子强度保持恒定在0.15M。
图2显示了(A)淀粉、(B)PMAA-PS 80和(C)PMAA-PS 80-g-St的FTIR光谱。指定主峰，并在文本中解释。
图3显示了在0.05M NaOD中的A)PS 80、B)淀粉、C)PMAA-PS80、D)PMAA-PS80-g-St-2、E)PS80、F)淀粉、G)DTPA、H)St-DTPA、I)PMAA-PS 80-g-St和J)PMAA-PS 80-g-St-DTPA的1H NMR谱。如在分子路线图上所示的那样指定主峰。
图4显示了穿过血脑屏障的来自毛细血管腔的PMAA-g-St-PS80-FITC外渗。PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒的脑分布和积累的定性和定量结果。全脑的离体近红外荧光图像。(A)与未注射纳米颗粒的正常脑相比，静脉内(iv)注射纳米颗粒以后随时间变化的脑中相对荧光强度的比率。将数据表示为平均值±标准差(n＝4)。(B)静脉内施用盐水(左)、PMAA-PS80-g-St(中)和PMAA-PS 80-g-St(右)以后45分钟，灌注小鼠脑的荧光显微术图像。对于用PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒处理的样品而言，可以在脑毛细血管的血管周围区域中检测到颗粒。
图5的示意图解释了三元共聚物合成的反应路线图中的不同步骤。
图6显示了：(A)在0.15M PBS(pH＝7.4)中的PMAA-g-St-2的TEM图像。将纳米颗粒用钼酸铵染色，并在碳包被的网格上干燥。(B)在0.15M pH 7.4PBS中的纳米颗粒的强度加权流体动力学直径。所述颗粒表现出高斯分布，且是相对单分散的。
图7显示了PDEAEM-g-St-2纳米颗粒的TEM图像。
图8显示了：(A)对于0.15M PBS中MAA/St的不同进料摩尔比，纳米颗粒的相对直径相对于pH的图。D7.4和D4分别是在pH 7.4和4的颗粒直径。(B)对于不同MAA/St摩尔比的颗粒，pH对表面电荷的影响。使用NaCl将离子强度保持恒定在10mM。数据点代表3个独立测量结果的平均值±标准差。
图9显示了：(A)电位测定滴定曲线。空三角形代表PMAA-g-St-2胶乳分散体的未校正的电位测定滴定曲线。固体含量＝0.104重量％，Cs＝0.05N NaCl，[NaOH]＝0.1N，[HCl]＝0.1N。实心圆圈代表校正后的滴定曲线。空心圆圈显示了空白滴定曲线。箭头代表当量点。使用当量点来计算不同纳米颗粒批次中的MAA含量。(B)表观解离常数(pKa)作为不同淀粉纳米颗粒的电离程度(α)和MAA含量的函数的变化。
图10显示了在注射之间使用30s的稳定时间的正向和反向电位测定滴定。(A)PMAA，(B)PMAA-g-St-2，(C)PMAA-g-St-4。仅在具有高淀粉含量的纳米颗粒的情况下，观察正向和反向滴定之间的延迟时间。
图11显示了表观解离常数(pKa)作为不同淀粉纳米颗粒的电离程度(α)和MAA含量的函数的变化。
图12显示了(A)SDS、(B)PS 80、(C)总单体浓度和(D)交联剂摩尔比对颗粒尺寸和pH敏感性的影响。实心正方形代表颗粒尺寸，实心三角形代表相对颗粒直径。数据点代表3个独立测量结果的平均值±标准差。
图13显示了(A)在0.15M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加载有多柔比星(LC＝33％)的PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒的数目加权高斯分布，和(B)加载多柔比星的纳米颗粒(LC＝33％)的透射电子显微照片(TEM)。
图14显示了以下物质的XRD谱：(A)天然形式的多柔比星，(B)PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒，(C)加载多柔比星的纳米颗粒(LC＝50％)，和(D)在室温贮存6个月以后的加载多柔比星的纳米颗粒(LC＝50％)。对于多柔比星，在衍射图中看到指示结晶相在天然形式中存在的明显峰，而纳米颗粒显示典型的无定形模式。加载多柔比星的纳米颗粒的衍射图中的峰的缺失指示出结晶的多柔比星向无定形多柔比星的相转化。
图15显示了最大化学计量为1的多柔比星和纳米颗粒的羧酸基团之间的相互作用的图解数据。(A)在具有不同NaCl含量的DDIW中滴定8.5mM多柔比星的空白示差焓曲线。(B)在不同pH的具有不同NaCl含量的DDIW中将8.5mM多柔比星滴定进0.1mg/ml PMAAg-St-PS80纳米颗粒中的示差焓曲线。
图16显示了来自纳米颗粒的pH依赖性的多柔比星释放。指示了在37℃时pH对多柔比星释放动力学的影响，所述多柔比星释放自具有50％的药物加载含量的纳米颗粒。使用游离多柔比星从透析袋的释放作为对照。对于每个缓冲系统，通过加入NaCl将离子强度保持恒定在0.15M。
图17显示了(A)在有和没有(对照)用荧光纳米颗粒(NP)孵育4小时的情况下，MDA-MB435/LCC6细胞(野生型(WT)和多药抗性型(MDR1))的荧光显微术图像。将细胞核用Hoescht 33342染色，并用DAPI滤光片显影，将细胞膜用VybrantTMDiI染色，并用Cy3滤光片显影，并将纳米颗粒用荧光素胺异构体I标记，并用FITC滤光片显影。每2μm从细胞的最上面和最下面区域做光学切片，从而允许选择大约在细胞核的中点处的图像。(B)用0.25mg/mlPMAA-PS 80-g-St纳米颗粒处理4小时的MDA-MB435/LCC6细胞的TEM显微照片。给纳米颗粒加载钆离子(金属)，并且表现为电子致密沉积物。在左侧图像中用虚线指示的区域是右侧图像的放大图。
图18显示了野生型和药物抗性的人乳腺癌细胞有效地内吞纳米颗粒。MDA-MB435/LCC6细胞的流式细胞计量术直方图指示孵育时间和温度对颗粒摄取的影响。以0.25mg/ml的最终纳米颗粒浓度，将细胞与荧光标记的纳米颗粒一起在37℃孵育。(A)MDA-MB435/WT(1)背景，(2)1小时孵育，(3)4小时孵育，(4)24小时孵育。(B)MDA-MB435/WT(1)背景，(2)4℃，(3)24℃。(C)MDA-MB 435/MDR1(1)背景，(2)1小时孵育，(3)4小时孵育，(4)24小时孵育。(D)MDA-MB435/MDR1(1)背景，(2)4℃，(3)24℃。使用488nm氩离子激光激发，并在530nm监测发射。
图19解释了加载多柔比星的纳米颗粒在表达MDR1的人乳腺癌细胞中表现出显著更低的IC50值。通过MTT测定确定了MDA-MB435/LCC6细胞类型对游离多柔比星和加载多柔比星的纳米颗粒的响应。(A-B)暴露于递增浓度的游离多柔比星和加载多柔比星的纳米颗粒24小时(A)和48小时(B)以后，MDA-MB435/LCC6/WT(n＝3)细胞的细胞生存力。(C-D)暴露于递增浓度的游离多柔比星和加载药物的纳米颗粒24小时(C)和48小时(D)以后，MDA435/LCC6/MDR1(n＝3)细胞的细胞活性。使用没有处理和与空白纳米颗粒一起孵育的细胞分别作为游离药物和加载药物的纳米颗粒的对照。将细胞活性表达为每个治疗组相对于对照的百分比。数据点代表为每个实验指定的试验数目的平均值±标准差。
图20显示了(A)SA-NP和PF-NP的TEM图像。(B)染料结合的纳米颗粒显示NIR荧光特征。(C)SA-NP和PF-NP的物理化学性能的总结。颗粒直径是指在5分钟内平均的读出的数目加权直径。加载效率(LE％)是并入纳米颗粒中的最初加入的药物的比例，而药物加载含量(LC％)是药物重量相对于纳米颗粒总重量的百分比。将所有值描述为3个独立试验的平均值±标准差。加载溶液中的Dox的总量是1.25mg。
图21显示了Balb/c小鼠的冠状T1-加权的(3D-FLASH,TE/TR 3/25毫秒,翻转角20°)全身图像，所述Balb/c小鼠注射有(A)(0.1mmol/kg Gd3+)、(B)PolyGd(0.025mmol/kg Gd3+)和(C)PolyGd-Dox(0.025mmol/Kg Gd3+)。在幻灯片A中描绘了心脏、肝、膀胱。幻灯片B显示了肾和腔静脉。在1/4剂量的PolyGd和PolyGd-Dox在延长的时段内产生了高得多的对比。
图22显示了脑(左)和血液(右)的荧光强度(相对于基线归一化)的比率；数据提供了PMAA-g-St-PS80在脑中的沉积的证据。
图23显示了(A)SA-NP和PF-NP的TEM图像。(B)SA-NP和PF-NP的物理化学性能的总结。颗粒直径表示在5分钟内平均的读出的数目加权直径。加载效率(LE％)是并入纳米颗粒中的最初加入的药物的比例，而药物加载含量(LC％)是药物重量相对于纳米颗粒总重量的百分比。将所有值描述为3个独立试验的平均值±标准差。加载溶液中的Dox的总量是1.25mg。
图24显示了(A)使用锥虫蓝排除测定，空白直链聚合物和纳米颗粒、加载Gd3+的聚合物和纳米颗粒、以及游离Gd3+在大鼠肝细胞中的体外细胞毒性。将Gd3+加载入直链聚合物和纳米颗粒中会显著降低在细胞中的Gd3+毒性(*与对照相比统计上显著的(p<0.05))。(B)暴露30min、60min、120min或240min的盐水(黑色)、空白聚合物(深灰色)、PolyGd(浅灰色)和游离Gd3+(白色)对培养物中的大鼠肝细胞的毒性。“％活”表示排除锥虫蓝的肝细胞的百分比。显示了3个试验的平均值和标准差。星号(*)表示存活值相对于对照的显著差异(p<0.05)。
图25显示了暴露30min、60min、120min或240min的盐水(黑色)、空白聚合物(深灰色)、PolyGd(浅灰色)和游离Gd3+(白色)对培养物中的大鼠肝细胞的毒性。“％活”表示排除锥虫蓝的肝细胞的百分比。显示了3个试验的平均值和标准差。星号(*)表示存活值相对于对照的显著差异(p<0.05)。
图26显示了(A)携带正位乳腺肿瘤模型的小鼠中SA-NP和PF-NP的整个动物实时生物分布和肿瘤靶向。在静脉内注射之前(基线)，然后在纳米颗粒注射以后的不同小时直到14天，确定纳米颗粒相关的荧光。用箭头指示肿瘤。(B)SA-NP和PF-NP从全身(左)和肿瘤(右)的时间依赖性的排泄谱。将目标区域的荧光强度记录为平均辐射效率。将数据表示为平均值±标准差(n＝2×3)。C)
图27显示了全身分布的定量MRI：(A)用加载Gd3+的PMAA-g-St聚合物(0.025mmol/kg Gd+3)注射的Balb/c小鼠的R1图谱。(B)与基线相比，(0.1mmol/Kg Gd3+)、PolyGd(0.025mmol/Kg Gd3+)和PolyGd-Dox(0.025mmol/Kg Gd3+)随时间在左心室血液、肝、膀胱和肾中的弛豫率的变化ΔR1。与相比，PolyGd和PolyGd-Dox造成血液弛豫率在延长的时间段中的高得多的增加。将数据表示为3个独立运行的平均值±标准差。(C)SA-NP和PF-NP的组织分布和肿瘤积累的定量结果。与正常主要器官和未注射NIR染料结合的纳米颗粒的肿瘤相比，在静脉内注射纳米颗粒以后，主要器官、肿瘤和血液的相对荧光强度的比率随时间变化。将数据表示为平均值±标准差(n＝2×3)。
图28显示了SA-NP和PF-NP的组织分布和肿瘤积累的定量结果。与正常主要器官和未注射NIR染料结合的纳米颗粒的肿瘤相比，在静脉内注射纳米颗粒以后，主要器官、肿瘤和血液的相对荧光强度的比率随时间变化。将数据表示为平均值±标准差(n＝2×3)。
图29显示了PolyGd(0.025mmol/kg Gd3+)在荷瘤Balb/c小鼠中的生物分布、消除和肿瘤积累。使用ICP-AES确定Gd3+含量。将数据表示为3个独立运行的平均值±标准差。
图30是并入纳米颗粒的聚山梨醇酯80(PS80)的示意图。PS80能够结合Apo-E，所述Apo-E转而结合脑微血管中的LDL受体，从而实现纳米颗粒的胞吞转运作用。NMR数据指示PS80聚合成St-g-PMAA纳米颗粒和直链聚合物。共价结合PS80确保体内稳定性。
图31显示的TOF-SIMS数据指示颗粒表面上的聚山梨醇酯80表达。TOF-SIMS以阳离子模式通过在255、265、267、281和283处的特征峰清楚地显示了PS80的存在，表明作为脱水山梨糖醇分子的侧链的油酸和硬脂酸脂肪酸系列。
图32显示了给予加载Gd3+的纳米颗粒以后小鼠脑的MR成像。(A)在基线和给予PMAA-g-St-P80以后20分钟，小鼠冠状脑切片的R1图谱。(B)在不同时间点的脑R1值。(C)脑分布的定量MRI：注射有加载Gd3+的PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒(0.05mmol/kg Gd+3)的Balb/c小鼠(n＝3)的R1图谱。(D)加载Gd3+的PMAA-PS 80-g-St-DTPA聚合物在矢状窦、脑室、皮质和亚皮质中随时间的纵向弛豫率(R1)。星号(*)表示与基线相比R1值的显著差异(p<0.05)。(E)在不同时间点的脑R1值。
图33显示了(A)通过用近红外染料(Hilyte Fluor 750,荧光素胺异构体I)标记的PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒的生物发光成像(左)和分布(右)获取的脑肿瘤的代表性图像。结果强烈地提示纳米颗粒在脑肿瘤中的积累。通过细胞的颅内注射，建立MDA-MB-231-luc-D3H2LN的脑转移。1周后，在腹膜内注射萤光素溶液以后3-5min，将脑肿瘤成像。在尾静脉注射纳米颗粒以后6小时，获取荧光图像。(B)使用DAPI和RFP滤光片获取的脑肿瘤切片的荧光显微图像，所述滤光片设置成使Hoescht 33342染色的细胞核(蓝色)和NIR HF 750-标记的纳米颗粒显影。图像清楚地显示了纳米颗粒(红色)和Dox(绿色)共局部化，从而提示Dox由纳米颗粒递送至肿瘤组织并且从纳米颗粒释放进入脑肿瘤中。
图34显示了加载Gd(III)的直链聚合物在小鼠肿瘤模型中实现显著的MR对比。(A)PolyGd(上)和PolyGd-Dox(下)(0.025mmol/kg Gd3+)的肿瘤分布：T1-加权的图像(1)和对应的R1图谱(2)。箭头指示在右后胁腹皮下植入的肿瘤。(B)肿瘤周围和肿瘤核心中的ΔR1的时程，从而显示甚至在造影剂注射以后48小时升高的肿瘤R1。将数据表示为3个独立运行的平均值±标准差。
图35显示了基于淀粉的纳米颗粒在EMT6/WT荷瘤小鼠中的抗肿瘤活性。在第0天在正位植入肿瘤细胞。在第8和15天，以等于Dox的2×10mg/kg剂量，用(A)5％右旋糖(n＝2×4)、(B)游离Dox(n＝8)、PF-NP(n＝2×4)、(C)PF-NP和(D)SA-NP(n＝2×3)治疗小鼠。测量肿瘤体积直到第62天。每条曲线代表1只动物。(E)5％右旋糖、游离Dox、PF-NP和SA-NP的Kaplan Meier存活曲线。存活曲线的趋势是显著不同的(p＝0.0033,Mantel Cox)。在第8天和第15天，通过静脉内注射不同制剂来治疗小鼠。(F)以等于Dox的2×10mg/kg剂量，用5％右旋糖(n＝2×4)、游离Dox(n＝2×4)、PF-NP(n＝2×4)和SA-NP(n＝2×3)治疗的荷瘤小鼠的体重的时间谱。给Balb/c小鼠在乳房脂肪垫中接种EMT6/WT肿瘤，并在接种后第8天和第15天接受治疗。每条曲线代表1只动物。(G)以等于Dox的2×10mg/kg剂量，用5％右旋糖(n＝2×4)、游离Dox(n＝2×4)、PF-NP(n＝2×4)和SA-NP(n＝2×3)治疗的荷瘤小鼠的体重的时间谱。给Balb/c小鼠在乳房脂肪垫中接种EMT6/WT肿瘤，并在接种后第8天和第15天接受治疗。每条曲线代表1只动物。
图36显示了(A)MIP血管造影照片，其显示在以0.03mmol Gd/kg注射加载Gd3+的PMAA-g-St-DTPA之前(基线)和之后15分钟得到的(1)全身和(2)头颈区域的对比增强。(B)在全身血管造影照片中从下腔静脉测量的血管信号与噪音(S/N)比率和对比与噪音(C/N)比率的动力学。*表示相对于基线的显著差异(p<0.05)。将数据表示为3个独立运行的平均值和标准差。
图37显示了(A)纯淀粉、(B)PDEAEM和(C)PDEAEM-g-St的FTIR光谱。
图38显示了(A)淀粉、(B)PDEAEM和(C)PDEAEM-g-St的HNMR谱。
图39显示了0.15M PBS(pH＝4)中的PDEAEM-g-St-1纳米颗粒的强度-重量分布。
图40显示了0.15M PBS(pH＝7.4)中的PDEAEM-g-St-1的强度-重量分布。
图41显示了不同淀粉组合物的PDEAEM-g-St颗粒的直径在25℃随介质的pH的变化。
图42显示了Gd-结合的PDEAEM-g-St-DTPA纳米颗粒在不同pH的直径。
图43显示了纳米颗粒中的近红外染料结合。A)结合反应的示意图。(B)与空白相比用NIR染料标记的PMAA-g-St-PS80。C)纳米颗粒显示对于4.3μmol/g的染料含量在820nm的荧光发射。
图44显示了(A)PMAA-g-St-P80聚合物在鼠乳腺癌肿瘤模型中的肿瘤积累。在尾静脉注射0.2ml PMAA-g-St-PS80(4.5mg/ml)以后，在不同时间点对动物成像。用箭头指示肿瘤。
表1显示了纳米颗粒制备配方和聚合物组成。将反应收率定义为纯化的三元共聚物与进料中MAA、PS 80和淀粉的总重量的比率。
表2显示了加载药物的纳米颗粒的表征。显示了药物加载对颗粒尺寸和表面电荷的影响。颗粒直径表示在5分钟内平均的读出的数目加权直径。加载效率是并入纳米颗粒中的最初加入的药物的比例，而药物加载含量是药物重量相对于纳米颗粒总重量的百分比。将所有值报告为3个独立试验的平均值±标准差。
表3显示了在不同pH的0.15M PBS中，具有不同MAA/St进料摩尔比的纳米颗粒的强度加权流体动力学直径。使用NaCl将离子强度保持恒定。将所有值描述为3个独立试验的平均值±标准差。
表4显示了从滴定数据计算的进料和产物MAA含量以及在pH 4和pH 7.4及10mM离子强度的缓冲液中的ζ电位值。将所有值描述为3个独立试验的平均值±标准差。
表5A显示了St-DTPA-g-PMAA-P80的Gd+3含量和体外弛豫率；在3T和7T在0.9％NaCl中测量弛豫率。已经包括Omniscan用于比较。
表5B显示了PolyGd和PolyGd-Dox的Gd3+含量、Dox含量、分子量、颗粒尺寸和r1。在3和7T下于盐水中测量r1。显示了3个独立实验的平均值和标准差。基于它的分子式，计算的分子量。
表6显示了PolyGd和PolyGd-Dox的Gd3+含量、Dox含量、分子量、颗粒尺寸和r1。在3和7T下于盐水中测量r1。显示了3个独立实验的平均值和标准差。基于它的分子式，计算的分子量。
表7显示了不同PDEAEM-g-St批次的进料组合物。
实施例
化学品和试剂
可溶性淀粉(MW 2,600-4,500Da)、甲基丙烯酸(MAA)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、硫代硫酸钠(STS)、过硫酸钾(KPS)、聚山梨醇酯80(PS 80)和十二烷基硫酸钠(SDS)购自Sigma-Aldrich Canada(Oakville,ON,加拿大)。在使用之前，通过真空蒸馏除去MAA抑制剂。所有其它化学物质是试剂级，并且原样使用。
细胞系和维持
鼠乳腺癌细胞系EMT6/WT最初由Ian Tannock博士(Ontario Cancer Institute,Toronto,ON,加拿大)提供，现在维持在我们的实验室中。在37℃在5％CO2/95％空气保湿培养箱中，在75cm2聚苯乙烯组织培养瓶上培养细胞单层。将癌细胞维持在补充了10％胎牛血清(Cansera Inc.,Etobicoke,ON,加拿大)的α-最低必需培养基(Ontario CancerInstitute Media Laboratory,Toronto,ON,加拿大)中。将生长至汇合的细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen Inc.,Burlington,ON,加拿大)进行胰蛋白酶处理，在新鲜生长培养基中稀释(1/10)，并重新接种。
实验动物和正位乳腺肿瘤的诱导
所有动物工作得到大学健康网络(University Health Network)动物护理委员会批准，并根据加拿大动物护理委员会(Canadian Council on Animal Care)颁布的所有指南和规定进行所有实验。使用8周龄雌性Balb/c小鼠(Jackson laboratory,Maine,USA)。在整个研究中，允许动物自由获取食物和水。对于肿瘤研究，将100万个鼠EMT6乳腺癌细胞皮下注射进左胁腹。监测肿瘤的生长，并在5mm的肿瘤平均直径开始MRI研究。
纳米颗粒的制备和表征
实施例1.聚甲基丙烯酸接枝的淀粉(PMAA-g-St)纳米颗粒的合成
PMAA-PS-80-g-St纳米颗粒的合成
使用过硫酸钾/硫代硫酸钠引发(KPS/STS)系统，使用自由基分散聚合法在一锅中制备PMAA-g-St纳米颗粒。进行一系列初步研究，以鉴别合适的表面活性剂类型和浓度以及得到稳定颗粒所需的单体浓度。
在浸在水浴中的配有氮气入口、冷凝器、温度计和磁力搅拌器的500ml三颈烧瓶中进行聚合。通过在95℃加热30分钟，将期望量的淀粉溶解在蒸馏水中，冷却至70℃，并用N2净化30分钟以除去任何溶解的氧。随后，在搅拌的同时将期望量的SDS、PS 80、KPS和STS加入淀粉溶液中。15分钟以后，通过向溶液中加入所需量的氮净化的MAA和MBA，开始反应。在5分钟以后出现乳光，继续在70℃进行反应8小时以确保完全转化。将产物用温水充分洗涤2次，并用甲醇萃取，随后超速离心以除去任何未反应的物质和同聚物。将纯化的颗粒冷冻干燥，并储存在干燥器中用于将来使用。
使用方程式1计算接枝收率百分比(GY％):
其中W1是纯化的产物的重量，且WT是进料中的单体的总重量。
在另一个实例中，在500ml三颈烧瓶中进行聚合，所述烧瓶浸入水浴中且配有氮气入口、冷凝器、温度计和磁力搅拌器。首先，将期望量的淀粉(图1)溶解在170ml蒸馏的去离子水(DDIW)中，将其在95℃加热30分钟。将溶液冷却至70℃，并用N2净化30分钟以除去任何溶解的氧。接着，加入溶解在5ml DDIW中的0.45mmol的KPS和1.36mmol的STS。10分钟以后，在搅拌下将溶解在10ml DDIW中的期望量的SDS和PS 80(图1)加入反应混合物中。15分钟以后，通过加入在10ml用氮气净化的水中的已知量的MAA和MBA(表1)开始反应，并通过加入DDIW将最终溶液体积调至200ml(表1)。5分钟后出现乳光，在70℃继续反应8小时以确保完全转化。将产物用温水和甲醇充分洗涤，随后超速离心(96,000g)以除去任何未反应的物质和同聚物。将纯化的颗粒冷冻干燥，并储存在干燥器中用于将来使用。
使用下述方程式计算反应收率百分比(RY％):
其中W1是纯化的产物的重量，且WT是进料中的MAA、淀粉和PS 80的总重量。
用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)证实接枝
在Perkin Elmer Spectrum 1000系列光谱仪(MA,USA)上记录FTIR光谱。以4cm-1的分辨率获取光谱，并取32次扫描的平均值。将样品与尽量干燥的KBr一起彻底研磨，并通过在真空下压缩来制备片状物。
质子核磁共振光谱法(1H NMR)
使用Varian Mercury 400MHz(CA,USA)得到1H NMR测量结果。将PMAA-g-St(没有交联)样品溶解在0.01M NaOD中，以得到15mg/ml的溶液浓度。以25°的脉冲角、10s的延迟时间和2s的获取时间，得到光谱。以水峰作为参照，以百万份数(ppm)为单位报告所有化学位移。
用透射电子显微术(TEM)检查纳米颗粒
使用透射电子显微术(TEM)检查纳米颗粒的形状和形态。将纳米颗粒在PBS(pH＝7.4)中的混悬液用钼酸铵染色，并放在碳包被的网格上。将样品用滤纸印迹，并放置干燥。以100kV的加速电压在Hitachi H7000电子显微镜(Hitachi加拿大,Ltd.,Mississauga,ON,加拿大)上获取透射电子显微照片。
通过动态光散射确定颗粒尺寸
在一个实例中，使用NICOMPTM380ZLS(PSSNICOMP,Santa Barbara,CA,USA)设备，通过动态光散射(DLS)测量颗粒尺寸。在90°的检测角，用HeNe激光束在37℃测量颗粒尺寸。借助于Hielscher UP100H探头超声发生器(Hielscher USA,Inc.,Ringwood NJ,USA)，在80％峰振幅和在溶液中的5mm探头深度下，将纯化的胶乳分散在蒸馏水中5分钟，以制备5mg/ml的储备胶乳混悬液。将储备混悬液用不同pH和0.15M恒定离子强度的水性缓冲溶液稀释10倍。用pH计证实得到的稀胶乳混悬液的pH。将每个样品的颗粒尺寸测量3次，并报告3次的平均值。使用强度加权平均直径作为流体动力学尺寸，因为它从原始数据直接计算，并且比体积加权和数目加权平均直径更可再现。使用多分散性指数(PdI)，评价粒度分布。通常，具有小于0.12的PdI值的颗粒被视作单分散体。
ζ电位测量
为了研究颗粒组成和pH对表面电荷的影响，使用电泳迁移率测量颗粒ζ电位。用不同pH和10mM恒定离子强度的缓冲溶液稀释储备胶乳混悬液。然后使用Malvernζ分选机Nano-ZS(Malvern,Worcestershire,UK)，测量ζ电位。
为了测量纳米颗粒的电泳迁移率值，用不同pH和10mM恒定离子强度的缓冲溶液稀释储备胶乳混悬液。使用下述方程式[25]，使测量的电泳迁移率(μ)与ζ电位(ξ)关联：
其中R是颗粒半径，η是溶液粘度，κ是德拜长度的倒数，ε0是真空的电容率，εr是介质介电常数，且f(κR)是1:1电解质的Henry函数。
滴定研究
用Fisher Scientific Accumet AB15pH计(Fisher Scientific,Toronto,ON,加拿大)进行电位测定滴定。通过将0.050g纯化的颗粒悬浮于50mL 0.05M NaCl中，制备样品。在彻底清洁的控温(25℃)的100mL烧杯中进行滴定，所述烧杯配有pH电极(FisherScientific)和氮管线。使用磁力搅拌器连续搅拌聚合物混悬液。将0.1M的HCl和NaOH的体积标准溶液(Fisher Scientific,Toronto,ON,加拿大)用作滴定剂。将胶乳的pH降低至3.0，并在滴定之前用氮气在胶乳中鼓泡20分钟，以从系统除去溶解的二氧化碳。在滴定过程中用氮气轻轻吹样品，以维持惰性气氛。除非另外指出，否则使用正向(碱进入酸中)滴定获取所有数据。在每次滴定剂添加之间使混悬液稳定5分钟以确保平衡。通过考虑游离H+和OH-的贡献，校正原始滴定数据，从而使得终点更清楚。根据方程式[26,27]进行校正：
其中[VNaOH]是加入分散体的NaOH的体积，并且和是加入与分散体相同pH的空白溶液中的HCl和NaOH的体积。对于该校正，假定H+和OH-在分散体中和在空白溶液中活度系数相同，[V]pH的值应当在等当量点是恒定的。
PMAA-g-St纳米颗粒合成
使用所述的方法，制备具有至多7.2％的固体含量的稳定PMAA-g-St胶乳。使用改进的水性分散聚合法进行接枝，所述方法能够在一锅合成过程中同时实现接枝和纳米颗粒形成。发现所述方法不需要使用油和有机溶剂。最初，单体、表面活性剂和引发剂都可溶于水。
如在表1中所示，反应收率(RY％)随着进料中MAA浓度增加而增加。通过在较高MAA浓度时MAA分子在淀粉和PS 80附近较大的可用性，可以解释该结果。淀粉的大基团具有比MAA更低的活动性，因而，它们与MAA单体的反应主要依赖于紧邻附近的单体分子的可用性。
不受任何理论约束，可认为随着引发剂在高温分解，在淀粉上产生的自由基会与溶质单体反应以形成寡聚基团。生长中的寡聚体链随着它们的分子量和浓度升高而逐渐彼此结合。在临界链长度，形成的接枝聚合物变得不溶于低pH介质(由于羧基的质子化及从引发剂产生硫酸根离子)并吸附稳定剂以形成稳定的颗粒核。一旦已经形成颗粒，它们会从连续相吸附单体。从该阶段开始，聚合主要发生在单体溶胀的颗粒内。
表1总结了选择的纳米颗粒批次的配方和它们各自的接枝收率(GY％)。增加MAA浓度伴随着接枝收率的增加。这可以以下述方式解释：在较高MAA浓度下，单体分子在淀粉附近有较大的可用性。淀粉的大基团是相对不活动的。所以，这些大分子与单体的反应基本上依赖于MAA单体在淀粉附近的可用性。
可以如下解释通过新分散聚合法对三元共聚物纳米颗粒的成功合成。最初，所有反应物都可溶于水。随着聚合进行，形成的在临界链长度的三元共聚物由于羧基的质子化和PS 80疏水侧链的存在而变得不溶于低pH的聚合介质。此外，已知PMAA已知会表现出50℃的较低临界溶液温度(LCST)，这意味着，它可以在70℃的聚合温度从水溶液中沉淀[28-30]。PMAA的LCST性能也可以促进纳米颗粒形成。聚合物“纳米沉淀物”可以吸附稳定剂以形成颗粒核。然后，它们可以从连续相吸附单体或低分子量基团，并生长得更大。在表面活性剂辅助下，较大的纳米颗粒稳定化。基于形成的三元共聚物在聚合条件下的相变性能，我们已经开发了这种新的水性分散聚合法，其能够在一锅合成过程中同时实现接枝和纳米颗粒形成。该方法不需要使用油和有机溶剂，因而比反向微乳液聚合法更有利。
接枝机制和聚合物组成
使用FTIR和NMR研究来确认接枝并研究聚合物组成和接枝机制。淀粉、PMAA和接枝淀粉的FTIR光谱示于图2中。与天然淀粉的光谱相比，主要变化是在1738cm-1的羰基C＝O吸收频率的存在。在天然淀粉中在1166cm-1、1090cm-1、1020cm-1和954cm-1的峰是由于CO键拉伸。在1090cm-1和1020cm-1的峰是失水葡萄糖环CO/CC拉伸的特征。在1645cm-1的特征峰是由于结合的水在淀粉中的存在。由氢键合的羟基(O-H)引起的宽带出现在3450cm-1，且归因于络合物振动拉伸，与游离的、分子间和分子内结合的羟基有关。在2940cm-1的带是C-H拉伸的特征。在天然淀粉中在3450cm-1的强OH拉伸带的强度在接枝反应以后下降，从而暗示淀粉通过淀粉OH基团与MAA反应。而且，接枝聚合物表现出在520-920cm-1的吡喃糖环振动的特征峰以及在1032cm-1的CO/CC环拉伸(其在MAA同聚物中不存在)，从而确认PMAA在淀粉上的接枝。
图3显示了a)PS 80、b)可溶性淀粉、c)PMAA和d)PMAA-g-St的1H-NMR谱。在0.86ppm的峰对应于PS 80的脂族CH3质子。在1.27的峰来自表面活性剂的脂族CH2区域。在3.62ppm的大峰来自PS 80的聚氧化乙烯区域的CH2质子。在5.33的小峰来自脂肪酸链(双键)中的CH基团。在脂族区域中的较小峰属于脂肪酸尾部的不同部分。淀粉光谱表现出在3.5ppm的特征峰，其归因于与C6碳连接的淀粉单元的CH2。在3.8ppm的峰归因于与CH单元(其连接至C1-C5碳)连接的氢。在5.1ppm的峰归因于R-OH羟基的氢。令人感兴趣的是，同聚物PMAA的光谱表现出PMAA和PS 80特有的峰。在0.94ppm和1.66ppm的峰分别来自PMAA的CH3和CH2。在5.33ppm的CH峰在PS 80-PMAA共聚物中不存在，从而指示PS 80与MAA单体通过双键进行反应。PS 80含有单-、二-、和三-不饱和脂肪酸酯作为主要疏水取代基，这会增加该表面活性剂的聚合途径的可能性。此外，已经在文献中充分记载了PS 80参与氧化反应的能力[31-33]。实际上，已经使用PS 80作为氧化试剂来评估药物稳定性[34]。在引发剂的存在下，通过氢夺取可以形成表面活性剂上的烷基自由基。这可以通过不同方法实现，包括RH键的热或光化学均裂。随后，自由基可以通过攻击单体双键而参与接枝聚合反应。
PMAA-g-St聚合物的1H NMR谱显示了淀粉、MAA和PS 80的特征峰。由于接枝导致的化学环境的改变，在0.94、1.29、1.66、3.5处存在峰的小转移以及在3.5ppm处存在峰形状的轻微变化。而且，在5.1处存在峰的相对强度的减小，从而指示淀粉羟基参与接枝反应。该峰线性地依赖于在样品中存在的失水葡萄糖单元的量。使用在3.52、3.70和1.66处的峰下面积来计算终产物中淀粉、MMA和PS 80的摩尔比，并呈现在表1中。另外，使用得自滴定研究的当量点数据，我们确定了用不同的进料单体比率制备的纳米颗粒中的MAA含量。这些数据也呈现在表2中。在进料和产物中的MAA和淀粉摩尔比之间存在相对良好关联。但是，进料中仅小部分PS 80并入终产物中。终产物中表面活性剂的相对摩尔比随着进料中MAA的量的减少而下降，这可能暗示，PS 80主要通过与MAA单体共聚而并入接枝聚合物中。
其它FTIR和H1NMR谱呈现在图4中。
下述反应路线图可以描述用于将PMAA接枝在淀粉上的引发过程和自由基形成[35,36]：
S2O8 2-→2SO4 .-(1)
2SO4 .-→终产物(2)
SO4 .-+S2O3 -2→SO4 2-+S2O3 .-(3)
S2O3 .-+S2O3 -2+SO4 .-→SO4 2-+S4O6 2-(4)
SO4 .-+H2O→HSO- 4+HO。(5)
S2O3 .-+H2O→HS2O3 -+HO。(6)
St-H+HO。→St。+H2O(7)
St-H+S2O3 .-→St。+HS2O3(8)
St-H+SO4 .-→St。+HSO- 4(9)
反应(3)、(5)和(6)有利于不同自由基物质的连续形成，而反应(2)和(4)导致自由基消失。应确信在硫代硫酸根存在下，存在不同的自由基：硫酸根、硫代硫酸根和羟基自由基，它们可以攻击淀粉，从而导致氢夺取和淀粉分子上的自由基的形成。羟基自由基或淀粉基团可以攻击MAA双键和诱导MAA在淀粉上的接枝。因而，根据图5，MAA分子向引发的链的后续添加会延长接枝的链。最后，通过结合或歧化来终止正在生长的接枝链(图5)。必须指出，由于MAA单体上的自由基的引发作用，MAA的并行同聚仍然在一定程度上发生。
纳米颗粒的形态和颗粒尺寸
分析的所有纳米颗粒呈现非常均一的形态，具有约100-200nm的颗粒尺寸和略微球形的形状(图6A)。所述纳米颗粒具有多孔的棉球状表面形态。具有多孔结构在响应于环境刺激(诸如pH)的较快相变以及促进较高药物加载的方面可能是有益的。还存在一定程度的颗粒聚集和融合；但是，这可能是由于TEM样品制备的性质。由于干燥和电子束的影响，沉积在TEM网格紧邻处的颗粒可以部分地融合在一起。这样的行为是典型的，且其它聚合纳米颗粒如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)颗粒经常报道有所述行为[37]。
如在表3中所示，就三元共聚物PMAA-PS 80-g-St-3而言，纳米颗粒的颗粒尺寸范围为70nm至310nm，取决于聚合物组成和pH。得自DLS测量的典型粒度分布图呈现在图6B中。一般而言，除了PMAA纳米颗粒(PdI＝0.26)以外，粒度分布是相对狭窄的，具有约0.09-0.14的多分散性指数PdI。在药物应用中确定纳米颗粒性能时，颗粒尺寸是关键参数。它会影响性能如响应率(针对刺激如pH)、药物释放、细胞摄取以及颗粒有效杀死癌细胞的能力。另外，颗粒尺寸会极大地影响体内药代动力学和生物分布，从而影响包封的药物的治疗效果。PMAA-g-St纳米颗粒的颗粒尺寸使其遵循细胞摄取机制以及增强的渗透性和保留(EPR)效应，所述效应给纳米颗粒赋予被动肿瘤靶向性能[38]。由于肿瘤脉管系统的孔隙率(大部分周围人肿瘤的有效平均孔径是约300nm)和淋巴排液的缺乏，合适大小的胶体纳米颗粒优先通过EPR而分布在肿瘤中。
典型样品的TEM照片(图6)证实，纳米颗粒具有约100-200nm的颗粒尺寸，接近球形的形状，和多孔棉球样形态。与致密结构相比，多孔结构在响应于环境刺激(诸如pH)的较快相变以及促进较高药物加载方面可能是有益的。图7显示PDEAEM-g-St-2纳米颗粒的TEM图像。
均匀颗粒尺寸对于药物递送应用而言也是重要的，因为颗粒尺寸会极大地影响纳米颗粒在体内的分布和它们与生物细胞的相互作用。通常，单分散颗粒表现出更均匀的物理和化学性能，从而使它更容易配制更复杂的智能药物递送系统。
PMAA-g-St纳米颗粒在生理pH范围内表现出pH-响应性膨胀
表3和图8A中的结果证实，颗粒尺寸随着pH从5增加至7.4而增加，并且颗粒尺寸的pH依赖性变化是MAA/St摩尔比的函数。图8证实，颗粒尺寸随着pH从4增加至7.4而增加，并且增加的量度取决于MAA含量。例如，PMAA纳米颗粒的平均直径从pH 4时的70.5nm增加2.2倍达到pH 7.4的152nm，而PMAA-g-St-4仅增加1.2倍，这解释为PMAA的10.1的体积比(V7.4/V4)和PMAA-g-St-4的1.5的体积比(V7.4/V4)。一般而言，淀粉含量的增加会导致pH敏感性的下降。这可以归因于以下事实：较低MAA含量会导致较小静电排斥，后者归因于较低的离子化羧基含量及较低的膨胀。不同的pH敏感性是指不同量的可电离的和/或离子化的羧基。较低MAA含量会导致在pH 7.4时较小静电排斥和较低膨胀，从而导致较小V7.4/V4值。
图8A也表明，颗粒直径的急剧增加发生在pH 5至pH 6之间，从而指示在该区域的电离跃迁，这与含有PMAA的纳米颗粒的体积相变pH一致[39]。在低于PMAA的pKa的pH值，质子化的羧酸基团形成广泛的氢键合，从而导致坍塌的结构。在较高pH值，增加的羧酸基团的电离会导致聚合物链之间的高静电斥力，从而扩大颗粒。
pH和PMAA含量对颗粒表面电荷的影响
纳米颗粒的ζ电位总结在表4和图8B中。数据表明，所有纳米颗粒具有负表面电荷，所述负表面电荷随着介质的pH从2增加至7而增加，这是由于与纳米颗粒结合的羧酸基团的电离。ζ电位是由液体的离子产生的在双电层处的电荷，其存在于每个颗粒周围。通过静电稳定(表面电荷)或通过空间稳定(在颗粒表面处的表面活性剂或其它分子)或通过二者的组合，可以稳定分散在水溶液中的纳米颗粒。通常，认为超过±20mV的ζ电位值是稳定胶体分散体的特征。根据DLVO理论，当颗粒之间的吸引性范德华力超过静电斥力时，发生聚集。如在表4和图8B中所示，大多数纳米颗粒产物在研究的不同pH值下具有接近或超过-20mV的ζ电位，因而预期是胶体上稳定的。当纳米颗粒中的PMAA含量下降时，ζ电位也下降。在pH 4下，PMAA-g-St-4纳米颗粒具有-2.7mV的ζ电位，这意味着，它们将具有一些胶体稳定性问题。这些数据与在高pH时更多的负电荷一起表明，PMAA很大程度上促进纳米颗粒的表面电荷。
基于淀粉的纳米颗粒中的羧酸基团的表征
图9显示了在Cs＝0.05N NaCl时，PMAA-g-St-2胶乳分散体的电位测定滴定的一个实例。除非另外指出，否则在每次滴定剂添加之间允许5分钟的稳定时间。这是在聚电解质胶乳颗粒的滴定中常见的操作，因为与对应的低分子量弱酸相比，达到平衡所需的弛豫时间通常非常长。通过考虑游离H+和OH-的贡献来校正原始滴定数据，从而使终点更清晰。根据方程式2进行校正[26,27]：
其中[VNaOH]是加入分散体中的NaOH的体积，并且和是加入与分散体相同pH的空白溶液中的HCl和NaOH的体积。对于该校正，假定H+和OH-在分散体中和在空白溶液中有相同的活度系数，[V]pH的值应当对等效物时是常数。我们使用上述过程确定了2.39ml的当量点，用箭头显示。该值与使用简单电子数据表程序从滴定曲线的拐点确定的值非常一致。
使用得自滴定研究的当量点数据，我们确定了具有不同进料单体比率的不同PMAA-g-St批次的MAA含量。这些数据与它们对应的当量点数据一起呈现在表4中。
将不同组成的纳米颗粒的pKa值相对于α绘图。然后通过将pKa值外推至α＝0来确定pK0值。发现pK0值依赖于纳米颗粒中的淀粉含量。从PMAA-PS 80纳米颗粒的4.9至PMAA-PS80-g-St-4纳米颗粒的5.8，几乎增加了1个单位。PMAA-PS 80-g-St-1、PMAA-PS 80-g-St-2和PMAA-PS 80-g-St-3颗粒的固有电离常数分别是5.0、5.1和5.5(图9)。基于淀粉羟基和三元共聚物酸基之间的较高氢键合程度，可以解释pK0随着淀粉含量增加而增加。三元共聚物的电离行为的变化(由pKa趋势的变化证实)可能是由于更低的颗粒电荷密度，淀粉的亲水性(其可以促进对水的更高亲和力)和更刚性的淀粉链结构(其可以导致更加扩展的构象和更高的可电离基团的空间分离)。
还使用电位测定滴定来研究羧酸官能团在PMAA-g-St纳米颗粒内的分布。水凝胶纳米颗粒的凝胶相对离子是可渗透的。因此，滴定剂离子没有局限于水性本体相，可以扩散进凝胶相中以中和存在于凝胶相内的官能团。本体相和凝胶相之间的稳定时间在很大程度上依赖于要滴定的官能团的分布。表面可接近的基团需要更短的平衡时间，而被埋在表面下面的可滴定的官能团需要更长的时间才能达到平衡。
使用正向(碱进入酸中)和随后快速反向(酸进入碱中)滴定研究(在每次添加之间允许仅30s的稳定时间)来洞察酸性基团在纳米颗粒内的分布。如果在加入下一体积的滴定剂之前水相和凝胶相完全平衡，正向和反向滴定应当充分重叠；但是，如果没有达到平衡，必须观察到2次滴定之间的一些延迟时间。图10显示了PMAA和2个不同批次的具有不同MAA:St进料比率的PMAA-g-St的正向和反向滴定曲线。PMAA(图10A)和具有高MAA含量的PMAA-g-St颗粒(图10B)表现出正向和反向滴定之间的良好重叠，另一方面，具有高淀粉含量的PMAA-g-St纳米颗粒仅在滴定开始和结束附近表现出良好重叠(图10C)。在发生酸性基团滴定的pH区域，存在显著的滞后。具有较低淀粉含量的PMAA和PMAA-g-St颗粒的迅速稳定时间表明，H+离子的扩散不受凝胶结构阻碍。这可能是由于羧酸基团存在于颗粒表面附近。相比而言，与H+向凝胶中可滴定基团的扩散速率相比，H+在具有高淀粉含量的PMAA-g-St凝胶中的添加速率似乎更快，从而表明质量传递过程部分地受凝胶结构阻碍。基于这些结果，得出以下结论是合理的：与具有较低淀粉含量的PMAA和PMAA-g-St颗粒中的羧酸基团相比，具有高淀粉含量水平的PMAA-g-St纳米颗粒的羧酸基团不太易于接近颗粒表面。
多元酸的酸强度或电离容易性与简单酸的不同之处在于，随着库仑场在聚合物线圈周围积累，每个连续电荷变得更难以除去。多元酸的酸强度由“表观”pKa值表示，且根据方程式3与电离程度(α)有关[40,41]：
其中pK0是固有解离常数的负对数，R是气体常数，T是开尔文温度，且ΔGel是静电相互作用术语。
如下计算电离程度(α)
其中[Veq]是当量点体积。
方程式3基于非-静电术语(pK0)和静电相互作用术语(ΔGel)的总和描述了pKa。在图11中，将不同组成的纳米颗粒的pKa值相对于α绘图。通过将pKa值外推至α＝0，确定pK0值。发现PMAA纳米颗粒的pK0为4.9。通过增加淀粉含量，使该值几乎增加了1个单位。实际上，对于PMAA-g-St-4纳米颗粒，计算出5.8的pK0。PMAA-g-St-1、PMAA-g-St-2和PMAA-g-St-3颗粒的固有电离常数分别为5.0、5.1和5.5。PMAA的pK0的实验值与直链PMAA以及异丁酸的实验值非常一致，可能表明在胶乳表面处的大部分羧酸基团具有与在大量水中相同的环境。如上所述，具有较低PMAA含量的纳米颗粒的一些COOH基团被埋在表面下面。这可能降低那些羧酸基团附近的介电常数和增加pK0值。
淀粉含量的增加会改变纳米颗粒的电离行为(图11)。具有高MAA含量的PMAA和PMAA-g-St的pKa值随着电离程度增加而初始急剧增加。pKa值在约25％电离时达到平稳，并在40％电离以后开始增加。该行为也已经被其它研究人员记载，且归因于PMAA的紧凑/延长的线圈转化(coil transformation)。通常，与它们在低电离程度的紧凑结构偶联的PMAA颗粒的高电荷密度会导致pKa值随着电离程度而快速初始增加。为了使强静电斥力最小化，聚合物经历构象变化至更长的线圈排列。具有较高淀粉含量的PMAA-g-St颗粒表现出不同的pKa特性。pKa在低电离程度显著更高；但是，直到50％电离几乎没有表观解离常数的增加。酸基似乎在该电离区域表现为分离的单元，从而产生具有小斜率的pKa曲线。这可以基于颗粒的较低电荷密度以及淀粉的亲水性来解释，所述亲水性促进与溶剂(水)的更高程度的相容性，这将导致可电离基团的更可伸展的构象和更高的空间分离。但是，由于较高的静电斥力，pKa值在50％电离以上开始增加。
加工参数对颗粒尺寸和pH敏感性的影响
图12A显示了SDS浓度对颗粒尺寸和相变的影响。PMAA-g-St颗粒的直径随着表面活性剂含量增加而下降。SDS表面活性剂的两亲结构有助于稳定水溶液中的聚合物颗粒，从而使得聚合物链可能形成较小的颗粒。表面活性剂的量对颗粒尺寸的影响是显著的。例如，随着SDS从0.17mmol变至0.69mmol，颗粒尺寸从591nm变至298nm。低于0.17mmol(0.05g)的SDS水平导致颗粒聚集(用箭头注解)。因为PMAA-g-St共聚物是带负电荷的(由于COOH基团的电离)且SDS是阴离子表面活性剂，所以吸附在颗粒表面上的SDS有助于将颗粒分散在水中，从而防止颗粒聚集。使用pH＝7.4时的粒径与pH＝4时的粒径的比率(D7.4/D4)来测量pH响应性。该比率在低SDS水平是下降的；但是，这是由于具有减少量的SDS的颗粒在低pH值时的较差稳定性，这会导致颗粒聚集和通过DLS得到的误导性较高读数。
PS 80浓度的增加对颗粒尺寸和pH响应性的影响呈现在图12B中。PS 80量的增加稍微增加颗粒尺寸。平均颗粒尺寸从在0.13mmol PS 80时的238nm增加至在0.27mmol PS80时的300nm。PS 80水平的进一步增加没有影响颗粒尺寸。增加PS 80浓度也会导致颗粒的pH敏感性的下降。如前面讨论的，PS 80可以通过自由基形成以及通过其双键而参与聚合反应；因此，它可以潜在地促进聚合物链的交联。通过增加PS 80浓度，可能增加颗粒内和颗粒间交联，从而导致纳米颗粒的pH敏感性的下降。
随着总单体浓度从0.156mol/l增加至0.41mol/l，平均颗粒直径从298nm增加至788nm(图12C)。当单体浓度进一步增加至0.61mol/L时，得到宽粒度分布的分散体(数据未显示)。单体浓度的进一步增加会导致大块颗粒聚集。单体浓度的增加通常会造成最终颗粒尺寸的增加，因为它以许多方式影响成核过程。首先，接枝聚合物链可以更长地停留在连续相中，这是由于该相的增加的溶解力。所以，寡聚体在沉淀之前生长至较长的链长度。其次，寡聚体链的增殖速率增加。稳定剂的吸附速率也下降，这是因为介质的溶解力的变化。所有这些作用促成颗粒核的平均尺寸的增加。令人感兴趣的是，pH敏感性没有由于进料中单体浓度的变化而受到显著影响。
图12D显示了交联剂摩尔比X对颗粒尺寸和pH敏感性的影响。使用下述方程式计算交联剂摩尔比：
颗粒尺寸由于交联剂摩尔比(X)的增加而增加。可以假定，在较高交联水平下，可以交联更多的聚合物链，从而产生更大的颗粒。并且，在各个较小颗粒之间存在较高的交联和颗粒扩散的可能性，以形成更大颗粒。通过增加交联水平，减小体积相变的量级。交联剂的含量对水凝胶的交联密度和网目大小具有直接影响[4]，因而交联剂含量对水凝胶的膨胀行为具有巨大影响。随着交联剂水平增加，交联物之间的聚合物链长度下降；因此限制凝胶膨胀的弹性收缩力急剧增加。这解释了在较高交联水平下颗粒pH响应性的下降。
因此已经例示了用于合成PMAA-g-St纳米颗粒的一锅水性分散聚合法。纳米颗粒的颗粒尺寸和pH响应性膨胀对合成参数(例如，MAA/St比率、表面活性剂浓度、交联剂浓度和总单体浓度)有依赖性。这些参数的调节表明具有不同颗粒尺寸和pH响应性的PMAA-g-St纳米颗粒的产生。发现PS 80参与聚合，使产物成为三元共聚物。聚山梨醇酯也在稳定纳米颗粒的形成中起作用。淀粉在聚合中的存在也似乎会提供更均匀的粒度分布。取决于MAA/St比率，当介质pH在7.4-4.0之间变化时，纳米颗粒可以经历多达10倍的体积变化。
前述实例阐明了本发明的实施方案，特别涉及纳米颗粒的合成和表征。
纳米颗粒的生产包括溶解聚合物骨架。在实例中，骨架由具有在约2,600至约4,500Da范围内的分子量的淀粉提供。如上所述，淀粉是在自然界中存在的生物相容的、可生物降解的、无毒的聚合物。淀粉由通过糖苷键连接的葡萄糖单元组成。天然淀粉的主要组分是直链淀粉和支链淀粉。在优选的实施方案中，构成聚合物骨架的单体单元带有取代度为0.5-3的羟基。这意味着，平均而言，当它们出现在聚合物中时，骨架中的单体单元平均具有0.5-3个羟基。直链淀粉(例如，其为直链葡萄糖聚合物)因而具有约3的取代度。所述取代度可以是在约1至约3、或2至约3的范围内，或它可以是约1、约2或约3。聚合物骨架因而具有多个羟基，所以被称作多羟基化的。单体单元可以是，例如，一个或多个戊糖或己糖(例如，葡萄糖)，所以骨架的每个单体单元可以具有5或6个碳。优选地，骨架具有3、4、5、6或7个碳/单体，更优选地，5或6个，最优选地，6个。相对较高分子量多糖(与例如二糖或三糖相比)的实例包括愈创葡聚糖、昆布多糖、金藻昆布多糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖和半乳甘露聚糖。可以使用在体内可容易分解的多糖(诸如直链淀粉)以利用它们的体内行为，但是可消化性更低的多糖(诸如纤维素)也可以形成本发明的纳米颗粒。天然存在的淀粉包括玉米淀粉、马铃薯淀粉、甘薯淀粉、小麦淀粉、西谷椰子淀粉、木薯淀粉、米淀粉、大豆淀粉、竹芋淀粉、支链淀粉(amioca starch)、欧洲蕨淀粉、百脉根淀粉、蜡质玉米淀粉和高直链淀粉玉米淀粉。
本发明的纳米颗粒的生产包括：将单体接枝聚合成聚合物。在实例中，将甲基丙烯酸接枝到淀粉上。甲基丙烯酸是α,β-不饱和羧酸，并且实例中的聚合生产方法被称作自由基接枝聚合。这样的聚合方法通常在自由基引发剂的存在下进行。随着接枝聚合过程进行，单体分子生长成链，其中C-C键形成基于碳的链，且羧基形成所述链的侧基。羧基是布郎斯台德酸，所述酸根据它的环境可以失去质子(H+)，从而以羧酸根基团(CO2 -)形式存在。所以，当提及链上的羧基的数目时，不考虑羧基的形式(为CO2H或CO2 -)。纳米颗粒中的羧基的酸行为会促成纳米颗粒的性能，特别是它在不同pH的行为，这在别处讨论。当单体是α,β-不饱和羧酸时，形成为纳米颗粒的一部分的所述链含有在交替碳上具有羧基的基于碳的链。
在本发明的优选的“一锅”合成中，在乙氧基化分子的存在下进行聚合反应，所述乙氧基化分子参与聚合反应，即，与形成的侧链形成共价键。在实例中，所述乙氧基化分子是聚山梨醇酯80，其以吐80形式可商购得到。措词聚山梨醇酯描述了一组具有以下结构的化合物：
对于给定的聚山梨醇酯，w+x+y+z等于给定的数目“n”，且“R”是一个或多个脂肪烃基。基团-O(O)C-R通常对应于天然存在的脂肪酸。在聚山梨醇酯80的情况下，n＝20，且R-基团与油酸中的R-基团相同：
实际上，聚山梨醇酯80的另一个名称是聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯，其反映了脱水山梨糖醇核心氧基亚乙基(-CH2-CH2-O-)以及经由酯键与脱水山梨糖醇连接的油酸的存在，并且指示n的值。
如在实例中所述，聚山梨醇酯80的油酸R-基团在单体的接枝聚合过程中变成与生长的侧链共价连接，并且聚乙氧基化部分最终停留在纳米颗粒的外表面上。本发明包括在纳米颗粒的合成过程中表现出该行为的乙氧基化分子：在乙氧基化分子的存在下进行聚合步骤，以使所述乙氧基化分子与所述聚合链共价连接。优选地，在聚乙氧基化分子的存在下进行聚合步骤，以将所述聚乙氧基化分子与形成的链共价连接，并且聚合的产物形成纳米颗粒，其中聚乙氧基化部分在所述纳米颗粒的外部上。
如别处指出的，聚乙氧基化物部分向本发明的纳米颗粒赋予有用的实用特征。并入纳米颗粒中的乙氧基化分子的氧基亚乙基单元或基团的数目可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。应当指出，给定的聚山梨醇酯经常是分子的混合物，所以这些数字表示平均值。优选地，聚乙氧基化分子是基于脱水山梨糖醇的分子。更优选地，它是聚山梨醇酯。
如对本发明的纳米颗粒所表征的，聚山梨醇酯的R-基团的C＝C(不饱和键)参与纳米颗粒合成的聚合。聚乙氧基化部分因而变成与在合成过程中形成的聚合物链共价结合，并且与形成的纳米颗粒的链共价结合。因此，本发明的一个实施方案是具有R(C9-C31)-C(O)O-基团的聚乙氧基化脱水山梨糖醇，其中所述脱水山梨糖醇在接枝聚合过程中通过R(C9-C31)-C(O)O-基团的C-C共价键与第二聚合物连接。优选地，所述脱水山梨糖醇是聚山梨醇酯，其中氧基亚乙基单元的总数是至少10。还优选的是，R(C9-C31)-C(O)O-基团含有至少一个C-C不饱和性，其在聚合步骤中反应以形成C-C共价键。R(C9-C31)-C(O)O-基团可以是C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C31中的任一种。具有为偶数的碳总数的脂肪酸(R-CO2H)是更常见的，这意味着，在该情况下具有奇数的R-基团是更常见的，这可以产生优选的那些。
存在除聚山梨醇酯80的油酸组分以外的含有不饱和性的脂肪酸，诸如亚油酸、花生四烯酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、十六碳烯酸、反油酸、异油酸、反亚油酸、α-亚麻酸、二十碳五烯酸、芥酸等。可以发现，在不同情况下对于纳米颗粒而言有利的是，在其中并入一种或多种基于这些脂肪酸中的一种或多种的聚山梨醇酯。
如在实例中所述，接枝聚合步骤的聚合物和单体的相对量可以变化，以得到具有不同聚合物/单体比率的纳米颗粒。在纳米颗粒的背景下，单体分子是在聚合过程中形成的链的一部分，所以还可以称为单体单元。该实例显示了这样的纳米颗粒：其中聚合单体的单体单元与聚合物骨架的单体单元的摩尔比(即，MMA/St)是0.6-4.7。可能得到在约0.1至约10之间、或0.2至9.0之间、或0.2至8之间、或0.2至8.0之间、或0.2至7.0之间、或0.3至7.0之间、或0.3至6.0之间、或0.4至6.0之间、或0.4至5.0之间、或0.4至4.0之间、或0.4至3.0之间、或0.5至6.0之间、或0.6至6.0之间、或0.7至6.0之间、或0.8至6.0之间、或1至5.0之间的其它比率，或得到例如约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5或约10的比率。
在实例中还描述了这样的纳米颗粒：其中再次通过在纳米颗粒合成过程中改变聚山梨醇酯80和MAA的量来改变聚乙氧基化物分子和聚合单体的单体单元的相对量。对于那些颗粒组分，指示约0.003至约0.01的乙氧基化分子与聚合链的单体单元的摩尔比。可能得到其它比率，即，约0.0005至1之间、约0.0006至0.1之间、约0.001至0.1之间、约0.001至0.05之间、约0.001至0.04之间、约0.002至0.04之间、约0.002至0.03之间、约0.002至0.02之间或约0.003至0.01之间，或得到例如约0.0005、约0.0007、约0.0009、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6、约0.5、约0.4、约0.3、约0.2、约0.1、约0.005、约0.006、约0.007、约0.008或约0.009的比率。
使用利用N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的实例的接枝聚合。在该实例中，聚合单体MAA和交联剂MBA的摩尔比的范围为约3:1至约7:1。在聚合步骤中使用的单体的量可以是交联剂的量的1-20倍(以摩尔计)，或者它可以是1-15之间、或1-10之间、或2-10之间、或2-9或2-8之间、或2-7之间、或2-6之间，或者单体的量可以是交联剂的量的3-6倍(以摩尔计)。
纳米颗粒的应用和用途
已经建立了本发明的纳米颗粒的不同修饰，从而证实它们可用在许多应用中，特别是与医学领域有关的应用。在合成纳米颗粒过程中，或者在它们的配制之后，可得到修饰形式的纳米颗粒。
在下面更详细地描述的一个应用中，使用药物多柔比星证实了本发明的纳米颗粒作为药物递送剂的有用性。多柔比星(蒽环类抗生素环抗生素家族的一个成员)是众所周知的抗癌药物，其在多种人和动物实体瘤中具有广谱抗肿瘤活性[42,43]。但是，该药物具有非常狭窄的治疗指数，并且它的临床应用受到几种不期望的副作用(诸如心脏毒性和骨髓抑制)阻碍[44-46]。另一个限制是，该药物是已知的p-糖蛋白(P-gp)底物。P-gp会阻止许多抗癌剂的积累，因此造成它们的细胞毒性活性的下降，主要是通过阻止主动摄取和以ATP依赖性的方式增加带正电荷的两亲药物的细胞流出。认为P-gp的过表达是癌细胞中的多药抗性的主要机制之一[47-50]。
多柔比星与合适的纳米颗粒系统的结合可能解决一些与多柔比星化学疗法有关的限制[51-55]。通过将药物并入适当的纳米载体系统中的对药物的靶向递送会改变药物在体内的生物分布和药代动力学[56]。大体而言，被称作增强的渗透性和保留(EPR)效应的非特异性靶向过程可以实现加载药物的纳米颗粒在肿瘤中的积累[38,57]。漏泄脉管系统和有限的淋巴排液(对于肿瘤而言为典型的，且在正常组织中缺失)会导致大分子药物载体系统在许多种类的肿瘤的间质间隙中的积累。多柔比星与胶体载体(诸如纳米颗粒)的结合可以潜在地克服多药抗性(MDR)。已经假定，P-gp仅在它存在于质膜中时才会识别要流出肿瘤细胞的药物，并且在胞吞作用之后，在其位于细胞质或溶酶体中的情况下不会识别[53,54,58,59]。
由于衬在脑毛细血管内皮里面的上皮样紧密连接部(被称作血脑屏障(BBB))的存在，所有新的潜在脑药物中超过98％是无效的，因为它们不能穿过BBB。在药物的脑递送领域中，已经存在许多克服BBB的方案，诸如紧密连接部的渗透打开、前药的使用和载体系统如靶向抗体、脂质体和纳米颗粒[60-63]。大概仅十年来，已经报道表面活性剂包被的纳米颗粒会跨过BBB而成功地运输药物。纳米颗粒介导的药物运输部分地依赖于颗粒的包衣，特别是用聚山梨醇酯的包衣，尤其是用聚山梨醇酯80(吐温80)的包衣[63-67]。用这些材料的外包衣(overcoating)会导致载脂蛋白E(ApoE)从血浆吸附到纳米颗粒表面上。所述颗粒然后似乎模拟低密度脂蛋白(LDL)颗粒并与LDL受体相互作用，从而导致衬在BBB里面的内皮细胞对它们的吞噬作用。被包封在纳米颗粒内的药物或成像探头然后可以通过受体介导的胞吞转运作用被运输进这些细胞中[63,68,69]。另外，已经怀疑，也会发生诸如紧密连接部的调节或P-糖蛋白流出系统的抑制等过程，从而导致纳米颗粒的脑摄取。迄今为止，已经评价了许多不同的表面活性剂。已经证实仅聚山梨醇酯80外包衣会在静脉内施用以后产生脑靶向效应，从而表明聚山梨醇酯80在脑靶向中的特异性作用[63]。由于以下事实，用聚山梨醇酯80的外包衣的效力是有限的：因为对颗粒表面具有高亲和力的血液组分的替换，在纳米颗粒表面上吸附的表面活性剂可以在体内被解吸。
在另一种应用中，在医学诊断领域中证实了本发明的纳米颗粒的有用性，下面描述的实例显示了在磁共振成像(MRI)和荧光探针领域中的用途。
磁共振成像是已知的强效诊断和分析模态，其以极好软组织对比而提供任意平面内的解剖学的非侵袭性3D可视化，并且能够使用定量生物标志物来研究血管和组织生理学和病理学[70,71]。MR图像中的软组织对比是多因子的，取决于成像方法、方案和组织的弛豫时间常量(例如T1,T2)。常使用外源性顺磁造影剂(例如，Gd3+、Fe3+和Mn2+络合物)，其改变周围水质子的弛豫率以强调在某些应用中的血管和软组织对比[72]。
钆(Gd3+)是由于高弛豫效率和磁矩而用于MRI的主要顺磁分子[73-75]。但是，处于游离形式的钆对生物系统是高度毒性的，因此将Gd+3造影剂配制为稳定的水溶性螯合物以改善它们的临床安全谱[76-78]。基于Gd3+的造影剂的对比增强能力(被称作‘弛豫率’)与Gd3+离子的内配位层中的可交换水分子的数目直接成比例[72-74]。不幸的是，有机螯合剂对Gd3+的络合会减少内层水分子的数目。因此，基于Gd3+的MRI造影剂的设计的主要挑战之一是如何在使毒性副作用最小化的同时增加它们的弛豫率。
临床上使用的Gd3+造影剂如二亚乙基三胺五乙酸钆和二亚乙基三胺五乙酸二甲基酰胺钆是无毒的，但是表现出相对较低的T1弛豫率、向细胞外空间中的快速血管外渗、向全身的非特异性分布和快速的肾清除率。因此，在临床实践中，单次诊断需要多次注射或输注Gd3+造影剂[79]。相比而言，无毒的大分子MRI造影剂如PEG、聚(L-赖氨酸)、聚谷氨酸、树枝状聚合物、葡聚糖和超分子系统(包括脂质体、胶束和其它这样的系统)在血流中表现出较高的T1弛豫率和较长的停留时段[80-90]。由于漏泄脉管系统以及周围淋巴管发育不全(被称作增强的渗透性和保留(EPR)效应)，这些大分子的和超分子系统也能够实现肿瘤的被动靶向[57,91]。
基于淀粉的衍生物如羧甲基淀粉已经在人类中用作血浆扩容剂；由于较低免疫学潜力，其与葡聚糖相比通常是良好耐受的。不同于白蛋白，羧甲基淀粉不含有在免疫学上有活性且可诱导抗体产生的肽组分。[92]
如在本文中例示的，可以在简单的一锅合成法中，在水中合成基于淀粉的纳米颗粒，其含有聚甲基丙烯酸接枝的淀粉-DTPA(PMAA-g-St-DTPA)。所述聚合物可以以高亲和力与钆结合。可以定制合成方法，以得到可溶于生理pH的合适分子量的聚合物。
由于由系统的淀粉和甲基丙烯酸组分引起的羟基和羧酸基团的丰度，可以将多种药物、靶向部分和荧光探针与聚合物结合。
实施例2.用于递送抗癌药物多柔比星的St-g-PMAA-P80纳米颗粒
已经使用药物摄取研究来评价纳米颗粒加载多柔比星(阳离子的,Mw＝579.98g/mol)的能力。将50mg低压冻干的纳米颗粒悬浮于10ml蒸馏的去离子水(DDIW)中。以0.1-5mg/ml的浓度将药物加入混悬液中，并使其吸附到纳米颗粒上，持续24小时。然后将颗粒在30000rpm超速离心30分钟，并使用紫外分光光度计测定上清液中的药物的量。随后，通过从加载溶液中的最初药物浓度减去最终药物浓度，计算加载进颗粒中的药物的量。然后使用下述方程式计算药物加载含量和捕集效率:
通过DLS和电泳迁移率测量，确定PolyGd-Dox纳米颗粒的颗粒尺寸和表面电荷。使用具有pH＝7.4和150mM(尺寸测量)或10mM(ζ-电势测量)的离子强度的PBS，将纳米颗粒分散体稀释至0.5mg/ml。使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Worcestershire,UK)，进行所有尺寸和ζ-电势测量。一式三份地进行每次测量，并报告平均值±标准差(表5A和5B)。
本发明的数据表明，PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒能够加载大量的Dox，而不损失它们的胶体稳定性(图13)。在图14中指示以下物质在室温贮存6个月以后的XRD谱：A)天然形式的多柔比星，B)PMAA-PS80-g-St纳米颗粒，C)加载多柔比星的纳米颗粒(LC＝50％)，D)加载多柔比星的纳米颗粒(LC＝50％)。对于多柔比星，在衍射图中可见清楚的峰，从而指示结晶相在天然形式中的存在，而纳米颗粒表现出典型的无定形模式。加载多柔比星的纳米颗粒的衍射图中的峰的缺失，指示结晶性多柔比星向无定形多柔比星的相转化。
纳米颗粒药物递送系统的常见限制是，可以负载的药物的量。例如，聚烷基氰基丙烯酸酯(PACA)纳米颗粒对多柔比星表现出加载含量为3.7％，且加载效率为74％[93]。在乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒中的多柔比星加载含量和加载效率分别为5％和47％[94]。表2证实了不同加载含量的颗粒的加载效率、大小和ζ电位。本发明的St-g-PMAA-P80纳米颗粒具有高加载能力，并且加载效率即使在最高加载含量下也保持基本上不变且接近100％。因此，通过改变纳米颗粒与药物的比率可以容易地制备具有不同药物加载的纳米颗粒，而不显著破坏加载效率以及颗粒尺寸和稳定性。高加载效率会减少昂贵药物的浪费。使递送系统具有高加载含量，可使用较小量的载体材料(这是重复注射所需要的)。此外，使颗粒具有高加载含量可潜在地改善治疗效力，因为只要少量加载药物的颗粒到达它们的作用部位，就可以在靶器官和组织中实现期望的药物水平。
使用ITC和FTIR来洞察多柔比星与纳米颗粒的相互作用。FTIR数据提供了纳米颗粒的羧基与Dox的胺基之间的强静电相互作用的证据。并且，存在淀粉的OH基团与Dox的OH和NH2基团之间可能的氢键合的一些证据。ITC结果表明，在Dox与纳米颗粒的羧酸基团之间存在非常强的相互作用，最大化学计量为1。所述相互作用的量级强烈地依赖于介质的pH和离子强度(图1和15)。
使用透析法研究了pH对dox从颗粒的体外释放的影响(图16)。颗粒表现出dox的pH依赖性的持续释放。与pH 5相比，纳米颗粒在pH 7.4和6表现出显著更慢的药物释放。在pH7.4几乎没有或根本没有爆炸性释放，90小时以后释放了小于20％的药物。在pH 6下，释放速率逐渐增加，90小时以后释放了接近35％的加载药物。随着pH下降至5，药物释放速率显著增加。所述释放的特征在于，在前8小时中20％的初始爆炸性释放，之后以相对更慢的释放速率，导致90小时以后释放了超过90％的药物。从St-g-PMAA-P80纳米颗粒的pH依赖性的药物释放可以基于以下方式来解释：药物-聚合物相互作用的程度，以及颗粒的pH依赖性的体积变化。在酸性环境中表现出显著更快的药物释放的纳米颗粒药物递送系统将充当在增加肿瘤部位中的药物水平的同时使药物向健康组织的暴露最小化的工具。已经表明，人肿瘤表现出在5.7-7范围内的酸性pH状态。快速增长的肿瘤细胞具有升高的葡萄糖摄取速率，但氧化磷酸化速率降低，从而导致乳酸积累和随后肿瘤微环境的酸度。在氧的存在下，这种持续的肿瘤的高乳酸盐产生(被称作沃伯格氏效应)会提供体内肿瘤细胞的生长优势。另外，血液供给不足和较差淋巴排液(大多数肿瘤的特征)也会促进肿瘤微环境的酸度。St-g-PMAA-P80纳米颗粒可以潜在地利用该pH梯度，以实现高局部药物浓度并使总全身性暴露最小化。
实施例3.用于递送半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶抑制剂肽的PMAA-PS 80-g-St纳米颗粒
已经证实半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)抑制剂肽如N-苄氧基羰基-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-氟甲基酮(Z-DEVD-FMK)会减少神经元细胞死亡[95-97]，但是不能穿过血脑屏障(BBB)。
为了有效地加载水溶性较差的药物诸如半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶抑制剂肽，将脂质链引入所述聚合物中。在典型的反应中，将肉豆蔻酸(10mg,0.043mmol)与EDC(34mg,0.175mmol)和NHS(40mg,0.350mmol)一起在5ml DMSO中在室温孵育1h，并加入溶解在5ml DMSO/H2O混合物中的PMAA-PS80-g-St(200mg)。将混合物在室温搅拌24h，然后通过透析用DDIW(2L,MWCO＝12000kDa)纯化48h，每12h更换透析液。通过冷冻干燥得到固体脂质-聚合物。使用Z-DEVD-FMK作为模型半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶抑制剂肽。为了制备自装配的纳米颗粒，将10mg脂质-聚合物溶解在2.0ml DDI水中。然后将脂质聚合物溶液放在冰浴中，并同时在使用Hielscher UP100H探针超声发生器(Hielscher USA,Inc.,Ringwood NJ,USA)的超声处理下，每10秒将200μL(5×40μL)的肽溶液(1mg/ml，在CH3CN/H2O(2/8,v/v)混合物中)以小增量加入脂质聚合物溶液中。使用Zetasizer纳米系统测量加载肽的纳米颗粒的颗粒尺寸为37nm。发现加载效率高于91％。
实施例4.MDA-MB435/LCC6人乳腺癌细胞的颗粒摄取
使用荧光显微术和流式细胞计量术，研究了MDA-MB435/LCC6细胞对荧光胺标记的纳米颗粒的摄取。将荧光素胺(FA)与纳米颗粒共价连接。简言之，将200mg纳米颗粒分散在20ml DDIW中，随后加入50mg NHS和EDC。45分钟以后，通过加入10mg FA来开始反应。将混合物避光并在室温搅拌24小时。然后将pH调至7.4，然后将颗粒洗涤3次，随后离心以除去任何未反应的染料。
使荧光胺与颗粒共价结合，因此不存在染料从颗粒的渗漏。孵育以后，将细胞用冷PBS充分洗涤，以确保与细胞表面松散结合的颗粒被洗掉。细胞的系列z-切片(每个厚度为1μm)证实了来自细胞表面的3-15μm之间的所有切片的荧光活性，从而指示纳米颗粒结合至细胞表面以及被细胞内化(数据未显示)。在细胞与纳米颗粒一起孵育之前细胞核(DAPI)和细胞膜(VybrantTMDil)的染色允许辨别通过膜结合的囊泡途径(即胞吞作用)或通过细胞膜的穿透对颗粒的摄取。如果颗粒通过被动扩散进入细胞中，预期在它们周围没有膜结合的囊泡，因此预期来自纳米颗粒的荧光信号不会与来自细胞内囊泡(VybrantTMDiI)的信号共同局部化。但是，如果纳米颗粒通过胞吞作用类机制溶解于细胞，膜结合的囊泡将包围所述颗粒，并且预期到来自标记的纳米颗粒和染色的膜囊泡的信号共同局部化。图17A证实了野生型(MDAMB435-WT)和多药抗性(MDA MBA435-MDR1)细胞的颗粒摄取。在没有纳米颗粒与细胞一起孵育的情况下，使用FITC过滤片没有信号，存在内化的VybrantTMDiI染色的细胞膜的有限数目的细胞内小荧光焦点，其代表膜结合的囊泡(野生型和MDR细胞的对照)。但是，在与纳米颗粒一起孵育4小时以后，在2个细胞系中观察到更大数目的较大荧光焦点。这些红色荧光焦点(其可代表从染色的细胞膜(VybrantTMDil)形成的膜结合的囊泡)与从纳米颗粒信号(FITC)观察到的绿色荧光焦点对齐。如在图17B中所示，加载有Gd3+的纳米颗粒作为电子致密沉积物出现。这表明St-g-PMAA-P80纳米颗粒被细胞通过膜结合的囊泡摄入，并在野生型和抗性的人乳腺肿瘤细胞中穿梭至胞质溶胶的核周区域。
使用流式细胞计量术来测量St-g-PMAA-P80纳米颗粒在MDA435细胞系(WT和MDR1)中的细胞摄取。如在图18中所示，纳米颗粒的细胞水平在WT(A,B)和MDR1(C,D)细胞中随着在37℃的孵育时间逐渐增加，并且直到孵育24小时也没有达到饱和。令人感兴趣的是，与野生型相比，抗性细胞系表现出更快和更高的颗粒摄取程度。1小时以后WT和MDR1细胞的平均荧光强度分别是896和1897。这些值在24小时以后增加至11510和18574。数据表明，在37℃的纳米颗粒摄取是相对快速的，因为我们能够在1小时内看到显著的摄取。可替换地，当在4℃孵育细胞时，颗粒的细胞摄取存在显著下降。在4℃孵育的细胞仅表现出与背景相比稍微更高的荧光强度值，所述背景可能代表在没有内化的情况下细胞表面结合的颗粒。在低温时颗粒的细胞摄取的显著下降(常见的代谢抑制剂)，表明纳米颗粒的细胞摄取是能量依赖性过程。因为胞吞作用是一个主动过程，通过该机制的摄取在低温减慢；如在此处观察到的，纳米颗粒摄取的显著减少与经由胞吞作用的内化(而不是穿过质膜的扩散)相一致。
实施例5.纳米颗粒对野生型和多药抗性人乳腺癌细胞系的抗癌效力的体外评估
在野生型和抗性细胞中评价了游离Dox和加载Dox的纳米颗粒对MDA-MB435/LCC6乳腺癌细胞系的效力(图19)。将细胞用递增浓度的多柔比星或加载多柔比星的纳米颗粒处理24小时和48小时，并使用MTT测定来确定细胞生存力。游离Dox和加载Dox的纳米颗粒对野生型细胞系同样有效(图19A,B)。所有处理以剂量依赖性方式引起对野生型细胞的细胞毒性。对于游离Dox和加载药物的纳米颗粒而言，24小时处理的IC50值分别为0.34μg/ml和0.32μg/ml。通过将处理时长增加至48小时，使这些值下降至0.07μg/ml(游离Dox)和0.06μg/ml(纳米颗粒)。数据指示，多柔比星向纳米颗粒中的加载不会导致药物活性的丧失。
还在MDR1细胞系中评价了游离药物和加载药物的纳米颗粒的细胞毒性。对于MDR细胞而言，增加Dox浓度不会以与野生型细胞相同的量级降低细胞活性。对于24小时和48小时处理而言，游离Dox在抗性细胞中的IC50分别为57.01μg/ml和7.69μg/ml(图19C,D)。与游离药物相比，加载Dox的纳米颗粒具有显著更好的表现，24小时和48小时孵育时间的IC50值为2.99μg/ml和0.62μg/ml。增加处理时间似乎会导致较高的杀灭。更重要的是，多柔比星向纳米颗粒中的加载会导致在抗性细胞中的IC50值下降多达19倍。
实施例6.新颖的含有DTPA的St-g-PMAA-P80聚合物和纳米颗粒的合成
双模式纳米颗粒的制备
PF-NP和SA-NP的示意结构和它们的制备过程显示在图20中，并且如下所示制备。
加载Gd3+的PMAA-g-St-DTPA聚合物(PF-NP)的制备
首先将二亚乙基三胺五乙酸二酸酐(DTPA-二酸酐)与淀粉结合，随后进行MAA的接枝聚合，合成PMAA-g-St-DTPA。
DTPA-二酸酐的合成:根据Andersen等人描述的方法[98]，合成DTPA-二酸酐。在50ml 3-颈平底反应器中结合DTPA(5g,0.0125mol)、乙酸酐(3.62ml)和吡啶(4.61ml)，所述反应器配有温度计、机械搅拌器和用冷水冷却的回流冷凝器。将混合物在搅拌下在油浴中加热至60℃过夜。将烧瓶用异丙醇(IPA)冲洗，并将内含物在布氏漏斗上过滤，用乙腈洗涤2次，并在真空下干燥过夜。
St-DTPA的合成:将可溶性淀粉(3g)溶解在50ml无水DMSO中，随后加入1.5g DTPA-二酸酐。将溶液在室温搅拌24小时，用DMSO透析24小时，随后用水透析另外24小时。然后将产物(St-DTPA)在烘箱中在50℃干燥过夜。
PMAA-g-St-DTPA聚合物的合成:使用以前在我们实验室中开发的一锅分散聚合法[99]的改进版本，合成PMAA-g-St-DTPA聚合物。简言之，通过在70℃加热30分钟，将1.55gSt-DTPA溶解在150ml蒸馏水中。将溶液用N2净化30分钟，以除去任何溶解的氧。随后，在搅拌下将0.25g SDS、1.5g PS 80、0.18g KPS和0.25g STS加入St-DTPA溶液中。10分钟以后，通过加入2g氮气净化的MAA，开始反应。乳光在5分钟以后出现，并且继续在70℃反应8小时，以确保完全接枝。将产物用温水充分洗涤2次，并用甲醇萃取，随后透析以除去任何未反应的材料和同聚物。然后将纯化的颗粒在真空干燥箱中干燥24小时，并在干燥器中储存用于将来使用。
Gd3+向PMAA-g-St-DTPA聚合物上的加载:将PMAA-g-St-DTPA聚合物(0.5g)分散在10mL DDIW水中。使用0.1N NaOH，将pH调至6.5。然后在搅拌下逐滴加入10ml氯化钆六水合物的水溶液(10mg/ml)，并在整个实验中用NaOH溶液将反应的pH保持在6.5。然后继续搅拌1小时，并用0.9％NaCl彻底透析产物，直到使用二甲酚橙试验[100]在洗涤介质中不会检测到游离Gd+3。然后将产物冷冻干燥，并储存用于将来使用。使用电感耦合等离子体原子发射摄谱术(ICP-AES,Optima 7300,PerkinElmer,Shelton,USA)，测量产物中的Gd+3含量。
在环境温度将DTPA二酸酐(DTPA-A)加入溶胀的St-g-PMAA-P80在无水DMSO中的混悬液中。将混悬液在环境温度搅拌24小时，然后用冰水浴冷却。加入蒸馏水(100ml)，并将混悬液在室温搅拌1小时。将聚合物用水透析48小时，并通过在30000rpm超速离心30分钟进行收集。可替换地，可以首先根据上述过程将DTPA与淀粉共价连接，并可使用前述的方法，将得到的淀粉-DTPA用于合成St-g-PMAA-P80。得到的含有DTPA的St-g-PMAA-P80然后可以有效地加载Gd+3。简言之，将0.5克聚合物分散在10mL DDIW水中。使用0.1N NaOH，将pH调至6.5。然后在搅拌下逐滴加入12.5ml氯化钆六水合物水溶液(10mg/ml)，并在整个实验中用氢氧化钠溶液将反应的pH保持在6.5。然后继续搅拌24小时，并如下纯化得到的产物：用0.9％NaCl透析，直到使用二甲酚橙试验在洗涤介质中不会检测到游离Gd+3。然后将产物冷冻干燥，并储存用于将来使用。然后使用电感耦合等离子体原子发射摄谱术(ICP-AES)，测量钆含量。
得到的镧系元素络合物在生物环境内的稳定性是重要的考虑因素，因为游离Gd3+是高毒性的。DTPA是钆的强螯合剂。已知DTPA-钆络合物在生物系统中是稳定的。通过改变反应参数如单体浓度、表面活性剂水平等，可以调节纳米颗粒的大小。可替换地，通过与淀粉羟基的反应，可以将DTPA并入已完成的St-g-PMAA-P80纳米颗粒中。我们的数据表明，含有DTPA的纳米颗粒可以与钆形成稳定的络合物(logKd＝17.5)。
为了得到关于加载Gd+3的纳米颗粒作为MRI造影剂的效率的定量信息，我们确定了在3.0和7.0T下的弛豫率。在体外确定了不同浓度的纳米颗粒的T1值，并且进行1/T1和浓度之间的线性拟合来得到弛豫率。弛豫率值列出在表5A和5B中。为了比较，已经包括了Omniscan(其是临床上可用的MRI造影剂)的弛豫率。加载Gd的St-g-PMAA-P80表现出与Omniscan相比显著更高的弛豫率值。发现弛豫率依赖于磁场强度，这对于大分子造影剂而言是意料之中的。
在一个实例中，向纳米颗粒加载Dox。简言之，将50mg低压冻干的纳米颗粒悬浮于10ml DDIW中。以2.5mg/ml的浓度将Dox加入混悬液中，并与纳米颗粒一起孵育48小时。然后将颗粒在96,000g超速离心30分钟，并用DDIW洗涤2次。然后将PF-NP冷冻干燥，并在4℃储存用于将来使用。
自装配纳米颗粒(SA-NP)的制备
使用上述的方法，经过稍微修改，合成PMAA-PS 80-g-St可溶性聚合物。不使用交联剂(MBA)，并将PS 80的量增加至1克。
接着，使用上述方法，将Hilyte FluorTM 750与聚合物共价连接。最后，为了制备自装配的纳米颗粒(SA-NP)，将8mg聚合物溶解在1.8ml无菌的5％右旋糖中。然后将聚合物溶液放在冰浴中，并同时在使用Hielscher UP100H探针超声发生器(Hielscher USA,Inc.,Ringwood NJ,USA)的超声处理下，每30秒以小增量将170μl(5×34μl)的多柔比星溶液(12mg/ml，在5％右旋糖中)加入聚合物溶液中。继续超声处理另外10分钟。Dox的加入导致纳米颗粒的自发形成。然后使SA-NP穿过离子交换树脂Sephadex G50fine(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)，以除去未结合的Dox。
如图20的示意图所示，在PF-NP的情况下，使NIR荧光探针共价结合，并将药物加载进预形成的交联PMAA-Ps 80-g-St纳米颗粒中。SA-NP在水性介质中自发地形成(与染料的共价键)，随后将Dox加入可溶性PMAA-PS 80-g-St聚合物中。认为HiLyte FluorTM 750的连接以及多柔比星与PMAA-PS 80-g-St聚合物的羧酸基团的离子络合会增加总疏水性，从而导致致密纳米结构的形成，所述纳米结构通过在颗粒表面上存在PS 80和离子斥力而稳定化(由于带负电荷的羧酸基团的存在)。
SA-NP和PF-NP分别表现出62±5nm(PdI＝0.12)和137±3nm(PdI＝0.07)的颗粒尺寸(图23D-E)。TEM照片表明，颗粒尺寸与DLS数据非常一致，并且表明SA-NP和PF-NP之间的不同形态。PF-NP是接近球形的，具有多孔的棉球结构，而SA-NP不太呈球形，并且表现出更紧凑的整体形态。发现纳米颗粒的表面电荷是负的，具有-38±1(SA-NP)和-35±5(PF-NP)的ξ-电势值。
实施例7.St-DTPA-g-PMAA-P80螯合的Gd+3相对于游离Gd+3的细胞毒性
细胞活性
作为纳米颗粒用于体内应用的安全性的初步评估，使用分离的大鼠肝细胞相对于游离钆溶液评估了它们的毒性。该模型已经用于快速毒性筛查，并且已经证实了体外-体内毒性外推。通过确定质膜破坏的锥虫蓝(0.1％w/v)排除试验，用显微镜评估肝细胞活性。在3h孵育过程中每30min确定肝细胞活性，并且所述细胞在使用之前是至少80％是活的。将800μl每种样品加入至肝细胞。在对照空白与加载Gd+3的聚合物和纳米颗粒之间不存在统计上显著的差异。游离Gd+3表现出显著的肝细胞毒性，在暴露于1.5mg/ml钆溶液后在240分钟以后分别导致小于15％肝细胞存活(图24)。肝细胞向加载在聚合物和纳米颗粒中的相同剂量的Gd+3暴露240min分别导致对聚合物和纳米颗粒的65％和68％的存活。数据指示将Gd+3加载至St-DTPA-PMAA-P80聚合物/纳米颗粒会显著降低钆的毒性。
细胞活性
作为纳米颗粒用于体内应用的安全性的初步评估，使用分离的大鼠肝细胞相对于游离钆溶液评估了它们的毒性。该模型已经被用于快速毒性筛查，并且已经证实了体外-体内毒性外推。通过确定质膜破坏的锥虫蓝(0.1％w/v)排除试验，用显微镜评估肝细胞活性。在3h孵育过程中每30min确定肝细胞活性，并且所述细胞在使用之前是至少80％是活的。将800μl每种样品加入至肝细胞。在对照空白与加载Gd+3的聚合物之间不存在统计上显著的差异。游离Gd+3表现出显著的肝细胞毒性，在暴露于1.5mg/ml钆溶液后在240分钟以后分别导致小于15％肝细胞存活(图25)。肝细胞向加载在聚合物和纳米颗粒中的相同剂量的Gd+3暴露240min分别导致对聚合物和纳米颗粒的65％和68％的存活。数据指示将Gd+3加载至PMAA-PS 80-g-St-DTPA聚合物会显著降低钆的毒性。
实施例8.近红外染料(HiLyte Fluor 750)与St-g-PMAA-P80聚合物和纳米颗粒的结合
使用碳二亚胺化学法，将近红外染料(HiLyte Fluor 750)与St-g-PMAA-P80共价连接(图43A)。简言之，将20mg聚合物/纳米颗粒分散在DDIW水中，随后加入EDC(48mg)和NHS(45mg)，并搅拌90分钟以活化St-g-PMAA-P80上的羧基。图43B显示了NIR与纳米颗粒结合的可视效应。随后，加入200μl Hilyte Fluor 750酰肼(1mg/ml)，并将混合物在暗处搅拌过夜。然后通过用水透析来纯化产物，随后冷冻干燥并在-20℃贮存用于将来使用。用NIR染料标记的St-g-PMAA-P80显示在820nm的荧光发射(图43C)。
实施例9.St-g-PMAA-P80的生物分布和靶向能力
体内全身荧光成像
制备共加载有NIR染料HiLyte Fluor 750和多柔比星的纳米颗粒。使用如上所述合成的St-g-PMAA纳米颗粒，其已经冷冻干燥并在干燥器中储存。将100mg纳米颗粒分散在2ml DDIW中，并加入30mg EDC/NHS。30分钟以后，在搅拌的同时加入0.2ml Hilyte Fluor750酰肼(1.25mg/ml)。将混合物避光并在室温搅拌24小时。最后，将产物中和至pH 7.4，并通过用水连续洗涤和离心进行纯化。然后使用上述方法给纳米颗粒加载Dox。
发现纳米颗粒尺寸为137±3nm，具有0.12的多分散性指数。这些纳米颗粒的直径因此低于在许多实体瘤中发现的可渗透性脉管系统的孔径，从而表明纳米颗粒能够借助增强的渗透性和保留效应(EPR)来选择性地积累在实体瘤中。所述颗粒是球形的，并表现出多孔棉球结构。
发现纳米颗粒的总表面电荷是负的，具有-35±5的ζ电位值。负表面电荷可以归因于羧酸基团和少量残余阴离子表面活性剂SDS在颗粒表面上的存在。纳米颗粒的净表面电荷对它们的稳定性以及不同生理脂蛋白在体循环中的吸附具有显著影响，并且可以在纳米颗粒体内清除中起关键作用。HiLyte Fluor 750含量为3.9±0.02％。
图26显示了位于其背上的小鼠体内荧光图像。由于制剂的非常高的荧光信号强度和近红外发射波长，具有低背景干扰的良好组织深度穿透是可能的。注射后1小时在体内检测到高荧光水平，其中最高信号水平来自膀胱，从而指示通过肾途径排泄聚合物。由于颗粒在血液中与颗粒沉积在皮肤和皮下脂肪隔室中的组合，在较早时间点可能在体内检测到信号。从高度灌注的器官(诸如肝脏和心脏)记录的高荧光可以解释为穿过器官的循环血液的组合活性，以及归因于肝脏招募的网状内皮系统(RES)的细胞对颗粒的摄取。在肝脏中增强的摄取主要归因于留在这些组织中的巨噬细胞，它们负责捕获在血液中循环的聚合物。要提及的是，与在文献中讨论的大多数制剂相比，肝摄取似乎相对较低。该制剂似乎随着时间从体内清除，因为荧光水平在9天后几乎恢复至基线。9天后在肝脏中仅检测到小信号，所述聚合物似乎在14天以后从体内完全消除。
使用非侵袭性的实时荧光成像来跟踪纳米颗粒在携带正位鼠EMT6乳腺肿瘤的Balb/c小鼠中的生物分布和肿瘤积累。由于HiLyte FluorTM 750的近NIR发射(λex＝754nm,λem＝778nm)和这些纳米颗粒的高荧光强度，可设定检测限以使得可以可靠地排除自发荧光的背景水平(图26A)。
图26A呈现了在时间零点(基线)和在不同时间将每种制剂注射进侧尾静脉中以后，小鼠的全身图像。在注射后1小时，由于纳米颗粒在血液、皮肤、器官和皮下脂肪内的分布，在体内可检测到清楚的荧光信号。如在图26A中所示，SA-NP和PF-NP表现出不同的生物分布谱。注射SA-NP以后1小时，在膀胱中观察到强荧光信号(图26A,上图)，从而指示通过肾途径的排泄。膀胱信号在注射后6小时显著下降；但是，在体内仍然可检测出强荧光，从而指示对SA-NP消除的快速和缓慢组分。重要的是，接受SA-NP的小鼠在肿瘤组织内表现出强荧光信号，而其它灌注的组织(诸如肝)表现出显著更低的纳米颗粒积累水平。与此相一致，可以从周围组织学上正常的组织描绘接种的肿瘤，从而指示SA-NP在肿瘤内的相对巨大积累。重要的是，这样的荧光信号持续超过1周。
观察到PF-NP的生物分布的不同模式。在注射后1小时，在肝和脾中注意到大量积累，如在这些器官中观察到的强荧光所揭示的。此外，这些颗粒没有通过肾途径有效地排泄，因为在前6小时内，在膀胱中没有检测到显著的荧光积累。尽管在此处没有系统地研究，值得提及的是，在注射了PF-NP的那些小鼠中观察到粪便物中的较高荧光水平(个人观察)，从而指示这些颗粒主要通过肝胆途径清除。在注射后1小时，可以将肿瘤与周围组织区分开，但是PF-NP在肿瘤中的积累程度似乎显著低于SA-NP。
使用Xenogen IVIS系统进一步量化SA-NP和PF-NP的时间依赖性的排泄谱，并绘制在图26B中。SA-NP初始表现出快速清除阶段，可能是由于通过尿排泄的清除，然后是在随后的时间点的更慢清除。在注射后15分钟，SA-NP的平均全身NIR荧光强度为1.5±0.2×108(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)。它在6小时之内迅速地下降至0.87±0.05×108(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)。对于24小时和72小时的时间点，身体荧光分别测量为0.63±0.09×108(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)和0.50±0.05×108(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)。在注射后14天(336小时)，这些值恢复至基线。但是，PF-NP的全身荧光强度在全身中以远远更低的速率下降。身体荧光在颗粒给予后15分钟测量为1.28±0.26×108(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)，并在24小时和72小时分别缓慢地下降至0.63±0.09×108(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)和0.50±0.05×108(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)。
结果表明，SA-NP通过肾途径排泄发生快速的初始消除，然后是更慢的消除期，其中颗粒在14天的时间跨度内从身体清除。由于较大尺寸和它们的高度交联性质，PF-NP没有通过肾途径清除，而是可能通过肝胆运输机制以显著更低的速率消除。
纳米颗粒在肿瘤组织中的实时药代动力学
从图26B中的数据提取纳米颗粒在肿瘤中的药代动力学参数，并总结在表6中。这些关于纳米颗粒在肿瘤中的积累、保留和消除的参数通常预示纳米级药物递送系统的治疗效果。一般而言，与对PF-NP所观察到的结果相比，SA-NP在肿瘤内积累至更高程度，但是以更快的速率清除。在肿瘤中的峰荧光强度测量为：对于SA-NP是6.15±1.04×108(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)和对于PF-NP是0.15±0.25×108(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)。SA-NP的肿瘤AUC是PF-NP的3.5倍，从而反映了SA-NP比PF-NP更广泛地积累在肿瘤中。SA-NP的更大肿瘤积累得到与PF-NP相比SA-NP的更长血液循环和更小尺寸的支持。但是，PF-NP表现出通过277±33小时的大t1/2值和0.0025±0.0003小时-1的较小kel反映的更慢的肿瘤清除率，而SA-NP的t1/2和kel为92±12小时和0.0075±0.0006小时-1。
通过离体成像确定的纳米颗粒的血液循环和器官分布
进行整个动物成像，以确定纳米颗粒的组织分布(图27A)。还在不同时间点，根据收集的血液及解剖的肿瘤和器官(包括肝、肺、肾、脾、皮肤、肠和心脏)的离体NIR荧光分析来评价组织分布和肿瘤积累。将数据表示为对组织平均基线值归一化的荧光强度的比率(图27B,C)。与PF-NP相比，在血液中以更高的浓度和更长的时间检测到SA-NP。在注射后约30分钟，对于SA-NP和PF-NP而言，测量的血液荧光强度比率分别为150.0±12.5和70.0±6.0。直至注射后4小时，这些值分别下降至47±8和4.1±0.5。基于这些数据，计算出PF-NP和SA-NP的63分钟和230分钟的血液循环半衰期。PF-NP表现出在肝、脾、肺、心脏和肠中明显更高的积累水平，而在肾和肿瘤中可以检测到显著更高的SA-NP水平。在用PF-NP治疗的小鼠的肠中的高荧光水平指示在肝中积累的颗粒通过粪便来排泄。该消除模式通常比尿消除更慢。由于该原因，来自肝的荧光在延长的时间段内保持非常强。这些结果与全身活动物成像非常一致。
肿瘤组织的显微成像证实纳米颗粒在肿瘤中的外渗
使用荧光显微术，在显微水平检查了SA-NP和PF-NP的肿瘤分布。在FITC(激发:460-490nm,发射500-535nm)发射窗内对仅用媒介物(5％右旋糖)灌输的肿瘤的组织切片成像，以确定自发荧光的相对水平。如在图28中所示，在媒介物处理的组织的某些区域中，观察到低水平的自发荧光。与FITC-标记的纳米颗粒的更尖锐地限定的发射峰相比，该光谱发射的性质的严格检查证实了宽波长分布。这样的自发荧光产生在含有脂褐素、胶原和延长的π轨道系统如血红素的组织中。因此，为了在FITC发射窗内明确地区分自发荧光和纳米颗粒介导的荧光，在FITC和TRITC(激发540-565nm,发射575-620nm)发射窗内对组织切片成像。这些结果的合并允许自发荧光(黄绿色)相对于纳米颗粒(绿色)介导的荧光的清楚描绘，如在图28中所示。如在该图中指示的，在给予后4小时，与PF-NP相比，SA-NP在小鼠肿瘤组织中积累至更大的程度，并以远远更大的程度从肿瘤微脉管系统外渗进入荷瘤组织中。相比而言，PF-NP表现出在肿瘤实质块中更有限的分布。PF-NP主要局限于肿瘤血管区域和有关的血管周围区域的较大元件。
实施例10.体内MRI研究
将加载Gd+3的PMAA-g-St-PS80(PolyGd)和加载Dox的加载Gd+3的PMAA-g-St-PS80(PolyGd-Dox)在体内不同器官中产生正对比增强的能力与商购可得的进行比较(图21)。在切片A中呈现了主要器官(诸如肝、脾、心脏、肠和膀胱)，而切片B提供了脑、主动脉和肾的更多细节。在0.05mmol/Kg Gd+3的临床剂量下，表现出在肝脏和心血管系统中的最小对比增强。其从脉管系统快速地外渗，并且对比增强甚至在注射后5分钟变得较差。如通过强膀胱信号所证实的，制剂通过肾途径从身体快速地清除。在半数剂量(0.025mmol/Kg Gd+3)下，PMAA-g-St-P80制剂在肝和心血管系统中产生了显著更高的对比。存在强烈的血液池效应，其甚至在60分钟以后仍在持续，从而提供该制剂的较长血液循环半衰期的证据。造影剂似乎通过肾途径消除，如通过在肾中、然后在膀胱中观察到的强对比增强所证实的。膀胱信号保持随时间快速增加，从而提供通过肾途径排泄聚合物的证据。使制剂通过肾途径清除在临床上是优选的，因为该清除途径比肝胆途径快得多。
由于PMAA-g-St-PS80制剂的更长血液循环、其优良对比增强和血液池效应，它们可以以更低的Gd+3总量和单剂量(而不是多达3次注射)使用，以提供心脏和全身MRI扫描，用于诊断和表征心肌活性和动脉粥样硬化。另外，由于详细检测脉管系统需要高分辨率和低剂量，可能提供在高度灌注的器官(诸如肺、肝、肾和脑的微出血)中的病原性病况的较早检测。
T1-加权的图像仅提供了造影剂分布的定性反映，主要因为RF发射和接收线圈的敏感性特性。相比而言，R1图谱提供了造影剂分布在全身中的更好定量测量。
通过在不移动动物的情况下在注射后的多个时间点构建R1图谱，量化造影剂的全身分布的时间行为(图27A)。然后根据方程式1(前面描述)在手工分段的目标区域中从R1测量结果直接量化器官特异性的浓度谱(图27B,C)。
肝R1值在注射后60分钟之前从它的1.0±0.1s-1的基线值增加至2.1±0.3s-1(ΔR1～1.1s-1)，并且肾R1在注射后5分钟之前从0.6±0.1s-1增加至1.4±0.3s-1(ΔR1～0.8s-1)。在基线测得0.4±0.1s-1的膀胱R1，并且在造影剂给予后急剧增加，在注射后5分钟和60分钟之前分别测量为1.1±0.1s-1(ΔR1～0.7s-1)和2.3±0.4s-1(ΔR1～1.9)。在300分钟之前，心脏和肾R1值存在显著下降，而肝脏和膀胱R1值保持较高。对于PolyGd-Dox而言，观察到类似的趋势。通过使用电感耦合等离子体原子发射摄谱术(ICP-AES)测量器官Gd3+含量，进一步验证了数据(图29)，并且观察到R1值和器官Gd3+含量之间的良好一致。
左心室(LV)血液的R1会提供全身图像中血管造影剂增强的有用指示。对于LV R1在注射后2分钟之前从0.7±0.2s-1的基线值轻微增加至0.8±0.1s-1(ΔR1～0.1s-1)。该增加不是统计上显著的，并且LV R1值在所有以后的时间点均保持接近基线(～0.7s-1)。在PolyGd注射以后，LV R1在注射后5分钟之前从它的0.62±0.04s-1基线值增加至1.5±0.2s-1(ΔR1～0.9s-1)，并且甚至在180分钟以后在1.0±0.1s-1仍保持是升高的。
实施例11.PMAA-g-St-PS80的脑靶向能力
已经提出，某些纳米颗粒的PS80包衣会导致Apo-E从血液向颗粒表面的吸附增强(图30)。随后，Apo-E在纳米颗粒表面上的存在会促进这些纳米颗粒经由这些细胞表达的LDL受体在脑毛细血管内皮细胞中的内化。St-g-PMAA-P80经由LDL受体在微血管中的摄取的示意图显示在图30中。TOF-SIMS是能够分析表面组成和化学性质的非常灵敏的表面特异性的技术。敏感性是在ppm的量级，而表面特异性会使取样在样本的顶部1-2nm内进行，即仅对顶部几个原子层取样。TOF-SIMS清楚地显示了PS 80在纳米颗粒的表面上的存在，如以负离子模式通过在255、265和283m/z的特征峰所证实的。这些峰代表油酸和硬脂酸脂肪酸系列，并且是脱水山梨糖醇分子的侧链，且在对照样品(没有PS 80)中不存在。指示St-g-PMAA-P80纳米颗粒的表面上的聚山梨醇酯80表达的Tof-sims数据显示在图31中。
为了研究PMAA-g-St-PS80穿过血脑屏障的能力，获取脑的MRI切片。图32显示了在基线和聚合物注射以后20分钟时不同脑切片的R1图谱。观察到脑血管的显著增强。并且，在脑的某些区域(诸如矢状窦、脑室、皮质和胼胝体)中存在r1值的显著增加。脑室的主要增强会提供聚合物在脑脊液(CSF)中存在的证据。在纳米颗粒注射之前和之后，不同脑切片的R1图谱的检查揭示了在某些脑区域(诸如矢状窦、脑室)中的增强，和在皮质和亚皮质区域中更低程度的增强。在注射后30分钟，对皮质、亚皮质、脑室和矢状窦分别测得在1.1±0.1s-1、1.1±0.1s-1、1.6±0.2s-1和1.7±0.1s-1的R1值。在注射后180分钟，这些值下降至1±0.1s-1、0.9±0.1s-1、1.5±0.3s-1和1.1±0.1s-1(图32C)。
实施例12.离体研究
进行离体研究来进一步确认PMAA-g-St-PS80的脑靶向能力。通过尾静脉注射制剂，并在某些时间点将动物处死，并将脑取出，洗涤，并使用荧光技术测定聚合物含量，也测量制剂的血液含量(图22)。在24小时(此时血液荧光已经恢复至基线)，荧光在脑中的存在以器官水平指示制剂的脑沉积。此外，使用在PMAA-g-St-PS80给予后灌注的脑切片中的荧光显微术来以细胞水平研究聚合物在脑中的沉积(图4)。我们的数据证实，PMAA-g-St-PS80纳米颗粒从脑毛细血管外渗(穿过内皮紧密连接部)并沉积在脑的血管周围区域中。
对于含有PS 80的制剂和不含PS80的制剂，进行了灌注的脑组织的荧光显微研究。如在图4B中所示，在灌注的接受PMAA-g-St(没有PS 80)制剂的脑样品中没有检测到聚合物相关的荧光(中图)。另一方面，PMAA-PS 80-g-St样品会提供颗粒相关的荧光在微血管内皮细胞内以及在脑毛细血管的血管周围区域内局部化的明显证据(最右侧图)。在此处研究的时间点(注射后45分钟)，没有神经元的摄取的证据。
实施例13.PMAA-g-St-PS80的肿瘤靶向潜力
使用鼠乳腺癌肿瘤模型(Balb/c小鼠携带正位鼠EMT6乳腺肿瘤)，研究了直链聚合物的肿瘤靶向能力。使用体内荧光成像和MRI，研究了肿瘤积累(图44)。所述聚合物表现出优良的肿瘤积累。在治疗后的不同时间点评估肿瘤体积。
MIP血管造影照片的定性分析指示造影剂给予以后动脉和静脉的延长的且恒定的可视化(图36A)。单个T1-加权的图像的定量分析证实了在给予聚合物造影剂以后，信噪比(SNR)和对比与噪音之比(CNR)的显著(P<0.05)升高，其甚至在注射后2小时保持升高(图36B)，所述信噪比(SNR)定义为下腔静脉信号强度除以信号强度标准差的比率，所述对比与噪音之比(CNR)定义为下腔静脉信号强度与背景软组织的信号强度之间的差异除以噪音信号强度标准差。
图34A显示了在以0.025mmol/kg Gd3+的剂量注射PolyGd和PolyGd-Dox之前和之后的多个时间点，携带EMT6WT乳腺癌异种移植物的Balb/c小鼠的T1-加权的MR图像和对应的R1图谱。图34B显示了相对于基线的时间定量R1变化(ΔR1)。观察到大分子造影剂的缓慢肿瘤积累，这反映为ΔR1的逐渐增加，在2小时达到0.66±0.13s-1峰值(PolyGd)和在3小时达到0.31±0.06s-1峰值(PolyGd-Dox)，然后在注射后48小时在肿瘤周围持续0.34±0.04s-1(PolyGd)和0.13±0.02s-1(PolyGd-Dox)的ΔR1升高。在PolyGd和PolyGd-Dox的峰ΔR1之间存在统计上显著的差异(p<0.05)。大分子造影剂在肿瘤中积累的能力与增强的渗透和保留效应(EPR)相一致，从而反映了与肿瘤脉管系统的漏泄性质关联的PolyGd和PolyGd-Dox的血液循环延长以及和较差的肿瘤有关的淋巴排液。
图35显示了基于淀粉的纳米颗粒在EMT6/WT荷瘤小鼠中的抗肿瘤活性。在第0天在正位植入肿瘤细胞，然后在第8和15天以等于Dox的2×10mg/kg的剂量用(A)5％右旋糖(n＝2×4)、(B)游离Dox(n＝8)、PF-NP(n＝2×4)、(C)PF-NP或(D)SA-NP(n＝2×3)治疗小鼠。测量肿瘤体积直到第62天。还制备了5％右旋糖、游离Dox、PF-NP和SA-NP的Kaplan Meier存活曲线(图35E)。在不同治疗之间，存活曲线的趋势是显著不同的(p＝0.0033,Mantel Cox)。使用动物体重的纵向记录作为动物生存力的一般量度，将最初总体重的20％减轻确定为需要安乐死的毒性限度。图35F显示了在接受图2中给予的治疗之前和之后，小鼠的体重谱。在肿瘤达到600mm3的截止尺寸之前，在任何情况下小鼠都没有死亡或减轻它们的体重的20％。所有Dox组在开始治疗以后的前20天中表现出体重减轻的一些证据。一般而言，在开始治疗的30天以后，使用游离Dox、SA-NP和PF-NP的治疗仅在几只小鼠中导致超过1g(约5％)的体重减轻。在任何治疗组中没有观察到进食、饮水、理毛、探究行为、活动或其它身体特征的变化，从而提示在给予的剂量下由纳米颗粒引起的一般毒性的缺乏。
甚至在注射后4天，肿瘤荧光信号保持相对较强(图44)。由于荧光成像的高敏感性，可以监测肿瘤几天。MRI不太敏感，但是会提供关于肿瘤形态、结构和聚合物在肿瘤内的分布的更多细节。由于PMAA-g-St-PS80平台适应近红外荧光探针和MRI造影剂，所述两种技术可以潜在地组合，以得到关于肿瘤大小(例如，对治疗的响应)、形态和聚合物随时间在肿瘤中的积累和分布的更详细信息。
在前述实例中公开了多柔比星作为本发明的一部分的应用。可以加载其它药物或治疗剂作为本发明的纳米颗粒的货物。这些包括，例如，氨磷汀、apomine、三氧化二砷、白桦脂酸、博来霉素、硼替佐米、波生坦、卡莫司汀、塞来考昔、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、4-S-半胱胺基儿茶酚、4-S-半胱胺基苯酚、达卡巴嗪、多西他赛、依维莫司、来那度胺、紫杉醇、卡铂、达卡巴嗪、氟尿嘧啶、氟他胺、甲磺酸伊马替尼、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、奥沙利铂、紫杉醇、泼尼松、利妥昔单抗、索拉非尼、他莫昔芬、替莫唑胺、沙利度胺、硫鸟嘌呤、曲妥珠单抗、丙戊酸、长春碱、长春碱等。
已经证实了本发明的纳米颗粒在穿过血脑屏障中的有效性，本发明包括本发明的纳米颗粒用于递送治疗剂的用途，所述治疗剂作为用于治疗以下任一种的纳米颗粒的加载货物：神经变性障碍；神经精神病学障碍；CNS障碍，其选自脑肿瘤、癫痫、偏头痛、发作性睡病、失眠症、慢性疲劳综合症、高山病、脑炎、脑膜炎和AIDS相关的痴呆；血管生成相关的障碍；炎症性或自身免疫性障碍；年龄相关的黄斑变性；或溶酶体贮积病，上述均在本发明范围内。在纳米颗粒的平均尺寸为约100nm或更小的情况下，更是如此。
实施例14.与Gd结合的PMAA-g-St-DTPA的pH依赖性的弛豫率和MR对比
已知肿瘤会造成局部pH的下降，这是由于从代谢产生大量乳酸。我们此处证实了PMAA-g-St-DTPA-Gd纳米颗粒会在不同pH值提供不同的弛豫率，从而表明它们通过MR成像在肿瘤组织或传染性病灶中检测从正常生理pH 7.4的pH偏差的潜力(表6)。
实施例15.聚(二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯)-接枝淀粉(PDEAEM-g-St)和PDEAEM-g-St-DTPA纳米颗粒的合成和表征
使用自由基分散聚合法来制备颗粒。使用α,α’-偶氮二异丁脒二盐酸盐(V-50)作为引发剂，使用乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDM)作为交联剂以用于完成的纳米颗粒，使用聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)作为非离子稳定剂，在氮气下进行聚合。使用水-乙醇混合物(9:1)在70℃进行聚合6小时。将得到的颗粒洗涤，并使用水和乙醇纯化。还使用相同的合成方法而不使用交联剂，从而制备PDEAEM-g-St的直链聚合物。
用FTIR和1H NMR光谱法证实PDEAEM向淀粉上的接枝。使用TEM来研究颗粒的形态。使用DLS来研究pH和颗粒组成对尺寸的影响。使用滴定研究来洞察DEAEM含量以及接枝共聚物的pKa。
为了合成PDEAEM-g-St-DTPA纳米颗粒，将2g干燥的淀粉-DTPA加入在经清洁的两嘴反应烧瓶内的40mL去离子水中，并搅拌至均匀。使用0.1N NaOH溶液，将溶液的pH调至约8，并填充水以补至95mL的总体积。将溶液放在搅拌板上的加热的水夹套中，并在70℃加热和搅拌，同时用氮气净化15分钟。然后将引发剂V-50加入反应烧瓶中。在一个单独的闪烁瓶中，将0.2g PVP和水与0.3-0.5g吐温80混合或不与其混合，并放在涡旋设备上直到均匀，然后加入反应烧瓶中。在另一个闪烁瓶中，一起加入2.0g单体DEAEM、75μL交联剂EGDM、5mL乙醇和5mL去离子水，并放在涡旋设备上至均匀。然后将它们加入反应烧瓶中。然后将反应系统用膜密封，并且松动通气，此后在70℃下放置8小时，也将其搅拌过夜。从分散体移除氮气净化，并替代性地给容器充气。然后将分散体转移至12,000-14,000MWCO Spectra/透析膜，并在过滤水中透析24小时，每2小时更新介质，最少3次。然后将洗涤的样品在光热中干燥另外24小时或直到晶体已经形成。通过将DTPA结合在PDEAEM-g-St上，也可以制备PDEAEM-g-St-DTPA纳米颗粒和直链聚合物。
使用所述的方法，成功地制备具有高达4.5％的固体含量的稳定PDEAEM-g-St胶乳。使用的分散聚合法是相当直截了当的，且不需要使用油和有机溶剂，从而使得该方法比反向微乳液聚合法更有利。最初，所有单体都可溶于水，并且随着聚合进行，形成的接枝聚合物在高pH下变成不溶性的，并且以颗粒的形式沉淀出来，随后，借助于表面活性剂使这些颗粒稳定化。表7总结了4个不同批次的进料组成。接枝收率依赖于DEAEM浓度。增加DEAEM浓度伴有接枝收率的增加。这可以基于较高DEAEM浓度下淀粉附近的更大的单体分子可用性来解释。淀粉大基团是相对固定的。因此，这些大分子与单体的反应基本上依赖于DEAEM单体在淀粉附近的可用性。
所有分析的纳米颗粒呈现非常均匀的形态，具有相对均匀的粒度分布和稍微球形的形状。所述纳米颗粒具有光滑的表面形态。存在轻度的颗粒聚集和融合；但是，这可能是由于TEM样品制备的性质。
通过FTIR和1H NMR确定接枝的构象
淀粉、PDEAEM和PDEAEM-g-St的FTIR光谱显示在图37中。与天然淀粉的光谱相比，主要变化是存在有1724cm-1的羰基C＝O吸收频率和2962-2964cm-1的叔胺基的拉伸振动。在天然淀粉中在1166、1090、1020和954cm-1的峰是由于CO键拉伸。在1090和1020cm-1的峰是失水葡萄糖环CO/CC拉伸的特征。发生在1645cm-1的特征峰是由于结合的水在淀粉中的存在。由氢键合的羟基(O-H)引起的宽带出现在3450cm-1，且归因于络合物振动拉伸，与游离的、分子间的和分子内结合的羟基有关。在3450cm-1的OH拉伸带在PDEAEM同聚物中不存在。在2,916-2920cm-1的带是C-H拉伸的特征。在接枝反应以后在天然淀粉中在3450cm-1的强OH拉伸带的强度下降，从而暗示淀粉通过淀粉OH基团与DEAEM的反应。并且，接枝聚合物表现出在520-920cm-1的吡喃糖环振动的特征峰，该峰在PDEAEM同聚物中不存在，从而证实了PDEAEM向淀粉上的接枝。
图38显示了a)可溶性淀粉、c)PDEAEM和d)PDEAEM-g-St的1H-NMR谱。淀粉光谱表现出在3.51ppm的特征峰，其归因于与C6碳连接的淀粉单元的CH2。在3.82ppm的峰归因于与C1-C5碳所连的CH单元的氢。在5.24ppm的峰归因于R-OH羟基的氢。PDEAEM-g-St聚合物的NMR谱显示淀粉和PDEAEM的特征峰。由于通过接枝导致的化学环境的改变，在3.34、3.59和5.24存在的峰的小转移以及在3.82ppm存在的峰的轻微形状变化。而且，在5.43的峰的相对强度下降，从而指示淀粉羟基参与接枝反应。
pH和淀粉含量对颗粒尺寸的影响
使用动态光散射来确定具有不同淀粉:DEAEM比率的纳米颗粒在不同pH和恒定离子强度的缓冲液中的尺寸。在图39和40中显示了典型的动态激光散射数据，其显示PDEAEM-g-St颗粒在pH 4和7.4的PBS中的强度重量分布。颗粒是单分散的，并且遵循高斯分布。在图41中的结果证实，颗粒尺寸作为pH和淀粉含量的函数而变化。PDEAEM纳米颗粒在pH 4下具有521nm的平均直径。由于与纳米颗粒有关的叔胺基的去质子化，尺寸下降至221.8nm(pH7.4)。平均直径的这种变化解释为体积随pH的913倍变化。观察到在某些情况下，接枝实际上使颗粒尺寸减小超过2倍。具有1:1.4的DEAEM和淀粉摩尔比的纳米颗粒在低pH具有250nm的平均直径，并且在7.4的pH收缩至129nm。一般而言，淀粉含量的增加会导致pH敏感性的下降。但是，与PDEAEM纳米颗粒相比，含有淀粉的颗粒似乎在生理pH范围附近具有更尖锐的相变。
加载了Gd的PDEAEM-g-St-DTPA的pH依赖性的颗粒尺寸
在典型的聚合中，使用下述配方，并使用上述方法将Gd3+结合在PMAA-g-St-DTPA-PS80纳米颗粒上。通过DLS测量在不同pH的缓冲溶液中的颗粒尺寸。在图42中的结果显示了随着pH下降而增加的颗粒直径。当颗粒体积增加时，颗粒水合作用增加，这可以在MR下产生更高的弛豫率，因而具有将肿瘤或传染性病灶与健康组织之间的pH差异成像的潜力。配方:麦芽糊精-DTPA(1.4g)；水(163.5mL)；加入NaOH以调节pH(用23.5mL调至pH 8.0))；乙醇(5mL)；V-50(0.2g)；PVP(0.2g)；吐温80(0.5g)；DEAEM(1.8g)；和EGDM(65μL)。
实施例16.多柔比星向脑肿瘤的递送
大多数治疗剂，包括化疗药物(例如多柔比星)和单克隆抗体，不可穿过BBB，因而不能提供脑肿瘤的有效治疗。作为治疗剂向脑肿瘤递送的实例之一，使用乳腺癌的脑转移。颅内注射1万个MDA-MB231-luc 3N2细胞。
图33A呈现了通过在颅内接种肿瘤后1周注射的FH750-标记的纳米颗粒的生物发光成像(左)和分布(右)获取的脑肿瘤的代表性图像。结果强烈地指示纳米颗粒在脑肿瘤中的积累。在尾静脉注射纳米颗粒以后6小时，获取图像。使用AMG EVOSf1荧光显微镜(Advanced Microscopy Group,Bothell,WA)，通过荧光显微术检查固定的和切片的脑肿瘤组织，并使用设定为使Hoescht33342和NIR HF 750-标记的纳米颗粒显影的DAPI和RFP滤光片来获取图像。图33B清楚地显示了纳米颗粒和从纳米颗粒释放的Dox。
在前述实例中公开了多柔比星作为本发明的一部分的应用。可以加载其它药物或治疗剂作为本发明的纳米颗粒的货物。这些包括，例如，氨磷汀、apomine、三氧化二砷、白桦脂酸、博来霉素、硼替佐米、波生坦、卡莫司汀、塞来考昔、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、4-S-半胱胺基儿茶酚、4-S-半胱胺基苯酚、达卡巴嗪、多西他赛、依维莫司、来那度胺、紫杉醇、卡铂、达卡巴嗪、氟尿嘧啶、氟他胺、甲磺酸伊马替尼、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、奥沙利铂、紫杉醇、泼尼松、利妥昔单抗、索拉非尼、他莫昔芬、替莫唑胺、沙利度胺、硫鸟嘌呤、曲妥珠单抗、丙戊酸、长春碱、长春碱等。
已经证实了本发明的纳米颗粒在穿过血脑屏障中的有效性，本发明包括本发明的纳米颗粒用于递送治疗剂的用途，所述治疗剂作为用于治疗以下任一种的纳米颗粒的加载货物：神经变性障碍；神经精神病学障碍；CNS障碍，其选自脑肿瘤、癫痫、偏头痛、发作性睡病、失眠症、慢性疲劳综合症、高山病、脑炎、脑膜炎和AIDS相关的痴呆；血管生成相关的障碍；炎症性或自身免疫性障碍；年龄相关的黄斑变性；或溶酶体贮积病，上述均在本发明范围内。在纳米颗粒的平均尺寸为约100nm或更小的情况下，更是如此。
应该理解，通过端点对数字范围的列举包括在该范围内包含的所有数字。而且，具有在不同列举范围内的端点的列举范围是具有那些列举范围的端点的任意其它范围的公开内容。例如，范围20-350和10-300的列举是范围20-300和10-350的公开内容。
在本文中提及的所有文件的内容，以及本申请要求其优先权的美国临时专利申请号61/605,995的内容，通过引用并入本文。
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Claims (109)

1.生产纳米颗粒的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将聚合物溶解在液体溶液中；
(b)提供包含羧酸侧基的可聚合单体；
(c)将所述单体接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合链，
(d)提供基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子，其具有可与形成的链反应的官能团，其中：
步骤(c)在所述基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子的存在下进行，以使所述基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子与所述聚合链共价连接。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体溶液包含羟基溶剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述羟基溶剂包含水。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述聚合物是每聚合物单元具有0.05-3取代度的多羟基聚合物，所述单体包含烯基，且所述接枝聚合步骤在交联剂的存在下进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述多羟基聚合物具有0.5-3的取代度。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述多羟基聚合物具有2-3的取代度。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述多羟基聚合物包括取代度为0.5-3的多糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述多羟基聚合物包括葡萄糖。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述多糖包括淀粉。
10.根据权利要求4所述的方法，其中所述步骤(c)的单体的摩尔数是所述交联剂的摩尔数的1-20倍。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述步骤(c)的单体以所述交联剂的量的3-6倍的量存在。
12.根据权利要求4所述的方法，其中所述聚合步骤是在自由基引发剂的存在下进行的自由基接枝聚合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述引发剂基本上不含有过渡金属。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述引发剂是过硫酸盐或其功能等效物。
15.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子的乙氧基化物基团由游离羟基封端。
16.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子包括烯基，所述烯基进行化学反应以将表面活性剂分子共价连接至所述聚合链。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子是具有R(C9-C31)-C(O)O-基团的聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯，其中在所述聚合步骤中，将聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯通过R(C9-C31)-C(O)O-基团的C-C共价键与第二聚合物连接。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯所含的氧基亚乙基单元的总数不小于10。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述氧基亚乙基单元的总数是10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32。
20.根据权利要求17、18或19所述的方法，其中所述R(C9-C31)-C(O)O-基团含有至少一个C-C不饱和性，所述C-C不饱和性在所述聚合步骤中反应以形成C-C共价键。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子是聚山梨醇酯80。
22.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中选择所述聚合物的量和所述步骤(c)的单体的量以产生纳米颗粒，其中所述聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是0.1-10。
23.根据权利要求22所述的方法，其中选择所述聚合物的量和所述步骤(c)的单体的量以产生纳米颗粒，其中所述聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是0.3-7.0。
24.根据权利要求22所述的方法，其中选择所述聚合物的量和所述步骤(c)的单体的量以产生纳米颗粒，其中所述聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是1-5.0。
25.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中选择所述基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子的量和步骤(c)中的单体的量以产生纳米颗粒，其中基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子与单体单元的摩尔比是0.0005-1。
26.根据权利要求25所述的方法，其中选择所述基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子的量和步骤(c)中的单体的量以产生纳米颗粒，其中基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子与单体单元的摩尔比是0.001-0.1。
27.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述聚合步骤在表面活性剂的存在下进行。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述表面活性剂是阴离子表面活性剂。
29.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述步骤(c)的单体的量足够高，以使在pH 7.4和10mM的离子强度测量的所产生的纳米颗粒的水溶液的ζ电位的绝对值是至少15mV。
30.生产用于递送生物试剂的纳米颗粒的方法，所述方法包括：权利要求1-29中任一项所述的方法，其中将所述试剂共价连接至步骤(a)的聚合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述聚合物是多羟基化聚合物，并将所述试剂通过所述聚合物的羟基氢原子的取代而共价连接至所述聚合物。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述试剂包含能够络合金属的有机部分。
33.根据权利要求32所述的方法，其还包括形成金属-有机部分络合物。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中选择所述金属以在磁共振成像中提供信号。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述金属是Gd+3。
36.生产用于递送生物试剂的纳米颗粒的方法，所述方法包括：将所述试剂和通过权利要求1-35中任一项所述的方法获得的纳米颗粒分散在液体介质中，以将所述试剂并入所述纳米颗粒中。
37.生产用于递送生物试剂的纳米颗粒的方法，所述方法包括：共价连接至通过权利要求1-35中任一项所述的方法生产的纳米颗粒和将所述试剂共价连接至所述纳米颗粒的聚合链的羧酸基团。
38.生产载体纳米颗粒的方法，所述方法包括下述步骤：
(i)将聚合物溶解在水溶液中；
(ii)提供包含羧酸侧基的可聚合单体；
(iii)将所述单体接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合链，
(iv)提供基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子，其具有可与形成的链反应的官能团，其中：
聚合步骤(ii)在基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子的存在下进行，以将所述基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子与形成的链共价连接，且聚合的产物形成所述纳米颗粒，其中基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的部分在所述纳米颗粒的外部上。
39.纳米颗粒，其包含：
-第一聚合物；
-与所述第一聚合物接枝的第二聚合物；和
-与所述第二聚合物共价结合的基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的部分。
40.根据权利要求39所述的纳米颗粒，其中所述第二聚合物包含聚合的乙烯基，所述第二聚合物的骨架的每2个碳具有1个羧基。
41.根据权利要求39所述的纳米颗粒，其中所述第二聚合物是聚烯基聚合物。
42.根据权利要求41所述的纳米颗粒，其中所述聚烯基聚合物是聚丙烯酸。
43.根据权利要求42所述的纳米颗粒，其中所述聚丙烯酸是聚甲基丙烯酸。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的纳米颗粒，其中所述基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的部分是具有R(C9-C31)-C(O)O-基团的聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯，其中所述聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯通过R-基团的C-C共价键与所述第二聚合物连接。
45.根据权利要求39-43中任一项所述的纳米颗粒，其中所述第一聚合物包括多羟基聚合物。
46.根据权利要求45所述的纳米颗粒，其中所述多羟基聚合物包括取代度为0.05-3的多糖。
47.根据权利要求46所述的纳米颗粒，其中所述多糖包括淀粉。
48.根据权利要求47所述的纳米颗粒，其中所述第二聚合物是交联的。
49.组合物，其包含多个权利要求39-48中任一项所述的纳米颗粒，还包含药学活性剂。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中将所述药学活性剂吸附至所述纳米颗粒。
51.组合物，其包含多个权利要求39-48中任一项所述的纳米颗粒，还包含信号分子。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述信号分子是通过有机部分螯合的金属，其中所述部分与所述纳米颗粒共价结合。
53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述有机部分与所述第一聚合物共价结合。
54.根据权利要求51所述的组合物，其中所述信号分子与所述纳米颗粒共价结合，与羧酸侧基共价连接。
55.根据权利要求51或54所述的组合物，其中所述信号分子是荧光团。
56.根据权利要求51-54中任一项所述的组合物，其还包含药学活性剂。
57.纳米颗粒，其包含：
-第一聚合物，其包含多糖；
-任选交联的第二聚合物，其包含与所述第一聚合物接枝的聚甲基丙烯酸；和
-聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯，其包含与所述第二聚合物共价结合的(C9-C31)R-C(O)O-基团，所述共价结合通过所述第二聚合物的碳主链和所述R基团之间的C-C键实现。
58.根据权利要求57所述的纳米颗粒，其中所述(C9-C31)R-C(O)O-基团是-(C17)R-C(O)O-，其中R是直链烷基。
59.根据权利要求58所述的纳米颗粒，其中所述聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯包含基团-O(CH2CH2O)w-C(O)(C17)R、HO(CH2CH2O)x-、-HO(CH2CH2O)y-、-HO(CH2CH2O)z-，其中w+x+y+z＝20。
60.根据权利要求57、58或59所述的纳米颗粒，其中所述多糖的分子量是2,600-4,500Da。
61.根据权利要求57、58或59所述的纳米颗粒，其中所述第一聚合物包含淀粉。
62.根据权利要求57-59中任一项所述的纳米颗粒，其中所述多糖的单体单元与所述聚甲基丙烯酸的单体甲基丙烯酸酯单元的摩尔比是0.2-8.0。
63.根据权利要求57-59中任一项所述的纳米颗粒，其中所述聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯与所述聚甲基丙烯酸的单体甲基丙烯酸酯单元的摩尔比是0.002-0.03。
64.生产纳米颗粒的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将聚合物溶解在液体溶液中；
(b)提供包含烷基氨基烷基酯侧基的可聚合单体；
(c)提供交联剂；
(d)将所述单体接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合链，从而形成所述纳米颗粒；以及
(e)在所述单体接枝聚合期间，使基于聚乙氧基化脱水山梨糖醇的分子与所述聚合链共价连接。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述聚合物是具有0.05-3取代度/聚合物单元的多羟基聚合物，所述单体包括烯基，且所述接枝聚合步骤在交联剂的存在下进行。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述多羟基聚合物具有1-3取代度/聚合物单元。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述多羟基聚合物包含取代度为0.5-3的多糖。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述多羟基聚合物包括葡萄糖。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述多糖包括淀粉。
70.根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中所述液体溶液包含羟基溶剂。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述羟基溶剂包含水和/或醇。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述羟基溶剂包含水和乙醇。
73.根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中所述可聚合单体是甲基丙烯酸的烷基氨基烷基酯。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述单体是甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯。
75.根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中所述聚合步骤是在自由基引发剂的存在下进行的自由基接枝聚合。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述引发剂基本上不含有过渡金属。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述引发剂是过硫酸盐或其功能等效物。
78.根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中所述交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯。
79.根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中所述步骤(d)的单体的摩尔数是所述交联剂的摩尔数的1-200倍。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述步骤(d)的单体的摩尔数是所述交联剂的摩尔数的3-50倍。
81.根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中选择所述聚合物的量和所述步骤(c)的单体的量以产生纳米颗粒，其中所述聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是0.05-20。
82.根据权利要求81所述的方法，其中选择所述聚合物的量和所述步骤(c)的单体的量以产生纳米颗粒，其中所述聚合链中的单体单元与所述聚合物的单体单元的摩尔比是2-4。
83.根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯存在于步骤(d)中。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯的R-基团是含有不饱和性的烃基。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯是聚山梨醇酯80。
86.根据权利要求83所述的方法，其中所述可聚合单体的摩尔数是所述聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯的摩尔数的5-50倍。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述可聚合单体的摩尔数是所述聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯的摩尔数的20-30倍。
88.根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中非离子稳定剂存在于步骤(d)中。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述稳定剂是聚乙烯吡咯烷酮。
90.生产用于递送生物试剂的纳米颗粒的方法，所述方法包括：权利要求64-89中任一项所述的方法，其中将所述试剂共价连接至所述步骤(a)的聚合物。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述试剂包含能够络合金属的有机部分。
92.根据权利要求91所述的方法，其还包括形成金属-有机部分络合物。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述有机部分是DTPA。
94.根据权利要求92或93所述的方法，其中选择所述金属以在磁共振成像中提供信号。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述金属是Gd+3。
96.生产用于递送生物试剂的纳米颗粒的方法，所述方法包括：将所述试剂和权利要求64-95中任一项所述的方法获得的纳米颗粒分散在液体介质中，以将所述试剂并入所述纳米颗粒中。
97.纳米颗粒，其包含：
-第一聚合物，其包含多糖；
-第二交联聚合物，其包含与所述第一聚合物接枝的甲基丙烯酸的烷基氨基烷基酯，其中所述第二聚合物是交联的；和
-与所述第二交联聚合物共价结合的基于聚乙氧基化脱水山梨糖的部分。
98.根据权利要求97所述的纳米颗粒，其中所述第二聚合物是聚合的甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯。
99.根据权利要求97所述的纳米颗粒，其中第二聚合物包含聚合的乙烯基，所述第二聚合物的骨架的每2个碳具有1个羧基。
100.根据权利要求97、98或99所述的纳米颗粒，其中所述多糖是淀粉。
101.组合物，其包含权利要求97-100中任一项所述的纳米颗粒的溶液，其中当所述纳米颗粒的环境溶液的pH从4变至7.4时，所述纳米颗粒表现出增加的500-1500倍的体积变化。
102.组合物，其包含多个权利要求97-100中任一项所述的纳米颗粒，还包含信号分子。
103.根据权利要求101所述的组合物，其还包含信号分子。
104.根据权利要求103所述的组合物，其中所述信号分子是通过有机部分螯合的金属，其中所述部分与所述纳米颗粒共价结合。
105.根据权利要求104所述的组合物，其中所述有机部分与所述第一聚合物共价结合。
106.根据权利要求105所述的组合物，其中选择所述金属以在磁共振成像中提供信号，并且所述甲基丙烯酸的烷基氨基烷基酯与所述多糖的单体单元的摩尔比是0.5-5。
107.根据权利要求106所述的组合物，其中所述甲基丙烯酸的烷基氨基烷基酯与所述多糖的单体单元的摩尔比是0.5-2。
108.组合物，其包含多个权利要求97-100中任一项所述的纳米颗粒，还包含药学活性剂。
109.根据权利要求108所述的组合物，其中将所述试剂吸附至所述纳米颗粒。
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