CN104450884A - 高血压易感性相关基因的变异位点及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个与原发性高血压易感性相关的单核苷酸位点，并公开了一种检测原发性高血压相关基因-线粒体融合基因2（Mfn2）/增殖抑制基因（HSG）单核苷酸多态性的方法，它包括检测个体的线粒体融合基因2（Mfn2）/增殖抑制基因（HSG）5’端非编码区-35位点的基因型。本发明还公开了相应的检测试剂盒。

Description

高血压易感性相关基因的变异位点及其检测方法

 

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地说，涉及人线粒体融合基因2（Mitofusin 2,Mfn2 gene）的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点5’端非编码区-35bp的检测。本发明还涉及检测这个SNP位点的试剂盒。

背景技术

原发性高血压（essential hypertension, EH）是一种常见而多发的、由环境与遗传因素共同致病的多因素、多基因疾病，对人类健康造成了极大的影响。随着分子医学的发展，目前已经发现的高血压相关基因已经有150余种，但是EH的发病机制仍然不完全清楚，高血压的早期诊断和预防问题仍然未能完全解决。EH是遗传因子和环境共同作用的结果，血压的变化30%-60%归因于遗传。由于环境因素是可以控制和确认的，而高血压遗传学因素却是固定不变的。因此，对可变因素的控制，如对高血压危险因素的预防，可以在一定程度上延缓和防止高血压的发病，但是对固定不变的遗传因素的认识不足却在一定程度上严重影响着对高血压发病、诊断和治疗。因此对高血压遗传学的研究十分必要（王佐广，温绍君，吴兆苏.高血压、易感基因与单核苷酸多态性[J].高血压杂志，2001，9：259-264）。

近二十余年来，有关高血压治疗的研究更多地集中在对血压的控制和对靶器官的保护，并已取得突飞猛进的发展。但是，这些手段并不能从根本上控制血压，目前对人类内源性抗高血压基因的研究还很少，因此，研究内源性抗高血压机制是今后高血压防治研究的主要方向之一，具有重要的研究价值和应用前景，如果通过调节内源性抗高血压机制治疗高血压病，将会促进我国生物医疗技术的发展，并为我国每年节省巨大的医疗费用。

目前所发现的高血压相关基因，归结起来可以概括为促高血压基因和抗高血压基因,Mfn2属于后者。Mfn2的前身是我国学者陈光慧等[Chen GH, Zhang CH, Zhu YQ, et al. Expression of a novel gene related to hypertension[J]. Natl Med J China, 1997, 77: 823-828.]于1997年对培养的自发性高血压大鼠（SHR）和正常Wistar Kyoto（WKY）大鼠的血管平滑肌细胞进行差异显示，克隆出一个新基因——增殖抑制基因（hyperplasia suppressor gene,HSG）。它包含有4160bp的碱基对，共编码661个氨基酸（NM_014874, GeneBank Access U41803）。后经一系列体内、体外实验发现[Chen KH, Guo XM, Dalong Ma, et al. Dysregulation of HSG triggers vascular proliferative disorders[J]. Nature Cell Biol, 2004, 6, 872-883.]，HSG可以明显地抑制ras-raf蛋白-丝裂素活化蛋白激酶基因表达，并且可以激活抗癌基因的表达，有效地阻遏细胞周期和抑制多种细胞的增殖，且这种抑制作用是通过细胞凋亡的方式实现的。因此HSG基因是原发性高血压的候选基因之一，后经基因功能研究表明，HSG基因参与线粒体融合,因此正式命名为线粒体融合基因2(mitofusin 2, Mfn2)。

    由于Mfn2基因在原发性高血压患者和自发性高血压大鼠血管和白细胞中主要的特点是出现表达下降，这应该是其表达调控出现了异常，但是目前对Mfn2基因转录调控方面的研究较少。5’端非编码区是处于基因转录起始位点上游，2000bp以内是启动子和主要转录因子存在部位，5’端非编码区-35bp（从起始密码子的“A”起向上第35位的位置，在SEQ ID NO: 1中为第17位核苷酸）变异正好处于这个位置。而且我们在进行序列的生物信息学分析时发现该位点位于Mfn2基因5’端非编码区转录起点2000bp内，且该变异位点正好位于一个启动子内，且处于相对保守的区域。另外，该变异位点是一个非常重要的转录调控因子-乙醇脱氢酶基因调节子（alcohol dehydrogenase gene regulator 1， ADR1）的结合部位，从转录调控角度而言，具有非常重要的价值，因而可能具有非常重要的意义。

综上所述，为了最终实现根治原发性高血压，本领域迫切需要深入研究原发性高血压的发病机制，寻找原发性高血压易感基因，筛选出具有高风险的原发性高血压患者，开发检测原发性高血压易感基因的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物等。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测高血压易感基因Mfn2多态性位点的方法及检测试剂盒。

本发明提供了一种可以通过高血压易感性基因的检测预测高血压发病风险的方法，即检测Mfn2基因5’端非编码区-35 位点的基因型。5’端非编码区-35位点为G基因型的个体其高血压的发病风险远高于普通人群。

所述的5’端非编码区-35，位于Mfn2的5’端非编码区中（1p36.22：NC_000001.10位置11980146 A/G）。其中，脱氧核糖核酸（DNA）序列编号：5’端非编码区-35位置基于SEQ ID NO：1；引物1基于SEQ ID NO：2；引物2基于SEQ ID NO：3；扩增产物基于SEQ ID NO：4。

具体而言，该方法包括步骤：（a）抽提样品的基因组DNA，扩增获得 Mfn2基因5’端非编码区；（b）通过特异性的引物扩增获得 Mfn2基因包含5’端非编码区-35位点的区域，扩增产物为SEQ ID NO：4；（c）检测步骤（b）产物中单核苷酸多态性位点5’端非编码区-35的基因型。

所述的扩增Mfn2基因5’端非编码区的引物序列如SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO 3所示。

上述方法中涉及的测序、扩增、抽提基因组DNA等技术均可采用本领域的常规操作方法。

本发明提供了一种检测高血压易感基因的试剂盒，它含有可以包括特异性扩增 Mfn2基因5’端非编码区中包含5’端非编码区-35位点的区域的引物。

在本发明的一个实施例中，与特异性扩增 Mfn2基因5’端非编码区中包含5’端非编码区-35位点的区域的引物的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

 

本发明经研究显示，首次证明了Mfn2基因单核苷酸多态性位点5’端非编码区-35（位于Mfn2 5’端非编码区中，1p36.22：NC_000001.10位置11980146 A/G）与高血压密切相关，而且发现了它的新功能：Mfn2基因单核苷酸多态性位点5’端非编码区-35位于Mfn2，5’端非编码区中（1p36.22：NC_000001.10位置11980146 A/G）基因型的改变将导致高血压的发病风险升高。其中关联研究结果显示，在Mfn2基因5’端非编码区-35 A→G在病例和对照组中的分布存在显著性差异（p<0.05），即在原发性高血压患者中该基因型主要表现为G，而在正常对照组中该基因型主要为A，该SNP变化可改变转录因子结合位点。在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤：检测该个体的Mfn2基因5’端非编码区-35位点的基因型，以此判断该个体患高血压的发病风险是否高于普通人群。

在一优选例中，所述的差异是选自5’端非编码区-35的单核苷酸多态性。5’端非编码区-35位于Mfn2基因5’端非编码区中（1p36.22：NC_000001.10位置11980146 A/G）。其中，5’端非编码区-35位置基于SEQ ID NO：1。

本发明提供了一种检测样品是否存在Mfn2基因的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：

(a)  用Mfn2基因5’端非编码区特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和

(b)  检测扩增产物中单核苷酸多态性位点5’端非编码区-35的基因型。

 

Mfn2基因的详细序列可参见登录号为（NG_007945.1）5’端非编码区-35的核苷酸序列（可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

本发明人对Mfn2基因中的5’端非编码区中（1p36.22：NC_000001.10位置11980146 A/G）区域进行了测序。

Mfn2基因的5’端非编码区-35的基因型可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。

 

本发明公开了一个与原发性高血压易感性相关的位点。提供了一种检测原发性高血压易感性基因Mfn2多态性的方法，它包括检测线粒体融合基因2（Mfn2）的5’端非编码区-35位点的基因型。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增5’端非编码区-35位点的引物，还可以包括扩增Mfn2基因5’端非编码区的引物。利用本发明检测5’端非编码区-35位点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为该基因多态性位点的检测和原发性高血压患病风险的预测提供了一个简捷的新途径。

 

附图说明

图1是经过使用本专利的引物通过PCR扩增后所得产物测序结果截图。显了5’端非编码区-35的一种SNP基因型的测序结果。5’端非编码区-35位于Mfn2基因5’端非编码区中（1p36.22：NC_000001.10位置11980146 A/G）。其中A为正常对照组正向测序图，B为原发性高血压患者组正向测序图，C为正常对照组反向测序图，D为原发性高血压患者组反向测序图。从正向测序图中可以看出，正常对照组的A碱基变异为原发性高血压组的G碱基；而在与之相对应的反向测序图中，正常对照组的T碱基变异为原发性高血压组的C碱基。

 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

 

实施例1

用测序法检测原发性高血压易感基因MFn2基因的5’端非编码区-35位点。挑选上述高血压病例-对照组样本各30例进行测序判断5’端非编码区-35的基因型。

一、实验方法

PCR测序引物仍采用上述PCR用引物，扩增的产物经纯化后直接测序。测序的仪器是ABI公司的3130xl遗传分析仪，用sequence analysis 5.2分析软件进行分析，结果用chromas也可以查看。

二、实验结果

测序结果截图如图1所示。

 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

<110>  首都医科大学附属北京安贞医院

 

 

<120>  高血压易感性相关基因的变异位点及其检测方法

 

 

<130> 

 

 

<160>  4

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  51

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (17)..(17)

<223>  n=a or g

 

 

<400>  1

tttgccccgc ccccccngct ccggccgacg cccaccggaa ctacagcccc c                    51

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<400>  2

agcgattctc  ctgcctcttc  c                                                   21

 

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<400>  3

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<210>  4

<211>  963

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<400>  4

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cgg                                                                     963

 

 

 

Claims (9)

1.一种与原发性高血压密切相关的DNA片段，其特征在于所述DNA片段包含如SEQ ID NO. 1所示的序列。

2.线粒体融合基因2（ Mfn2）5’端非编码区-35位点多态性在制备检测高血压易感性的试剂中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述Mfn2基因5’端非编码区-35位点位于1p36.22：NC_000001.10位置11980146 A/G。

4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于所述Mfn2基因5’端非编码区-35位点A→G的突变增加原发性高血压的患病风险。

5.一种用于检测高血压易感性的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包括能够特异性扩增Mfn2基因包含5’端非编码区-35位点的区域的引物。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述Mfn2基因5’端非编码区-35位点位于1p36.22：NC_000001.10位置11980146 A/G。

7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于所述引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

8.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于通过所述引物特异性扩增获得 Mfn2基因包含5’端非编码区-35位点的DNA片段；并检测获得的DNA片段中5’端非编码区-35位点的核苷酸，所述位点A→G的突变增加原发性高血压的患病风险。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于检测Mfn2基因5’端非编码区-35位点的核苷酸的方法选自：Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交。