CN104436196A - Senp1蛋白的抑制剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及SENP1蛋白的抑制剂及其用途，具体地，本发明涉及SENP1蛋白的抑制剂shRNA，以及SENP1蛋白的抑制剂用于制备预防或治疗恶性血液肿瘤的药物中的用途，以及用于制备抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖和/或促进恶性血液肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。本发明还涉及筛选用于预防或治疗恶性血液肿瘤的药物的方法。

Description

SENP1蛋白的抑制剂及其用途

技术领域

本发明涉及SENP1蛋白的抑制剂及其用途，具体地，本发明涉及SENP1蛋白的抑制剂shRNA，以及SENP1蛋白的抑制剂用于制备预防或治疗恶性血液肿瘤的药物中的用途，以及用于制备抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖和/或促进恶性血液肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。本发明还涉及筛选用于预防或治疗恶性血液肿瘤的药物的方法。

背景技术

恶性血液肿瘤包括白血病、骨髓瘤等疾病。慢性髓性白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）主要是由造血干细胞在原癌蛋白BCR-ABL的作用下发生恶性转化而产生的一类恶性克隆性血液疾病，也称慢性粒细胞白血病。CML的发病主要是因为位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr-abl融合基因，其编码具有强蛋白酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，该蛋白通过激活不同的信号途径，最终导致造血细胞的恶性转化[Cilloni D,Saglio G.Molecularpathways:BCR-ABL.Clin Cancer Res.2012;18(4):930-7]。目前，针对BCR-ABL设计的特异性抑制剂格列卫（Gleevec，又名Imatinib,STI571）已经发展成为临床治疗CML的一线药物[Takahashi N,MiuraM.Therapeutic drug monitoring of imatinib for chronic myeloidleukemia patients in the chronic phase.Pharmacology.2011;87(5-6):241-8]。但是，在临床治疗中，类似于格列卫等药物对CML加速期病人的疗效较差[Eiring AM,Khorashad JS,Morley K,et al.Advances in the treatment of chronic myeloid leukemia.BMC Med.2011;9:99]。即使慢性期的病人，也有一定比例的病人会产生格列卫的耐药从而导致CML的治疗失败。CML耐药和复发的主要机制是静息期CML肿瘤干细胞对格列卫并不敏感，部分病人bcr-abl基因存在格列卫结合位点的突变[Alikian M,Gerrard G,Subramanian PG,et al.BCR-ABL1kinase domain mutations:methodology and clinicalevaluation.Am J Hematol.2012;87(3):298-304]。目前，进一步提高CML治疗效果策略是针对多靶点的药物联合应用，如格列卫联合其它酪氨酸激酶抑制剂等。动物实验也表明靶向蛋白乙酰化和泛素化相关的靶点可以提高格列卫杀伤CML肿瘤干细胞的效率[Li L,Wang L,Li L,et al.Activation of p53by SIRT1inhibition enhances elimination of CMLleukemia stem cells in combination with imatinib.Cancer Cell.2012;21(2):266-81]。多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）也是一种临床常见的恶性血液肿瘤，主要是一种浆细胞恶性肿瘤，目前其治疗也有耐药的问题需要解决。

SUMO（small ubiquitin-related modifier protein）是一种小泛素相关修饰物，能共价结合许多调控基因转录的重要蛋白，包括转录因子、转录辅助因子等。SUMO化（SUMOylation）是重要的蛋白修饰方式，对蛋白-蛋白之间的相互作用、亚细胞定位、基因转录的活性以及靶蛋白的稳定性等具有重要的调节作用[Geiss-Friedlander R,Melchior F.Concepts in sumoylation:a decade on.Nat Rev Mol Cell Biol.2007;8(12):947-56.]。人类基因组编码四种不同的SUMO蛋白，分别为SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。SUMO化修饰是一个动态可逆的过程，将SUMO从靶蛋白上去除，称为去SUMO化(desumoylation)。去SUMO化则是由一组SUMO特异性蛋白酶（SUMO-specific protease,SENPs）家族来完成[Hay RT.SUMO-specific proteases:a twist in thetail.Trends Cell Biol.2007;17(8):370-6]。目前已鉴定了SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6、SENP7等人SENP家族成员。其中，SENP1是研究最深入的成员之一。SENP1介导的去SUMO化在前列腺癌等发生和发展过程中发挥重要作用[Zuo Y,Cheng JK.Small ubiquitin-likemodifier protein-specific protease1and prostate cancer.Asian J Androl.2009;11(1):36-8]。SENP1在早期T细胞、B细胞的发育中至关重要。条件性基因剔除SENP1基因导致小鼠淋巴系统发育障碍。另外，SENP1缺失还通过增加XBP1的SUMO化促进内质网应激诱导的细胞凋亡[Jiang Z,Fan Q,Zhang Z,et al.SENP1deficiency promotes ERstress-induced apoptosis by increasing XBP1SUMOylation.Cell Cycle.2012;11(6):1118-22]。但目前为止，尚没有以SENP1为恶性血液肿瘤治疗靶点的报道。

发明内容

本发明人经过大量实验研究，令人惊奇地发现CML患者、MM患者的干、祖细胞的SENP1表达比正常骨髓捐献者要高，并且进一步发现SENP1蛋白的抑制剂可以抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖并促进凋亡，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及SENP1蛋白的抑制剂或者SENP1蛋白的抑制剂与其它药物的联合应用用于制备预防或治疗恶性血液肿瘤的药物中的用途。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂是指能够抑制SENP1蛋白发挥功能的物质，例如为能够抑制SENP1基因的复制、转录、翻译、或转录、翻译后修饰的核酸、蛋白或化合物，或者为能够和SENP1蛋白结合、进而抑制SENP1蛋白活性的核酸、蛋白或化合物，例如为shRNA，例如为如SEQ ID NO：1所示的shRNA。

在本发明的实施方案中，所述核酸例如为shRNA、siRNA或miRNA。

在本发明的实施方案中，所述蛋白例如为抗体，所述抗体例如为单克隆抗体或多克隆抗体。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂为包含所述shRNA的重组载体。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂为包含所述重组载体的重组宿主细胞。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的恶性血液肿瘤选自慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等。

本发明第二方面涉及SENP1蛋白的抑制剂或者SENP1蛋白的抑制剂与其它药物的联合应用用于在体外/体内抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖和/或促进恶性血液肿瘤细胞凋亡的用途。

根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂是指能够抑制SENP1蛋白发挥功能的物质，例如为能够抑制SENP1基因的复制、转录、翻译、或转录、翻译后修饰的核酸、蛋白或化合物，或者为能够和SENP1蛋白结合、进而抑制SENP1蛋白活性的核酸、蛋白或化合物，例如为shRNA，例如为如SEQ ID NO：1所示的shRNA。

在本发明的实施方案中，所述核酸例如为shRNA、siRNA或miRNA。

在本发明的实施方案中，所述蛋白例如为抗体，所述抗体例如为单克隆抗体或多克隆抗体。

根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂为包含所述shRNA的重组载体。

根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂为包含所述重组载体的重组宿主细胞。

根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的恶性血液肿瘤选自慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等。

本发明第三方面涉及SENP1蛋白的抑制剂或者SENP1蛋白的抑制剂与其它药物的联合应用用于制备抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖和/或促进恶性血液肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。

根据本发明第三方面任一项的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂是指能够抑制SENP1蛋白发挥功能的物质，例如为能够抑制SENP1基因的复制、转录、翻译、或转录、翻译后修饰的核酸、蛋白或化合物，或者为能够和SENP1蛋白结合、进而抑制SENP1蛋白活性的核酸、蛋白或化合物，例如为shRNA，例如为如SEQ ID NO：1所示的shRNA。

在本发明的实施方案中，所述核酸例如为shRNA、siRNA或miRNA。

在本发明的实施方案中，所述蛋白例如为抗体，所述抗体例如为单克隆抗体或多克隆抗体。

根据本发明第三方面任一项的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂为包含所述shRNA的重组载体。

根据本发明第三方面任一项的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂为包含所述重组载体的重组宿主细胞。

根据本发明第三方面任一项的用途，其中所述的恶性血液肿瘤选自慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等。

本发明第四方面涉及shRNA用于下调体外/体内细胞中SENP1蛋白的表达的用途，优选地，所述shRNA为如SEQ ID NO：1所示的shRNA。

本发明第五方面涉及shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还涉及重组载体，其含有本发明第五方面任一项的shRNA。

本发明还涉及重组宿主细胞，其含有本发明所述的重组载体。

本发明还涉及筛选用于预防或治疗恶性血液肿瘤的药物的方法，其包括筛选SENP1蛋白的抑制剂的步骤；

优选地，所述SENP1蛋白的抑制剂是指能够抑制SENP1蛋白发挥功能的物质，例如为能够抑制SENP1基因的复制、转录、翻译、或转录、翻译后修饰的核酸、蛋白或化合物，或者为能够和SENP1蛋白结合、进而抑制SENP1蛋白活性的核酸、蛋白或化合物；

优选地，所述恶性血液肿瘤选自慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤。

在本发明的实施方案中，所述核酸例如为shRNA、siRNA或miRNA。

在本发明的实施方案中，所述蛋白例如为抗体，所述抗体例如为单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还涉及预防或治疗恶性血液肿瘤的方法、或者抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖、或者促进恶性血液肿瘤细胞凋亡的方法，所述方法包括给有需要的受试者有效量的SENP1蛋白的抑制剂的步骤。

在本发明的实施方案中，所述SENP1蛋白的抑制剂是指能够抑制SENP1蛋白发挥功能的物质，例如为能够抑制SENP1基因的复制、转录、翻译、或转录、翻译后修饰的核酸、蛋白或化合物，或者为能够和SENP1蛋白结合、进而抑制SENP1蛋白活性的核酸、蛋白或化合物。

在本发明的实施方案中，所述核酸例如为shRNA、siRNA或miRNA。在本发明的具体实施方案中，所述shRNA的序列如SEQ IDNO：1所示。

在本发明的实施方案中，所述蛋白例如为抗体，所述抗体例如为单克隆抗体或多克隆抗体。

在本发明中，所述SENP1蛋白的抑制剂是指能够抑制SENP1蛋白发挥功能的物质，例如是指能够抑制SENP1基因复制、转录、翻译或转录、翻译后修饰中的任一步骤的物质，例如为能够抑制SENP1基因的复制、转录、翻译、或转录、翻译后修饰的核酸分子、蛋白或化合物，或者所述抑制剂是指能够和SENP1蛋白结合、进而抑制SENP1蛋白活性的核酸、蛋白或化合物，所述抑制剂可以为天然分子或化合物，也可以为人工合成的分子或化合物，所述分子可以是核酸分子或蛋白分子。

本领域技术人员知晓，可以利用SENP1蛋白制备抗体，通过抗体与蛋白的结合来抑制SENP1蛋白的活性；或者可以根据SENP1蛋白活性中心的结构设计或筛选蛋白或化合物，从而抑制SENP1蛋白的活性。

本领域技术人员知晓，可以根据SENP1基因或其转录生成的mRNA的序列选取靶序列设计小干扰RNA（siRNA）或者小RNA（microRNA、miRNA）分子。该siRNA或者miRNA分子可以干扰基因的转录、翻译或转录、翻译后的修饰，进而影响蛋白的表达。

本领域技术人员知晓，为了延长siRNA对靶基因表达的抑制作用，可以设计一对特定的寡核苷酸序列，退火后克隆至载体中，该重组载体的转录产物即短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA），其可以自身折叠配对成茎长为19-21个碱基的茎环（stem-loop）结构，其中该19-21个碱基即来源于靶基因mRNA的一段特定序列，这种茎环结构的前体在细胞内很快被切割形成有功能的siRNA。这种载体表达的shRNA经剪切形成的siRNA具有表达量稳定、待续时间长的特点，从而可引起目标基因表达的长效抑制。

在本发明中，所述shRNA是指短发夹RNA（short hairpin RNA），shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。将siRNA序列克隆进质粒载体中，可以在活体中输送“小干扰RNA”（siRNA）。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成茎环结构，该茎环结构被切割成有功能的siRNA，发挥基因沉默作用。

在本发明中，所述siRNA是指Small interfering RNA，是一种小RNA分子，由大约21-25个核苷酸组成，由Dicer（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成，siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。

在本发明中，所述microRNA(miRNA)是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源于内源性染色体上的非编码单链RNA,长度约为22（18～25）个核苷酸（nt）的短序列,在进化上具有高度的保守性，它们基于与靶mRNA的序列互补，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。

在本发明的实施方案中，所述SENP1蛋白的抑制剂是shRNA，其在细胞内经过剪切形成siRNA通过RNA干涉作用导致SENP1的基因表达的沉默。

在本发明的具体实施方案中，所述shRNA的序列为5’CCGGGCGCCAGAUUGAAGAACAGAACUCGAGUUCUGUUCUUCAAUCUGGCGCUUUUU3’（SEQ ID NO：1）。

该shRNA所针对的靶序列为人SNEP1mRNA的第1396-1416位，即5’GCGCCAGAUUGAAGAACAGAA3’（SEQ ID NO：2）。

该shRNA转录生成的DNA寡核苷酸链为5’CCGGGCGCCAGATTGAAGAACAGAACTCGAGTTCTGTTCTTCAATCTGGCGCTTTTT3’（SEQ ID NO：3）。

该shRNA可剪切形成siRNA正义链和反义链，

正义链为5’GCGCCAGAUUGAAGAACAGAA3’（SEQ ID NO：4），

反义链为5’UUCUGUUCUUCAAUCUGGCGC3’（SEQ ID NO：5）。

在本发明的实施方案中，所述载体为能够克隆表达shRNA的表达载体，例如为原核表达载体、真核表达载体、噬菌体载体或病毒载体。其中所述原核表达载体例如为PET载体、PGEX载体，所述真核表达载体例如为pcDNA3.1、pEGFP-C1、pPIC9K，所述噬菌体载体例如为λ噬菌体载体λgt、λgt-λB，所述病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。在本发明的实施方案中，所述病毒载体为慢病毒载体。

在本发明的实施方案中，所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。所述真核细胞例如为哺乳动物细胞。所述宿主细胞可以通过向原核细胞或真核细胞中引入/转染上述的重组载体而得到。

在本发明中，所述原核细胞例如可以为大肠杆菌DH5α、BL21、JM109、Top10，所述真核细胞例如可以为肿瘤细胞，所述肿瘤细胞例如可以为恶性血液肿瘤细胞，例如慢性髓性白血病细胞、多发性骨髓瘤细胞等，所述哺乳动物例如可以为大鼠、小鼠、犬、小型猪、猴、人。在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞。在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物为大鼠或人。

在本发明中，可以利用本领域所知的任何种类的转染方法获得转染有特定核酸或载体的重组宿主细胞，例如，可通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中；或者，可使用脂转染试剂如FuGENE6、X-tremeGENE和LipofectAmine；或者，可通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的适当病毒病毒载体将核酸引入细胞中。

在本发明的实施方案中，通过脂质体转染或病毒转染的方法将含有shRNA的载体转染入离体或在体细胞中。

在本发明中，所述抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖是指与不干预的情况相比，即不使用增殖抑制剂的情况相比，所述恶性血液肿瘤细胞的增殖至少减少30%，例如至少减少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或者99%。

在本发明中，所述促进恶性血液肿瘤细胞凋亡是指与不干预的情况相比，即不使用凋亡促进剂的情况相比，所述恶性血液肿瘤细胞的凋亡数至少增加30%，例如至少增加40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、400%、600%。

在本发明中，所述下调体外/体内细胞中SENP1蛋白的表达是指与不干预的情况相比，降低SENP1蛋白表达量的至少30%，例如至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或者99%。

在本发明中，所述的其它药物是指能够用于预防或治疗恶性血液肿瘤的药物。在本发明的实施方案中，所述其它药物是指伊马替尼。

在本发明的实施方案中，通过将SENP1蛋白的抑制剂与其它药物联合应用，可以增强对恶性血液肿瘤的预防或治疗效果，或者用于在对其它药物产生耐药的恶性血液肿瘤中增强预防或治疗效果。

本发明通过实验证实了SENP1蛋白的抑制剂可以抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖并促进凋亡，表明SENP1蛋白可以作为恶性血液肿瘤治疗的靶点。在本发明的具体实施方案中，shRNA可以通过RNA干扰机制有效抑制SENP1蛋白的表达，进而抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖并促进凋亡，表明SENP1蛋白的抑制剂可以作为药物用于预防或治疗恶性血液肿瘤。

附图说明

图1为SENP1在CML的表达检测，其中A为CML患者和供者的骨髓CD34⁺细胞中SENP1mRNA的表达，B为两例CML CD34⁺细胞的干、组细胞中SENP1mRNA的表达，横坐标为各细胞或细胞系，纵坐标为SENP1较内参β-actin的相对表达量，C为CML患者和供者的骨髓CD34⁺细胞中SENP1蛋白的表达。

图2为SENP1-GFP-shRNA干涉载体的电泳鉴定结果。

图3为SENP1-GFP-shRNA干涉载体转入293细胞后荧光显微镜的鉴定结果。

图4为SENP1-GFP-shRNA干涉载体中小发卡序列的测序结果。

图5为SENP1-GFP-shRNA干涉载体能够在mRNA水平和蛋白水平降低SENP1的表达，其中左图中的纵坐标为mRNA水平降低的倍数。

图6为SENP1-GFP-shRNA感染K562细胞荧光显微镜结果。

图7为SENP1-GFP-shRNA对K562细胞中SENP1的mRNA表达的抑制作用，其中纵坐标为mRNA水平降低的倍数。

图8为SENP1-GFP-shRNA对K562细胞增殖的抑制作用，其中纵坐标为细胞增殖的倍数。

图9为SENP1-GFP-shRNA对K562细胞凋亡的影响。

图10为SENP1-GFP-shRNA感染KCL22细胞的荧光显微镜结果。

图11为SENP1-GFP-shRNA对KCL22细胞中SENP1的mRNA表达的抑制作用，其中纵坐标为mRNA水平降低的倍数。

图12为SENP1-GFP-shRNA对KCL22细胞增殖的抑制作用，其中纵坐标为细胞增殖的倍数。

图13为SENP1-GFP-shRNA对KCL22细胞凋亡的影响。

图14为SENP1-GFP-shRNA对CML患者和健康捐献者骨髓CD34+细胞凋亡的影响，左图为CML患者，右图为健康捐献者，其中纵坐标为Annexin V阳性细胞的比率。

图15为SENP1-GFP-shRNA对CML患者CD34+细胞红系分化的影响，其中左图的纵坐标为CD235a阳性红系细胞比率；右图是流式细胞仪检测的一个代表图。

图16为SENP1-GFP-shRNA对CML患者和健康捐献者骨髓CD34+细胞增殖的影响，其中纵坐标为对照组与SENP1-shRNA组细胞数目倍数比。

图17为SENP1-GFP-shRNA对耐药细胞的抑制作用，其中A为T315I-GFP逆转录病毒感染TF-1细胞系的荧光检测结果，B为流式细胞仪检测GFP的表达效率，C为SENP1-GFP-shRNA相对于对照病毒使TF-1-T315I细胞凋亡增加，其中C的纵坐标为存活细胞数比率。

图18为SENP1在MM细胞的表达及作用，其中A为MM细胞系高表达SENP1，纵坐标为SENP1较内参β-actin的相对表达量，B为SENP1-GFP-shRNA对MM细胞凋亡的影响，纵坐标为存活细胞数比率，C为SENP1-GFP-shRNA对MM细胞增殖的影响，纵坐标为细胞增殖倍比。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：SENP1在CML的表达检测。

发明人分别对8例CML患者和供者（donor）的骨髓细胞进行了磁珠分选，获得CD34⁺细胞，通过实时定量PCR检测SENP1mRNA的表达，发现CML患者的SENP1表达高于donor（图1-A）。取其中两例CML CD34⁺细胞进行了干、祖细胞的分选，得到髓系祖细胞(CMP)、粒单核细胞系祖细胞(GMP)，红系巨核系祖细胞(MEP)和造血干细胞(HSC)，之后进行PCR检测，发现HSC组分的SENP1表达水平最高（图1-B）。各取两例样本的蛋白进行western blot分析，发现SENP1的蛋白在CML CD34⁺细胞比donor CD34⁺细胞的表达要高（图1-C）。

实施例2：降低SENP1基因表达的shRNA（short hairpin RNA，小发夹RNA）干涉载体的构建及鉴定。

从sigma公司购买SENP1干涉载体套装1套（含5个）（SHCLNG，NM-014554，其中包括TRCN0000004395、TRCN0000004396、TRCN0000004397、TRCN0000004398、TRCN0000004399），利用lipofectin2000转染试剂转入工程细胞株HEK293细胞，提取总RNA，之后利用RT-qPCR检测获得干涉效率最高的载体，具体过程为：以反转录出的cDNA为模板，qPCR（定量PCR）检测SENP1基因的表达，以β-actin做内参；其中以干涉载体的空载体作对照，2-ΔΔCT为干涉后的SENP1的表达。该干涉效率最高的载体中的小发卡序列为：5’CCGGGCGCCAGAUUGAAGAACAGAACUCGAGUUCUGUUCUUCAAUCUGGCGCUUUUU3’（SEQ ID NO：1），其针对的靶序列为人SNEP1mRNA的第1396-1416位，即5’GCGCCAGAUUGAAGAACAGAA3’（SEQ ID NO：2），其转录生成的DNA寡核苷酸链为5’CCGGGCGCCAGATTGAAGAACAGAACTCGAGTTCTGTTCTTCAATCTGGCGCTTTTT3’（SEQ ID NO：3），该shRNA可剪切形成siRNA正义链和反义链，正义链为5’GCGCCAGAUUGAAGAACAGAA3’（SEQ ID NO：4），反义链为5’UUCUGUUCUUCAAUCUGGCGC3’（SEQ ID NO：5）。

由于此载体无标识蛋白GFP，故将此载体中含有目的干涉序列的片段构建到含有GFP标志的慢病毒表达载体PPIG-u6-scramble中。该PPIG-u6-scramble载体的构建是在商业化载体pLKO.1载体（购自Addgene公司）的基础上进行kpnI单酶切，之后将MigR1载体（购自Addgene公司）中的“IRES-GFP”片段平端连接上去，鉴定连接正确。将目的干涉序列与PPIG-u6-scramble连接后，首先利用双酶切进行鉴定，如图2所示，4号克隆有可能正确，将其送Invitrogen公司测序，内含有完全正确的干涉小发卡序列（图4）；同时将该质粒转入293细胞，24h后在荧光显微镜下观察有绿色荧光出现（图3）。之后进行qPCR检测和Western blot检测，发现在mRNA水平和蛋白水平（图5）都能有效降低人SENP1的表达。这证明此干涉载体构建成功，载体命名为SENP1-GFP-shRNA。

实施例3：含人SENP1-shRNA的慢病毒的制备及SENP1-GFP-shRNA对K562细胞的抑制作用。

降低SENP1基因表达的shRNA干涉载体的构建成功后，进行慢病毒的制备及纯化。首先接种293T细胞4-4.5×10⁶个于10cm培养皿中。备次日待细胞铺满至80-85%，进行慢病毒质粒SENP1-GFP-shRNA转染。用磷酸钙转染方法将慢病毒质粒转染至293T细胞，具体步骤为：pMD2G：3μg，pSAX2：9μg（载体购自Addgene公司），目的质粒（干涉载体）：12μg。三种质粒混匀。加入63μl2.0M的CaCL₂，用0.1×TE补齐至500μl，混匀。将上述液体缓慢滴入500μl2×HBS中，边加边混匀。液体混匀后呈浑浊状态，室温静置25-30min。将1ml混合液缓慢滴入1个培养皿中。6-7小时后，检查细胞状态，轻轻将培养皿中液体换为6ml DMEM+10%胎牛血清新鲜培养液（液体预热至37℃）并加入36μl丁酸钠。换液后分别在24h、36h和48h，收集上清液暂储于4℃，并换6ml新鲜培养液+36μl丁酸钠。最后一次将所有收集液体离心：3500rpm，15min，4℃，弃沉淀。上清与PEG20000以4：1混匀，4℃过夜。3000rpm，30min，4℃，离心，弃上清。将沉淀重悬至合适体积IMDM培养基中（冰上操作），进行病毒滴度测定。病毒液分装后-80℃保存，命名为慢病毒SENP1-GFP-shRNA。慢病毒滴度测定：接种HT1080细胞2×10⁵/2ml于六孔板中。备次日进行慢病毒感染。将纯化后病毒或原液按1μl/孔、5μl/孔或100μl/孔、500μl/孔感染于各孔HT1080细胞。同时加polybrene，4μl/孔。在此过程中，要取一孔未加病毒的细胞进行记数（一般细胞会增殖至4×10⁵/孔）；计数后，可将剩余细胞继续放入孔内用作空白对照细胞。感染病毒48h后，消化细胞并用PBS洗1遍后进行流式检测（GFP）。在病毒感染期间可以在荧光显微镜下观察荧光表达情况。根据细胞数和GFP流式检测结果，计算病毒滴度。滴度（titer unit/ml）=[-ln(未感染细胞比率)×每孔细胞数]/滴加病毒（ml）。

慢病毒SENP1-GFP-shRNA感染K562细胞及其作用研究

接种K562细胞（人红白血病细胞）4×10⁵于六孔板中。按20MOI滴加慢病毒SENP1-GFP-shRNA及对照病毒（即转染有空载体PPIG-u6-scramble的慢病毒，下同），同时加polybrene8μg/ml。48h后传代。荧光显微镜观察绿色荧光（图6），病毒感染效率较高。用TRIZOL提取总RNA，之后进行反转录，得到cDNA；用ABI fast7500PCR仪检测SENP1的mRNA的表达，干涉效率可达到70%（图7）。利用CCK-8细胞增殖试剂盒（日本同仁化学研究所）检测病毒感染过的这些细胞，发现SENP1-GFP-shRNA使K562细胞增殖率明显降低（图8）。利用ANNEXIN V-APC，PI凋亡试剂盒（美国eBioscience公司）进行细胞凋亡性能的检测，发现SENP1-GFP-shRNA使K562细胞凋亡增加（图9）。

实施例4：SENP1-GFP-shRNA对KCL22细胞的抑制作用。

与实施例3的方法相似，接种KCL22细胞（人髓系白血病细胞）4×10⁵于六孔板中。按20MOI滴加慢病毒及对照病毒，同时加polybrene8μg/ml。8h后补加新鲜培养液，48h后细胞传代。荧光显微镜下观察绿色荧光（图10），显示病毒感染效率较高，不用进行流式细胞仪分选。用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，核算定量后进行反转录，得到cDNA；同样用ABI fast7500PCR仪进行实时定量PCR检测SENP1的mRNA的表达，干涉效率可达到70%（图11）。利用这些细胞进行CCK-8细胞增殖检测，发现SENP1-GFP-shRNA使KCL22细胞增殖能力降低（图12）。利用ANNEXIN V-APC，PI凋亡试剂盒进行细胞凋亡性能的检测，发现SENP1-GFP-shRNA使KCL22细胞凋亡增加（图13）。

实施例5：SENP1-GFP-shRNA对CML原代细胞的抑制作用。

各从3例CML患者及3例健康捐献者骨髓取得单个核细胞后利用磁珠分选获得CD34阳性细胞。利用20MOI的SENP1-GFP-shRNA慢病毒重复感染CD34阳性细胞2次，之后进行流式细胞仪分选，获得GFP、CD34双阳细胞。利用这些细胞进行细胞凋亡、增殖及分化特性的检测。使用ANNEXIN V-APC，PI凋亡试剂盒进行细胞凋亡性能检测，发现SENP1-GFP-shRNA可以使CML患者CD34+细胞的凋亡性能明显增强，即有促进凋亡作用（图14左）；而对健康捐献者骨髓CD34阳性细胞的凋亡性能没有作用（图14右）。这为SENP1-shRNA成药奠定了很好的基础。在GEMM培养体系中培养GFP、CD34双阳细胞，分别于实验第3天和第6天利用多色流式分析仪进行细胞分化指标检测（其中CD33为髓系指标，CD14为单核系指标，CD11b为粒系指标，CD235a为红系指标），发现SENP1-GFP-shRNA明显抑制CML CD34⁺细胞的红系分化（图15）。同时在实验第3、6、9天分别计数细胞数，发现SENP1-GFP-shRNA能明显抑制CML CD34⁺细胞的增殖，而对健康捐献者骨髓CD34⁺细胞的作用与对照比较没有差异（图16）。

实施例6：SENP1-GFP-shRNA对耐药细胞的抑制作用。

利用T315I-GFP逆转录病毒（美国洛杉矶医学中心惠赠）感染TF-1细胞系，荧光显微镜下观察绿色荧光表达，显示感染效率较高（图17-A）。流式细胞仪检测GFP表达效率达到94.4%（图17-B）。T315I赋予了TF-1细胞对伊马替尼（Imatinib）等药物的耐药性，而SENP1-GFP-shRNA相对于对照病毒使TF-1-T315I细胞凋亡特性大大增强（图17-C），这为SENP1-GFP-shRNA的成药也奠定了很好的基础。

实施例7：SENP1在MM的表达及作用。

发明人分别对供者（donor）的骨髓单个核细胞（MNC）和CD34+细胞及MM细胞系XG-7、RPMI8226、SKO-007细胞，通过实时定量PCR检测SENP1mRNA的表达，发现MM细胞系高表达SENP1（图18-A）。利用慢病毒SENP1-GFP-shRNA和对照病毒，在细胞系XG-7、RPMI8226细胞上进行了细胞凋亡和增殖的实验，结果表明SENP1-shRNA具有促进细胞凋亡（图18-B）和抑制细胞增殖的作用（图18-C）。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.SENP1蛋白的抑制剂或者SENP1蛋白的抑制剂与其它药物的联合应用用于制备预防或治疗恶性血液肿瘤的药物中的用途，或者用于在体外/体内抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖和/或促进恶性血液肿瘤细胞凋亡的用途，或者用于制备抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖和/或促进恶性血液肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂是指能够抑制SENP1蛋白发挥功能的物质，例如为能够抑制SENP1基因的复制、转录、翻译、或转录、翻译后修饰的核酸、蛋白或化合物，或者为能够和SENP1蛋白结合、进而抑制SENP1蛋白活性的核酸、蛋白或化合物，，例如为shRNA，例如为如SEQ ID NO：1所示的shRNA。

3.权利要求2的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂为包含所述shRNA的重组载体。

4.权利要求3的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制剂为包含所述重组载体的重组宿主细胞。

5.权利要求1-4任一项的用途，其中所述的恶性血液肿瘤选自慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤。

6.ShRNA用于下调体外/体内细胞中SENP1蛋白的表达的用途，优选地，所述shRNA为如SEQ ID NO：1所示的shRNA。

7.ShRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

8.重组载体，其含有权利要求7的shRNA。

9.重组宿主细胞，其含有权利要求8的重组载体。

10.筛选用于预防或治疗恶性血液肿瘤的药物的方法，其包括筛选SENP1蛋白的抑制剂的步骤；

优选地，所述SENP1蛋白的抑制剂是指能够抑制SENP1蛋白发挥功能的物质，例如为能够抑制SENP1基因的复制、转录、翻译、或转录、翻译后修饰的核酸、蛋白或化合物，或者为能够和SENP1蛋白结合、进而抑制SENP1蛋白活性的核酸、蛋白或化合物，例如为shRNA，例如为如SEQ ID NO：1所示的shRNA；

优选地，所述恶性血液肿瘤选自慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤。