CN104422751B - 生化分离检测一体芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生化分离检测一体芯片，该芯片包括衬底、分离层固定相以及表面增强拉曼信号检测层，所述信号检测层通过第一黏合层连接到所述分离层固定相上,其中,所述分离层固定相包括由多个纳米单元构成的纳米阵列薄膜层；所述纳米阵列薄膜层的孔隙率为50%～70%；所述纳米单元的材料为SiO2或Al2O3。本发明提供的检测芯片可以实现对待测混合物样品进行快速分离和高灵敏度检测一体化，在食品、环境和临床医学等领域中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生化分析检测技术领域，特别涉及一种集超薄薄层色谱分离和表面增强拉曼检测于一体的生化分离检测一体芯片及其制备方法。
背景技术
快速、高灵敏度和高特异性的生化检测手段在食品、环境和临床医学领域有重要作用,是建立有效的食品安全质量控制体系的重要保证；为医学临床诊断和疾病/流行病预防控制提供依据；为环境污染的监控提供量化的佐证。然而，食品、环境和临床医学中的生化样品通常为复杂混合物，通常需要进行分离和纯化以消除样品基底对测定的干扰。尤其对于痕量的环境样品和医学临床样品等，还需要恰当方法对样品进行富集以弥补检验方法灵敏度的不足。现有技术方法如高效液相色谱-质谱联用技术、荧光免疫分析和酶联免疫分析(ELISA)、聚合酶链反应（PCR)等通常步骤繁冗，并且需要依赖于昂贵的实验室设备和特殊试剂，不利于进行快速检测。
表面增强拉曼（Surface-EnhancedRamanScattering，SERS）检测方法具有极高的灵敏度，可以用于单分子水平的检测,其主要原理是在纳米尺度(5～100nm)的金属表面受入射激光激发产生的局域电磁场增强效应，其表面增强效应与金属种类、金属纳米结构的形状、粒径大小等直接相关。SERS检测方法中信号强度与荧光信号强度在同一数量级，谱峰信号尖锐，可以提供荧光信号所不具备的分子结构特征指纹信息，既可以用于直接检测，也可以进行标记间接检测,是进行生化检测的强有力的工具。
运用SERS检测方法对食品、环境和临床医学等领域中由复杂基体组成的生化样品进行检测时，主要有两种检测模式：其一是基于免疫夹心结构的间接检测模式，检测芯片由第一（捕捉）抗体+SERS信号标记+第二（特异）抗体组成.该方法需要分别生长/固定第一（捕捉）抗体的芯片，以及由第二（特异）抗体修饰的SERS标记单元，制备过程繁冗，成本高昂；第二种检测模式为直接检测模式，将待测样品直接吸附于SERS活性芯片表面，运用化学计量学的多变量分析方法对SERS谱图进行定性鉴别与定量分析，该方法简单易行，但容易受到大量的复杂样品基体干扰，从而降低了检测灵敏度。
银的斜纳米棒阵列是一种高灵敏度和高效的表面增强拉曼芯片结构。该结构的表面增强拉曼芯片使用直接检测模式，在用于临床样品（如病毒）检测时，由于复杂样品基体的干扰，大大降低了该芯片的灵敏度。
另一方面，虽然表面增强拉曼技术可以与传统的薄层色谱（TLC）分离技术联用，即首先使用薄层色谱对混合物样品进行分离，然后在分离的样品斑点原位点滴加Au或Ag溶胶纳米颗粒，形成检测“热点”(hot spot)，进行的表面增强拉曼检测，但由于Au/Ag溶胶颗粒形成的“热点”不稳定，导致该方法可靠性较低。
发明内容
针对上述提到的现有技术的不足，本发明提出了一种生化分离检测一体芯片及其制备方法，该检测芯片可以实现对待测混合物样品进行快速分离和高灵敏度检测一体化，在食品、环境和临床医学等领域中具有广泛的应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种生化分离检测一体芯片，包括衬底、分离层固定相以及表面增强拉曼信号检测层，所述信号检测层通过第一黏合层连接到所述分离层固定相上。
优选地，所述分离层固定相包括由多个纳米单元构成的纳米阵列薄膜层；所述纳米阵列薄膜层的孔隙率为50%～70%；所述纳米单元的材料为SiO2或Al2O3。
优选地，所述纳米单元为斜纳米棒；其中，以垂直于衬底的方向为基准，斜纳米棒倾斜的角度为20～50°。
优选地，所述分离层固定相包括多个纳米阵列薄膜层，其中相邻两层纳米阵列薄膜层中的斜纳米棒呈相反方向倾斜。
优选地，所述纳米单元为螺旋状纳米棒，并且所述螺旋状纳米棒的轴线垂直于衬底。
优选地，所述信号检测层为金属斜纳米棒阵列薄膜层，所述金属为Au或Ag,所述信号检测层的厚度为800～1000nm。
优选地，所述信号检测层500还包覆有一表面化学修饰材料层。
优选地，所述分离层固定相的厚度为3～5μm。
优选地，所述第一黏合层的材料为Ti或者Cr。
优选地，所述衬底与分离层固定相之间还设置有第二黏合层，所述第二黏合层的材料为Ti或者SiO2。
本发明的另一方面是提供了如上所述的生化分离检测一体芯片的制备方法，包括步骤，首先采用斜/掠角沉积工艺在衬底上生长分离层固定相，然后在分离层固定相上生长第一黏合层，最后采用斜/掠角沉积工艺在第一黏合层上生长具有斜纳米棒阵列的信号检测层，获得所述检测芯片；其中，所述分离层固定相包括由多个纳米单元构成的纳米阵列薄膜层；所述纳米阵列薄膜层的孔隙率为50%～70%；所述纳米单元的材料为SiO2或Al2O3。
优选地，所述芯片的分离层固定相包括多个纳米阵列薄膜层，所述衬底与所述分离层固定相之间还包括第二黏合层，所述制备方法具体包括步骤：
S101、在衬底上生长第二黏合层；
S102、采用斜/掠角沉积工艺在第二黏合层上生长具有斜纳米棒阵列的第一薄膜层；
S103、旋转样品台180°，生长具有斜纳米棒阵列的第二薄膜层；其中，第二薄膜层的纳米棒的倾斜角度与所述第一薄膜层的相反；
S104、重复步骤S103，获得具有多个纳米阵列薄膜层的分离层固定相；
S105、采用电子束沉积在所述分离层固定相上生长第一黏合层；
S106、采用斜/掠角沉积工艺在第一黏合层上生长具有斜纳米棒阵列的信号检测层；
其中，所述斜/掠角沉积工艺中沉积角度的范围是80～86°，沉积速率范围是0.2～0.4nm/s。
优选地，所述斜纳米棒的直径为60～510nm，斜纳米棒之间的间隙为40～240nm；每一层纳米阵列薄膜层的厚度为500～1500nm。
在另外一个优选的实施方案中，所述芯片的分离层固定相为螺旋状纳米棒阵列的薄膜层,所述衬底与所述分离层固定相之间还包括第二黏合层，所述制备方法具体包括步骤：
S201、在衬底上生长第二黏合层；
S202、采用斜/掠角沉积工艺，并且在沉积过程中控制样品台旋转，在所述第二黏合层生长具有螺旋状纳米棒阵列，获得具有多个螺旋状纳米棒阵列薄膜层的分离层固定相；
S203、采用电子束沉积工艺在所述分离层固定相上生长第一黏合层；
S204、采用斜/掠角沉积工艺在第一黏合层上生长具有斜纳米棒阵列的信号检测层；
其中，所述斜/掠角沉积工艺中沉积角度的范围是80～85°，沉积速率范围是0.2～0.4nm/s。
优选地，所述沉积速率与样品台旋转速率的比值范围是100:1～200:1nm/rev。
优选地，所述螺旋状纳米棒的直径为60～160nm，螺旋状纳米棒之间的间隙为40～160nm；螺旋状纳米棒阵列薄膜层的厚度为3000～5000nm。
优选地，所述分离层固定相的厚度为3～5μm。
优选地，如上所述的制备方法还包括步骤，对所述芯片进行表面化学修饰与改性。
有益效果：
第一、本发明提供了一种采样量小(≤0.1μL)，并且将快速分离与高灵敏度检测有机结合的快速生化分析检测芯片；该芯片使用斜/掠角沉积技术，在一个工艺过程内依次生长制备超薄薄层色谱(UltraThin-LayerChromatography，UTLC)分离层固定相和表面增强拉曼（Surface-EnhancedRamanScattering，SERS）信号检测层；
第二、用于生长UTLC分离层固定相的材料为SiO2或Al2O3，通过控制沉积角度（入射气流角度与衬底法线之夹角）的变化，控制精度≤1°，可以方便的调节控制不同材料的UTLC分离层固定相的孔隙率和厚度，从而形成特定的UTLC分离层固定相孔隙结构；
第三、与传统的在薄层色谱(TLC)色谱样品斑点原位点上滴加Au/Ag纳米溶胶颗粒进行SERS信号采集的方法相比，本发明将分离层固定相和信号检测层集合到同一芯片上，可以克服使用Au/Ag纳米溶胶颗粒不易形成稳定的检测“热点”（hot spots）、可靠性（均一度和重现性）差等缺陷，并且使用斜/掠角沉积技术生长的SERS信号检测层的灵敏度和可靠性都得到大大提高；
第四、本发明方法所生长制备生长的分离检测纳米结构层可以进一步进行表面化学修饰与改性，为进一步扩展提高本发明芯片的性能提供了有利条件。
附图说明
图1为本发明实施例中提供的生化分离检测一体芯片的结构示意图。
图2为本发明另一实施例中提供的表生化分离检测一体芯片的结构示意图。
图3为如图1所示的生化分离检测一体芯片的制备方法流程图。
图4为如图2所示的生化分离检测一体芯片的制备方法流程图。
图5为本发明实施例中应用生化分离检测一体芯片进行检测的图示；其中，图5a为将点样后的芯片在玻璃染色缸中使待测样品展开的图示；图5b为应用拉曼光谱仪对展开后的待测样品进行扫描的图示。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术存在的不足，本发明提出了一种集快速分离与高灵敏度检测为一体的生化分离检测一体芯片,所述芯片包括衬底以及衬底上的超薄薄层色谱（UTLC)分离层固定相,以及表面增强拉曼（SERS）信号检测层，其中，所述信号检测层通过第一黏合层连接到所述分离层固定相上。该检测芯片可以实现对待测样品进行分离和检测一体化，在食品、环境和临床医学等领域的快速检测中具有广泛的应用前景。
下面将结合附图用实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
如图1所示，本实施例提供的生化分离检测一体芯片包括衬底100以及依次设置于衬底100上的分离层固定相300和信号检测层500，所述分离层固定相300通过第二黏合层200连接到所述衬底100上，所述信号检测层500通过第一黏合层400连接到所述分离层固定相300上。
在本实施例中，所述衬底100的材料为硅；所述第二黏合层200的材料为Ti,第二黏合层200的厚度为20nm；所述分离层固定相300包括4个纳米阵列薄膜层（301、302）；所述第一黏合层400的材料为Ti,第一黏合层400的厚度为10nm；所述信号检测层500为具有金属斜纳米棒阵列的薄膜层，其厚度为800nm，所述金属为Ag，其中，以垂直于衬底的方向为基准，金属斜纳米棒倾斜的角度为71±4°。
其中，所述纳米阵列薄膜层（301、302）由多个纳米单元300a构成，纳米阵列薄膜层（301、302）的孔隙率为50%，其厚度为1000nm；所述纳米单元300a为斜纳米棒，以垂直于衬底的方向为基准，斜纳米棒倾斜的角度为28±4°，所述纳米单元300a的材料为Al2O3；并且，在所述分离层固定相300中，相邻的两层纳米阵列薄膜层中的斜纳米棒呈相反方向倾斜，例如，相邻的两层纳米阵列薄膜层301和302中，以垂直于衬底的方向为基准，薄膜层301中斜纳米棒的倾斜角度为+（28±4°），则薄膜层302中斜纳米棒的倾斜角度为-（28±4°）。
在本实施例中，所述Al2O3斜纳米棒的平均直径为410±95nm，相邻Al2O3斜纳米棒间的平均间隙为160±80nm。
下面介绍如上所述的生化分离检测一体芯片的制备方法，参阅图3，该方法具体包括步骤：
S101、采用电子束沉积工艺，在硅衬底100上沉积一层20nm厚的Ti薄膜层作为第二黏合层200；
S102、固定样品台，采用Al2O3为沉积物原料，应用斜/掠角电子束沉积工艺在第二黏合层200上生长具有斜纳米棒300a阵列的第一薄膜层301；所述第一薄膜层301的厚度为1000nm，所述Al2O3斜纳米棒300a的平均直径为410±95nm，相邻Al2O3斜纳米棒300a之间的平均间隙为160±80nm；以垂直于衬底的方向为基准，所述Al2O3斜纳米棒300a倾斜的角度为28±4°；其中，电子束沉积工艺的沉积角度为86°，沉积速率为0.4nm/s，所述沉积角度是指待沉积物的入射方向与衬底法线方向的夹角。
S103、旋转样品台180°，参照步骤S102中的电子束沉积工艺生长具有斜纳米棒阵列的第二薄膜层302；其中，第二薄膜层302的纳米棒的倾斜角度与所述第一薄膜层301的相反；
S104、重复步骤S103，获得具有4个纳米阵列薄膜层（301、302）的分离层固定相300；其中相邻两层纳米阵列薄膜层中的斜纳米棒呈相反方向倾斜；
S105、采用电子束沉积工艺，在所述分离层固定相300上沉积一层10nm厚的Ti薄膜层作为第一黏合层400；电子束沉积工艺的沉积角度为80°，沉积速率为0.2nm/s，所述沉积角度是指待沉积物的入射方向与衬底法线方向的夹角；
S106、采用Ag为沉积物原料，应用斜/掠角沉积工艺在第一黏合层400上生长具有斜纳米棒阵列的信号检测层500，所述信号检测层500的厚度为800nm；其中，电子束沉积工艺的沉积角度为84°，沉积速率为0.32nm/s，所述沉积角度是指待沉积物的入射方向与衬底法线方向的夹角；以垂直于衬底的方向为基准，信号检测层500中斜纳米棒的倾斜角度为（71±4°）；获得所述生化分离检测一体芯片。
在本实施例中,使用如上所述的芯片进行叶绿体色素的分离检测。本实例首先在芯片上对植物的叶绿体色素，包括叶绿素和叶黄素等进行超薄薄层色谱分离，叶绿体色素的各个组分由于在色谱展开溶剂中具有不同的溶解性能，通过色谱展开溶剂带动，从原混合物样点在芯片固定相上分离并依次展开，然后在分离展开后的各个组分斑点位置使用特定波长的激光激发，在信号层产生表面增强拉曼信号，使用拉曼光谱仪采集相应组分的表面增强拉曼谱图，根据各个组分物质的特征谱峰进行物质的鉴别检测。检测的具体步骤为：
(1)采用新鲜洗净的绿叶片2-3片，用剪刀剪成约6mm×3mm的碎片放入玛瑙研钵中，加入约2-3mL乙醇，使用研钵棒不断压挤碎叶片，压榨出叶绿素。使用快速定性滤纸，将压榨出的汁液过滤进入具塞玻璃试管，盖瓶塞振荡摇匀待用；
（2）配制色谱展开溶剂：将石油醚与丙酮按体积比为3:1混合得到色谱展开溶剂，然后在玻璃染色缸中加入3-4ml色谱展开溶剂，加盖放置，使玻璃染色缸内色谱展开溶剂蒸汽达到饱和；
（3）使用内径为1mm的毛细点样管吸取上述步骤（1）中的叶绿素乙醇溶液<0.1μL，在本实施例中制备得到的生化分离检测一体芯片一端距离边缘7-8mm处进行点样，在空气中静置干燥；
（4）如图5a所示，将上述步骤（3）点样后的芯片插入上述步骤（2）的玻璃染色缸中，保持样品点O接近但不接触展开溶剂的弯月面A-A，加盖并静置20min，使溶剂在毛细管作用下向上移动，对叶绿体色素样品进行展开，其中B-B为样品展开的前沿面；得到叶绿体色素中的组分展开次序从展开溶剂一端向上依次为叶黄素和叶绿素；
（5）从上述步骤（4）玻璃染色缸中取出芯片，对展开的样品点作标记，使用干燥氮气小心吹干残余溶剂；
（6）将上述步骤（5）的芯片置于拉曼光谱仪600下，使用633nm激发波长，功率≤5mW，聚焦在标记点，沿溶剂展开方向，在包括点样点原点和展开色谱点的区间内，分别扫描采集分离后的样品点表面增强拉曼光谱,在400-1800cm-1内进行光谱扫描，曝光时长10s,扫描2次,如图5b所示。
由上述步骤（6）在分离斑点得到分离后叶绿素各个组分的特征拉曼谱图。例如，叶绿素在1141cm-1和1166cm-1处有一对特征双峰；叶黄素在971cm-1有区别于叶绿素的特征谱峰。
实施例2
如图2所示，本实施例提供的生化分离检测一体芯片包括衬底100以及依次设置于衬底100上的分离层固定相300和信号检测层500，所述分离层固定相300通过第二黏合层200连接到所述衬底100上，所述信号检测层500通过第一黏合层400连接到所述分离层固定相300上。
在本实施例中，所述衬底100的材料为玻璃载玻片；所述第二黏合层200的材料为SiO2,第二黏合层200的厚度为50nm；所述分离层固定相300包括螺旋状纳米棒阵列薄膜层；所述第一黏合层400的材料为Cr,第一黏合层400的厚度为10nm；所述信号检测层500为具有金属斜纳米棒阵列的薄膜层，其厚度为1000nm，所述金属为Au，其中，以垂直于衬底的方向为基准，金属斜纳米棒倾斜的角度为70±4°。
其中，所述分离层固定相300是由多个螺旋状纳米棒300b构成的纳米阵列薄膜层，其厚度为3000nm，所述螺旋状纳米棒300b的材料为SiO2，所述SiO2螺旋状纳米棒300b的平均直径为75±15nm，并且所述螺旋状纳米棒的轴线垂直于衬底，其中，相邻SiO2螺旋状纳米棒300b间的平均间隙为100±25nm。
下面介绍如上所述的检测芯片的制备方法，参阅图4，该方法具体包括步骤：
S201、采用电子束沉积工艺，在玻璃载玻片衬底100上沉积一层50nm厚的SiO2薄膜层作为第二黏合层200；
S202、采用斜/掠角沉积工艺，沉积角度为85°，沉积速率为0.4nm/s,同时控制样品台旋转，样品台旋转的速率为0.002rev/s，此时沉积速率与衬底旋转速率之比为200:1nm/rev,在第二黏合层上生长具有螺旋状纳米棒阵列的分离层固定相300，其厚度为3000nm；所述螺旋状纳米棒300b的材料为SiO2，所述SiO2螺旋状纳米棒300b的平均直径为75±15nm，并且所述螺旋状纳米棒的轴线垂直于衬底，其中，相邻SiO2螺旋状纳米棒300b间的平均间隙为100±25nm；
S203、采用电子束沉积工艺，在所述分离层固定相300上沉积一层10nm厚的Cr薄膜层作为第一黏合层400；电子束沉积工艺的沉积角度为80°，沉积速率为0.2nm/s，所述沉积角度是指待沉积物的入射方向与衬底法线方向的夹角；
S204、采用Au为沉积物原料，应用斜/掠角沉积工艺在第一黏合层400上生长具有斜纳米棒阵列的信号检测层500，所述信号检测层500的厚度为1000nm；其中，电子束沉积工艺的沉积角度为80°，沉积速率为0.3nm/s，所述沉积角度是指待沉积物的入射方向与衬底法线方向的夹角；以垂直于衬底的方向为基准，信号检测层500中斜纳米棒的倾斜角度为（70±4°）；获得所述生化分离检测一体芯片。
在本实施例中,使用如上所述的芯片进行混合物体系分离检测，本实例首先在芯片上对混合物体系，包括亚甲基蓝、结晶紫和罗丹明6G等进行超薄薄层色谱分离，混合物体系的各个组分由于在色谱展开溶剂中具有不同的溶解性能，通过色谱展开溶剂带动，从原混合物样点在芯片固定相上分离并依次展开，然后在分离展开后的各个组分斑点位置使用特定波长的激光激发，在信号层产生表面增强拉曼信号，使用拉曼光谱仪采集相应组分的表面增强拉曼谱图，根据各个组分物质的特征谱峰进行物质的鉴别检测。检测方法的具体步骤为：
(1)配制亚甲基蓝（10-5M）、结晶紫（10-4M）和罗丹明6G（10-5M）的乙醇混合物溶液；
（2）配制色谱展开溶剂，将甲苯和乙醇按体积比为2:1混合得到色谱展开溶剂，然后在玻璃染色缸中加入3-4ml色谱展开溶剂，加盖放置，使玻璃染色缸内的展开溶剂蒸汽达到饱和；
（3）使用移液枪吸取上述步骤（1）中的混合物溶液0.1μL，在本实施例制备得到的生化分离检测一体芯片一端距离边缘7-8mm处进行点样，在空气中静置干燥；
（4）如图5a所示，将上述步骤（3）点样后的芯片插入上述步骤（2）的玻璃染色缸中，保持样品点O接近但不接触展开溶剂的弯月面A-A，加盖并静置10min，使溶剂在毛细管作用下向上移动，对混合物样品进行展开,其中B-B为样品展开的前沿面；得到混合物中的组分展开次序从展开溶剂一端向上依次为亚甲基蓝、结晶紫和罗丹明6G。
（5）从上述步骤（4）的玻璃染色缸中取出芯片，对展开的样品点作标记，使用干燥氮气小心吹干残余溶剂；
（6）如图5b所示，将上述步骤（5）的芯片置于拉曼光谱仪600下，使用633nm激发波长，功率≤5mW，聚焦在标记点，沿溶剂展开方向，在包括混合物点样原点和展开色谱点的区间内，分别扫描采集分离后的样品点表面增强拉曼光谱,在400-1800cm-1内进行光谱扫描，曝光时长10s,扫描2次。
由上述步骤（6）在分离斑点得到分离后混合物各个组分的特征拉曼谱图。例如，亚甲基蓝的C-S键在480cm-1处有特征强峰；结晶紫在1619cm-1、1588cm-1、1374cm-1、1175cm-1、918cm-1、808cm-1、763cm-1和733cm-1处有特征组峰，罗丹明6G在1513cm-1、1364cm-1、1313cm-1、775cm-1和614cm-1有特征组峰。
实施例3
本实施例与实施例1的不同的是，所述分离层固定相300的材料为SiO2；此外，为进一步改善样品在分离层固定相300和信号检测层500之间分布的均匀性，本实例中进一步采用正硅酸乙酯水解法对信号检测层500的金属斜纳米棒进行多孔SiO2薄层包覆。
参阅图1，本实施例提供的检测芯片包括衬底100以及依次设置于衬底100上的分离层固定相300和信号检测层500，所述分离层固定相300通过第二黏合层200连接到所述衬底100上，所述信号检测层500通过第一黏合层400连接到所述分离层固定相300上，其中，所述信号检测层500上还包覆有一多孔SiO2薄层包覆层（图中未标示出）。
在本实施例中，所述衬底100的材料为玻璃；所述第二黏合层200的材料为SiO2,第二黏合层200的厚度为50nm；所述分离层固定相300包括4个纳米阵列薄膜层（301、302）；所述第一黏合层400的材料为Ti,第一黏合层400的厚度为10nm；所述信号检测层500为具有金属斜纳米棒阵列的薄膜层，其厚度为900nm，所述金属为Ag，其中，以垂直于衬底的方向为基准，金属斜纳米棒倾斜的角度为70±4°。
其中，所述纳米阵列薄膜层（301、302）由多个纳米单元300a构成，纳米阵列薄膜层（301、302）的孔隙率为70%，其厚度为1000nm；所述纳米单元300a为斜纳米棒，以垂直于衬底的方向为基准，斜纳米棒倾斜的角度为46±4°，所述纳米单元300a的材料为SiO2；并且，在所述分离层固定相300中，相邻的两层纳米阵列薄膜层中的斜纳米棒呈相反方向倾斜，例如，相邻的两层纳米阵列薄膜层301和302中，以垂直于衬底的方向为基准，薄膜层301中斜纳米棒的倾斜角度为+（46±4°），则薄膜层302中斜纳米棒的倾斜角度为-（46±4°）。
在本实施例中，所述SiO2斜纳米棒的平均直径为65±8nm，相邻SiO2斜纳米棒间的平均间隙为100±30nm。
下面介绍如上所述的检测芯片的生长方法，参阅图2，该方法具体包括步骤：
S101、采用电子束沉积工艺，在玻璃衬底100上沉积一层50nm厚的SiO2薄膜层作为第二黏合层200；
S102、固定样品台，采用SiO2为沉积物原料，应用斜/掠角电子束沉积工艺在第二黏合层200上生长具有斜纳米棒300a阵列的第一薄膜层301；所述第一薄膜层301的厚度为1000nm，所述SiO2斜纳米棒300a的平均直径为65±8nm，相邻SiO2斜纳米棒300a之间的平均间隙为100±30nm；以垂直于衬底的方向为基准，所述SiO2斜纳米棒300a倾斜的角度为46±4°；其中，电子束沉积工艺的沉积角度为85°，沉积速率为0.4nm/s，所述沉积角度是指待沉积物的入射方向与衬底法线方向的夹角；
S103、旋转样品台180°，参照步骤S102中的电子束沉积工艺生长具有斜纳米棒阵列的第二薄膜层302；其中，第二薄膜层302的纳米棒的倾斜角度与所述第一薄膜层301的相反；
S104、重复步骤S103，获得具有5个纳米阵列薄膜层（301、302）的分离层固定相300；其中相邻两层纳米阵列薄膜层中的斜纳米棒呈相反方向倾斜；
S105、采用电子束沉积工艺，在所述分离层固定相300上沉积一层10nm厚的Ti薄膜层作为第一黏合层400；电子束沉积工艺的沉积角度为80°，沉积速率为0.2nm/s，所述沉积角度是指待沉积物的入射方向与衬底法线方向的夹角；
S106、采用Ag为沉积物原料，应用斜/掠角沉积工艺在第一黏合层400上生长具有斜纳米棒阵列的信号检测层500，所述信号检测层500的厚度为900nm；其中，电子束沉积工艺的沉积角度为82°，沉积速率为0.4nm/s，所述沉积角度是指待沉积物的入射方向与衬底法线方向的夹角；以垂直于衬底的方向为基准，信号检测层500中斜纳米棒的倾斜角度为70±4°。
S107、对上述步骤S106制备得到的芯片进行表面化学修饰与改性（附图中未标示出）；具体地，在本实施例中，使用正硅酸四乙酯（TEOS）水解法对所述芯片进行多孔SiO2薄层包覆，包括以下步骤为：
（i）首先将上述步骤S106制备得到的芯片在0.4M柠檬酸中静置30分钟取出，以便清洗所述芯片并对所述芯片的纳米结构表面进行酸化，然后使用超纯水冲洗该芯片，并使用干燥氮气流吹干；
（ii）配制乙醇、水和正硅酸乙酯（体积比为50:8:1）的混合液，使用磁力搅拌使溶液均匀混合，其中，乙醇的加入有利于形成均相的混合溶液，以利于后续水解反应的发生；
（iii）将经上述步骤（i）处理的芯片浸入上述步骤（ii）制备的混合液中20分钟，保持对上述步骤（ii）中的磁力搅拌，并逐滴加入与正硅酸四乙酯等体积的氨水（28%）作为催化剂，水解30分钟；
其中，水解方程式为：
（iv）从上述步骤（iii）中取出所述芯片，使用超纯水冲洗，并使用干燥氮气吹干，获得所述生化分离检测一体芯片，其中，所述生化分离检测一体芯片的信号检测层500上包覆有一多孔SiO2薄层包覆层，所述多孔SiO2薄层厚度不大于10nm。
本实施例中所述的斜/掠角沉积工艺是指待沉积物的入射方向与衬底法线方向具有一定的夹角，并且还可根据需要控制衬底旋转的一种沉积工艺。
本发明提供的快速生化检测芯片可以实现对待测混合物样品进行快速分离和高灵敏度检测一体化，在食品、环境和临床医学等领域中具有广泛的应用前景。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (12)
1.一种生化分离检测一体芯片，其特征在于,包括衬底、分离层固定相以及表面增强拉曼信号检测层，所述信号检测层通过第一黏合层连接到所述分离层固定相上；所述分离层固定相包括由多个纳米单元构成的纳米阵列薄膜层，所述纳米阵列薄膜层的孔隙率为50％～70％；所述纳米单元的材料为SiO2或Al2O3，所述信号检测层为金属斜纳米棒阵列薄膜层，所述金属为Au或Ag；
其中，所述纳米单元为斜纳米棒，以垂直于衬底的方向为基准，斜纳米棒倾斜的角度为20～50°，所述分离层固定相包括多个纳米阵列薄膜层，其中相邻两层纳米阵列薄膜层中的斜纳米棒呈相反方向倾斜；或者是，所述纳米单元为螺旋状纳米棒，并且所述螺旋状纳米棒的轴线垂直于衬底。
2.根据权利要求1所述的生化分离检测一体芯片，其特征在于，所述信号检测层的厚度为800～1000nm。
3.根据权利要求1或2所述的生化分离检测一体芯片，其特征在于，所述信号检测层还包覆有一表面化学修饰材料层。
4.根据权利要求1或2所述的生化分离检测一体芯片，其特征在于，所述分离层固定相的厚度为3～5μm。
5.一种如权利要求1所述的生化分离检测一体芯片的制备方法，其特征在于，首先采用斜/掠角沉积工艺在衬底上生长分离层固定相，然后在分离层固定相上生长第一黏合层，最后采用斜/掠角沉积工艺在第一黏合层上生长具有金属斜纳米棒阵列的信号检测层，获得所述检测芯片；其中，所述分离层固定相包括由多个纳米单元构成的纳米阵列薄膜层；所述纳米阵列薄膜层的孔隙率为50％～70％；所述纳米单元的材料为SiO2或Al2O3。
6.根据权利要求5所述的生化分离检测一体芯片的制备方法，其特征在于，所述芯片的分离层固定相包括多个纳米阵列薄膜层，所述衬底与所述分离层固定相之间还包括第二黏合层，所述制备方法具体包括步骤：
S101、在衬底上生长第二黏合层；
S102、采用斜/掠角沉积工艺在第二黏合层上生长具有斜纳米棒阵列的第一薄膜层；
S103、旋转样品台180°，生长具有斜纳米棒阵列的第二薄膜层；其中，第二薄膜层的纳米棒的倾斜角度与所述第一薄膜层的相反；
S104、重复步骤S103，获得具有多个纳米阵列薄膜层的分离层固定相；
S105、采用电子束沉积在所述分离层固定相上生长第一黏合层；
S106、采用斜/掠角沉积工艺在第一黏合层上生长具有金属斜纳米棒阵列的信号检测层；
其中，所述斜/掠角沉积工艺中沉积角度的范围是80～86°，沉积速率范围是0.2～0.4nm/s。
7.根据权利要求6所述的生化分离检测一体芯片的制备方法，其特征在于，所述分离层固定相中的斜纳米棒的直径为60～510nm，斜纳米棒之间的间隙为40～240nm；每一层纳米阵列薄膜层的厚度为500～1500nm。
8.根据权利要求5所述的生化分离检测一体芯片的制备方法，其特征在于，所述芯片的分离层固定相为螺旋状纳米棒阵列的薄膜层,所述衬底与所述分离层固定相之间还包括第二黏合层，所述制备方法具体包括步骤：
S201、在衬底上生长第二黏合层；
S202、采用斜/掠角沉积工艺，并且在沉积过程中控制样品台旋转，在所述第二黏合层生长具有螺旋状纳米棒阵列，获得具有多个螺旋状纳米棒阵列薄膜层的分离层固定相；
S203、采用电子束沉积工艺在所述分离层固定相上生长第一黏合层；
S204、采用斜/掠角沉积工艺在第一黏合层上生长具有金属斜纳米棒阵列的信号检测层；
其中，所述斜/掠角沉积工艺中沉积角度的范围是80～85°，沉积速率范围是0.2～0.4nm/s。
9.根据权利要求8所述的生化分离检测一体芯片的制备方法，其特征在于，所述沉积速率与样品台旋转速率的比值范围是100:1～200:1nm/rev。
10.根据权利要求8所述的生化分离检测一体芯片的制备方法，其特征在于，所述螺旋状纳米棒的直径为60～160nm，螺旋状纳米棒之间的间隙为40～160nm；螺旋状纳米棒阵列薄膜层的厚度为3000～5000nm。
11.根据权利要求6或8所述的生化分离检测一体芯片的制备方法，其特征在于，所述分离层固定相的厚度为3～5μm。
12.根据权利要求6或8所述的生化分离检测一体芯片的制备方法，其特征在于，该方法还包括步骤，对所述芯片进行表面化学修饰与改性。
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