CN104397457A - 提高鱼鳃屏障功能的营养组方、应用及含该组方的饲料 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高鱼鳃屏障功能的营养组方、应用及含该组方的饲料。所述营养组方包括以下重量份的组分：亮氨酸0.00004-0.0002份，苏氨酸0.8-2.0份，泛酸0.37-0.98份，锰0.0008-0.0027份。本发明通过添加所述范围的营养组方，能提高腮屏障功能，降低铜离子毒性，降低腮和血清铜含量，保障腮和鱼体健康。同时能促进鱼类生长，提高饲料效率，具有使用方便、成本低、无毒安全等优点。
Description
技术领域
本发明属于鱼类营养技术领域，具体的，涉及一种提高养殖鱼鳃屏障功能的营养组方、及其应用和含该组方的饲料。
背景技术
鱼肉富含优质蛋白、多种矿物元素和维生素，是改善膳食结构，提高人体健康水平的重要肉品之一，我国人均拥有量占肉类总量的近1/3。草鱼、鲤鱼等淡水鱼类是我国主要养殖鱼类，占鱼类养殖总产量的近40％。
近年来，随着鱼类养殖集约化程度不断增加，养殖水体恶化越来越严重，水中重金属如铜等有毒有害物增加，导致鳃的屏障功能受损，进一步导致鳃病高发，死亡的年经济损失高达60亿元以上，发病后鱼的生长速度和生产水平降低，导致养殖效益下降。鳃病的治疗目前主要采用化学药物和中草药。化学药物使用后产生严重的毒副作用：(1)破坏鱼鳃结构，降低鱼体免疫和抗应激能力，疾病抵抗能力进一步下降；(2)抗药性增加，不断提高化学药物的使用剂量，导致药物残留增加，影响水产品安全，威胁人体健康。中草药虽然对鳃病有一定的治疗作用，但是治愈效率不高，病愈后鱼的生长速度和生产水平下降20-30％以上，经济损失严重。但所有的药物治疗均只能治标，不能治本，同时严重威胁产业和食品安全。因此，预防的治本技术是最有效的技术，提高鱼自身抵御鳃病的能力是最有效的措施。研究表明：鳃病发生的核心原因是鳃屏障结构受到破坏，因此保证鱼鳃屏障结构完整性是抵御鳃病发生的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种通过营养技术增强鱼鳃的抗损伤能力，有效上调鱼鳃上皮细胞屏障功能，保证鱼鳃结构完整性，降低铜离子的通透性，保障鳃健康，抵御鳃病发生且无毒副作用，无污染的营养组方及含有该营养组方的饲料。
此外，本发明还提供一种上述营养组方的使用方法及应用。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是，提供一种营养组方，包括以下重量份的组分：亮氨酸0.00004-0.0002份，苏氨酸0.8-2.0份，泛酸0.37-0.98份，锰0.0008-0.0027份。
一种营养组方，由以下重量份的组分组成：亮氨酸0.00004-0.0002份，苏氨酸0.8-2.0份，泛酸0.37-0.98份，锰0.0008-0.0027份。
优选的，所述营养组方中，各组分的重量份为：亮氨酸0.00012-0.00017份，苏氨酸1.2-1.7份，泛酸0.44-0.67份，锰0.0013-0.0024份。
其中，所述亮氨酸是鱼类必需的氨基酸，可促进鱼类摄食、提高饲料效率和生长性能；提高鱼类白细胞吞噬能力以及杀菌能力，提高血清IgM含量，增强鱼类免疫功能。本发明人经过多次试验发现，适量的亮氨酸可降低鱼腮细胞因子IL-1的活性，显著上调鱼腮紧密连接蛋白组装，提高鳃屏障功能，降低鳃紧密连接屏障对铜离子的通透性，降低腮中铜离子含量，减低铜离子毒性，保障鳃健康。
其中，所述苏氨酸是鱼类的必需氨基酸，参与体蛋白质的合成、促进鱼类生长，增加肌肉蛋白含量和剪切力，改善肉质。本发明人经过多次试验发现，适量的苏氨酸可提高鱼腮细胞因子IL-10的活性，显著上调鱼腮紧密连接跨膜蛋白Claudin-b的表达，提高鳃屏障功能，降低鳃屏障对铜离子的通透性，降低血清铜含量，减低铜离子毒性，保障鱼体健康。
其中，所述泛酸是鱼类的必需维生素之一，泛酸可增强鱼类胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的分泌能力以及增强肠道吸收能力，提高生长性能；促进白细胞的吞噬作用，提高血清溶菌酶和酸性磷酸酶的溶菌作用，以增强鱼免疫功能和疾病抵抗力。本发明人经过多次试验发现，适量的泛酸可提高腮细胞因子TGF-β的活性，显著上调鱼类腮紧密连接跨膜蛋白Claudin-15的表达，提高鳃屏障功能，降低鳃屏障对铜离子的通透性，降低腮组织铜含量，减低铜离子毒性，保障鳃健康和鱼体健康。
其中，所述锰是鱼类必需的矿物营养素之一，参与众多酶类的组成和激活作用，发挥着重要的生理作用，是鱼类骨骼正常发育所必需。本发明人经过多次试验发现，适量的锰可提高腮细胞因子IL-8和TNF-α的活性，显著降低鱼类腮紧密连接复合体的对铜离子的通透性，提高鳃屏障功能，降低腮组织和血清铜含量，减低铜离子毒性，保障鳃和鱼体健康。
如上所述，本发明人最新研究发现：部分营养物质如亮氨酸、苏氨酸、泛酸和锰等具有有效的抵御鱼鳃损伤、保证鳃屏障结构完整性的新作用。根据对不同营养物质进行合理的配比后，可得到具有明显提高鱼鳃屏障功能、增强鳃病抵抗力的营养组方。为此，本申请提供一种有效提高鱼鳃屏障功能且不含化学药物和中草药的营养组方，从治本的角度提高鱼鳃屏障功能、降低鱼鳃对铜离子的通透性。它不仅是我国水产养殖业健康发展的内在要求，也是保障鱼产品安全的迫切需要。
现有申请号为CN201010604994.X的中国专利公开了一种瘤胃屏障功能修复剂，采用微量元素锌和铜、维生素A1、维生素B1、谷氨酰胺和玉米蛋白制得。但该专利主要用于反刍动物的瘤胃修复，与本申请有本质区别：
(1)不同营养物质的营养生理作用存在巨大差异。在动物10种必需氨基酸(动物自身不能合成或合成速率不能满足机体需要，必须从食物中摄取的氨基酸)中，不同必需氨基酸的营养生理作用存在巨大差异，如组氨酸和色氨酸，前者具有舒张血管、降低血压、促进铁的吸收，防治贫血的作用；而后者用于合成一种重要神经传递物质5-羟色胺，参与动物昼夜节律和睡眠调节。动物必需维生素包括脂溶性和水溶性维生素两大类，其营养生理作用也存在巨大差异，脂溶性维生素A和水溶性维生素C，前者影响动物视觉，促进肾上腺皮质酮的分泌，调节糖代谢；而后者参与胶原蛋白质合成。动物必需矿物元素包括常量和微量两大类，二者营养生理作用同样存在巨大差异，如钙和铁，前者是骨骼和牙齿的主要组成元素，而后者是血红蛋白的重要组成成分。
(2)同种营养物质在鱼与陆生动物上的营养存在巨大差异。氨基酸的营养存在巨大差异，如赖氨酸，鱼类除了合成蛋白质外，相当一部分用于分解供能；而陆生动物则仅用于合成蛋白质。维生素的营养也存在巨大差异，如肌醇，鱼类体内不能合成肌醇，必需由饲料供给；而陆生动物体内能合成肌醇，无需饲料供给。矿物元素的营养同样存在巨大差异，如钙，鱼类可通过鳃的离子交换，从水体获得足够的钙，无需饲料供给；而陆生动物必需由饲料供给大量的钙，占饲料总重0.7-0.9％。
(3)同种营养物质在鱼与陆生动物上的代谢存在巨大差异。鱼类是变温冷血动物，反刍动物恒温温血动物，两种动物的营养物质代谢差异巨大：分解代谢供能的底物不同，鱼类主要代谢氨基酸和脂肪供能，而反刍动物主要分解糖类供能；氨基酸分解代谢的终产物不同，鱼类氨基酸分解代谢终产物主要是氨，而反刍动物氨基酸分解代谢终产物主要是尿素；含氮废物的排泄途径和形式不同，鱼类主要通过鳃排泄氨氮，而反刍动物主要通过肾排泄尿素。
(4)该专利所述的修复剂主要作用于反刍动物，而本申请所述的营养组方主要用于鱼类。反刍动物是高等脊椎动物，而鱼类则是低等脊椎动物，它们在组织器官组成、消化吸收、代谢和生长规律上完全不同。并且在学科分类完全不同，反刍动物是畜牧学一级学科，鱼类则是水产学一级学科。
(5)该专利所述修复剂的主要作用是反刍动物瘤胃的修复作用(损失破坏后的修复作用)，其作用是调控瘤胃有机酸的产生速度和生成量、中和酸性物质的唾液分泌量、体液离子平衡。而本申请所述的营养组方主要用于提高鱼抵御鳃损伤能力、增强鱼鳃屏障功能(预防作用)，其作用方式完全不同。
(6)反刍动物瘤胃与鱼鳃的上皮组织结构、构成成分存在巨大差异。鱼鳃上皮为单层扁平上皮，由一层扁平细胞组成，细胞边缘呈锯齿状或波浪状，互相嵌合；而反刍动物的瘤胃上皮为单层柱状上皮，由一层棱柱状细胞组成，细胞呈六角形或多角形。虽然鱼鳃单层扁平细胞和反刍动物瘤胃单层柱状上皮细胞之间均存在细胞间紧密连接复合体，但组分子种类存在巨大的差异，如Claudin 14、Claudin 15、Claudin 18、Claudin 19、Claudin 23和Claudin 25在陆生动物和鱼类紧密连接复合体中均在，但Claudin 34、Claudin 45、Claudin 50、Claudin 51、Claudin53和Claudin 55只有鱼类紧密连接复合体中存在。
(7)反刍动物瘤胃与鱼鳃的上皮的功能截然不同。瘤胃为消化器官，上皮主要执行营养物质的消化吸收功能；而鱼鳃为呼吸排泄器官，上皮主要执行氧气的吸入和二氧化碳的排出，氨基酸分解代谢废物氨氮的排泄，以及渗透压调节等功能。
基于上述7个方面的巨大差异，本领域技术人员如果没有在大量系统的科学研究及实验发现的基础上，是绝不可能将领域相差巨大的用于修复瘤胃屏障功能的修复剂应用到提高鱼鳃抵御损伤能力，增强鱼鳃屏障功能的预防作用上的。而本申请人是在大量的科学实验及系统的研究中发现了上述能够提高鱼鳃的屏障功能的营养组方。
本发明人通过系统的实验发现，通过单一的适量的亮氨酸、苏氨酸、泛酸、或锰等营养物质能在一定程度上改善鱼患鳃病的风险，但其改善效果非常有限，而将上述4种营养物质混合后组成的营养组方也并非都能具有改善鱼患鳃病风险的效果，而本发明通过对上述4种营养物质进行合理配比得到的所述范围的营养组方则能显著改善调控腮紧密连接复合体通透性的细胞因子IL-1、IL-8、IL-10、TGF-β和TNF-α的活性，以及显著上调鱼鳃紧密连接相关蛋白Claudin-b和Claudin-15的表达，从而从治本的角度出发，显著地提高鳃屏障功能，降低铜攻毒后腮和血清铜含量，降低鳃对铜离子的通透性，保障鳃和鱼体健康。
一种所述营养组方的使用方法，包括如下步骤：
将所述营养组方加入到基础饲料中。
其中，所述营养组方与基础饲料的重量比为1:99-3:97。
其中，本发明所述的基础饲料无特别限定，本领域技术人员常用的基础饲料均可供选择，具体如鱼粉、豆粕、菜粕、次粉、鱼油、豆油、麦麸、米糠等。
本发明所述的营养组方及含有该营养组方的饲料适用于草鱼、鲤鱼等淡水养殖鱼类，尤其适用于草鱼。
一种含有所述营养组方的饲料。
其中，所述100重量份的饲料中，含有1-3wt％的营养组方。
综上所述，本发明的有益效果是：
1.通过添加本发明所述范围的营养组方改变调控腮紧密连接复合体通透性的细胞因子活性，上调鱼鳃紧密连接相关蛋白Claudin-b和Claudin-15的表达，从治本的角度达到提高鳃屏障功能，降低鳃对铜离子的通透性，降低腮组织和血清铜含量，减低铜离子毒性，保障鳃和鱼体健康；
2.促进鱼类生长，提高饲料效率，具有使用方便、成本低、无毒安全等优点。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
本发明中的性能测试采用本领域技术人员常用的常规测试方法，其中，腮组织和血清铜离子含量采用原子吸收法测定，基因表达采用实时荧光定量PCR方法测定。
实施例1：
取亮氨酸0.00004重量份，苏氨酸0.8重量份，泛酸0.37重量份，锰0.0008重量份，混合后制得营养组方S1。
为了验证本发明的应用效果，本发明的营养组方应用在四川、重庆、广西12个养殖场的草鱼上(体重在260-265g)进行试验。试验鱼均分为试验组和对照组两个组别，每个处理组设3个重复，每个重复380尾鱼，组间初始体重无显著差异。试验组的日粮为按照鱼饲料总重量的2.1wt％添加上述营养组方S1的鱼饲料；对照组的日粮为不添加营养组方S1的相同重量的鱼饲料。两处理组鱼每日投喂4次，每次投喂量根据实际摄食情况而定。试验期间定期进行常规消毒杀菌。饲喂56天后称重，每个重复选择15尾鱼进行取样，进行铜浸泡攻毒，实验组和对照组用0.6ppm铜离子浸泡96小时，期间不投食和换水。攻毒实验结束后，取腮和血清测定相关指标，测定结果均以平均值表示，并统计患有鳃病的鱼尾数，记录绘制成相应的表格，记录于下表1中，取P＜0.05为有显著差异；取P＜0.01为有极显著性差异。
上述试验中患有鳃病的试验鱼会出现以下典型的烂鳃病症状中的任意一种：(1)体色发黑，尤其是头部，俗称“乌头瘟”。(2)池边独自或浮于水面缓慢游动，反应迟钝，呼吸困难，食欲减退。病情严重者，离群水面独游，不摄食，对外界刺激无反应。(3)鳃丝末端腐烂、充血，有时被成块污物和泥土粘着，严重者鳃丝成柱状，鳃骨外露发白，鳃盖骨内外层同时被腐蚀时远看呈空洞状，俗称“开天窗”。
实施例2
取亮氨酸0.0002重量份，苏氨酸2.0重量份，泛酸0.98重量份，锰0.0027重量份，混合后制得营养组方S2。
实施例3
取亮氨酸0.00017重量份，苏氨酸1.3重量份，泛酸0.67重量份，锰0.0013重量份，混合后制得营养组方S3。
对比例1
取亮氨酸0.00001重量份，苏氨酸0.3重量份，泛酸0.05重量份，锰0.0002重量份，混合后制得营养组方DS1。
对比例2
取亮氨酸0.0010重量份，苏氨酸3.5重量份，泛酸3.98重量份，锰0.0064重量份，混合后制得营养组方DS2。
对比例3
取亮氨酸0.00004重量份作为营养物质DS3。
对比例4
取苏氨酸0.8重量份作为营养物质DS4。
对比例5
取泛酸0.37重量份作为营养物质DS5。
对比例6
取锰0.0008重量份作为营养物质DS6。
上述实施例2-3、对比例1-6采用与实施例1相同的方式进行试验，S2、S3、DS1、DS2、DS3、DS4、DS5、DS6添加量分别为鱼饲料总量的3wt％、1wt％、3wt％、1wt％、2.1wt％、2.1wt％、2.1wt％、2.1wt％。分别测试实施例2-3及对比例1-6中的各项数据并将结果列于下表1-2中。
表1
表2
| 处理 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 |
| 初重(g/尾) | 263 | 264 | 262 | 263 |
| 末重(g/尾) | 561 | 567 | 572 | 563 |
| 增重率(％) | 113 | 115 | 118 | 114 |
| 饲料效率(％) | 56 | 56.4 | 58 | 56.4 |
| 鱼尾数(尾) | 45 | 45 | 45 | 45 |
| 患鳃病鱼尾数(尾) | 19ef | 18aef | 18aef | 19ef |
| 患鳃病率(％) | 42.2ef | 40.0aef | 40.0aef | 42.2ef |
| 腮铜含量(微克/克) | 5.23 | 5.13 | 5.20 | 5.24 |
| 血清铜含量(毫克/升) | 0.95 | 0.93 | 0.94 | 0.95 |
| Claudin-b | 1.8 | 2.3aefgij | 1.8 | 1.8 |
| Claudin-15 | 1.9 | 1.9 | 2.2aefghj | 1.9 |
| IL-10 | 1.3 | 1.5ef | 1.3 | 1.3 |
| TGF-β | 1.2 | 1.2 | 1.5aefghj | 1.2 |
| IL-1 | 1.1aefhij | 1.4 | 1.4 | 1.4 |
| IL-8 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.1f |
| TNF-α | 1.4 | 1.4 | 1.4 | 1.1aefghi |
注：同对照组比较，aP＜0.05；AP＜0.01
同实施例1比较，bP＜0.05；BP＜0.01
同实施例2比较，cP＜0.05；CP＜0.01
同实施例3比较，dP＜0.05；DP＜0.01
同对比例1比较，eP＜0.05；EP＜0.01
同对比例2比较，fP＜0.05；FP＜0.01
同对比例3比较，gP＜0.05；GP＜0.01
同对比例4比较，hP＜0.05；HP＜0.01
同对比例5比较，iP＜0.05；IP＜0.01
同对比例6比较，jP＜0.05；JP＜0.01
上表1-2中，各数据后有A或a标示的，表明该组实验数据与对照组实验数据相比较的统计分析结果，A表明该组实验数据与对照组实验数据相比较P＜0.01，a表明该组实验数据与对照组实验数据相比较P＜0.05；B-J、b-j表示的意义以此类推。
上表1-2中，始重指的是试验前每尾鱼的平均重量。末重指的是饲喂56天后每尾鱼的平均重量。饲料转化率指的是每尾鱼增重量与摄食量的百分比。试验鱼在0.6ppm铜攻毒96小时后，腮和血清铜含量能有效表征鱼腮的屏障功能，所述腮和血清铜含量值越低，表明鱼腮的屏障功能越好，对铜离子的通透性也就越低。而腮紧密连接组成蛋白及其调控细胞因子的表达能有效表征本发明发挥作用的分子机制，所述腮紧密连接复合体构成的主要成分Claudin-b和Claudin-15表达升高，表明鱼腮的屏障功能越好；抗炎因子IL-10和TGF-β的基因表达水平提高，表明腮紧密连接屏障对铜的通透性降低，鱼腮的屏障功能越好，促炎因子IL-1、TNF-α和IL-8的基因表达水平下调，表明腮紧密连接屏障对铜的通透性降低，鱼腮的屏障功能越好。
从上述表1-2可以看出：
1.单一的适量的亮氨酸、苏氨酸、泛酸、或锰等营养物质具有改善部分调控腮紧密连接复合体通透性的细胞因子活性、鱼鳃紧密连接相关蛋白Claudin-b和Claudin-15的表达的功能，具有有限的降低鳃组织和血清铜含量的作用，从而在一定程度上具有有限的降低鱼患鳃病的风险。
2.将上述具有降低鱼换鳃病风险的4种营养物质按照不在本发明所述配比范围进行配置，制得的营养组方在一定程度上能够促进鱼类生长，提高饲料效率，但其却并没有防治鱼患鳃病的功效，从表中可以看出，用该营养组方饲喂的鱼患鳃病的数量甚至更多于采用单一适量的亮氨酸、苏氨酸、泛酸、或锰等营养物质饲喂的鱼。
3.采用不在本发明所述配比范围内的上述4种营养物质组合成的营养组方饲喂的鱼在铜攻毒后，鳃铜含量及血清铜含量并未得到有效控制，反而还有小范围的升高，使得鱼患鳃病的风险升高。
4.采用不在本发明所述配比范围内的上述4种营养物质组合成的营养组方饲喂的鱼的调控腮紧密连接复合体通透性的细胞因子活性、鱼鳃紧密连接相关蛋白Claudin-b和Claudin-15的表达均未得到有效改善，甚至还有一定的反作用，使得腮紧密连接屏障对铜的通透性小幅升高，鱼腮的屏障功能降低，鱼患鳃病的风险升高。
5.采用本发明所述配比范围内的上述4种营养物质组合成的营养组方饲喂的鱼，其与鳃屏障功能相关的各项机能(如调控腮紧密连接复合体通透性的细胞因子的活性，鱼鳃紧密连接相关蛋白Claudin-b和Claudin-15的表达)等均得到显著性改善(P＜0.05或P＜0.01)，从而从治本的角度出发，提高鱼鳃的屏障功能，降低铜攻毒后腮组织和血清中铜含量，降低鳃对铜离子的通透性，保障鳃和鱼体健康，能有效降低鱼患鳃病的风险。
6.与采用单一的适量的亮氨酸、苏氨酸、泛酸、或锰等营养物质饲喂的鱼相比，采用本发明所述配比范围内的上述4种营养物质组成的营养组方饲喂的鱼的患鳃病的风险显著降低，且与鱼鳃的屏障功能相关的各项机能(如调控腮紧密连接复合体通透性的细胞因子IL-10、IL-1、TGF-β、IL-8、TNF-α的活性，鱼鳃紧密连接相关蛋白Claudin-b和Claudin-15的表达等)均得到更显著的改善(P＜0.05或P＜0.01)。
综上所述，本发明所述的营养组方及含有该营养组方的饲料均能显著提高腮屏障功能，降低铜离子毒性，降低腮和血清铜含量，保障腮和鱼体健康；同时能促进鱼类生长，提高饲料效率。具有使用方便、成本低、无毒安全等优点。
以与实施例1相同的方式对其他淡水鱼类进行相同的试验，均能得到上述有益效果，即，本发明所述的营养组方能明显提高鱼腮屏障功能，降低腮对铜离子的通透性，降低铜离子毒性，保障腮和鱼体健康。
如上所述，可较好的实现本发明。
Claims (8)
1.一种营养组方，包括以下重量份的组分：亮氨酸0.00004-0.0002份，苏氨酸0.8-2.0份，泛酸0.37-0.98份，锰0.0008-0.0027份。
2.一种营养组方，由以下重量份的组分组成：亮氨酸0.00004-0.0002份，苏氨酸0.8-2.0份，泛酸0.37-0.98份，锰0.0008-0.0027份。
3.一种如权利要求1或2所述的营养组方的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述营养组方加入到基础饲料中。
4.根据权利要求3所述的营养组方的使用方法，其特征在于，所述营养组方与基础饲料的重量比为1:99-3:97。
5.一种如权利要求1或2所述的营养组方的应用，其特征在于，所述营养组方应用于淡水养殖的鲤科鱼类。
6.一种如权利要求1或2所述的营养组方在提高鱼鳃屏障功能、降低鱼鳃对铜离子通透性方面的应用。
7.一种含有如权利要求1或2所述的营养组方的饲料。
8.根据权利要求7所述的饲料，其特征在于，所述100重量份的饲料中，含有1-3wt％的营养组方。
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