CN104397318A - 耐酸高乳化性能的大豆分离蛋白的制备方法及其制品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐酸高乳化性能的大豆分离蛋白的制备方法及其制品，属于大豆分离蛋白的改性领域；其制备方法包括：(1)将大豆分离蛋白配制成水溶液；(2)超声预处理大豆分离蛋白水溶液；(3)向超声预处理后的大豆分离蛋白水溶液中加入植酸酶进行第一次酶解反应；向第一次酶解反应产物中加入酸性蛋白酶进行第二次酶解反应；(4)灭酶，冷却，浓缩干燥，即得。本发明方法制备得到的改性大豆分离蛋白在pH4时乳化活性为0.625m2/g，比普通SPI提高了247％；乳化稳定性为15.8min，比普通SPI提高了17％。本发明所制备的改性大豆分离蛋白能应用于制备乳制品、饮料制品、面制品或肉制品等。
Description
技术领域
本发明涉及一种改性大豆分离蛋白的制备方法，尤其涉及一种耐酸性高乳化性能的改性大豆分离蛋白的制备方法，进一步涉及由该制备方法得到的改性大豆分离蛋白及其应用，属于大豆分离蛋白的改性领域。
背景技术
大豆分离蛋白(SPI)是从脱脂大豆中除去可溶性糖类和不溶性多聚糖后得到的蛋白含量在90％以上的大豆蛋白制品。其具有多种良好的功能特性如：溶解性、乳化性、发泡性、凝胶性、吸水性等，因此被广泛应用于肉制品、乳制品、饮料制品及面制品等。但是，普通大豆分离蛋白难以同时兼具上述多种性能，并且当环境条件发生某些改变时，蛋白会丧失原有的功能特性，如：在酸性或多离子等环境中，由于蛋白缺乏良好的乳化能力而发生沉降，从而影响食品品质，限制了大豆分离蛋白的应用，因此需要将蛋白进行改性处理以提高和强化大豆分离蛋白的某些功能特性。
目前常见的改善大豆分离蛋白乳化性的方法主要有：物理改性、化学改性、生物酶改性、食品添加剂改性及复合改性。但是，采用目前改性方法制备的大豆分离蛋白在酸性条件下乳化性能以及乳化稳定性方面差强人意，有待改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种显著提高改性大豆分离蛋白在酸性条件下的乳化性能的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种耐酸高乳化性能的改性大豆分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白配制成水溶液；(2)超声预处理大豆分离蛋白水溶液；(3)向超声预处理后的大豆分离蛋白水溶液中加入植酸酶进行第一次酶解反应；向第一次酶解反应产物中加入酸性蛋白酶进行第二次酶解反应；(4)灭酶，冷却，浓缩干燥，即得。
其中，按质量百分比计，步骤(1)中将大豆分离蛋白配制成浓度为6-10％的水溶液，优选为6％。
步骤(2)中将大豆分离蛋白水溶液进行超声处理时，所述的超声预处理的参数如下：超声功率优选为250-450W，更优选为350W；超声时间优选为5-25min，更优选为15min。
步骤(3)中向超声预处理的大豆分离蛋白水溶液加入植酸酶进行第一次酶解反应，其中，植酸酶添加量为3u/g-6u/g；第一次酶解完成后再向酶解反应产物中加入酸性蛋白酶进行第二次酶解反应，酸性蛋白酶添加量为900u/g-1500u/g；优选的，步骤(3)中将超声预处理的大豆分离蛋白水溶液pH值调到5后加入植酸酶，于50℃进行第一次酶解反应，其中，植酸酶添加量优选为5u/g；第一次酶解反应完成后将酶解反应产物pH值调到3后加入酸性蛋白酶，于40℃进行第二次酶解反应，酸性蛋白酶添加量优选为900u/g。步骤(3)中第一次酶解反应时间以及第二次酶解反应时间均优选为30-70min，更优选为40min。
步骤(4)采用沸水浴灭酶，冷水冷却。
本发明首先对超声预处理条件包括超声功率和超声时间进行优化，筛选出超声功率350W，处理15min时乳化效果较佳，乳化性与乳化稳定性分别为0.23m2/g，17min；再对超声波-酶联合改性中酶制剂进行筛选，发现超声波处理结合采用植酸酶和酸性蛋白酶对大豆蛋白进行联合改性，SPI的乳化性(EA)与乳化稳定性(ES)较佳。
本发明进一步通过单因素试验确定了蛋白浓度、酸性蛋白酶添加量、植酸酶添加量和酶解时间较佳的数值范围；在此范围内进一步对蛋白浓度，酸性蛋白酶添加量，植酸酶添加量为和酶解时间进行了正交试验。由于本发明主要以乳化活性为考察指标，且在一定范围内乳化稳定性变化不大，综合考虑，确定最优的组合为：在超声功率为350W，超声处理15min条件下，蛋白浓度为6％，植酸酶添加量为5u/g，酸性蛋白酶添加量为900u/g，酶解时间为40min，此条件下SPI的乳化性最佳，pH4时，乳化活性为0.625m2/g，比普通SPI提高247％；此条件下SPI的乳化稳定性也较好，为15.8min，比普通SPI提高17％。
本发明还公开了所述改性大豆分离蛋白在制备乳制品、饮料制品、面制品或肉制品中的应用。本发明制备的改性大豆分离蛋白在酸性条件下的乳化性高，扩大了大豆分离蛋白的应用，可以用于制备乳制品、饮料制品、面制品或肉制品等，保证食品品质。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益技术效果：
本发明利用超声预处理与植酸酶和酸性蛋白酶联合改性，获得的改性大豆分离蛋白在酸性条件(pH4)时乳化活性为0.625m2/g，比普通SPI提高247％；此条件下SPI的乳化稳定性也较好，为15.8min，比普通SPI提高17％；扩大了大豆分离蛋白的应用，保证食品品质。
附图说明
图1为超声功率和超声时间对EA和ES的影响；a为超声功率对EA和ES的影响；b为超声时间对EA和ES的影响；
图2为pH4时乳化性和乳化稳定性随蛋白浓度的变化；
图3为pH4时乳化性和乳化稳定性随酸性蛋白酶添加量的变化；
图4为pH4时乳化性和乳化稳定性随植酸酶添加量的变化；
图5为pH4时乳化性和乳化稳定性随酶解时间的变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、材料与设备
大豆分离蛋白(粗蛋白含量85％，水分含量7％)购自黑龙江哈高科大豆食品有限责任公司；大豆油购自九三集团哈尔滨惠康食品有限公司；酸性蛋白酶(91248U/g)购自上海金穗生物科技有限公司；植酸酶(500U/g)购自上海田源生物技术有限公司；其它试剂为分析纯，所用的水为去离子水。
JY92-11N超声细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；
TU-1901双光束紫外分光光度计购自北京普希通用仪器有限责任公司。
实施例1耐酸性高乳化性能的改性大豆分离蛋白的制备
(1)将大豆分离蛋白配制成水溶液，大豆分离蛋白浓度为6％(wt％)；用超声波破碎仪处理，超声功率为350W，超声时间为15min。
(2)先将超声预处理后的大豆分离蛋白水溶液的pH调到5加入植酸酶5u/g，于50℃震荡水浴锅中反应40min，然后沸水浴灭酶、冷水冷却；再将pH调到3加入酸性蛋白酶900u/g，于40℃震荡水浴锅中反应40min。
(3)沸水浴灭酶，冷水冷却，浓缩干燥，即得。
制备的改性大豆分离蛋白在pH4时的乳化活性为0.625m2/g，比普通SPI提高247％；乳化稳定性为15.8min，比普通SPI提高17％。
实施例2耐酸性高乳化性能的改性大豆分离蛋白的制备
(1)将大豆分离蛋白配制成水溶液，大豆分离蛋白浓度为6％(wt％)；用超声波破碎仪处理，超声功率为250W，超声时间为5min。
(2)先将超声预处理后的大豆分离蛋白水溶液的pH调到5加入植酸酶3u/g，于50℃震荡水浴锅中反应30min，然后沸水浴灭酶、冷水冷却；再将pH调到3加入酸性蛋白酶900u/g，于40℃震荡水浴锅中反应30min。
(3)沸水浴灭酶，冷水冷却，浓缩干燥，即得。
实施例3耐酸性高乳化性能的改性大豆分离蛋白的制备
(1)将大豆分离蛋白配制成水溶液，大豆分离蛋白浓度为10％(wt％)；用超声波破碎仪处理，超声功率为450W，超声时间为25min。
(2)先将超声预处理后的大豆分离蛋白水溶液的pH调到5加入植酸酶6u/g，于50℃震荡水浴锅中反应70min，然后沸水浴灭酶、冷水冷却；再将pH调到3加入酸性蛋白酶1500u/g，于40℃震荡水浴锅中反应70min。
(3)沸水浴灭酶，冷水冷却，浓缩干燥，即得。
试验例1大豆分离蛋白超声预处理条件的优化
1、试验方法
将大豆分离蛋白配制成水溶液，用JY92-11N超声细胞粉碎机处理(直径0.636cm的探针钛)，频率20kHz。
当超声功率300W时，超声时间分别为5min、10min、15min、20min、25min，以pH4时的乳化性为指标，考察超声时间对改性后SPI乳化能力的影响。
当超声功率分别为250W、350W、450W，超声处理时间15min(按工作4s，间歇2s)，以pH4时的乳化性为指标，考察超声功率对改性后SPI乳化能力的影响。
2、试验结果
结果见图1，从图1a、图1b中看出，在一定范围内，不同超声功率与超声时间对大豆分离蛋白的乳化性和乳化稳定性影响不显著。但是，超声功率350W，处理15min时乳化效果较佳，乳化性与乳化稳定性分别0.23m2/g，17min，比未改性的SPI(EA：0.18m2/g，ES：13.5min)分别提高28％和26％。因此，本发明优选超声功率为350W，超声处理时间优选为15min。
试验例2超声波-酶联合改性中酶制剂的选择
1、试验方法
将大豆分离蛋白配制成水溶液，在试验例1优化的超声预处理条件下用JY92-11N超声细胞粉碎机处理，超声功率350W，时间15min；向上述预处理过的大豆分离蛋白水溶液中分别加入五种酶(胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，酸性蛋白酶，菠萝蛋白酶，植酸酶)中的一种或两种，其最适温度、最适pH、此酶活下的用量及酶解时间见表1，其中，加入两种酶时采用分步水解法，测得酶解30min后改性蛋白在pH4时的乳化活性(EA)与乳化稳定性(ES)，以普通SPI作对照。
表1 各酶的反应条件
2、试验结果
结果见表2。
表2 不同处理条件下所得改性蛋白在pH4时的乳化性(EA)与乳化稳定性(ES)
结果表明，超声波处理与植酸酶-酸性蛋白酶联合改性后的EA与ES最佳。
试验例3超声波与植酸酶-酸性蛋白酶联合处理的单因素试验
本发明在试验例1超声预处理条件的优化及试验例2超声波-酶联合改性中酶制剂的选择基础上，进一步对大豆分离蛋白浓度、酸性蛋白酶添加量、植酸酶添加量和酶解时间进行单因素试验。
1、试验方法
1.1超声样品处理
配制一定浓度的SPI大豆分离蛋白溶液，JY92-11N超声细胞粉碎机(直径0.636cm的探针钛)，超声功率350W，频率20kHz，处理时间15min(按工作4s，间歇2s)之后，冷冻保存于冰箱中，待用。
1.2大豆分离蛋白浓度对改性后蛋白乳化性能的影响
SPI浓度分别为2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％时，经超声预处理后，将蛋白溶液pH调到5加入1.5u/g植酸酶，于50℃震荡水浴锅中反应30min，然后在沸水浴中灭酶，冷水冷却；再将pH调至3加入1000u/g酸性蛋白酶，于40℃震荡水浴锅中反应30min，然后在沸水浴中灭酶，冷水冷却。以pH4时的乳化性为指标，考察蛋白浓度对改性后SPI乳化能力的影响。
1.3乳化活性(EA)和乳化稳定指数(ESI)的测定
取一定体积浓度为0.5％的蛋白溶液与大豆色拉油以3:1比例混合(即取3ml酶处理后的蛋白溶液加27ml水，再加10ml大豆色拉油)，以10000r/min均质1min，之后分别在0min、10min取样，以0.1％(w/v)SDS(十二烷基磺酸钠，pH7.0)稀释100倍，以SDS溶液为空白，测定500nm处的吸光度值，以0min的吸光度值(A0)表示乳化活性EA，乳化稳定性用ES表示：
ES＝A0×ΔT/ΔA；
式中：A0：0时刻的吸光值；
ΔT：时间差(min)；
ΔA：ΔT内的吸光值差。
1.4酸性蛋白酶添加量对SPI乳化性能的影响
按SPI蛋白浓度6％，经超声预处理后，将蛋白溶液pH调到5加入1.5u/g植酸酶，于50℃震荡水浴锅中反应30min，然后在沸水浴中灭酶，冷水冷却；再将pH调至3分别加入0u/g、300u/g、600u/g、900u/g、1200u/g、1500u/g、1800u/g、2100u/g的酸性蛋白酶，于40℃震荡水浴锅中反应30min，然后在沸水浴中灭酶，冷水冷却。以pH4时的乳化性为指标，考察酸性蛋白酶添加量对SPI乳化能力的影响。
1.5植酸酶添加量对SPI乳化性能的影响
按SPI蛋白浓度6％，经超声预处理后，将蛋白溶液pH调到5分别加入0u/g、1u/g、2u/g、3u/g、4u/g、5u/g、6u/g、7u/g、8u/g的植酸酶，于50℃震荡水浴锅中反应30min，然后在沸水浴中灭酶，冷水冷却；再将pH调至3加入1000u/g酸性蛋白酶，于40℃震荡水浴锅中反应30min，然后在沸水浴中灭酶，冷水冷却。以pH4时的乳化性为指标，考察植酸酶添加量对SPI乳化能力的影响。
1.6酶解时间对SPI乳化性能的影响
按SPI蛋白浓度6％，经超声预处理后，将蛋白溶液pH调到5加入1.5u/g植酸酶，于50℃震荡水浴锅中反应时间分别为10min、30min、50min、70min、90min、110min、130min，然后在沸水浴中灭酶，冷水冷却；再将pH调至3加入1000u/g酸性蛋白酶，于40℃震荡水浴锅中反应30min，然后在沸水浴中灭酶，冷水冷却。以pH4时的乳化性为指标，考察酶解时间对SPI乳化能力的影响。
按SPI蛋白浓度6％，经超声预处理后，将蛋白溶液pH调到5加入1.5u/g植酸酶，于50℃震荡水浴锅中反应30min，然后在沸水浴中灭酶，冷水冷却；再将pH调至3加入1000u/g酸性蛋白酶，于40℃震荡水浴锅中反应时间分别为10min、30min、50min、70min、90min、110min、130min，然后在沸水浴中灭酶，冷水冷却。以pH4时的乳化性为指标，考察酶解时间对SPI乳化能力的影响。
2、试验结果
2.1蛋白浓度对SPI乳化性和乳化稳定性的影响
由图2可以看出，蛋白浓度在6％-10％范围内，改性后的SPI乳化性和乳化稳定性最佳，因此在此范围内做优化实验。
2.2酸性蛋白酶添加量对SPI乳化性和乳化稳定性的影响
由图3可知，酸性蛋白酶添加量在900u/g-1500u/g范围内，改性SPI的乳化性和乳化稳定性最佳，因此在此范围内做优化实验。
2.3植酸酶添加量对SPI乳化性和乳化稳定性的影响
由图4可知，植酸酶添加量在3u/g-6u/g范围内，改性SPI的乳化性和乳化稳定性最佳。因此在此范围内做优化实验。
2.4酶解时间对SPI乳化性和乳化稳定性的影响
由图5可知，酶解时间在30min-70min范围内，改性SPI的乳化性和乳化稳定性最佳。因此在此范围内做优化实验。
试验例4正交设计试验
1、试验方法
在试验例1-3的基础上进行正交设计试验，在酸性(pH4)条件下，以乳化性和乳化稳定性为指标，进一步优化反应条件。
反应条件因素水平表见表3。
表3 反应条件因素水平表
2、试验结果
2.1乳化性和乳化稳定性正交试验结果
酸性(pH4)条件下，乳化性和乳化稳定性正交试验结果见表4。
表4 pH4时乳化性和乳化稳定性正交试验结果
2.2乳化性正交试验结果与方差分析
结果见表5。
表5 乳化性方差分析表
注：*表示在α＝0.05水平上显著。
由表5可知，极差值反映了各因素影响试验指标的主次关系，极差值越大，表明此因素对试验指标的影响越大。表4中，乳化性正交试验的极差值为RB>RA>RD>RC。各反应条件对SPI乳化性影响为SPI植酸酶添加量影响最大(α＝0.05)，其次是蛋白浓度和酶解时间，而酸性蛋白酶添加量对改性SPI的乳化性影响最小，通过乳化性的优化试验，可以初步确定改性SPI条件组合为：A2B3C2D2，即各个反应条件分别为：蛋白浓度为6％，植酸酶添加量为5u/g，酸性蛋白酶添加量900u/g，酶解时间为40min，此条件下SPI的乳化性较好。
2.3乳化稳定性正交试验结果与方差分析
结果见表6。
表6 乳化稳定性方差分析表
注：*表示在α＝0.05水平上显著。
表4中，乳化稳定性正交试验的极差值为RB>RC>RA>RD，由表6可知，各反应条件对SPI乳化稳定性影响为：植酸酶添加量影响最大(α＝0.05)，其次是SPI的蛋白浓度和酸性蛋白酶添加量，而酶解时间对改性SPI的乳化稳定性影响最小，通过乳化稳定性的优化试验，可以初步确定改性SPI条件组合为A3B2C1D1：即各个反应条件分别为：蛋白浓度为10％，植酸酶添加量为3u/g，酸性蛋白酶添加量为300u/g，酶解时间为20min，此条件下SPI的乳化稳定性较好。
针对优化的配方做重复试验，得出：
当蛋白浓度为6％，植酸酶添加量为5u/g，酸性蛋白酶添加量为900u/g，酶解时间为40min，此条件下SPI的乳化性最佳。乳化活性0.625m2/g，比普通SPI提高247％；
当蛋白浓度为10％，植酸酶添加量为3u/g，酸性蛋白酶添加量为300u/g，酶解时间为20min，此条件下SPI的乳化稳定性较好。乳化稳定性为19.1min，比普通SPI提高41.5％。
综上，由于本发明主要以乳化活性为考察指标，且在一定范围内乳化稳定性变化不大。因此选出：在超声功率为350W，超声处理15min条件下，当蛋白浓度为6％，植酸酶添加量为5u/g，酸性蛋白酶添加量为900u/g，两种酶各自的酶解时间均为40min，测得SPI在pH4时的乳化性最佳，乳化活性为0.625m2/g，比普通SPI提高了247％；此条件下SPI的乳化稳定性也较好，为15.8min，比普通SPI提高了17％。
Claims (10)
1.一种耐酸高乳化性能的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将大豆分离蛋白配制成水溶液；(2)超声预处理大豆分离蛋白水溶液；(3)向超声预处理后的大豆分离蛋白水溶液中加入植酸酶进行第一次酶解反应；向第一次酶解反应产物中加入酸性蛋白酶进行第二次酶解反应；(4)灭酶，冷却，浓缩干燥，即得。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：按质量百分比计，步骤(1)中将大豆分离蛋白配制成浓度为6-10％的水溶液，优选为6％。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的超声预处理的参数如下：超声功率为250-450W，优选为350W；超声时间为5-25min，优选为15min。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中向超声预处理的大豆分离蛋白水溶液中加入植酸酶进行第一次酶解反应，其中，植酸酶的添加量为3u/g-6u/g；第一次酶解完成后再向酶解反应产物中加入酸性蛋白酶进行第二次酶解反应，酸性蛋白酶添加量为900u/g-1500u/g。
5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中向超声预处理的大豆分离蛋白水溶液加入植酸酶进行第一次酶解反应，其中，植酸酶添加量为5u/g；第一次酶解完成后再向反应产物中加入酸性蛋白酶进行第二次酶解反应，酸性蛋白酶添加量为900u/g。
6.按照权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中将超声预处理的大豆分离蛋白水溶液pH值调至5后加入植酸酶进行第一次酶解反应；第一次酶解完成后将酶解反应产物的pH值调至3后加入酸性蛋白酶进行第二次酶解反应；优选的，第一次酶解反应的温度为50℃，第二次酶解反应的温度为40℃。
7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中第一次酶解反应时间以及第二次酶解反应时间均为30-70min。
8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中第一次酶解反应时间以及第二次酶解反应时间均为40min。
9.权利要求1至8任何一项所述制备方法制备得到的改性大豆分离蛋白。
10.权利要求9所述改性大豆分离蛋白在制备乳制品、饮料制品、涂抹调味品、面制品或肉制品中的应用。
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