CN104388439B - 编码酰基‑CoA合成酶同源物的多核苷酸及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及被孢霉属微生物的酰基‑CoA合成酶同源物蛋白质及编码该蛋白质的多核苷酸等。本发明提供例如含有高山被孢霉(Mortierella alpina)的酰基‑CoA合成酶同源物基因的多核苷酸、编码酰基‑CoA合成酶同源物蛋白质的多核苷酸、含有这些多核苷酸的表达载体及转化体、使用该转化体的脂质或脂肪酸的制造方法、或含有通过该制造方法制造的脂质或脂肪酸的食品等。

Description

编码酰基-CoA合成酶同源物的多核苷酸及其用途

本申请是申请日为2011年2月1日、申请号为201180007631.0(国际申请号为PCT/JP2011/052035)、名称为编码酰基-CoA合成酶同源物的多核苷酸及其用途的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及编码酰基-CoA合成酶同源物的多核苷酸及其利用方法。

背景技术

含有2个以上不饱和键的脂肪酸总称为多不饱和脂肪酸(PUFA：polyunsaturated)，已知有花生四烯酸(ARA)、二高γ-亚麻酸(DGLA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。多不饱和脂肪酸中存在在动物体内无法合成的多不饱和脂肪酸。因此，对于此种多不饱和脂肪酸，作为必需脂肪酸需要从食物中摄取。

多不饱和脂肪酸分布广泛，例如花生四烯酸可从由动物的肾上腺、肝脏中提取的脂质中分离。但是，动物脏器中所含有的多不饱和脂肪酸为少量，仅从动物脏器中分离提取，不足以进行大量供给。因此，不断在开发通过培养各种微生物以生产多不饱和脂肪酸的方法。其中，被孢霉属(Mortierella)微生物作为生产包含花生四烯酸等多不饱和脂肪酸在内的脂质的微生物而广为人知。

此外，还进行了在植物体内生产多不饱和脂肪酸的尝试。已知多不饱和脂肪酸构成三酰甘油等的贮藏脂质，在微生物的菌体内或植物种子中积累。

酰基-CoA合成酶(ACS)是使脂肪酸和辅酶A(CoA)进行硫酯化的酶，催化以下反应。

脂肪酸+CoASH+ATP→酰基-CoA+AMP+Ppi

通过ACS生成的酰基-CoA参与包括脂质的生物合成、重构、通过β‐氧化产生能量、蛋白质的酰化、通过脂肪酸的表达调节等各种生命现象。此外，还报道了ACS参与从细胞外摄取脂肪酸、细胞内的脂肪酸输送等(非专利文献1及2)。鉴于以上内容，认为利用微生物、植物生产多不饱和脂肪酸等时，控制ACS的活性非常重要。

已知在作为真核模式生物的酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中有6个酰基-CoA合成酶基因(ScFAA1、ScFAA2、ScFAA3、ScFAA4、ScFAT1、ScFAT2)(非专利文献1)。由这些基因编码的蛋白质在底物特异性、表达时期、细胞内的定位及功能上不同。

在专利文献1中，作为来自裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)的酰基-CoA合成酶基因(ScACS)记载了9个基因。此外，在专利文献1中，记载了编码裂殖壶菌属PUFA合酶系的基因和ScACS共表达时与不和ScACS共表达时相比，DPA(n-6)(二十二碳五烯酸(n-6))、DHA的产生增加。

其他，也报道了来自动物及植物的酰基-CoA合成酶基因(非专利文献2及专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特表JP2009-529890公报

专利文献2:国际公开公报WO0209295公报

非专利文献

非专利文献1:B.B.A.1771,286-298,2007

非专利文献2:Exp.Biol.Med.,233(5),507-521,2008

发明内容

在上述情况下，希望分离出在宿主细胞中表达时使该宿主细胞的脂肪酸生产量增加或使所产生的脂肪酸的组成改变的新型基因。

本发明者深入研究的结果，成功地克隆出了编码作为脂质生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)(以下为“M.alpina”)的ACS同源物(MaACS)的基因，从而完成了本发明。即本发明提供以下多核苷酸、蛋白质、表达载体、转化体、使用该转化体的脂质或脂肪酸组合物及食品等的制造方法以及根据该制造方法制造的食品等。

即本发明如下。

[1]一种多核苷酸，其特征在于，为选自以下(a)～(e)中任一项所述的多核苷酸：

(a)多核苷酸，其含有选自序列号46、51、56、36、21、1、6、11、16、26、31及41所示的碱基序列中的任一个碱基序列。

(b)多核苷酸，编码如下蛋白质，该蛋白质由选自序列号47、52、57、37、22、2、7、12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列组成；

(c)多核苷酸，其编码如下蛋白质，该蛋白质由选自序列号47、52、57、37、22、2、7、12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列中1～100个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性或使组成改变的活性；

(d)多核苷酸，其编码如下蛋白质，该蛋白质具有与选自序列号47、52、57、37、22、2、7、12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸量增加的活性或使组成改变的活性；及

(e)多核苷酸，其与由选自序列号46、51、56、36、21、1、6、11、16、26、31及41所示的碱基序列中的任一个碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性或使组成改变的活性的蛋白质。

[2]根据上述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，为以下(f)或(g)中任一项所述的多核苷酸：

(f)多核苷酸，其编码如下蛋白质，该蛋白质由选自序列号47、52、57、37、22、2、7、12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列中1～10个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性或使组成改变的活性；及

(g)多核苷酸，其编码如下蛋白质，该蛋白质具有与选自序列号47、52、57、37、22、2、7、12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性或使组成改变的活性。

[3]根据上述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，含有选自序列号46、51、56、36、21、1、6、11、16、26、31及41所示的碱基序列中的任一个碱基序列。

[4]根据上述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，编码由选自序列号47、52、57、37、22、2、7、12、17、27、32及42所示的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列组成的蛋白质。

[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，为DNA。

[6]一种蛋白质，其特征在于，由上述[1]～[5]中任一项所述的多核苷酸编码。

[7]一种载体，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的多核苷酸。

[8]一种非人转化体，其特征在于，导入了上述[1]～[5]中任一项所述的多核苷酸或导入了上述[7]中所述的载体。

[9]一种脂质或脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从上述[8]中所述的转化体的培养物中提取脂质或脂肪酸组合物。

[10]根据上述[9]中所述的方法，其特征在于，所述脂质为三酰甘油。

[11]根据上述[9]中所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸为碳数18以上的多不饱和脂肪酸。

[12]一种食品、医药品、化妆品或肥皂，其特征在于，含有通过上述[9]中所述的制造方法提取的脂质或脂肪酸组合物。

本发明的多核苷酸可用于适合的宿主细胞的转化，如此得到的转化体可用于制造脂肪酸组合物、食品、化妆品、医药、肥皂等。

更加具体地说，本发明的转化体生产脂质及脂肪酸的效率极高。因此，本发明可有效用于制造需要大量脂质或脂肪酸的医药品或健康食品。

附图说明

图1表示MaACS-1的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图2A表示MaACS-1的基因组序列和CDS序列的比对图。

图2B表示图2A的接续图。

图3A表示MaACS-2的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图3B表示图3A的接续图。

图4A表示MaACS-2的基因组序列和CDS序列的比对图。

图4B表示图4A的接续图。

图4C表示图4B的接续图。

图5表示MaACS-3的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图6A表示MaACS-3的基因组序列和CDS序列的比对图。

图6B表示图6A的接续图。

图7A表示MaACS-4的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图7B表示图7A的接续图。

图8A表示MaACS-4的基因组序列和CDS序列的比对图。

图8B表示图8A的接续图。

图8C表示图8B的接续图。

图9A表示MaACS-5的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图9B表示图9A的接续图。

图10A表示MaACS-5的基因组序列和CDS序列的比对图。

图10B表示图10A的接续图。

图11A表示MaACS-6的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图11B表示图11A的接续图。

图12A表示MaACS-6的基因组序列和CDS序列的比对图。

图12B表示图12A的接续图。

图13表示MaACS-7的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图14A表示MaACS-7的基因组序列和CDS序列的比对图。

图14B表示图14A的接续图。

图15A表示MaACS-8的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图15B表示图15A的接续图。

图16A表示MaACS-8的基因组序列和CDS序列的比对图。

图16B表示图16A的接续图。

图16C表示图16B的接续图。

图17表示MaACS-9的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图18A表示MaACS-9的基因组序列和CDS序列的比对图。

图18B表示图18A的接续图。

图19A表示MaACS-10的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图19B表示图19A的接续图。

图20A表示MaACS-10的基因组序列和CDS序列的比对图。

图20B表示图20A的接续图。

图20C表示图20B的接续图。

图21A表示MaACS-11的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图21B表示图21A的接续图。

图22A表示MaACS-11的基因组序列和CDS序列的比对图。

图22B表示图22A的接续图。

图23A表示MaACS-12的cDNA序列和推定氨基酸序列的对应图。

图23B表示图23A的接续图。

图24A表示MaACS-12的基因组序列和CDS序列的比对图。

图24B表示图24A的接续图。

图25A表示与来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的FAA蛋白质(FAA:脂肪酸活化(FattyAcid Activation))有较高氨基酸序列同源性的MaACS和该FAA蛋白质的比对图。单下线部表示ATP-AMP基序，双下线部表示FACS/VLACS-FATP基序。

图25B表示图25A的接续图。

图25C表示图25B的接续图。

图26A表示与来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的FAT蛋白质(FAT:Fatty AcidTransferase)有较高氨基酸序列同源性的MaACS和该FAT的蛋白质的比对图。单下线部表示ATP-AMP基序，双下线部表示FACS/VLACS-FATP基序。

图26B表示图26A的接续图。

图27是表示使MaACS-10超表达的高山被孢霉(M.alpina)中单位菌体的脂质生产量(图27A)和花生四烯酸生产量(图27B)的经时变化的图。

图28是表示使MaACS-11超表达的高山被孢霉(M.alpina)中单位菌体的脂质生产量(图28A)和花生四烯酸生产量(图28B)的经时变化的图。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，并不意味着将本发明只局限于该实施方式。本发明在不脱离其主旨的前提下，可以以各种方式实施。

另外，在本说明书中引用的所有文献以及公开公报、专利公报等其他专利文献，均作为参照列入本说明书中。且本说明书包含2010年2月1日申请的作为本申请优先权主张的基础的日本国专利申请(日本特愿2010-19967号)的说明书和附图中记载的内容。

本发明者如后述实施例中所详细记载，首次成功地克隆了来自作为脂质生产菌高山被孢霉(M.alpina)的ACS同源物的基因(MaACS-1～12)的全长cDNA。且本发明者还鉴定了来自高山被孢霉(M.alpina)的MaACS-1～12的基因组DNA的碱基序列及推定氨基酸序列。MaACS1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12的ORF序列、推定氨基酸序列、CDS序列、cDNA序列及基因组序列分别为序列号1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51及56(以下将这些序列统称为“MaACS-1～12的ORF序列”)、序列号2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52及57(以下将这些序列统称为“MaACS-1～12的氨基酸序列”)、序列号3、8、13、18、23、28、33、38、43、48、53及58(以下将这些序列统称为“MaACS-1～12的CDS序列”)、序列号4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54及59(以下将这些序列统称为“MaACS-1～12的cDNA序列”)、以及序列号5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55及60(以下将这些序列统称为“MaACS-1～12的基因组序列”)。这些多核苷酸及蛋白质可通过后述实施例中所述的方法、公知的基因工程的方法、公知的合成方法等获得。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供一种多核苷酸，其特征在于，为选自以下(a)～(g)中任一项所述的多核苷酸：

(a)多核苷酸，其含有选自MaACS-1～12的ORF序列中的任一个碱基序列；

(b)多核苷酸，其含有选自MaACS-1～12的cDNA序列中的任一个碱基序列；

(c)多核苷酸，其编码如下蛋白质，该蛋白质由选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列组成；

(d)多核苷酸，其编码如下蛋白质，该蛋白质由选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列中1～100个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性及/或使组成改变的活性；

(e)多核苷酸，其编码如下蛋白质，该蛋白质具有与选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性及/或使组成改变的活性；

(f)多核苷酸，其与由选自MaACS-1～12的ORF序列中的任一个碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性及/或使组成改变的活性的蛋白质；及

(g)多核苷酸，其与由选自MaACS-1～12的cDNA序列中的任一个碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性及/或使组成改变的活性的蛋白质。

本说明书中，“多核苷酸”是指DNA或RNA。

本说明书中，“在严谨条件下杂交的多核苷酸”是指，例如将由选自MaACS-1～12的ORF序列中的任一个碱基序列或选自MaACS-1～12的cDNA序列中的任一个碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸、或由编码选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列的碱基序列组成的多核苷酸的全部或一部分作为探针，采用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸。关于杂交的方法，例如可以利用在“Sambrook&Russell,Molecu lar Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor,Laboratory P ress 2001”以及“Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley &Sons 1987-1997”等中记载的方法。

本说明书中，“严谨条件”可以是低严谨条件、中严谨条件以及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SD S、50％甲酰胺、42℃或5×SSC、1％SDS、50mM Tris-HCL(pH7.5)、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃或0.2×SSC、0.1％SDS、65℃的条件。在这些条件中，温度越高越能期待高效地得到具有高同一性的DNA。但是，作为影响杂交的严谨度的因素，有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员可以通过适当选择这些因素来实现同样的严谨度。

另外，当杂交使用市售的试剂盒时，例如可以使用Alkphos Direct Labellingand Detection System(GE Healthcare)。此时，按照试剂盒中附带的操作指南，与标记的探针孵育过夜后，在55℃的条件下使用含有0.1％(w/v)SDS的最初的洗涤缓冲液将膜洗涤后，即可检测出杂交的DNA。或基于选自MaACS-1～12的ORF序列中的任一个碱基序列或选自MaACS-1～12的cDNA序列中的任一个碱基序列的互补碱基序列、或编码选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列的全部或一部分制备探针时，使用市售的试剂(例如PCR标记混合物(Roche Diagnostics公司)等)将该探针进行地高辛(DIG)标记的情况下，可使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)来检测杂交。

作为上述以外可进行杂交的多核苷酸，可以列举通过FASTA、BLAST等同源性检索软件，使用默认参数计算时，与选自MaACS-1～12的ORF序列中的任一个碱基序列或选自MaACS-1～12的cDNA序列中的任一个碱基序列的DNA、或编码选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列的DNA有50％以上、51％以上、52％以上、53％以上、54％以上、55％以上、56％以上、57％以上、58％以上、59％以上、60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上同一性的DNA。

另外，氨基酸序列、碱基序列的同一性，可以用FASTA(Science 227(4693):1435-1441,(1985))、Karlin-Altschul的算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)来确定。开发出了基于BLAST算法的被称为blastn、blastx、blastp、tblastn和tblastx的程序(Altschul SF,et al:J Mol Biol 215:403,1990)。使用blastn分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。此外使用blastp分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。

上述本发明的多核苷酸可以通过公知的基因工程的方法或公知的合成方法获得。

2.本发明的蛋白质

本发明提供如下所示的蛋白质。

(i)蛋白质，其由上述(a)～(g)中任一项的多核苷酸编码。

(ii)蛋白质，其含有选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列。

(iii)蛋白质，其由选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性及/或使组成改变的活性。

(iv)蛋白质，其具有与选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性及/或使组成改变的活性。

上述(iii)或(iv)所述的蛋白质，代表性的有天然存在的由选自MaAC S-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列组成的蛋白质的突变体，但也包括可使用例如“Sambrook&Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Ma nual Vol.3,Cold SpringHarbor Laboratory Press 2001”、“Ausubel,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons 1987-1997”、“Nuc.Aci ds.Res.,10,6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)”、“Gene,34,315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.,13,4431(1985)”、“Proc.N atl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)”等中记载的定点突变法而人工获得的蛋白质。

本说明书中，作为“蛋白质，其由选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序组成，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性及/或使组成改变的活性”，可列举如下蛋白质，其由在选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列中的例如1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个(1～数个)、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序组成，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性及/或使组成改变的活性。上述氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加的数量通常优选越少越好。

且作为此种蛋白质，还可以列举如下蛋白质，其具有与选自MaACS-1～12的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列有60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基-CoA合成酶活性、在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性及/或使组成改变的活性。上述同一性的数值通常优选越大越好。

本发明的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加，是指在同一序列中的任意且1个或多个氨基酸序列中的位置上有1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加，缺失、取代、插入及附加中的2种以上也可同时发生。

以下所示为能相互取代的氨基酸残基的例子。在同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

另外，本发明的蛋白质也可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造。此外，还可利用Advanced Automation Peptide ProteinTechnologies公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Protein Technologies公司制、PerSeptive公司制、Applied Biosystems公司制、SHIMADZU公司制等的肽合成仪进行化学合成。

由本发明的多核苷酸编码的蛋白质或本发明的蛋白质均为ACS的同源物蛋白质，且因对酰基-CoA合成酶活性重要的ATP-AMP基序及FACS/VLACS-FATP基序保守，所以认为具有酰基-CoA合成酶活性。在此，ATP、AMP、F ACS、VLACS及FATP分别指三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate)、一磷酸腺苷(Adenosine Monophosphate)、脂酰辅酶A合成酶(Fatty AcylCoA Synt hetase)、极长链酰基辅酶A合成酶(Very Long Chain Acyl-CoA Synthetase)及脂肪酸转运蛋白(Fatty Acid Transport Protein)。本发明的蛋白质中所含有的ATP-AMP基序及FACS/VLACS-FATP基序的具体的氨基序列分别如图25及26的单下线部分及双下线部分所示。有关ATP-AMP基序及FACS/VLAC S-FATP基序的代表性氨基序列，可参照pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)等的数据库。

在此，“酰基-CoA合成酶活性(ACS活性)”指促进脂肪酸和辅酶A之间生成硫酯键、生成酰基-CoA的反应(下述化学反应式)的活性。

脂肪酸+辅酶A→酰基-CoA+H₂O

酰基-CoA合成酶活性例如可如下确认，将导入本发明的多肽的宿主细胞培养一定时间后，制备该宿主细胞的细胞溶解物，将该细胞溶解物、经过标记的脂肪酸(例如用放射性同位素标记的多不饱和脂肪酸等)和辅酶A混合反应一定时间，而后用n-庚烷提取游离脂肪酸并除去，通过将水层中所含有的由上述反应生成的脂肪酸-CoA的量用闪烁计数器作为放射性水平进行测定，可定量确认。有关酰基-CoA合成酶活性的详细确认方法可参照BlackPN et al.(J.B.C.,272(8),4896-4903,1997)。或也可通过本申请实施例2的“ACS活性的评价”中所记载的不使用放射性标记的方法来测定酰基-CoA合成酶活性。

“在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸的量增加的活性”是指将编码本发明的多核苷酸或本发明的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞内(转化)使其在该宿主细胞内表达时，为与所述宿主细胞来自同一菌株，且与未导入所述多核苷酸的对照细胞(对照)相比使脂肪酸的总生产量增加的活性。

此外，“在宿主细胞表达时使该宿主细胞产生的脂肪酸组成改变的活性”是指将本发明的多核苷酸或编码本发明的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞内(转化)使其在该宿主细胞内表达时，与和所述宿主细胞来自同一菌株且与未导入所述多核苷酸的对照细胞(对照)相比，使由细胞产生的各种脂肪酸的量或比率改变的活性。

本说明书中，“脂肪酸”是指通式RCOOH(R为烷基)表示的脂肪族一元羧酸(具有一个羧基，碳素原子链状连接的羧酸)。脂肪酸中包含烃链中不具有双键的饱和脂肪酸和含有双键的不饱和脂肪酸。优选脂肪酸为不饱和脂肪酸，进一步优选烃链中含有多个双键的多不饱和脂肪酸。且作为多不饱和脂肪酸的优选例，为碳数18以上的不饱和脂肪酸，例如为碳数18或20的不饱和脂肪酸，作为其例子，可列举油酸、亚油酸、亚麻酸(γ-亚麻酸及二高γ-亚麻酸等)、花生四烯酸等，但不限于这些。特别优选多不饱和脂肪酸为亚油酸、γ-亚麻酸、二高γ-亚麻酸及花生四烯酸，更优选为亚油酸、二高γ-亚麻酸及花生四烯酸，最优选为二高γ-亚麻酸及花生四烯酸。

本发明中，“宿主细胞”是指只要在导入本发明的多核苷酸时可表达该多核苷酸的细胞，无特别限定。此种细胞中，包含来自哺乳动物(人除外)、昆虫、植物、真菌、细菌等的细胞，优选来自植物及真菌的细胞，特别优选来自真菌的细胞。尤其优选脂质生产菌或酵母。

作为脂质生产菌，例如可以使用在MYCOTAXON,Vol.XLIV,No.2,pp.257-265(1992)中记载的脂质生产菌，但不限于此。作为具体例可以列举属于被孢霉属的微生物。作为属于被孢霉属的微生物的具体例，可以列举长孢被孢霉(Mortierella elongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierella exigua)IFO8571、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO5941、高山被孢霉(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等属于被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物、或深黄被孢霉(Mortierella isabellina)CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、矮被孢霉(Mortierella nana)IFO8190、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)CBS236.82等属于Micromucor亚属(subgenus Micromucor)的微生物等。特别优选高山被孢霉(Mortierella alpina)。

作为酵母的具体例，可列举酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)，作为酵母属(Saccharomyces)，可优选列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。但是，酿酒酵母等的野生株酵母在其细胞内中主要可合成碳数18以下的饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸，但不能合成多不饱和脂肪酸。因此，将酿酒酵母等的酵母作为宿主细胞使用时，优选该酵母细胞通过基因重组等被赋予合成多不饱和脂肪酸的能力。合成此种多不饱和脂肪酸的能力可通过导入编码如下蛋白质的基因来赋予，该蛋白质来自已具有合成多不饱和脂肪酸能力的生物且参与脂肪酸合成。

作为“已具有合成多不饱和脂肪酸能力的生物”的例子，可列举脂质生产菌。脂质生产菌的具体例如前所述。

此外，作为编码来自已具有合成多不饱和脂肪酸能力的生物的蛋白质，且参与脂肪酸合成的蛋白质的基因的例子，可列举Δ12脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因、GLELO脂肪酸链延长酶基因及Δ5脂肪酸去饱和酶基因等，但不限定这些。Δ12脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因、GLELO脂肪酸链延长酶基因及Δ5脂肪酸去饱和酶基因的碱基序列可通过访问GenBank等数据库获取，例如可通过在GenBank中分别输入为No.AB020033、No.AB020032、No.AB193123及No.AB188307的注册号获取各序列。

上述与脂肪酸合成有关的蛋白质的基因可在插入适当的载体(例如、pESC(Stratagene)或pYES(Invitrogen)等)后，通过电穿孔法、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978))、醋酸锂法(J.Bacteriology,153,p163(1983))、及Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)、Methods in yeast genetics,2000Edition:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中记载的方法导入酵母中。

脂肪酸可从由本发明的多核苷酸或编码本发明的蛋白质的多核苷酸转化的宿主细胞中如下提取。关于宿主细胞，培养结束后，可以按照离心分离法、过滤等常用方法得到培养细胞。将细胞充分水洗，优选进行干燥。干燥可以通过冷冻干燥、风干等来进行。将干燥细胞根据需要采用Dyno Mill或超声波等破碎后，优选在氮气流下使用有机溶剂进行提取处理。作为有机溶剂，可以使用醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚等，或者通过甲醇和石油醚的交替提取或使用了氯仿-甲醇-水的单相溶剂的提取也能得到良好的结果。通过在减压下从提取物中馏去有机溶剂，可以得到含有脂肪酸的脂质。提取的脂肪酸也可以采用盐酸甲醇法等进行甲酯化。

此外，各种脂肪酸的量或比率可将如上所述提取的脂肪酸用各种色谱法通过分析进行测定。作为色谱法的例子，可列举高效液相色谱法及气相色谱法，作为特别优选的例子可列举气相色谱法，但不限于此。

3.本发明的载体及导入该载体的转化体

本发明还在另一实施方式中提供含有本发明的多核苷酸的表达载体。

本发明的载体通常包含如下表达盒而构成，该表达盒包含

(i)可在宿主细胞内转录的启动子；

(ii)与该启动子连接的上述(a)～(g)中任一项所述的多核苷酸；以及

(iii)与RNA分子的转录终止和多聚腺苷酸化相关、在宿主细胞内起作用的信号作为构成要素。

如此构建的载体被导入宿主细胞。作为本发明中使用的适合的宿主细胞的例子，如上所述。

由本发明的载体转化后的这些宿主细胞与未由本发明的载体转化的宿主细胞相比，ACS活性增加或者生产了更多的脂肪酸、或者细胞内含有的各种脂肪酸的量或比率发生了变化。

作为在脂质生产菌中导入时使用的载体，例如可以利用pDura5(Appl.Microbiol.Biotechnol.,65,419-425,(2004))，但不限于此。

作为在酵母中导入时使用的载体，只要是具有在酵母细胞内表达插入片段的活性的载体即可，无特别限定，作为例子，可以列举pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221-1228,1995)。

作为调节宿主细胞中的基因表达的启动子/终止子，只要在宿主细胞中起作用即可，可以是任意的组合。例如，在脂质生产菌中利用时，可以利用hist on H4.1基因的启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子等。

作为转化时使用的选择性标记，可以利用营养缺陷型标记(ura5、niaD)、潮霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、Geneticin抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m,PDR4)(分别来自猪腰淳嗣等，生化学,64,660,1992；Hussain et al.,gene,101,149,1991)等。

作为宿主细胞的转化方法，可以利用常用的公知方法。例如为脂质生产菌时，可以利用电穿孔法(Mackenxie D.A.et al.Appl.Environ.Microbiol.,66,4655-4661,2000)、粒子轰击(Particle Delivery)法(日本特开2005-287403“脂质生产菌的育种方法”(日语原名：脂質生産菌の育種方法)中记载的方法)。另外，为酵母时，可以采用电穿孔法、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.U SA,75p1929(1978))、醋酸锂法(J.Bacteriology,153,p163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)、Methods in yeast genetics,2000Edition:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中记载的方法来实施，但不限于这些。

此外，有关通常的克隆技术，可参照“Sambrook&Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods inYeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、ColdSpring Harbor,NY)"等。

4.本发明的脂质或脂肪酸组合物的制造方法

本发明还在另一实施方式中提供使用上述转化体的脂质或脂肪酸组合物的制造方法。

本说明书中，“脂质”是指包括由脂肪酸和醇通过酯键形成的化合物(例如甘油酯)或其类似物(例如胆固醇酯)等的单纯脂质、在单纯脂质的一部分上进一步结合磷酸、氨基酸、糖等而得到的复合脂质以及脂质的水解产物中不溶于水的衍生脂质。

本说明书中，“油脂”是指甘油和脂肪酸的酯(甘油酯)。

有关“脂肪酸”如上所述。

本发明的脂质或脂肪酸组合物的提取方法与上述的脂肪酸的提取方法相同。

从含有脂肪酸的脂质中分离脂肪酸，可以在混合脂肪酸或混合脂肪酸酯的状态下采用常用方法(例如尿素附加法、冷却分离法、柱色谱法等)浓缩分离来进行。

通过本发明的方法制造的脂质优选含有不饱和脂肪酸，进一步优选含有多不饱和脂肪酸。作为多不饱和脂肪酸的优选例，为碳数18以上的不饱和脂肪酸、例如碳数18或20的不饱和脂肪酸，作为其例子可列举油酸、亚油酸、亚麻酸(γ-亚麻酸及二高γ-亚麻酸等)、花生四烯酸等，但不限于这些。特别优选的多不饱和脂肪酸为亚油酸、γ-亚麻酸、二高γ-亚麻酸及花生四烯酸，更优选为亚油酸、二高γ-亚麻酸及花生四烯酸，最优选为二高γ-亚麻酸及花生四烯酸。

且通过本发明的方法生产的脂质及该脂质中所含有的脂肪酸的组成可通过上述脂质的提取方法、脂肪酸的分离方法或这些的组合确认。

使用本发明的制造方法得到的脂质或脂肪酸组合物，可以按照常用方法用于例如含有油脂的食品、医药品、工业原料(化妆品、肥皂等的原料)的制造等用途。

本发明还在另一实施方式中提供使用本发明的转化体的食品、化妆品、医药、肥皂等的制造方法。该方法包含使用本发明的转化体来生成脂质或脂肪酸的工序。含有生成的脂质或脂肪酸的食品、化妆品、医药、肥皂等的制备采用常用方法。如上所述，使用本发明的制造方法制造的食品、化妆品、医药、肥皂等，含有使用本发明的转化体所生成的脂质或脂肪酸。本发明还提供使用上述方法制造的食品、化妆品、医药、肥皂等。

本发明的化妆品(组合物)或医药品(组合物)的剂型无特别限定，可以采用溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型。另外，本发明的化妆品组合物或医药组合物不仅可以用于油、化妆水、乳霜、乳液、凝胶、洗发液、润丝、护发素、指甲油、粉底、口红、香粉、面膜、软膏、香水、粉饼、花露水、牙膏、肥皂、气雾剂、洁面膏等化妆品或皮肤外用药，还可以用于皮肤老化防止改善剂、皮肤炎症防止改善剂、沐浴用剂、生发剂、皮肤美容液、防晒剂或因外伤、皲裂、龟裂等引起的皮肤粗糙的防止改善剂等。

本发明的化妆品组合物还可以根据需要进一步适当配合其他油脂及/或色素、香料、防腐剂、表面活性剂、颜料、抗氧化剂等。关于它们的配合比例，本领域技术人员可以根据目的适当决定(例如，油脂在组合物中可以含有1～99.99重量％，优选为5～99.99重量％，进一步优选为10～99.95重量％)。此外，本发明的医药组合物也可以根据需要进一步含有其他医药活性成分(例如消炎成分)或辅助成分(例如润滑成分、载体成分)。例如，作为化妆品或皮肤外用药中的其他常用成分，可以列举粉刺用药、头屑·瘙痒防止剂、止汗防臭剂、烫伤用药、防螨·虱剂、角质软化剂、干皮症用药、抗病毒剂、经皮吸收促进剂等。

作为本发明的食品的例子，可以列举营养辅助食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方奶、早产儿用配方奶、老人用食品等。在本说明书中，食品是固体、流体、液体以及它们的混合物，是可摄取食用的物质的总称。

营养辅助食品是指强化了特定营养成分的食品。保健食品是指被认为是健康的或对健康有益的食品，包括营养辅助食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充具有身体调节功能的营养成分的食品，与特定保健用食品同义。幼儿用食品是指供给约6岁以下的儿童用的食品。老人用食品是指处理成比未处理食品易消化和吸收的食品。婴儿用配方奶是指供给约1岁以下的儿童用的配方奶。早产儿用配方奶是指供给早产儿出生后到约6个月为止所用的配方奶。

作为这些食品的形态的例子，可以列举肉、鱼、坚果等天然食品(用油脂处理过的食品)、中国菜、拉面、汤等在制作时加入油脂的食品、天妇罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、甜甜圈、花林糖等用油脂作为热介质的食品、黄油、人造黄油、蛋黄酱、调味汁、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇凌等油脂食品或在加工时添加了油脂的加工食品、(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等在加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，并不限于含有油脂的食品，例如还可以是面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、豆腐及其加工品等农产品、清酒、药酒、甜料酒、食醋、酱油、黄酱等发酵食品、酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品、鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品、果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。

本发明的食品还可以是胶囊等医药制剂的形态，或是在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合了本发明的油脂得到的自然流食、半消化态营养食品以及成分营养食品、保健饮料、经肠营养剂等加工形态。

如上所述，通过使本发明的ACS同源物的基因在宿主细胞内表达，能高效地生成脂肪酸。

而且，还可以将该基因的表达量作为指标，应用于高效地进行脂肪酸生产的培养条件的探讨、培养管理等。

实施例

以下用实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围并不限于这些实施例。

[实施例1]高山被孢霉(Mortierella alpina)的基因组分析

将M.alpina 1S-4株接种到100ml的GY2：1培养基(2％葡萄糖、1％酵母膏pH6.0)中，在28℃下振荡培养2天。通过过滤收集菌体，使用DNeasy(Q IAGEN)制备基因组DNA。使用Roche 454GS FLX Standard来确定上述基因组DNA的碱基序列。此时，片段文库的碱基序列的确定进行2个run，末端配对文库的碱基序列的确定进行3个run。通过将得到的碱基序列拼接，得到300个超级重叠群(supercontig)。

cDNA的合成和cDNA文库的构建

将M.alpina 1S-4株接种到100ml的培养基(1.8％葡萄糖、1％酵母膏、p H6.0)中，在28℃下预培养3天。在10L培养槽(Able Co.，东京)中加入5L培养基(1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％增稠剂(ADEKANO L)、0.3％KH₂PO₄、0.1％Na₂SO₄、0.05％CaCl₂·2H₂O、0.05％MgCl₂.6H₂O、pH6.0)，接种全部预培养物，在300rpm、1vvm、26℃的条件下通气搅拌培养8天。培养第1、2及3天后，分别添加相当于2％、2％及1.5％的葡萄糖。回收培养第1、2、3、6及8天的各阶段的菌体，用盐酸胍/CsCl法制备total RNA。使用Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa Bio In c.)从total RNA中进行poly(A)⁺RNA的纯化。使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(STRATAGENE)构建各阶段的cDNA文库。

ACS同源物的搜索

将作为酵母的ACS的ScFAA1(YOR317W)、ScFAA2(YER015W)、S cFAA3(YIL009W)、ScFAA4(YMR246W)、ScFAT1(YBR041W)、ScF AT2(YBR222C)的氨基酸序列作为查询(query)序列，相对于M.alpina 1S-4的基因组碱基序列进行tblastn搜索。其结果，12种序列匹配。即包含序列号5、序列号10、序列号15、序列号20、序列号25、序列号30、序列号35、序列号40、序列号45、序列号50、序列号55、序列号60的序列的超级重叠群(supercontig)匹配。将序列号5所涉及的基因作为MaACS-1，将序列号10所涉及的基因作为MaACS-2，将序列号15所涉及的基因作为MaACS-3，将序列号20所涉及的基因作为MaACS-4，将序列号25所涉及的基因作为Ma ACS-5，将序列号30所涉及的基因作为MaACS-6，将序列号35所涉及的基因作为MaACS-7，将序列号40所涉及的基因作为MaACS-8，将序列号45所涉及的基因作为MaACS-9，将序列号50所涉及的基因作为MaACS-10，将序列号55所涉及的基因作为MaACS-11，将序列号60所涉及的基因作为MaACS-12。

ACS同源物的克隆

为克隆与MaACS-1～12的基因对应的cDNA，进行上述cDNA文库的筛选。另外，探针的标记通过使用ExTaq(TaKaRa Bio Inc.)的PCR进行。即替换ExTaq中附带的dNTP混合物，使用PCR标记混合物(Roche Diagnostics)，制备将经过扩增的DNA进行地高辛(DIG)标记的探针。

杂交条件如下。

缓冲液：5xSSC、1％SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50％甲酰胺；

温度：42℃(一夜)；

洗涤条件：在0.2x SSC、0.1％SDS溶液中(65℃)、20分钟×3次；

使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics)进行检测。从通过筛选得到的噬菌体克隆中，使用体内切割技术切割质粒，得到各质粒DNA。

以下，通过各基因筛选中使用的探针制备用的引物、所得到的各基因CDS的碱基数、由CDS的碱基序列导出的氨基酸序列的氨基酸数及基因组DNA序列和CDS序列的比较，记载外显子、内含子的数量。

(1)MaACS-1引物ACS-1-1F：5'-gtcggctccaagcttgcaatcc-3'(序列号61)

引物ACS-1-2R：5'-ggacagctccagcactgtggtaaag-3'(序列号62)

cDNA(序列号4)

CDS(序列号3)：1857bp

ORF(序列号1)：1854bp

氨基酸序列(序列号2)：618氨基酸(参照图1)

外显子数：5、内含子数：4(参照图2)

(2)MaACS-2

引物ACS-2-1F：5'-gaccacgggattccccaaggctgc-3'(序列号63)

引物ACS-2-2R：5'-cttggtcgcgcttgttcctggccac-3'(序列号64)

cDNA(序列号9)

CDS(序列号8)：1929bp

ORF(序列号6)：1926bp

氨基酸序列(序列号7)：642氨基酸(参照图3)

外显子数：8、内含子数：7(参照图4)

(3)MaACS-3

引物ACS-3-1F：5'-tacagctttgttgctgtccccatc-3'(序列号65)

引物ACS-3-2R：5'-gatgatgggtgtgcttgcaaagatc-3'(序列号66)

cDNA(序列号14)

CDS(序列号13)：1653bp

ORF(序列号11)：1650bp

氨基酸序列(序列号12)：550氨基酸(参照图5)

外显子数：9、内含子数：8(参照图6)

(4)MaACS-4

引物ACS-4-1F：5'-aacccaaagctgcgccaggctgtcc-3'(序列号67)

引物ACS-4-2R：5'-ttacagcttggattccttttgatgg-3'(序列号68)

cDNA(序列号19)

CDS(序列号18)：2067bp

ORF(序列号16)：2064bp

氨基酸序列(序列号17)：688氨基酸(参照图7)

外显子数：7、内含子数：6(参照图8)

(5)MaACS-5

引物ACS-5-1F：5'-gtcgtgcccgatgcggagacgc-3'(序列号69)

引物ACS-5-2R：5'-tcagtggatcccgttatacatcag-3'(序列号70)

cDNA(序列号24)

CDS(序列号23)：1980bp

ORF(序列号21)：1977bp

氨基酸序列(序列号22)：659氨基酸(参照图9)

外显子数：6、内含子数：5(参照图10)

(6)MaACS-6

引物ACS-6-1F：5'-gcgtccccctctatgatacattg-3'(序列号71)

引物ACS-6-2R：5'-gtgggatgcaggacggcaacatcg-3'(序列号72)

cDNA(序列号29)

CDS(序列号28)：1980bp

ORF(序列号26)：1977bp

氨基酸序列(序列号27)：659氨基酸(参照图11)

内含子数：至少为5(参照图12)

(7)MaACS-7

引物ACS-7-1F：5'-ggatgccgaacaacagcgcgtgg-3'(序列号73)

引物ACS-7-2R：5'-gcaccctcctcagaaacagccctc-3'(序列号74)

cDNA(序列号34)

CDS(序列号33)：1827bp

ORF(序列号31)：1824bp

氨基酸序列(序列号32)：608氨基酸(参照图13)

外显子数：5、内含子数：4(参照图14)

(8)MaACS-8

引物ACS-8-1F：5'-cagtcgagtacattgtcaaccacg-3'(序列号75)

引物ACS-8-2R：5'-gcggttcaagaggcgaggcacagc-3'(序列号76)

cDNA(序列号39)

CDS(序列号38)：2079bp

ORF(序列号36)：2076bp

氨基酸序列(序列号37)：692氨基酸(参照图15)

外显子数：8、内含子数：7(参照图16)

(9)MaACS-9

引物ACS-9-1F：5'-gttcatcttctgctggctgggtctc-3'(序列号77)

引物ACS-9-2R：5'-gttgcgttgttcacgcggcaatcc-3'(序列号78)

cDNA(序列号44)

CDS(序列号43)：1851bp

ORF(序列号41)：1848bp

氨基酸序列(序列号42)：616氨基酸(参照图17)

外显子数：5、内含子数：4(参照图18)

(10)MaACS-10

引物ACS-10-1F：5'-atggaaaccttggttaacggaaag-3'(序列号79)

引物ACS-10-2R：5'-tcagcaaagatggccttgggctgg-3'(序列号80)

cDNA(序列号49)

CDS(序列号48)：2076bp

ORF(序列号46)：2073bp

氨基酸序列(序列号47)：691氨基酸(参照图19)

外显子数：8、内含子数：7(参照图20)

(11)MaACS-11

引物ACS-11-1F：5'-gtcaagggcgagactcgcatcc-3'(序列号81)

引物ACS-11-2R：5'-cggtgacgatggtcatggactgc-3'(序列号82)

cDNA(序列号54)

CDS(序列号53)：2043bp

ORF(序列号51)：2040bp

氨基酸序列(序列号52)：680氨基酸(参照图21)

外显子数：3、内含子数：2(参照图22)

(12)MaACS-12

引物ACS-12-1F：5'-gcgagacccgcatccgccgctcc-3'(序列号83)

引物ACS-12-2R：5'-gaccgtcctcgcccagggtgtcg-3'(序列号84)

cDNA(序列号59)

CDS(序列号58)：2043bp

ORF(序列号56)：2040bp

氨基酸序列(序列号57)：680氨基酸(参照图23)

外显子数：3、内含子数：2(参照图24)

序列分析

来自高山被孢霉(M.alpina)的12种ACS同源物的CDS碱基序列间的同一性如表1所示，氨基酸序列间的同一性如表2所示。MaACS-11和MaACS-12显示出碱基序列为80.2％、氨基酸序列为84.3％的高的同一性。

[表1]

来自M.alpina的ACS同源物的CDS碱基序列间的同一性

[表2]

来自M.alpina的ACS同源物的氨基酸序列间的同一性

将MaACS-1～12的CDS序列的推定氨基酸序列作为查询(query)序列，相对于GenBank上注册的氨基酸序列进行BLASTp搜索。具有与MaACS-1～12的推定氨基酸序列以最高分匹配的氨基酸序列的蛋白质及该蛋白质的氨基酸序列和MaACS-1～12的推定氨基酸序列的同一性如表3所示。此外，来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的酰基‐CoA合成酶的氨基酸序列和MaACS-1～12的推定氨基酸序列的同一性如表4所示。

[表3]

来自M.alpina的ACS同源物的氨基酸序列和已知氨基酸序列的同一性

[表4]

来自M.alpina的ACS同源物的按基酸序列和来自S.cerevisiae的ACS同源物的氨基酸序列的比较

MaACS-1～12中，与来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的FAA蛋白质有较高氨基酸序列同源性的MaACS和该FAA蛋白质的比对如图25所示。且与来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的FAT蛋白质有较高氨基酸序列同源性的ACS同源物的比对如图26所示。作为图25及26所示的任一组ACS同源物中，作为对ACS活性重要的基序ATP-AMP基序和FACS/VLACS-FATP基序的区域也高度保守。

表达载体的构建

使用酵母表达用载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221-1228,1995)，如下构建用于使MaACS-1、MaACS-10、MaACS-11、MaACS-6、MaACS-8、MaACS-9分别在酵母中表达的的载体。

通过用限制性内切酶BamHI及XhoI酶切包含筛选MaACS-6而得到的序列号29的质粒，将所得到的约2.1kbp的DNA片段和用限制性内切酶BamHI及SalI酶切载体pYE22m后的DNA片段使用ligation high(TOYOBO)连接，得到质粒pYE-ACS-6。

以包含MaACS-8的cDNA的质粒为模板，将通过使用以下引物、使用ExTaq(TakaraBio Inc.)的PCR扩增而得到的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit(Invitrogen)进行克隆。

引物EcoRI-ACS-8-F：

5'-GGATCCATGCCTTCCTTCAAAAAGTACAACC-3'(序列号85)

引物SmaI-ACS-8-R：5'-CCCGGGCAAAGAGTTTTCTATCTACAGCTT-3'(序列号86)

确认插入片段部分的碱基序列，将用限制性内切酶EcoRI及SmaI酶切具有正确碱基序列的质粒而得到的约2.1kbp的DNA片段、和用限制性内切酶EcoRII及SmaI酶切载体pYE22m后的DNA片段使用ligation high(TOYOBO)连接，得到质粒pYE-ACS-8。

以包含MaACS-9的cDNA的质粒为模板，将通过使用以下引物、使用ExTaq(TakaraBio Inc.)的PCR扩增而得到的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit(Invitrogen)进行克隆。

引物EcoRI-ACS-9-F：5'-GAATTCATGGTTGCTCTCCCACTCG-3'(序列号87)

引物BamHI-ACS-9-R：5'-GGATCCCTACTATAGCTTGGCCTTGCC-3'(序列号88)

确认插入片段部分的碱基序列，将用限制性内切酶EcoRI及BamHI酶切具有正确碱基序列的质粒而得到的约2.0kbp的DNA片段、和用限制性内切酶EcoRII及BamHI酶切载体pYE22m后的DNA片段使用ligation high(TOYOBO)连接，得到质粒pYE-ACS-9。

以包含MaACS-1的cDNA的质粒为模板，将通过使用以下引物、使用ExTaq(TakaraBio Inc.)的PCR扩增而得到的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit(Invitrogen)进行克隆。

引物EcoRI-ACS-1-F：5'-GGATCCATGTATGTCGGCTCCAAGCTTGC-3'(序列号89)

引物SalI-ACS-1-R：5'-GTCGACTCAAAGCCTGGCTTTGCCGCTGACG-3'(序列号90)

确认插入片段部分的碱基序列，将用限制性内切酶EcoRI及SalI酶切具有正确碱基序列的质粒而得到的约1.9kbp的DNA片段、和用限制性内切酶EcoRI及SalI酶切载体pYE22m后的DNA片段使用ligation high(TOYOBO)连接，得到质粒pYE-ACS-1。

以包含MaACS-10的cDNA的质粒为模板，将通过使用以下引物、使用ExTaq(TakaraBio Inc.)的PCR扩增而得到的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit(Invitrogen)进行克隆。

引物ACS-10-1F：5'-GGATCCatggaaaccttggttaacggaaag-3'(序列号91)

引物KpnI-ACS-10-R：5'-GGTACCTAGAACTTCTTCCACATCTCCTC-3'(序列号92)

确认插入片段部分的碱基序列，将用限制性内切酶EcoRI及KpnI酶切具有正确碱基序列的质粒而得到的约2.1kpb的DNA片段、和用限制性内切酶EcoRI及KpnI酶切载体pYE22m后的DNA片段使用ligation high(TOYOBO)连接，通过选择在MaACS-10的CDS的5’侧与载体pYE22m的具有GAPDH启动子的方向连接的质粒，得到质粒pYE-ACS-10。

以包含MaACS-11的cDNA的质粒为模板，将通过使用以下引物、使用E xTaq(TakaraBio Inc.)的PCR扩增而得到的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit(Invitrogen)进行克隆。

引物SacI-ACS-11-F：5'-GAGCTCATGCCAAAGTGCTTTACCGTCAACG-3'(序列号93)

引物BamHI-ACS-11-R：5'-GGATCCTTACTTGGAGCCATAGATCTGCTT G-3'(序列号94)

确认插入片段部分的碱基序列，将用限制性内切酶SacI及BamHI酶切具有正确碱基序列的质粒而得到的约2.0kbp的DNA片段、和用限制性内切酶S acI及BamHI酶切载体pYE22m后的DNA片段使用ligation high(TOYOBO)连接，得到质粒pYE-ACS-11。

在酵母中的表达

转化株的获得

分别使用质粒pYE22m、pYE-MaACS-6、pYE-MaACS-8、pYE-MaACS-9，通过醋酸锂法转化酵母S.cerevisiae EH13-15株(trp1,MATα)(Appl.Microbiol.Biotechnol.,30,515-520,1989)。转化株以在SC-Trp(每1l中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/oamino acids)(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)中生长繁殖为标准进行筛选。

酵母的培养

将使用各个质粒转化所得到的任意1株用于以下的培养实验。

作为预培养，从培养板中取1白金耳酵母在SC-Trp培养基10ml中接种，30℃下振荡培养1天。主培养为在SC-Trp培养基中添加1ml预培养液，30℃下振荡培养1天。

菌体的脂肪酸分析

通过离心分离酵母的培养液而回收菌体。用10ml的灭菌水洗涤，通过离心分离再次回收菌体，冷冻干燥。通过盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生成甲酯后，用己烷提取，馏去己烷，通过气相色谱法进行分析。

单位培养基的脂肪酸生产量如表5所示。与用pYE22m转化的对照相比，用ppYE-MaACS-6、pYE-MaACS-8或pYE-MaACS-9转化的菌株中单位培养基的脂肪酸生产量上升。

[表5]

单位培养基中转化株的脂肪酸生产量

在花生四烯酸生产酵母中的表达

(1)花生四烯酸酵母的育种

为了将花生四烯酸生产酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae))育种，构建以下质粒。

首先，以由M.alpina 1S-4株制备的cDNA为模板，通过以下引物Δ12-f及Δ12-r、Δ6-f及Δ6-r、GLELO-f及GLELO-r、或Δ5-f及Δ5-r的组合，使用ExTaq进行PCR，扩增M.alpina 1S-4株的Δ12脂肪酸去饱和酶基因(GenBank accession No.AB020033)(以下为“Δ12基因”)、Δ6脂肪酸去饱和酶基因(GenBank accession No.AB020032)(以下为“Δ6基因”)、GLELO脂肪酸链延长酶基因(GenBank accession No.AB193123)(以下为“GLELO基因”)及Δ5脂肪酸去饱和酶基因(GenBank accession No.AB188307)(以下为“Δ5基因”)。

Δ12-f：5'-TCTAGAatggcacctcccaacactattg-3'(序列号95)

Δ12-r：5'-AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC-3'(序列号96)

Δ6-f：5'-TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag-3'(序列号97)

Δ6-r：5'-AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG-3'(序列号98)

GLELO-f：5'-TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc-3'(序列号99)

GLELO-r：5'-GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC-3'(序列号100)

Δ5-f：5'-TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc-3'(序列号101)

Δ5-r：5'-AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC-3'(序列号102)

将这些使用TOPO-TA-cloning Kit克隆。确认碱基序列，将包含Δ12基因、Δ6基因、GLELO基因及Δ5基因的碱基序列的克隆分别作为质粒pCR-MAΔ12DS(包含Δ12基因的碱基序列)、pCR-MAΔ6DS(包含Δ6基因的碱基序列)、pCR-MAGLELO(包含GLELO基因的碱基序列)、pCR-MAΔ5DS(包含Δ5基因的碱基序列)。

另一方面，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pURA34(日本特开2001-120276)而得到的约1.2kb的DNA片段插入到用限制性内切酶EcoRI和Sph I酶切载体pUC18(TakaraBio Inc.)后进行末端平滑化并进行自我连接而得到的载体的HindIII位点，将载体的EcoRI位点侧为URA3的5’侧的克隆作为pUC-URA3。此外，将用限制性内切酶SalI和XhoI酶切YEp13而得到的约2.2kb的DNA片段插入到载体pUC18的SalI位点，将载体的EcoRI侧为LUE2的5’侧的克隆作为pUC-LEU2。

而后，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pCR-MAΔ12DS后进行末端平滑化再用限制性内切酶XbaI酶切而得到的约1.2kbp的DNA片段、和用限制性内切酶SacI酶切载体pESC-URA(STRATAGENE)后进行末端平滑化再用限制性内切酶SpeI酶切的约6.6kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-U-Δ12。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ6DS后进行末端平滑化再用限制性内切酶HindIII酶切而得到的约1.6kbp的DNA片段、和用限制性内切酶SalI酶切质粒pESC-U-Δ12后进行末端平滑化再用限制性内切酶HindIII酶切的约8kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-U-Δ12:Δ6。将用限制性内切酶PvuII部分酶切该质粒而得到的约4.2kb的片段插入pUC-URA3的SmaI位点，得到质粒pUC-URA-Δ12:Δ6。

另外，将用限制性内切酶XbaI和SacI酶切质粒pCR-MAGLELO而得到的约0.95kbp的DNA片段、和用限制性内切酶XbaI和SacI酶切载体pESC-LEU(STRATAGENE)而得到的约7.7kbp的DNA片段连接，得到质粒pES C-L-GLELO。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ5DS后进行末端平滑化再用限制性内切酶HindIII酶切而得到的约1.3kbp的DNA片段和用限制性内切酶ApaI酶切质粒pESC-L-GLELO后进行末端平滑化再用限制性内切酶HindIII酶切而得到的约8.7kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-L-GLELO:Δ5。将用限制性内切酶PvuII酶切该质粒而得到的约3.2kbp片段插入pUC-L EU2的SmaI位点，得到质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5。将Saccharomyces cerevi siae YPH499株(STRATAGENE)用质粒pUC-URA-Δ12:Δ6和质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5进行共转化(co-transformation)。转化株以在SC-Leu,Ura琼脂培养基中生长繁殖为标准进行筛选。如此得到的菌株中，将任意一株作为ARA3-1株。该菌株通过在含有半乳糖的培养基中培养，可从GAL1/10启动子开始表达Δ12脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因、GLELO基因、Δ5脂肪酸去饱和酶基因。

(2)向花生四烯酸生产酵母中的转化和分析

将ARA3-1株用质粒pYE22m、pYE-ACS-1、pYE-ACS-10、pYE-ACS-11分别转化。转化株用在SC-Trp,Leu,Ura(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o aminoacids)(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)中生长繁殖为标准进行筛选。从各个质粒导入株中任选4株用于以下的培养实验。

将这些菌株在上述SC-Trp,Leu,Ura液体培养基10ml中30℃下培养1天，将其中1ml在SG-Trp,Leu,Ura(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、半乳糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)1.3g)液体培养基10ml中接种，15℃下培养6天。集菌、水洗后冷冻干燥。通过盐酸甲醇法将干燥菌体内的脂肪酸衍生成甲酯，通过气相色谱法进行脂肪酸分析。相对于用质粒pYE22m转化的对照株及用来自被孢霉的各ACS同源物转化的菌株的总脂肪酸，各PUFA的组成比如表6所示。

[表6]

来自被孢霉的ACS同源物表达株的PUFA组成比(％)

如表6所示，通过使来自被孢霉的ACS同源物表达，可改变脂肪酸的组成。特别是在MaACS-11表达株中，与对照株相比，花生四烯酸的组成比增加到约1.8倍，亚油酸增加到约1.5倍，γ-亚麻酸增加到2.4倍。此外，在MaACS-1表达株中，与对照株相比，花生四烯酸量增加到约1.5倍。进而在MaACS-10表达株中，与对照株相比，亚油酸增加到约2倍，γ-亚麻酸增加到约4倍。

[实施例2]表达载体的构建

酵母用表达载体

如下构建用于使MaACS-12在酵母中表达的载体pYE-ACS-12。以包含MaACS-12的cDNA的质粒为模板，使用

引物Eco-ACS-G-F：5’-GAATTCATGACAAAGTGCCTCACCGTCG-3’(序列号103)

引物Sma-ACS-G-R：5’-CCCGGGACTTAGGCCGTTCCATAAAGCTG-3’(序列号104)，

将由使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增的DNA片段用Zero Blunt TOPO PCRCloning Kit(invitrogen)克隆。确认插入片段部分的碱基序列，将用限制性内切酶EcoRI和SmaI酶切具有正确碱基序列的质粒而得到的约2kbp的DNA片段、和用限制性内切酶BamHI酶切载体pYE22m后使用Blunting Kit(TAKARA BIO)进行末端平滑化再用EcoRI酶切的DNA片段使用Ligation High(TOYOBO)连接，得到质粒pYE-ACS-12。

高山被孢霉(M.alpina)用表达载体

为使MaACS-10和MaACS-11在高山被孢霉(M.alpina)中表达，如下构建载体。

首先，用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切载体pUC18，插入使寡聚DNA MCS-for-pUC18-F2和MCS-for-pUC18-R2退火后的连接片段，构建质粒

pUC18-RF2。

MCS-for-pUC18-F2：

5’-aattcataagaatgcggccgctaaactattctagactaggtcgacggcgcgcca-3’(序列号105)

MCS-for-pUC18-R2：

5’-agcttggcgcgccgtcgacctagtctagaatagtttagcggccgcattcttatg-3’(序列号106)

以高山被孢霉(M.alpina)的基因组DNA为模板，使用引物Not1-GAPDHt-F和引物EcoR1-Asc1-GAPDHt-R，将由使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增的约0.5kbp的DNA片段用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(invitrogen)克隆。在确认了插入片段部分的碱基序列后，将用限制性内切酶NotI和EcoRI酶切而得到的约0.9kbp的DNA片段插入质粒pUC18-RF2的NotI及EcoRI位点，构建质粒pDG-1。

Not1-GAPDHt-F：5’-agcggccgcataggggagatcgaacc-3’(序列号107)

EcoR1-Asc1-GAPDHt-R：5’-agaattcggcgcgccatgcacgggtccttctca-3’(序列号108)

以高山被孢霉(M.alpina)的基因组为模板，使用引物URA5g-F1和引物URA5g-R1，将由使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增的DNA片段用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(invitrogen)克隆。在确认插入片段部分的碱基序列后，将用限制性内切酶SalI酶切而得到的约2kbp的DNA片段插入质粒pDG-1的SalI位点，将URA5基因的5’侧在载体的EcoRI侧的方向插入的质粒作为质粒pDuraG。

URA5g-F1：5’-gtcgaccatgacaagtttgc-3’(序列号109)

URA5g-R1：5’-GTCGACTGGAAGACGAGCACG-3’(序列号110)

接着，以高山被孢霉(M.alpina)的基因组为模板，使用引物hisHp+URA5-F和引物hisHp+MGt-F，将由使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增的约1.0kbp的DNA片段、和以pDuraG为模板使用引物pDuraSC-GAPt-F和引物URA5gDNA-F并由使用KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增的约5.3kbp的DNA片段使用In-Fusion(注册商标)Advantage PCR Cloning Kit(TAKA RABIO)连接，得到质粒pDUra-RhG。

hisHp+URA5-F：5’-GGCAAACTTGTCATGAAGCGAAAGAGAGATTATGAAAACAAGC-3’(序列号111)

hisHp+MGt-F：5’-CACTCCCTTTTCTTAATTGTTGAGAGAGTGTTGGGTGAGAGT-3’(序列号112)

pDuraSC-GAPt-F：5’-TAAGAAAAGGGAGTGAATCGCATAGGG-3’(序列号113)

URA5gDNA-F：5’-CATGACAAGTTTGCCAAGATGCG-3’(序列号114)

以质粒pDUra-RhG为模板，使用引物pDuraSC-GAPt-F和引物pDurahG-hisp-R，由使用了KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增约6.3kbp的DNA片段。

pDurahG-hisp-R：5’-ATTGTTGAGAGAGTGTTGGGTGAGAGTG-3’(序列号115)

以包含MaACS-10的cDNA的质粒为模板，使用

引物ACS-10+hisp-F：

5’-CACTCTCTCAACAATATGGAAACCTTGGTTAACGGAAAGT-3’(序列号116)

引物ACS-10+MGt-R：

5’-CACTCCCTTTTCTTACTAGAACTTCTTCCACATCTCCTCAATATC-3’(序列号117)，

由使用了KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增约2.1kbp的DNA片段。将所得到的片段和上述6.3kbp的DNA片段使用In-Fusion(注册商标)Advantage PCR Cloning Kit(TaKaRaBio)连接，得到质粒pDUraRhG-ACS-10。

以包含MaACS-11的cDNA的质粒为模板，使用

引物ACS-11+MGt-R：

5’-CACTCCCTTTTCTTATTACTTGGAGCCATAGATCTGCTTGA-3’(序列号118)

引物ACS-11+hisp-F：

5’-CACTCTCTCAACAATATGCCAAAGTGCTTTACCGTCAAC-3’(序列号119)，

由使用了KOD-plus-(TOYOBO)的PCR扩增约2.1kbp的DNA片段。

将所得到的片段和上述6.3kbp的DNA片段使用In-Fusion(注册商标)

Advantage PCR Cloning Kit(TAKARA BIO)连接，得到质粒

pDUraRhG-ACS-11。

ACS活性的评价

将用质粒pYE22m、pYE-ACS-5、pYE-ACS-8、pYE-ACS-10、pYE-ACS-11、pYE-ACS-12将酵母EH13-15分别转化而得到的任意2株如下培养。作为预培养，在SC-Trp培养基10ml中接种1白金耳菌体，30℃下振荡培养1天。作为主培养，在SD-Trp培养基100ml中接种1％预培养液，28℃下振荡培养1天。

粗酶液的制备如下进行。用离心分离集菌后水洗，在-80℃暂时保存菌体。将菌体悬浮于Buffer B(50mM磷酸钠buffer(pH6.0)、10％甘油、0.5mM PMSF)5ml中，用弗式压碎器(16kPa、3次)破碎菌体。用1,500xg、4℃离心分离10分钟，将所得到的上清作为粗酶液。

ACS活性的测定按照参考文献(J.B.C.,272(8),1896-4903,1997)中记载的以下顺序进行。反应液含有200mM Tris-HCl(pH7.5)、2.5mM ATP、8mM MgCl₂、2mM EDTA、20mM NaF、0.1％TritonX-100、脂肪酸50μg/ml、50μM CoA、粗酶液(用buffer B适当稀释)100μl，使其为总量500μl，28℃下反应30分钟。反应终止后，添加终止液(异丙醇：n-庚烷：1M硫酸(40：20：1))2.5ml，充分搅拌。进而添加n-庚烷2ml，充分搅拌后离心分离，回收上层。在下层中进一步加入2ml的n-庚烷，同样回收上层。将所回收的上层一同用离心浓缩机干固，作为内标，添加0.2mg/ml的二十三烷酸(23：0)50μl，通过盐酸甲醇法将脂肪酸衍生成甲酯，通过气相色谱进行脂肪酸分析。从所检测出的脂肪酸量中，计算出为形成酰基-CoA而用上述操作分配在下层中的脂肪酸量。结果如以下表中所示。另外，ACS活性用单位粗酶液的蛋白质量中用上述操作分配在下层中的脂肪酸量来表示。对照是指用pYE22m转化的菌株，其他为导入各个基因的表达载体的菌株。

[表7]

表7相对于棕榈酸的ACS活性

以棕榈酸为底物时，MaACS-5、MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12显示出对照的2～4倍左右的ACS活性。

[表8]

表8相对于油酸的ACS活性

以油酸为底物时，MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12显示出对照的2倍左右的ACS活性。

[表9]

表9相对于亚油酸的ACS活性

以亚油酸为底物时，MaACS-5、MaACS-8、MaACS-12显示出对照的数倍(分别为3倍、3倍、6倍左右)的ACS活性，相对于此，MaACS-10和MaACS-11显示出对照的数10倍(分别为40倍、20倍左右)的ACS活性。

[表10]

表10相对于γ亚麻酸的ACS活性

以γ-亚麻酸为底物时，MaACS-5、MaACS-8、MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12均显示出对照的2～10倍左右的ACS活性。

[表11]

表11相对于二高γ-亚麻酸的ACS活性

以二高γ-亚麻酸为底物时，MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12均显示出对照的数10倍(分别为60倍、40倍、30倍)左右的ACS活性。

[表12]

表12相对于花生四烯酸的ACS活性

以花生四烯酸为底物时，MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12显示出数10倍(分别为90倍、30倍、10倍)左右的活性。

如上所述，特别是MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12相对于二高γ-亚麻酸、花生四烯酸等的碳数20的多不饱和脂肪酸的活性高。

使ACS表达的酵母的花生四烯酸摄取活性

将用质粒pYE22m、pYE-ACS-10、pYE-ACS-11、pYE-ACS-12分别转化酵母EH13-15而得到的任意2株如下培养。作为预培养，在SC－Trp 10ml中接种1白金耳，30℃下振荡培养1天。作为主培养，在SC-Trp中，在为使其成为50μg/ml而添加花生四烯酸的培养基10ml中添加预培养的培养物100μl，25℃下振荡培养1天。集菌后冷冻干燥，进行脂肪酸分析，从所添加的花生四烯酸中求出菌体内摄取的花生四烯酸的比例。结果如表14所示。对照为用pYE22m转化的菌株，其他为导入各个基因的表达载体的菌株。

[表13]

表13干燥菌体重量

[表14]

表14菌体内摄取的花生四烯酸的比率

高山被孢霉(M.alpina)转化株的获得

根据国际公开公报WO2005/019437(“脂质生产菌的育种方法”)中记载的方法，将由M.alpina 1S-4株诱变的尿嘧啶缺陷型株Δura－3作为宿主，使用粒子轰击法，使用质粒pDUraRhG-ACS-10和pDUraRhG-ACS-11分别进行转化。转化株的选择中，使用SC琼脂培养基(无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)and硫酸铵(AmmoniumSulfate)(Difco))0.5％、硫酸铵0.17％、葡萄糖2％、腺嘌呤0.002％、酪氨酸0.003％、蛋氨酸0.0001％、精氨酸0.0002％、组氨酸0.0002％、赖氨酸0.0004％、色氨酸0.0004％、苏氨酸0.0005％、异亮氨酸0.0006％、亮氨酸0.0006％、苯丙氨酸0.0006％、琼脂2％)。

转化高山被孢霉(M.alpina)的评价

将所得到的转化株接种于GY培养基4ml中，28℃下振荡培养2天。通过过滤回收菌体，使用RNeasy plant kit(QIAGEN)提取RNA。通过用于RT-PCR的第一链合成试剂盒(SuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR)(invitrogen)合成cDNA。为确认导入的构建物中各基因的表达，通过以下引物的组合进行RT-PCR。

ACS10-RT1：5’-GTCCCGAATGGTTCCT-3’(序列号120)

ACS10-RT2：5’-AGCGGTTTTCTACTTGC-3’(序列号121)

ACS11-RT1：5’-AACTACAACCGCGTCG-3’(序列号122)

ACS11-RT2：5’-CGGCATAAACGCAGAT-3’(序列号123)

在可确认出超表达的菌株中，用各1株在GY培养基(葡萄糖2％、酵母膏1％)10ml中接种，28℃、300rpm振荡培养3天。将这些全部移入GY培养基500ml(2L摇瓶)中，28℃、120rpm振荡培养。从其中，在3天后、7天后、10天后、12天后分别各分取5ml、10ml，将其过滤。将菌体在120℃下干燥，通过盐酸甲醇法将脂肪酸衍生成甲酯，通过气相色谱进行脂肪酸分析。分析单位干燥菌体中的脂肪酸生产量及花生四烯酸生产量的经时变化。另外，将作为转化的宿主的Δura－3株作为对照。结果如图27(MaACS-10)及图28(MaACS-11)所示。

如图27及28所示，使MaACS-10及MaACS-11在高山被孢霉(M.alpina)中超表达时，单位菌体中的脂肪酸量、花生四烯酸量均比对照增加。

通过使本发明的多核苷酸在适合的宿主细胞内表达，可高效生成脂肪酸、特别是多不饱和脂肪酸。通过本发明而在宿主细胞内中生成的脂肪酸可用于食品、化妆品、医药、肥皂等的制造中。

Claims (7)

1.一种多核苷酸，其特征在于，为选自以下(a)和(b)中任一项所述的多核苷酸：

(a)多核苷酸，其由序列号56所示的碱基序列组成；

(b)多核苷酸，编码如下蛋白质，该蛋白质由序列号57所示的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，为DNA。

3.一种蛋白质，其特征在于，由权利要求1或2所述的多核苷酸编码。

4.一种载体，其特征在于，含有权利要求1或2所述的多核苷酸。

5.一种脂质或脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从非人转化体细胞的培养物中提取脂质或脂肪酸组合物，所述非人转化体细胞是导入了权利要求1或2所述的多核苷酸或导入了权利要求4中所述的载体的转化体细胞。

6.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于，所述脂质为三酰甘油。

7.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸为碳数18以上的多不饱和脂肪酸。