CN104387456B - 生物合成吲哚‑3‑乙酸的成套蛋白质及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生物合成吲哚‑3‑乙酸的成套蛋白质及其应用。用于生物合成吲哚‑3‑乙酸的成套蛋白质由吲哚‑3‑乙酸合成相关蛋白A、吲哚‑3‑乙酸合成相关蛋白B和吲哚‑3‑乙酸合成相关蛋白C组成。用于生物合成吲哚‑3‑乙酸的成套基因，由吲哚‑3‑乙酸合成相关基因1、吲哚‑3‑乙酸合成相关基因2和吲哚‑3‑乙酸合成相关基因3组成。将上述成套基因导入解淀粉芽孢杆菌SQR9构建的重组解淀粉芽孢杆菌菌株SQR9‑E、将上述成套基因导入枯草芽孢杆菌168构建的重组枯草芽孢杆菌菌株168‑E的吲哚‑3‑乙酸的产量均高于受体菌株。本发明可以有效提高重组菌株中吲哚‑3‑乙酸的产量。

Description

生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白质及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白质及其应用。
背景技术
吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，简称IAA)是一类含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素，属吲哚类化合物，又名茁长素、生长素、异生长素。现已证实，吲哚-3-乙酸存在于细菌、真菌、藻类和许多高等植物中。在高等植物中,它主要存在于生长旺盛的部位,如胚芽鞘、根尖、受精后的子房和幼嫩的种子等。虽然在植物体内含量甚微,但参与了许多生理生化过程的调节与控制,具有十分广泛的生理作用。从细胞水平看,它可以影响细胞的伸长、分裂和分化；从器官水平看,它可以影响营养器官和生殖器官的生长、成熟和衰老。吲哚-3-乙酸的基本作用在于调节植物的生长，不仅能促进生长，而且具有抑制生长和器官建成的作用。吲哚-3-乙酸在农业生产领域具有广泛的用途，它能促进植物生根，提高农作物产量；用于木本和草本植物的扦插(插枝)生根，以加速根的形成和提高植株生根的百分率。
微生物具有体积小、结构简单、生长繁殖快、代谢旺盛等特征，如能得到高效合成吲哚-3-乙酸的微生物，将为吲哚-3-乙酸的生产提供新的途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何利用微生物合成吲哚-3-乙酸。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白质(用于生物合成吲哚-3-乙酸的蛋白组合物)。
本发明所提供的用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白质(用于生物合成吲哚-3-乙酸的蛋白组合物)，由吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C组成；
所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A为下述A1)或A2)的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；
所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B为下述B1)或B2)的蛋白质：
B1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白质；
B2)在B1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质；
所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C为下述C1)或C2)的蛋白质：
C1)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的蛋白质；
C2)在C1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由C1)衍生的蛋白质。
上述成套蛋白质中，所述成套蛋白质中各种蛋白质分别独立包装。
为解决上述技术问题，本发明还提供了用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套基因(用于生物合成吲哚-3-乙酸的基因组合物)。
本发明所提供的用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套基因，所述成套基因由吲哚-3-乙酸合成相关基因1、吲哚-3-乙酸合成相关基因2和吲哚-3-乙酸合成相关基因3组成；
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A；
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B；
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C。
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1为如下A11)或A12)或A13)所示的核酸分子：
A11)其编码序列是SEQ ID No.1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子；
A12)与A11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A的cDNA分子或基因组DNA分子；
A13)在严格条件下与A11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2为如下B11)或B12)或B13)所示的核酸分子：
B11)其编码序列是SEQ ID No.1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子；
B12)与B11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B的cDNA分子或基因组DNA分子；
B13)在严格条件下与B11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3为如下C11)或C12)或C13)所示的核酸分子：
C11)其编码序列是SEQ ID No.1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子；
C12)与C11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C的cDNA分子或基因组DNA分子；
C13)在严格条件下与C11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C的cDNA分子或基因组DNA分子。
上述成套基因中，所述成套基因中各基因独立包装。
上述成套基因中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的吲哚-3-乙酸合成相关基因1或吲哚-3-乙酸合成相关基因2或吲哚-3-乙酸合成相关基因3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的吲哚-3-乙酸合成相关基因1的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A，或与吲哚-3-乙酸合成相关基因2的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B，或与吲哚-3-乙酸合成相关基因3的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述成套基因中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套基因相关的遗传材料。
本发明所提供的与用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套基因相关的遗传材料，为下述1)至8)中的任一种；所述成套基因由所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3组成；
1)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的表达盒；
2)用于生物合成吲哚-3-乙酸的表达盒组合物，为21)或22)：
21)由21a)、21b)和21c)组成的表达盒组合物：
21a)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的表达盒；
21b)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的表达盒；
21c)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2的表达盒；
22)由22a)、22b)和22c)组成的表达盒组合物：
22a)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的表达盒；
22b)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2的表达盒；
22c)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1的表达盒；
3)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的重组载体；
4)用于生物合成吲哚-3-乙酸的重组载体组合物，为41)或42)：
41)由41a)、41b)和41c)组成的重组载体组合物：
41a)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的重组载体；
41b)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的重组载体；
41c)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2的重组载体；
42)由42a)、42b)和42c)组成的重组载体组合物：
42a)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的重组载体；
42b)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2的重组载体；
42c)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1的重组载体；
5)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的重组微生物；
6)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的转基因植物细胞系；
7)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的转基因植物组织；
8)含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的转基因植物器官。
上述与所述吲哚-3-乙酸合成相关的成套基因相关的遗传材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达相应蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子，如1)所述含有所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C的DNA，该DNA的启动子可为P43启动子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的载体构建含有上述表达盒的重组载体。上述与所述吲哚-3-乙酸合成相关的成套基因的相关遗传材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。上述与所述吲哚-3-乙酸合成相关的成套基因的相关遗传材料中，3)所述重组载体可含有SEQ IDNo.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA；进一步3)所述重组载体具体可为pUBC19-P43-E；所述pUBC19-P43-E为将pUBC19-P43载体的KpnI和PstI识别位点间的序列替换为SEQID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列，保持其它序列不变，得到表达SEQ ID No.3所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、SEQ ID No.4所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和SEQ ID No.5所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质的重组载体。
上述与所述吲哚-3-乙酸合成相关的成套基因的相关遗传材料中，5)所述的微生物可为细菌、酵母、藻或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阳性细菌可为芽孢杆菌属细菌。所述革兰氏阴性细菌可为埃希氏菌属细菌。进一步所述芽孢杆菌属细菌为解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)。所述解淀粉芽孢杆菌可为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168和所述大肠杆菌(Escherichia coli)可为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21。
上述与所述吲哚-3-乙酸合成相关的成套基因的相关遗传材料中，所述遗传材料不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA。
本发明所提供的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，由吲哚-3-乙酸合成相关基因1、吲哚-3-乙酸合成相关基因2和吲哚-3-乙酸合成相关基因3连接而成；所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质。
所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA为如下D1)或D2)或D3)所示的核酸分子：
D1)其核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子
D2)与D1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
D3)在严格条件下与D1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
上述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.1具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上文中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本发明所提供的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA相关的遗传材料，为E1)-E6)中任一种：
E1)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的表达盒；
E2)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的重组载体、或含有E1)所述表达盒的重组载体；
E3)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的重组微生物、或含有E1)所述表达盒的重组微生物、或含有E2)所述重组载体的重组微生物；
E4)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的转基因植物细胞系、或含有E1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有E2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
E5)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的转基因植物组织、或含有E1)所述表达盒的转基因植物组织、或含有E2)所述重组载体的转基因植物组织；
E6)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的转基因植物器官、或含有E1)所述表达盒的转基因植物器官、或含有E2)所述重组载体的转基因植物器官。
所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA相关的遗传材料中，E1)所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A和所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3转录的启动子，还可包括终止所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。具体的，所述启动子可为P43启动子。
可用现有的载体构建含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA表达盒的重组载体。上述与用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA相关遗传材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体的构建方法具体可为将pUBC19-P43载体的KpnI和PstI识别位点间的序列替换为SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列，保持其它序列不变，得到表达SEQ ID No.3所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、SEQ ID No.4所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和SEQ ID No.5所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质的重组载体。
上述与用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA相关遗传材料中，E3)所述的微生物可为细菌、酵母、藻或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阳性细菌可为芽孢杆菌属细菌。所述革兰氏阴性细菌可为埃希氏菌属细菌。进一步所述芽孢杆菌属细菌为解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)。所述解淀粉芽孢杆菌可为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168和所述大肠杆菌(Escherichia coli)可为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21。
上述与用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA相关遗传材料中，所述遗传材料不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Ⅰ-Ⅴ中任一种应用：
Ⅰ、所述的成套蛋白质在生物合成吲哚-3-乙酸中的应用；
Ⅱ、所述的成套基因在生物合成吲哚-3-乙酸中的应用；
Ⅲ、所述的成套基因的相关遗传材料在生物合成吲哚-3-乙酸中的应用；
Ⅳ、所述的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA在生物合成吲哚-3-乙酸中的应用；
Ⅴ、所述的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的相关遗传材料在生物合成吲哚-3-乙酸中的应用。
上文中，序列表中SEQ ID No.1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子(吲哚-3-乙酸合成相关基因1)编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.3的蛋白质(吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A)；序列表中SEQ ID No.1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子(吲哚-3-乙酸合成相关基因2)编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.4的蛋白质(吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B)；序列表中SEQ ID No.1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子(吲哚-3-乙酸合成相关基因3)编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的蛋白质(吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C)；序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子(由吲哚-3-乙酸合成相关基因1、吲哚-3-乙酸合成相关基因2和吲哚-3-乙酸合成相关基因3连接而成)编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.3的蛋白质(吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A)、序列表中SEQ ID No.4的蛋白质(吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B)和序列表中SEQ ID No.5的蛋白质(吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C)这三种蛋白质。
实验证明，将本申请的成套基因导入解淀粉芽孢杆菌SQR9构建的重组解淀粉芽孢杆菌菌株SQR9-E、将本申请的成套基因导入枯草芽孢杆菌168构建的重组枯草芽孢杆菌菌株168-E均能够表达出吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质。SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸的产量是其受体菌株SQR9菌株的4.2倍，是空载体对照菌株SQR9-CK菌株的4倍(SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸产量为42±2.41mg/L发酵液,SQR9菌株的吲哚-3-乙酸产量为9.8±1.31mg/L发酵液，SQR9-CK菌株的吲哚-3-乙酸产量为10.5±1.08mg/L发酵液)；168-E菌株的吲哚-3-乙酸的产量是其受体菌株168菌株的10倍，是空载体对照菌株168-CK菌株的10倍(168-E菌株的吲哚-3-乙酸产量为22±2.32mg/L发酵液,168菌株的吲哚-3-乙酸产量为2.2±0.30mg/L发酵液，168-CK菌株的吲哚-3-乙酸产量为2.2±0.26mg/L发酵液)。本发明的用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白质及其相关生物材料可以有效提高重组菌株中吲哚-3-乙酸的产量，可广泛应用于农业生产领域。
附图说明
图1为重组载体pUBC19-P43-E示意图。
图2为重组菌株蛋白差异分析的变性聚丙烯酰胺凝胶。泳道1和泳道8为蛋白分子量标准15-170KDa的Ladder，泳道2为168-CK菌株蛋白条带，泳道3为168-E菌株蛋白条带，泳道4为BL21-CK菌株蛋白条带，泳道5为BL21-E菌株蛋白条带，泳道6为SQR9-CK菌株蛋白条带，泳道7为SQR9-E菌株蛋白条带。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的解淀粉芽孢杆菌SQR9(Bacillus amyloliquefaciens SQR9)(XuZ,Shao J,Li B,Yan X,Shen Q,Zhang R.2013.Contribution of Baci llomycin D inBacillus amyloliquefaciens SQR9to Antifungal Activity and BiofilmFormation.Appl.Environ.Microbiol.79:808–815.)公众可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。解淀粉芽孢杆菌SQR9(Bacillus amyloliquefaciens SQR9)在下文中简称SQR9。
下述实施例中的枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)(Kunst F,Ogasawara N,Moszer I,etal.1997.The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.Nature 390:249–256.)公众可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)在下文中简称168。
下述实施例中的pUBC19(Zhang X-Z,Cui Z-L,Hong Q,Li S-P.2005.High-LevelExpression and Secretion of Methyl Parathion Hydrolase in Bacillus subtilisWB800.Appl.Environ.Microbiol.71:4101–4103.)公众可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、生物合成吲哚-3-乙酸
一、高产吲哚-3-乙酸的重组菌体细胞的制备
高产吲哚-3-乙酸的重组菌体细胞的构建方法，包括向受体细胞中导入用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，得到产吲哚-3-乙酸的重组菌体细胞的步骤。其中，用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，由吲哚-3-乙酸合成相关基因1、吲哚-3-乙酸合成相关基因2和吲哚-3-乙酸合成相关基因3连接而成；用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1。具体方法如下：
将pUBC19载体的BamHI和PstI识别位点间的序列替换为SEQ ID No.2所示的P43启动子的核苷酸序列保持其它序列不变，得到重组载体pUBC19-P43。
将重组载体pUBC19-P43的KpnI和PstI识别位点间的序列替换为SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列，保持其它序列不变，得到重组载体pUBC19-P43-E(图1)。pUBC19-P43-E可表达SEQ ID No.3所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、SEQ ID No.4所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和SEQ ID No.5所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质。SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA编码SEQ IDNo.3所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、SEQ ID No.4所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和SEQ ID No.5所示的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质。SEQ ID No.1中，第1-1164位为吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A的编码序列，第1165-2586位为吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B的编码序列，第2587-4074位为吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C的编码序列。
采用化学方法将pUBC19-P43-E导入解淀粉芽孢杆菌SQR9菌株中，得到含有SEQ IDNo.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株，将该菌株命名为重组解淀粉芽孢杆菌SQR9-E(下文中简称SQR9-E菌株)；将pUBC19-P43-E导入枯草芽孢杆菌168菌株中，得到含有SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株，将该菌株命名为重组枯草芽孢杆菌168-E(下文中简称168-E菌株)；将pUBC19-P43-E导入大肠杆菌BL21菌株中，得到含有SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株，将该菌株命名为重组大肠杆菌BL21-E(下文中简称BL21-E菌株)；将pUBC19-P43导入解淀粉芽孢杆菌SQR9菌株中，得到不含有SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株，将该菌株命名为重组解淀粉芽孢杆菌SQR9-CK(下文中简称SQR9-CK菌株)，该菌株是SQR9-E的空载体对照菌株；将pUBC19-P43导入枯草芽孢杆菌168菌株中，得到不含有SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株，将该菌株命名为重组枯草芽孢杆菌168-CK(下文中简称168-CK菌株)，该菌株是168-E的空载体对照菌株；将pUBC19-P43导入大肠杆菌BL21菌株中，得到不含有SEQ ID No.1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株，将该菌株命名为重组大肠杆菌BL21-CK(下文中简称BL21-CK菌株)，该菌株是BL21-CK的空载体对照菌株。
二、用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白质的提取及分析
1、不同处理的菌体细胞收集
将步骤一的BL21-CK、BL21-E、168-CK、168-E、SQR9-CK和SQR-E菌株分别接种于含有3mL液体LB培养基的试管(卡那霉素的浓度为20μg/mL)中，过夜培养作为种子液，分别得到BL21-CK、BL21-E、168-CK、168-E、SQR9-CK和SQR-E菌株的种子液。将上述种子液分别以1％体积比的接种量接种于100mL含3mM色氨酸的Landy培养基(在Landy培养基中加入色氨酸，使色氨酸的含量为3mM得到的液体即为含3mM色氨酸的Landy培养基)中(Landy M,Warren GH,RosenmanM SB,Colio LG.1948.Bacillomycin:an antibiotic from Bacillussubtilis active against pathogenic Fungi.Exp.Biol.Med.67:539-541.)，22℃，90rpm避光培养72小时后在4℃，8000g离心收集菌体，分别得到BL21-CK、BL21-E、168-CK、168-E、SQR9-CK和SQR-E菌株的菌体。
2、用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白质的提取
将收集到的菌体用0.2M pH 6.8磷酸缓冲液洗涤，4℃，8000g离心10min收集菌体，共进行上述操作三次。将收集到的菌体采用Bacteria Protein ExtractionReagent(Thermo Scientific)试剂盒提取菌体蛋白。具体流程如下：离心沉淀的菌体用10mL B-PER Reagent重悬，并且加入2μL 100mg/mL溶菌酶；其中BL21-CK和BL21-E菌体置于室温反应10-15min，得到BL21-CK菌体裂解液和BL21-E菌体裂解液；SQR9-CK、SQR9-E、168-CK和168-E菌株置于室温反应45min，得到SQR9-CK菌体裂解液、SQR9-E菌体裂解液、168-CK菌体裂解液和168-E菌体裂解液，将各裂解液15000g离心5min，所获上清液即为菌株的蛋白粗提液，获得BL21-CK蛋白粗提液、BL21-E蛋白粗提液、SQR9-CK蛋白粗提液、SQR9-E蛋白粗提液、168-CK蛋白粗提液和168-E蛋白粗提液。将各菌株的蛋白粗提液置于-70℃冰箱中保存。
3、BCA法测定蛋白总量
蛋白定量采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国生物技术有限责任公司)，具体流程如下：根据标准品和样品的数量，将试剂A(BCA碱性溶液)和试剂B(硫酸铜溶液)以50：1(V/V)的比例混合配制BCA工作液；将0、1、2、4、6、8、10μL的标准BSA蛋白溶液(1mg/mL)分别加入96孔板的不同孔中，并加ddH2O使得每孔的体积为10μL，每个浓度设置3个复孔。分别取10μL稀释的待测蛋白样品加入96孔板的不同孔中，每个样品设置3个复孔。向BSA蛋白标准品孔和待测样品孔中每孔分别加入200μL配置好的BCA工作液，充分混匀后于37℃反应30min，反应结束后将96孔板冷却至室温，采用酶标仪测定各样品的吸光度OD562。以BSA蛋白标准品浓度作为横坐标，吸光度值作为纵坐标制作标准曲线。根据标准曲线，计算各样品的蛋白质含量。
4、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE凝胶制备：先灌制浓度为10％的分离胶，浓度为10％的分离胶包含5.3mL30％Acr/Bis(29:1)贮存液、4.0mL下层缓冲液、0.8mL 10％APS、0.008mL TEMED和6.7mL去离子水，分离胶灌好后置于37℃凝固30min；待分离胶凝固后灌制浓度为5％的浓缩胶，浓度为5％的浓缩胶包含0.75mL 30％Acr/Bis(29:1)贮存液、1.25mL上层缓冲液、0.015mL 10％APS、0.005mL TEMED和3.0mL去离子水，浓缩胶灌好后置于室温凝结15-20min。
在电泳槽内加入新鲜配置的1×电极缓冲液。根据待测蛋白浓度取适量的待测蛋白样品，加入10μL样品缓冲液混合均匀，然后去离子水补齐至30μL，各个样品的蛋白质质量浓度均相同，将样品进行沸水浴5min，14000rpm离心5min后上样，每个泳道的上样体积均相同。首先采用80V的电压使样品先从浓缩胶迁移至分离胶，随后采用100V的电压使得样品跑至分离胶底部。
凝胶的染色及脱色：电泳结束后，将凝胶从玻璃板上轻轻拨下，放入已加入适量固定液的干净玻璃皿内，固定30min，固定结束后倒出固定液加入适量考马氏亮蓝R-250染色液，震荡染色1h，然后倒出染色液加入脱色液进行震荡脱色，每隔10min更换脱色液，重复脱色洗脱四次，之后加脱色液连续脱色4-8h，期间更换脱色液3-4次，脱色完全后进行扫描拍照。
吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A的分子量为43KDa，吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B的分子量为53KDa和吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C的分子量为54KDa，图2中显示含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株BL21-E、SQR9-E和168-E均能够表达出吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C。相对于不含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株，含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株BL21-E、SQR9-E和168-E表达出的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C的含量均明显增多，168-E菌株蛋白条带中在约43KDa处明显比168-CK菌株增强，而由于菌株在55KDa大小的蛋白很多，只能推测168-E菌株与168-CK菌株相比能更多的表达55KDa左右的蛋白；与BL21-CK菌株相比，在菌株BL21-E蛋白条带中能清晰分辨出在43KDa、54KDa和53KDa大小处条带增强；在SQR9-E菌株蛋白条带中可清晰分辨出在43KDa、54KDa和53KDa大小处条带比SQR9-CK菌株蛋白条带增强。
三、吲哚-3-乙酸产量检测
将SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌株分别接种于含有3mL液体LB培养基的试管(卡那霉素的浓度为20μg/mL)中，过夜培养作为种子液，分别得到SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌株的种子液。将上述种子液分别以1％体积比的接种量接种于100mL含3mM色氨酸的Landy培养基(在Landy培养基中加入色氨酸，使色氨酸的含量为3mM得到的液体即为含3mM色氨酸的Landy培养基)中，SQR9菌株、SQR9-E菌株和SQR9-CK菌株的接种量以菌体含量计相同，168菌株、168-E菌株和168-CK菌株的接种量以菌体含量计相同。在22℃，90rpm避光培养72小时，分别得到SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168-E菌株和168-CK菌株的发酵液。实验设三次重复，每次重复每个菌株均接入10个装有100mL含3mM色氨酸的Landy培养基的容积为500mL三角瓶在上述条件下进行发酵。
分别将各菌株的100mL发酵液在4℃，8000rpm离心10min去除菌体细胞，收集SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌株的上清液。将各菌株的上清液分别倒入不同的无菌三角瓶中，用2M HCl溶液调节各菌株的上清液pH值至2.0，然后加入与上述三角瓶中等体积的乙酸乙酯萃取三次，萃取结束后8000rpm，4℃离心10min，将各菌株的乙酸乙酯相37℃旋转蒸发获得旋转蒸发后的样品。将各菌株的旋转蒸发后的样品分别用1mL甲醇溶解，过0.22μm滤膜，放入-20℃冰箱保存。甲醇溶解的样品采用HPLC进行定量分析，HPLC的分析条件为：采用Agilent TC-C18色谱柱，柱温25℃，流动相为A(甲醇)和B(0.1％乙酸)的体积比为60：40，进样量为10μL，流速为0.4mL/min，紫外吸收波长为220nm。HPLC分析中，以吲哚-3-乙酸(Sigma，CAS NO:87-51-4)为标准品，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析。
试验所有数据采用SPSS12.0(SPSS Inc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。
不同菌株的吲哚-3-乙酸产量如表1，结果表明含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重组菌株SQR9-E和168-E中吲哚-3-乙酸的产量均高于每株相应的受体菌株和空载体对照菌株。SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸产量是SQR9菌株的4.2倍，是SQR9-CK菌株的4倍(SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸产量为42±2.41mg/L发酵液,SQR9菌株的吲哚-3-乙酸产量为9.8±1.31mg/L发酵液，SQR9-CK菌株的吲哚-3-乙酸产量为10.5±1.08mg/L发酵液)；168-E菌株合成吲哚-3-乙酸的产量是168菌株的10倍，是168-CK菌株的10倍(168-E菌株的吲哚-3-乙酸产量为22±2.32mg/L发酵液,168菌株的吲哚-3-乙酸产量为2.2±0.30mg/L发酵液，168-CK菌株的吲哚-3-乙酸产量为2.2±0.26mg/L发酵液)。
表1、各菌株的吲哚-3-乙酸产量
注：各列数值后面的英文字母表示差异显著程度，相同字母的处理间在0.05水平无显著差异，字母不同的处理间在0.05水平有显著差异。

Claims (8)

1.用于制备吲哚-3-乙酸的成套蛋白质，所述成套蛋白质由吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C组成；
所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A为下述A1)的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B为下述B1)的蛋白质：
B1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白质；
所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C为下述C1)的蛋白质：
C1)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的蛋白质。
2.用于制备吲哚-3-乙酸的成套基因，所述成套基因由吲哚-3-乙酸合成相关基因1、吲哚-3-乙酸合成相关基因2和吲哚-3-乙酸合成相关基因3组成；
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1编码权利要求1中所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A；
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2编码权利要求1中所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B；
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3编码权利要求1中所述吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C。
3.根据权利要求2所述的成套基因，其特征在于：所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1为如下A11)所示的核酸分子：
A11)其编码序列是SEQ ID No.1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子；
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2为如下B11)所示的核酸分子：
B11)其编码序列是SEQ ID No.1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子；
所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3为如下C11)所示的核酸分子：
C11)其编码序列是SEQ ID No.1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子。
4.用于制备吲哚-3-乙酸的成套基因的相关遗传材料，为下述1)至5)中的任一种；所述成套基因由权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3组成；
1)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的表达盒；
2)用于制备吲哚-3-乙酸的表达盒组合物，为21)或22)：
21)由21a)、21b)和21c)组成的表达盒组合物：
21a)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的表达盒；
21b)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的表达盒；
21c)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2的表达盒；
22)由22a)、22b)和22c)组成的表达盒组合物：
22a)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的表达盒；
22b)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2的表达盒；
22c)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1的表达盒；
3)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的重组表达载体；
4)用于制备吲哚-3-乙酸的重组载体组合物，为41)或42)：
41)由41a)、41b)和41c)组成的重组载体组合物：
41a)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的重组载体；
41b)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的重组载体；
41c)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2的重组载体；
42)由42a)、42b)和42c)组成的重组载体组合物：
42a)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的重组载体；
42b)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2的重组载体；
42c)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3不含权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1的重组载体；
5)含有权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因1、权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因2和权利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相关基因3的重组微生物。
5.用于制备吲哚-3-乙酸的DNA，由吲哚-3-乙酸合成相关基因1、吲哚-3-乙酸合成相关基因2和吲哚-3-乙酸合成相关基因3连接而成；所述用于制备吲哚-3-乙酸的DNA编码权利要求1中所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白A、权利要求1中所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白B和权利要求1中所述的吲哚-3-乙酸合成相关蛋白C这三种蛋白质。
6.根据权利要求5所述的用于制备吲哚-3-乙酸的DNA，其特征在于：所述用于制备吲哚-3-乙酸的DNA为核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子。
7.权利要求5或6所述用于制备吲哚-3-乙酸的DNA的相关遗传材料，为E1)-E3)中任一种：
E1)含有权利要求5或6所述用于制备吲哚-3-乙酸的DNA的表达盒；
E2)含有权利要求5或6所述用于制备吲哚-3-乙酸的DNA的重组载体、或含有E1)所述表达盒的重组载体；
E3)含有权利要求5或6所述用于制备吲哚-3-乙酸的DNA的重组微生物、或含有E1)所述表达盒的重组微生物、或含有E2)所述重组载体的重组微生物。
8.下述Ⅰ-Ⅴ中任一种应用：
Ⅰ、权利要求1所述的成套蛋白质在制备吲哚-3-乙酸中的应用；
Ⅱ、权利要求2或3所述的成套基因在制备吲哚-3-乙酸中的应用；
Ⅲ、权利要求4所述的成套基因的相关遗传材料在制备吲哚-3-乙酸中的应用；
Ⅳ、权利要求5或6所述的用于制备吲哚-3-乙酸的DNA在制备吲哚-3-乙酸中的应用；
Ⅴ、权利要求7所述的用于制备吲哚-3-乙酸的DNA的相关遗传材料在制备吲哚-3-乙酸中的应用。
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解淀粉芽孢杆菌SQR9吲哚乙酸合成途径及促生效应的研究;邵佳慧;《中国博士论文全文数据库》;20161231;全文 *

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