CN104381253B

CN104381253B - 含苯肼叉间二酮类化合物在蓝藻生长抑制中的应用

Info

Publication number: CN104381253B
Application number: CN201410665180.5A
Authority: CN
Inventors: 万坚; 任彦亮; 朱秀云; 韩新亚; 祝帅华; 彭浩; 冯玲玲; 李定
Original assignee: Huazhong Normal University
Current assignee: Huazhong Normal University
Priority date: 2014-11-19
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2034-11-19
Also published as: CN104381253A

Abstract

本发明涉及提供一类含苯肼叉间二酮类化合物在蓝藻生长抑制中的应用。含苯肼叉间二酮类化合物结构如通式Ⅰ所示：通式Ⅰ中R¹代表羟基；R₂，R₃，R₄代表氢、硝基、羧基或者磺酸基；R₂，R₃，R₄代表的取代基相同或者不相同；R₅、R₆代表甲基、三氟甲基或者乙氧基；R₅、R₆代表的取代基相同或者不同。通式I所述结构的含苯肼叉间二羰基类化合物对蓝藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶具有较好的抑制效果，可用于蓝藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的抑制；对蓝藻有较好的抑制作用，可作为杀藻剂的有效成份。

Description

含苯肼叉间二酮类化合物在蓝藻生长抑制中的应用

技术领域

本发明涉及含苯肼叉间二酮类化合物在蓝藻生长抑制中的应用。

背景技术

近年来随着人类生活生产垃圾的大量产生，水体的富营养化越来越严重，大量的蓝藻频繁暴发，也被称为水华现象。蓝藻水华暴发后，水体含氧量少，鱼类会大面积死亡，对鱼类生产非常不利，对人类的健康生活也造成了很大的影响。因此如何治理蓝藻水华成为人们亟待解决的问题。探索、发现不仅具有新结构，而且具有新靶标的农药活性化合物，是目前新农药创制研究关注的焦点。研究表明，果糖1,6-二磷酸醛缩酶是蓝藻的卡尔文循环和糖质新生代谢过程中必不可少的一个关键调控酶，若蓝藻果糖1,6-二磷酸醛缩酶受到抑制或被突变，将导致蓝藻无法生长。

发明内容

本发明目的在于提供一类含苯肼叉间二酮类化合物在蓝藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性抑制及蓝藻生长抑制中的应用。

本发明提供了通式Ⅰ表示的含苯肼叉间二酮类化合物在蓝藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性抑制中的应用，其具有通式I所示的结构：

通式Ⅰ中R¹代表羟基；R₂，R₃，R₄代表氢、硝基、羧基或者磺酸基；R₂，R₃，R₄代表的取代基相同或者不相同；R₅、R₆代表甲基、三氟甲基或者乙氧基；R₅、R₆代表的取代基相同或者不同。

按上述方案，所述的通式Ⅰ化合物中R₂，R₃，R₄中至少一个不为氢。

本发明还提供了通式Ⅰ表示的含苯肼叉间二酮类化合物在蓝藻生长抑制中的应用，其具有通式I所示的结构：

以通式I表示的含苯肼叉间二羰基类化合物的制备方法，是使通式Ⅱ所表示的化合物在强酸性介质中于0～5℃和NaNO₂经重氮化反应得到重氮盐体系化合物III，然后在碱性条件下和二酮类化合物R₅COCH₂COR₆反应得到化合物I。

其中：R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆的定义与式Ⅰ化合物中定义相同。

按上述方案，所述重氮盐体系化合物III和二酮类化合物R₅COCH₂COR₆反应时控制体系的PH值控制为8-12范围。

按上述方案，所述具体制备方法如下：将通式Ⅱ所表示的化合物II加碱溶解后，加入亚硝酸钠，在0～5℃下滴加浓盐酸进行重氮化反应得重氮盐体系，然后将二酮类化合物R₅COCH₂COR₆加入氢氧化钠的水溶液及乙醇的混合溶液中，在0～5℃下滴加重氮盐体系，加完后用浓盐酸酸化抽滤，用乙醇洗涤，干燥即得。

按上述方案，所述碱的浓度为0.1-0.8mol/L。

按上述方案，所述加入的氢氧化钠的水溶液及乙醇的混合溶液控制使加入重氮盐体系后的体系PH值控制在8-12范围。

本发明的有益效果：

本发明提供的具有通式I所述结构的含苯肼叉间二羰基类化合物对蓝藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶具有较好的抑制效果，可用于蓝藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的抑制。蓝藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶酶体实验表明：此类化合物对蓝藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶有较好的抑制效果。

蓝藻生长抑制实验表明：本发明提供的具有通式I所述结构的含苯肼叉间二羰基类化合对蓝藻有较好的抑制作用，可作为杀藻剂的有效成份。

具体实施方式

下面通过实施例1来具体地说明本发明的I式化合物的制备方法。

实施例1

化合物I-1

3-(2-(2-羟基-4-硝基苯基)肼叉基)-2,4-戊二酮的制备

称取0.77g2-氨基-4-硝基苯酚溶于10mL0.5mol/L的NaOH溶液中，磁力搅拌，，加入0.35gNaNO₂固体，冰水浴控制温度在0～5℃，滴加1mL浓HCl使其反应生成重氮盐体系；将0.5mL乙酰丙酮加入到5mL0.5mol/L的NaOH溶液和5mL乙醇的混合体系中，控制温度在0～5℃，滴加重氮盐体系，用浓盐酸酸化抽滤，用乙醇洗涤，烘干，得到橘红色片状固体粗产物，粗产率为85％。

分子式：C₁₁H₁₁N₃O₅

¹HNMR(400MHz,acetone)δ14.41(s,1H),10.31(s,1H),8.01–7.89(m,2H),7.86(d,1H),2.63–2.53(s,3H),2.53–2.45(s,3H).

MS(ESI)：m/z＝265.12

化合物2-10均按化合物1类似的方法制备

化合物I-2

3-(2-(2-羟基-5-硝基苯基)肼叉基)-2,4-戊二酮

所得产品为橘红色粉末，产率为80％

分子式：C₁₁H₁₁N₃O₅

¹HNMR(400MHz,acetone)δ14.71(s,1H),8.45(d,J＝2.9Hz,1H),7.94(dd,J＝9.1,2.9Hz,1H),6.97(d,J＝9.1Hz,1H),2.57–2.52(s,3H),2.51(s,3H).

MS(ESI)：m/z＝265.13

化合物I-3

1,1,1,5,5,5-六氟-3-(2-(2-羟基-4-硝基苯基)亚肼基)戊烷-2,4-二酮

所得产品为黑色粉末，产率约为50％

分子式：C₁₁H₅F₆N₃O₅

¹HNMR(400MHz,dmso)δ10.61(s,1H),7.74(s,1H),7.72(d,J＝2.2Hz,1H),7.47(d,J＝8.2Hz,1H).

化合物I-4

4,4,4-三氟-2-(2-(2-羟基-4-硝基苯基)肼叉基)3-氧代丁酸乙酯

所得产品为黑色粉末，产率为55％

分子式：C₁₂H₁₀F₃N₃O₆

¹HNMR(400MHz,dmso)δ13.29(s,1H),11.77(s,1H),7.59(d,J＝9.0Hz,1H),7.28(s,1H),6.90(d,J＝9.5Hz,1H),4.36(dd,J＝14.2,7.0Hz,2H),1.33(t,J＝7.1Hz,3H).

MS(ESI)：m/z＝337.04

化合物I-5

3-(2-(1,1,1,5,5,5-六氟-2,4-二氧代戊烷基-3-叉)肼基)-2-羟基-5-硝基苯磺酸

所得产品为黑色粉末，产率为35％

分子式：C₁₁H₅F₆N₃O₈S

¹HNMR(400MHz,dmso)δ12.06(s,1H),9.11(s,1H),8.42(s,1H),8.26(s,1H).

化合物I-6

3-(2-(1-乙氧基-4，4，4-三氟-1，3-二氧代丁-2-叉)肼基)-4-羟基苯甲酸

所得产品为棕黑色粉末，产率约为45％

化学式：C₁₃H₁₁F₃N₂O₆

¹HNMR(400MHz,dmso)δ13.43(s,1H),12.15(s,1H),11.65(s,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,1H),7.73(d,J＝8.2Hz,1H),7.10(dd,J＝13.1,8.6Hz,1H),4.37(dd,J＝17.0,7.6Hz,2H),1.39–1.28(m,3H).

化合物I-7

4,4,4-三氟-2-(2-(2-羟基-5-硝基苯基)肼)-3-氧代丁酸乙酯

所得产品为红棕色粉末，产率约为75％

化学式：C₁₂H₁₀F₃N₃O₆

¹HNMR(400MHz,dmso)δ15.19(s,1H),8.49(s,1H),8.17(d,J＝8.5Hz,1H),7.22(d,J＝8.9Hz,1H),4.41(d,J＝6.7Hz,2H),1.38(t,J＝7.0Hz,3H).

化合物I-8

3-(2-(1-乙氧基-4,4,4-三氟-1,3-二氧代丁-2-亚基)肼)-2-羟基-5-硝基苯磺酸

所得产品为深红色粉末，产率约为50％

分子式：C₁₂H₁₀F₃N₃O₉S

¹HNMR(400MHz,dmso)δ15.13(s,1H),13.23(s,1H),12.31–12.09(s,1H),8.50(d,1H),8.29(d,1H),4.47–4.34(q,2H),1.36(t,3H).

化合物I-9

1,1,1,5,5,5-六氟-3-(2-(2-羟基-5-硝基苯基)肼叉基)-2,4,-戊二酮

所得纯品为土红色粉末，产率为75％

分子式：C₁₁H₅F₆N₃O₅

¹HNMR(400MHz,dmso)δ8.98(d,J＝9.7Hz,1H),8.05(dd,J＝11.3,1.9Hz,1H),6.59(d,J＝10.1Hz,1H).

化合物I-10

3-(2-(1,1,1,5,5,5-六氟-2,4-二氧代戊烷基-3-叉)肼基)-4-羟基苯甲酸

所得产品为红色粉末，产率为65％

分子式：C₁₂H₆F₆N₂O₅

¹HNMR(400MHz,dmso)δ12.75(s,1H),8.37(s,1H),7.74(d,J＝9.7Hz,1H),6.51(d,J＝9.7Hz,1H).

下面通过实施例2、3来具体地说明本发明的I式化合物对果糖1,6-二磷酸醛缩酶活性和蓝藻生长有较好的抑制作用。

实施例2

对以上合成的10种化合物进行蓝藻果糖1,6-二磷酸醛缩酶酶体抑制试验。果糖-1，6-二磷酸醛缩酶能可逆的将果糖-1，6-二磷酸分解为二羟丙酮磷酸和3-磷酸甘油醛。在磷酸丙糖异构酶(TIM)作用下，二羟丙酮磷酸可以转化为3-磷酸甘油醛。最后，3-磷酸甘油醛在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的作用下转化为3-磷酸甘油，同时将两分子的NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)转化为NAD+。因此可以通过测定NADH在340nm处的吸光值变化来测定果糖-1，6-二磷酸醛缩酶的活性，进而反应出上述合成的10种化合物作抑制剂的抑制效率。实验过程：将反应混合物(190ul)配制在96-孔板上，其中含有100mM甘氨酰甘氨酸缓冲(PH7.4)、200mM醋酸钾、NADH(0.3mM),GPDH(0.26U),TIM(1U)、果糖1,6-二磷酸醛缩酶(4mU)，抑制剂浓度在一定范围内变化，通过加入合适浓度的底物开始反应，酶标仪(35℃)340nm处监测6分钟。测试结果见表1。

实施例3

对以上合成的10种化合物进行集胞藻PCC6803藻体水平生长抑制试验。集胞藻PCC6803是蓝藻中最主要的一种模式藻类，而且其毒性危害性最大，因此选择集胞藻PCC6803作为活体实验对象。集胞藻PCC6803培养于含不同浓度化合物的BG-11(+N)液体培养基中，在人工气候培养箱中培养。控制培养箱温度为28℃±1℃，湿度60％，光强为6000lx，12h(光照):12h(黑暗)，振动模式，另每日人工摇3次。

具体操作如下：

1、预培养一批集胞藻PCC6803，待生长4-7天到对数期后，测OD680，接种待用；

2、用新鲜的BG-11(+N)培养基稀释上述对数期藻液，获得接种藻液，并控制藻细胞浓度约1×10⁶个/mL；

3、预先称量化合物，用DMSO溶解，配制不同浓度的化合物。向96孔板中的每个孔中加入200μL稀释好的接种藻液，然后再加入1μL一定浓度的化合物。每个浓度的化合物平行做5组，同时设置不含化合物的空白对照(藻液体系中加入DMSO)和化合物背景对照(用DMSO溶解配制的化合物体系)；

4、在人工气候培养箱中培养7天后用酶标仪测OD680，计算不同浓度化合物的抑制率；

抑制率计算公式：

生长抑制率＝[空白对照组OD680-(实验组OD680-化合物背景对照组OD680)]×100/空白对照组OD680；

5、以化合物的浓度为横坐标，生长抑制率为纵坐标作图，在Origin里用公式logistic拟合，求得10种化合物的EC₅₀值。结果列于表1。

表1通式I的化合物对果糖-1，6-二磷酸醛缩酶抑制IC50值和蓝藻抑制的EC₅₀值

化合物

R₁

R₂

R₃

R₄

R₅

R₆

I₅₀(μM)

EC₅₀(μM)

I-1

OH

H

NO₂

H

CH₃

16.5±6.0

6.3±0.5

I-2

OH

H

NO₂

CH₃

98.6±7.2

10.2±1.1

I-3

OH

H

NO₂

H

CF₃

1.4±0.2

2.0±0.3

I-4

OH

H

NO₂

H

CF₃

C₂H₅O

2.5±0.2

36.2±4.7

I-5

OH

SO₃H

H

NO₂

CF₃

0.1±0.01

50.9±3.3

I-6

OH

H

COOH

CF₃

C₂H₅O

7.4±0.4

80.7±17.2

I-7

OH

H

NO₂

CF₃

C₂H₅O

1.9±0.1

2.0±0.4

I-8

OH

SO₃H

H

NO₂

CF₃

C₂H₅O

0.3±0.03

27.8±1.7

I-9

OH

H

NO₂

CF₃

2.4±0.3

2.3±0.4

I-10

OH

H

COOH

CF₃

9.0±0.6

61.3±4.9

Claims

1.通式Ⅰ表示的含苯肼叉间二酮类化合物在蓝藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性抑制中的应用，其特征在于：具有通式I所示的结构：

通式Ⅰ中

R₁代表羟基；R₂，R₄代表氢、R₃代表硝基；R₅、R₆代表甲基；

或R₁代表羟基；R₂，R₃代表氢、R₄代表硝基；R₅、R₆代表甲基；

或R₁代表羟基；R₂，R₄代表氢、R₃代表硝基；R₅、R₆代表三氟甲基；

或R₁代表羟基；R₂，R₄代表氢、R₃代表硝基；R₅代表三氟甲基、R₆代表乙基；

或R₁代表羟基；R₂代表磺酸基，R₃代表氢、R₄代表硝基；R₅、R₆代表三氟甲基；

或R₁代表羟基；R₂，R₃代表氢、R₄代表羧基；R₅代表三氟甲基、R₆代表乙基；

或R₁代表羟基；R₂，R₃代表氢、R₄代表硝基；R₅代表三氟甲基、R₆代表乙基；

或R₁代表羟基；R₂代表磺酸基，R₃代表氢、R₄代表硝基，R₅代表三氟甲基、R₆代表乙基；

或R₁代表羟基；R₂，R₃代表氢、R₄代表硝基；R₅、R₆代表三氟甲基；

或R₁代表羟基；R₂，R₃代表氢、R₄代表羧基；R₅、R₆代表三氟甲基；

2.通式Ⅰ表示的含苯肼叉间二酮类化合物在蓝藻生长抑制中的应用，其特征在于：具有通式I所示的结构：

通式Ⅰ中R_1，R₂，R₃，R₄，R₅、R₆的定义与权利要求1相同。