CN104374724A

CN104374724A - 一种使用菠萝蛋白酶检测重金属汞的方法

Info

Publication number: CN104374724A
Application number: CN201410682381.6A
Authority: CN
Inventors: 熊开胜; 张海防; 谢建庭
Original assignee: DONGCHEN-LEADER TESTING Co Ltd
Current assignee: DONGCHEN-LEADER TESTING Co Ltd
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2015-02-25

Abstract

本发明属于重金属检测领域，涉及一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，所述的方法的步骤包括如下：配置含菠萝蛋白酶的缓冲溶液，并调节其pH，将菠萝蛋白酶和待测金属溶液室温震荡混合，加入底物蛋白溶液，用考马斯亮蓝法并通过用酶标仪检测定底物蛋白的含量，确定其金属的含量。本发明使用菠萝蛋白酶对重金属进行了定性和定量的测定分析，方便早期快速检测及后期的浓度定量检测，具有操作简便、快速及经济的优点。可以有效的提高蛋白酶的水解底物蛋白的灵敏度，提高测定准确度，具有更加实用的应用价值。

Description

一种使用菠萝蛋白酶检测重金属汞的方法

技术领域

本发明涉及重金属污染检测领域，涉及一种重金属汞的检测方法，具体是涉及一种使用菠萝蛋白酶检测重金属汞的方法。

背景技术

汞是水环境中毒性最强污染最广泛的重金属，汞的化合物大多都能溶于水，且有很强的毒性，汞的无机化合物在环境中微生物作用下，可转化为有机汞，也可以通过生物体富集，而在生物体内转化成有机汞，如甲基汞、二甲基汞等，对人体危害大。

水中汞污染的主要来源是氯碱、塑料、电池、电子等工业排放的废水和废旧器械。随着工业的发展，尤其是电子行业的快速发展，汞的排放量日益攀升，严重威胁到人们的健康。汞检测的国标方法主要有气相色谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法等，然而这些方法不仅检测仪器昂贵且对操作人员技术要求高，不适用广泛应用，为了顺应市场的需求，提供一种新型快速简单的检测重金属汞的方法。

酶抑制法因其操作方便、快速、经济等优点，已备受国内外研究者的关注。目前，重金属检测抑制的酶主要有，脲酶，磷酸酯酶、脱氢酶及木瓜蛋白酶等。

菠萝蛋白酶，是从菠萝果茎、叶、皮提取出来得到的一种纯天然植物蛋白酶，属巯基蛋白酶，不是一种单一成份的酶，由各种不同分子量和分子结构的酶系组成，除了蛋白水解酶系外，还含有过氧化物酶、磷酸酯酶等，产品已被广泛应用于食品、医药等行业。而对于菠萝蛋白酶检测重金属的报道国内目前没有。

发明内容

要解决的技术问题：常规的用于重金属汞的检测方法多为气相色谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法等，然而这些方法不仅检测仪器昂贵且对操作人员技术要求高，不适用广泛应用，本发明目的在于提供一种新的使用菠萝蛋白酶检测重金属汞的方法。

技术方案：为了实现本发明的上述目的，本发明公开了一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，所述的方法的步骤包括如下：配置含菠萝蛋白酶的缓冲溶液，并调节其pH，将菠萝蛋白酶和待测金属溶液室温震荡混合，加入底物蛋白溶液，用考马斯亮蓝法并通过用酶标仪检测定底物蛋白的含量，确定其金属的含量。

优选的，所述的一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，所述的菠萝蛋白酶溶液的浓度为1 mg/mL-20 mg/mL。

优选的，所述的一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，所述的缓冲溶液为磷酸、乳酸或硼酸中的一种。

优选的，所述的一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，所述的菠萝蛋白酶-缓冲溶液的pH为4-10。

优选的，所述的一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，所述的待测金属浓度为0.1mg/L-10 mg/L。

优选的，所述的一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，所述的底物蛋白为酪蛋白或明胶中的一种。

优选的，所述一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，所述的底物蛋白含量为0.1%-1.0%。

本发明属于生物技术中的酶分析法，利用重金属对菠萝蛋白酶活性抑制作用降低底物蛋白的水解，通过检测底物蛋白的含量定性检测重金属的存在，通过梯度实验根据金属含量-蛋白质浓度曲线定量分析重金属的含量。

有益效果：本发明使用菠萝蛋白酶对重金属进行了定性和定量的测定分析，方便早期快速检测及后期的浓度定量检测，具有操作简便、快速及经济的优点。菠萝蛋白酶中除了蛋白水解酶系外，还含有过氧化物酶、磷酸酯酶等多种活性酶，且菠萝蛋白酶具有高水解活性，其水解蛋白活性是木瓜蛋白酶的10倍以上，可以有效的提高蛋白酶的水解底物蛋白的灵敏度，提高测定准确度，具有更加实用的应用价值。

具体实施方式

下面对本发明实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1

准确称取菠萝蛋白酶并溶于磷酸缓冲溶液中，调节pH至7.5，配置成1 mg/mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液；精确吸取1 mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液和0.2 mL，0.5 mg/mL金属溶液（或等量的蒸馏水作为空白对照）并混合均匀，吸取0.6 mL室温保温30 min的 0.2% 酪蛋白溶液加入混合溶液中，混合均匀得到混合溶液A。马上吸取0.2 mL A溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液（G-250），震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值A1。剩余的A溶液置于35℃下保温，20 min后再吸取0.2 mL A溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液，震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值A2。对照组的吸光度值分别为A1-0和A2-0。

实施例2

准确称取菠萝蛋白酶并溶于乳酸缓冲溶液中，调节pH至10，配置成5 mg/mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液；精确吸取1 mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液和0.2 mL，5.0 mg/mL溶液（或等量的蒸馏水作为空白对照）并混合均匀，吸取0.4 mL室温保温30 min的 0.6% 酪蛋白溶液加入混合溶液中，混合均匀得到混合溶液B。马上吸取0.2 mL B溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液（G-250），震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值B1。剩余的B溶液置于35℃下保温，20 min后再吸取0.2 mL B溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液，震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值B2。对照组的吸光度值分别为B1-0和B2-0。

实施例3

准确称取菠萝蛋白酶并溶于硼酸缓冲溶液中，调节pH至4.0，配置成20 mg/mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液；精确吸取1 mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液和0.2 mL， 10 mg/mL溶液（或等量的蒸馏水作为空白对照）并混合均匀，吸取0.5 mL室温保温30 min的 1.0% 酪蛋白溶液加入混合溶液中，混合均匀得到混合溶液B。马上吸取0.2 mL C溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液（G-250），震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值C1。剩余的C溶液置于35℃下保温，20 min后再吸取0.2 mL C溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液，震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值C2。对照组的吸光度值分别为C1-0和C2-0。

实施例4

准确称取菠萝蛋白酶并溶于磷酸缓冲溶液中，调节pH至6.0，配置成5 mg/mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液；精确吸取1 mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液和0.2 mL，4 mg/mL金属溶液（或等量的蒸馏水作为空白对照）并混合均匀，吸取0.6 mL室温保温30 min的 0.6% 酪蛋白溶液加入混合溶液中，混合均匀得到混合溶液D。马上吸取0.2 mL D溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液（G-250），震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值D1。剩余的D溶液置于35℃下保温，20 min后再吸取0.2 mL D溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液，震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值D2。对照组的吸光度值分别为D1-0和D2-0。

实施例5

准确称取菠萝蛋白酶并溶于硼酸缓冲溶液中，调节pH至6.0，配置成5 mg/mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液；精确吸取1 mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液和0.2 mL，3 mg/mL金属溶液（或等量的蒸馏水作为空白对照）并混合均匀，吸取0.8 mL室温保温30 min的 0.6% 酪蛋白溶液加入混合溶液中，混合均匀得到混合溶液E。马上吸取0.2 mL E溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液（G-250），震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值E1。剩余的E溶液置于35℃下保温，20 min后再吸取0.2 mL E溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液，震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值E2。对照组的吸光度值分别为E1-0和E2-0。

实施例6

准确称取菠萝蛋白酶并溶于磷酸缓冲溶液中，调节pH至7.9，配置成4 mg/mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液；精确吸取1 mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液和0.2 mL，2 mg/mL金属溶液（或等量的蒸馏水作为空白对照）并混合均匀，吸取0.6 mL室温保温30 min的 0.6% 明胶溶液加入混合溶液中，混合均匀得到混合溶液F。马上吸取0.2 mL F溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液（G-250），震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值F1。剩余的F溶液置于35℃下保温，20 min后再吸取0.2 mL F溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液，震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值F2。对照组的吸光度值分别为F1-0和F2-0。

实施例7

准确称取菠萝蛋白酶并溶于磷酸缓冲溶液中，调节pH至7.9，配置成4 mg/mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液；精确吸取1 mL菠萝蛋白酶-缓冲溶液，与0.2 mL，金属溶液浓度分别为0 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL及10 mg/mL金属溶液并混合均匀，吸取0.6 mL室温保温30 min的 0.6% 酪蛋白溶液加入混合溶液中，混合均匀得到混合溶液，分别标记为G1-G6。马上吸取0.2 mL的G1-G6溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液（G-250），震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值G1-G6。剩余的G1-G6溶液置于35℃下保温，20 min后再吸取0.2 mL G1-G6溶液于微量滴定板中，并加入2 mL的考马斯亮蓝溶液，震荡混合均匀后上酶标仪测定595 nm的吸光度值H1-H6。

表一实施例1-6中实验测试的OD值

表二实施例7中实验测试的OD值

实验编号	H1	H2	H3	H4	H5	H6
							OD_595nm	0.87	0.85	0.86	0.83	0.85	0.90
实验编号	G1	G2	G3	G4	G5	G6
							OD_595nm	0.01	0.32	0.42	0.54	0.63	0.72

从表1可以看出，在pH4-10，汞金属浓度0.1-10 mg/mL范围内，均能有效的抑制菠萝蛋白酶对底物蛋白的分解抑制，具有较宽的环境适应性和较宽的汞检测极限。从表2可以看出，汞对菠萝蛋白酶的抑制作用和汞含量成正相关，通过非线性回归分析并建立模型，算出IC₅₀为3.53 mg/L,汞检测极限为0.25 mg/L。

Claims

1.一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，其特征在于所述的方法的步骤包括如下：配置含菠萝蛋白酶的缓冲溶液，并调节其pH，将菠萝蛋白酶和待测金属溶液室温震荡混合，加入底物蛋白溶液，用考马斯亮蓝法并通过用酶标仪检测定底物蛋白的含量，确定其金属的含量。

2.根据权利要求1所述的一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，其特征在于：所述的菠萝蛋白酶溶液的浓度为1 mg/mL-20 mg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为磷酸、乳酸或硼酸中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，其特征在于：所述的菠萝蛋白酶-缓冲溶液的pH为4-10。

5.根据权利要求1所述的一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，其特征在于：所述的待测金属浓度为0.1 mg/L-10 mg/L。

6.根据权利要求1所述的一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，其特征在于：所述的底物蛋白为酪蛋白或明胶中的一种。

7.根据权利要求6所述一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，其特征在于：所述的底物蛋白含量为0.1%-1.0%。

8.根据权利要求1所述一种使用菠萝蛋白酶测定重金属汞的方法，其特征在于：所述的菠萝蛋白酶-缓冲溶液的pH为6-7.9。