CN104368010A

CN104368010A - 维生素e聚乙二醇琥珀酸酯及其衍生物在制备亲水性药物的前药水凝胶纳米粒制剂中的应用

Info

Publication number: CN104368010A
Application number: CN201410696369.0A
Authority: CN
Inventors: 冯思慎; 赵婧
Original assignee: SUZHOU NASIDA BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: SUZHOU NASIDA BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2015-02-25

Abstract

本发明提供了维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)及其衍生物在制备亲水性药物的前药水凝胶纳米粒制剂中的应用。本发明具有以下的技术效果：（1）本发明为纳米级别的生物制剂。（2）本发明可以实现对亲水药物的缓释。（3）在本发明中，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯使水凝胶纳米粒具有更强的生物兼容性。（4）本发明可用于多种药物的共输送，从而达到协同增效作用。

Description

维生素E聚乙二醇琥珀酸酯及其衍生物在制备亲水性药物的前药水凝胶纳米粒制剂中的应用

技术领域

本发明涉及维生素E聚乙二醇琥珀酸酯及其衍生物在制备亲水性药物的前药水凝胶纳米粒制剂中的应用，属于药物制剂技术领域。

背景技术

在美国，新药物从发现到临床通常需要10-15年的时间和近十亿美元的资金投入。新药的成功与否很大程度上决定于药物的临床应用制剂。这是由于制剂极大的影响了药物代谢学、药物动力学和药物的生物分布。纳米粒(nanoparticles)作为一种新型的药物制剂不仅可以显著的改善药动药代和生物分布，大大提高细胞摄入率，而且能够实现药物的缓释、控释和靶向等优势。迄今世界上已有少数几种纳米粒制剂的抗癌药物在临床和市场上取得了成功，例如美国ABI公司的Abraxane是一种用于输送紫衫醇的白蛋白纳米粒稳定制剂。它已经被美国食品药品监督管理局(US FDA)批准作为治疗乳腺癌，晚期非小细胞肺癌，和转移性胰腺癌的二线药物。据报道，Abraxane在2011年带来的收入已达3.68亿美元，在2012年为4.27亿美元。同样的，作为一种阿霉素的脂质体纳米粒制剂被证明能够有效的减少阿霉素的副作用。Doxil在2011年为强生带来了4.02亿美元的收入。截止到2012年，已经有19种纳米粒制剂进入了临床实验。在过去的几十年里，被收录在SCI期刊中的与纳米粒制剂相关的科学论文与日俱增。但是，大多数的相关论文致力于疏水性(hydrophobic)药物制剂的研究。例如高分子纳米粒，胶束，固体脂质体纳米粒等都被证明是疏水性药物的良好载体。然而，亲水性(Hydrophilic)药物纳米粒制剂的研究相对较为少见。虽然亲水药物基本不存在溶解度的问题，但药物的许多基本问题，如药代药动、生物分布、靶向给药、传输效率等等，亲水性药物依然存在。纳米粒药物制剂方面也可望解决亲水性药物的这类问题。

纳米粒制剂可以为亲水药物包括小分子亲水药物，蛋白质药物，多肽药物以及核酸类药物等提供以下多方面的优点：(1)纳米粒制剂可以保护药物使其不被快速代谢，降解和清除。这种保护对于蛋白质、多肽和核酸类药物尤为重要。(2)纳米粒制剂可以通过内吞作用(endocytosis)将药物带入细胞中，其运送效率远大于小分子药物本身通过扩散机制的传输，主动运输，和受体介导运输等方式进入细胞的机制。从而提高药物运送效率。(3)纳米粒表面可以用靶向抗体修饰以实现靶向输送。(4)拥有合适大小尺寸和表面性质的纳米粒可以帮助药物逃脱免疫系统巨噬细胞的识别，从而达到药物的持续输送，延长其半衰期，并改变其生物分布。(5)纳米粒可以实现多种药物的同时输送，促进药物协同增效(synergistic)作用。

亲水性药物纳米粒制剂的研发具有许多技术难点，其中主要的一点是亲水药物缺乏与常用纳米粒例如高分子纳米粒，胶束，和固体脂质体纳米粒等的亲和作用，从而难以达到令人满意的包埋率。现今常用的亲水药物制剂为脂质体反胶束以及通过双乳化法形成的高分子纳米粒.脂质体的亲水性一面适合亲水药物的承载。但是，脂质体难以达到亲水性药物的控制释放。例如，在头部和颈部癌症以及肺癌的I/II期临床试验中，顺铂的脂质体制剂SPI-077并没有达到顺铂疗效的提升。研究将不理想的疗效归咎于低效的顺铂释放。因此，研究者们改进了SPI-077中脂质体的成分。然而，这种改进也没有引起疗效上的显著提高。反胶束可以将亲水分子包覆在核心，隔离其与周围疏水环境。反胶束在生物催化和生物活性化合物的提纯中都有广泛的应用。但是，反胶束及反胶束形成的膜在接触到水环境时会迅速释放包覆着的亲水物，无法达到缓释的效果。双乳液法也可将亲水药物包覆在纳米胶囊或者高分子纳米粒中。但是，双乳液法的药物包埋率较低，稳定性差，而且形成的颗粒较大(>100nm)。

水凝胶纳米粒制剂(nanogels,nanohydrogels,hydrogel nanoparticles)是通过物理作用或化学键交联的含有大量水分的纳米结构。它是亲水性药物例如小分子亲水药物，蛋白质，多肽与核酸等生物药物的良好载体。药物的释放主要通过扩散，聚合物腐蚀和交联剂的断裂而实现。水凝胶纳米粒制剂对亲水药物具有较高的包埋率。但是，由于水凝胶纳米粒含有大量水渗透的相互联结的孔，物理方法包覆的小分子亲水药物会被快速的释放。

前药在水凝胶纳米粒制剂上的化学连接或者交联可以达到药物缓释甚至触发释放的效果。一个优选的模式是将前药通过对于环境如温度，酸碱度,离子浓度，酶等敏感的化学键连接在水凝胶纳米粒上以实现靶相的触发释放。同时，大分子生物活性药物例如蛋白、多肽和核酸可以被包覆在前药水凝胶纳米粒中以实现叠加或者协同增效作用。

现今的水凝胶纳米粒多数是由亲水性的天然或人造高分子制成的。这类材料大多不能被生物降解，其合成的水凝胶纳米粒缺乏生物兼容性，缺乏生物活性的表面性质。维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(d-α-tocopheryl polyethylene glycolsuccinate，简称Vitamin E TPGS或TPGS)是一种双亲性可降解的分子生物材料，经TPGS修饰可以显著改善其他分子生物材料的各项理化性质，尤其是生物兼容性和表面生物活性。TPGS是一种水溶性维他命E。它常被食品和药品工业用做乳化剂，助溶剂，以及用以提高生物利用度的添加剂。TPGS的广泛应用很大程度上取决于它的稳定性和安全性。美国国家癌症研究所的毒理学研究证明高至1000毫克/千克/天的口服TPGS在大鼠和狗身上都没有引起任何安全问题。此外，TPGS还被证明具有抑制P-糖蛋白介导的多药耐药性的功效，从而可以提高药物的效率。当在制备中被用作PLGA纳米粒的表面活化剂时，TPGS显示出极强的乳化效率(高于PVA 67倍)，极大地提高了药物包埋率，以及口服药物的生物利用度。相较于(紫杉醇的商业配方)，由生物可降解的共聚物PLA-TPGS制成的紫杉醇纳米制剂提高了循环半衰期27.4倍，提高了血液浓度随时间变化的曲线下面积(代表疗效)1.6倍。

目前尚未将维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)及其衍生物应用于制备亲水性药物的前药水凝胶纳米粒制剂中。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术的空白，提供维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)及其衍生物在制备亲水性药物的前药水凝胶纳米粒制剂中的应用。

本发明提供了维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)及其衍生物在制备亲水性药物的前药水凝胶纳米粒制剂中的应用。

所述的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)衍生物为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸(多聚-L-赖氨酸)共聚物(TPGS-PLL)。

所述的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯或其衍生物的表面有靶向配体。

本发明中的水凝胶纳米粒制剂是指1纳米到1000纳米通过物理作用或化学键交联的含有大量水分的用于输送药物的制剂；

本发明中的前药水凝胶纳米粒制剂是指与前药以静电作用、化学键连接或者交联而结合的水凝胶纳米粒制剂。

本发明中的亲水性药物包括小分子药物和大分子生物药物(如蛋白质、多肽与核酸药物)。小分子药物例如顺铂(cisplatin)，阿霉素(doxorubicin)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)等。大分子生物药物包括单克隆抗体例如曲妥珠单抗(trastuzumab),贝伐珠单抗(bevacizumab),利妥昔单抗(rituximab)等；还包括多肽类药物例如抗癌多肽疫苗，抑制血管增生多肽等；还包括小干扰RNA例如polo样激酶1小干扰RNA，多聚酶1小干扰RNA等。

本发明中的靶向配体包括抗体、肽、适体，以及小分子靶向配体等。例如曲妥珠单抗，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(RGD peptide),前列腺特异性膜抗原适体(PSMA aptamer),叶酸(folic acid)等。

本发明具有以下的技术效果：

(1)本发明为纳米级别的生物制剂。例如在实施例中，顺铂前药交联的TPGS-PLL制剂为平均直径为138纳米的颗粒。此颗粒大小可以很好的实现实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect)。

(2)本发明可以实现对亲水药物的缓释。例如在实施例中，顺铂前药交联的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物在药物释放缓冲液中实现了对顺铂200个小时的缓释。

(3)在本发明中，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯使水凝胶纳米粒具有更强的生物兼容性。例如在实施例中，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯减小了多聚左旋赖氨酸所带正电，从而减小了细胞对水凝胶纳米粒的非特异性吞噬。除此之外，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯减小了多聚左旋赖氨酸的细胞毒性。浓度小于0.2毫克/毫升的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸水凝胶纳米粒在未载药时未见毒性。

(4)本发明可用于多种药物的共输送，从而达到协同增效作用。在实施例中，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物水凝胶纳米粒实现了对顺铂和polo样激酶1小分子干扰RNA的共输送，达到了协同增效作用。

附图说明

图1(A)前药水凝胶纳米粒制剂的结构示意图；其中，1为亲水性前药，2为交联剂或可作为交联剂的亲水性前药，3为靶向配体，4为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯或其衍生物；

图1(B)为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物合成示意图；

图2为多聚左旋赖氨酸和维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物的¹H NMR图谱，其中(A)为多聚左旋赖氨酸共聚物的¹H NMR图谱；(B)为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸的¹H NMR图谱；

图3(A)为顺铂前药交联的polo样激酶1小干扰RNA(siPLK1)装载的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物水凝胶纳米粒的示意图；

图3(B)为顺铂前药对维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物水凝胶纳米粒的化学交联反应式；

图4为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物水凝胶纳米粒制剂的场发射透射电子显微镜(FETEM)图片；其中(A)顺铂装载的水凝胶纳米粒制剂；(B)顺铂前药交联的水凝胶纳米粒制剂；(C)顺铂和siPLK1同时装载的水凝胶纳米粒制剂；(D)顺铂前药交联的siPLK1装载的水凝胶纳米粒制剂；

图5为顺铂前药交联的siPLK1装载的水凝胶纳米粒制剂在不同赖氨酸/顺铂前药摩尔比例下的顺铂包覆效率和载药量(A)；以及在不同赖氨酸的氮(N)和siPLK1的硫(P)的N/P比例之下siPLK1的电泳迁移率(B)；

图6为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物水凝胶纳米粒制剂的体外累计释放曲线。(A)顺铂释放曲线。其中GelPt指顺铂装载的水凝胶纳米粒；GelPtcros是指顺铂前药交联的水凝胶纳米粒；GelSiPt指顺铂和siPLK1同时装载的水凝胶纳米粒；GelSiPtcros指顺铂前药交联的siPLK1装载的水凝胶纳米粒。(B)siPLK1释放曲线。其中GelSi指siPLK1装载的水凝胶纳米粒；

图7为SK-BR-3细胞在被50nM,25nM,12.5nM,和6.25nM的装载于TPGS-PLL水凝胶纳米粒中的siPLK1转染24小时后PLK1mRNA的相对表达水平。阴性对照为未经任何处理的SK-BR-3细胞；阳性对照为lipofectamine 2000转染的50nM siPLK1(Lipo-50)；

图8(A)为共聚焦显微镜观察到的异硫氰酸荧光素标记的阴性对照小干扰RNA(siRNA_scramble-FITC)装载的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂(GelSi_scramble-FITC)(第一行)和siRNA_scramble-FITC装载的PLL水凝胶纳米粒制剂(PLLSi_scramble-FITC)(第二行)转染的NIH3T3(第一列)，SK-BR-3(第二列)，MDA-MB-231(第三列),和HCC38(第四列)细胞。

图8(B)为NIH3T3,SK-BR-3,MDA-MB-231,和HCC38细胞对于GelSi_scramble-FITC和PLLSi_scramble-FITC的定量摄取效率。数据表示平均值±标准偏差，n＝6；

图9(A)为阴性对照小干扰RNA(siRNA_scramble)装载的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂对NIH3T3成纤维细胞48小时的细胞毒性；

图9(B)为不同浓度的siPLK1装载的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂(GelSi)对NIH3T3,SK-BR-3,MDA-MB-231,和HCC38细胞48小时的细胞毒性；

图10为在各种顺铂制剂作用下NIH3T3(A),SK-BR-3(B),MDA-MB-231(C),和HCC38(D)细胞48小时的存活率；

图11为SK-BR-3细胞的流式细胞仪细胞周期检测直方图。(A)显示没有经过任何处理的SK-BR-3细胞周期分布；(B)是与溶解在0.9％NaCl的顺铂(cispt)共培养的SK-BR-3的细胞周期分布；(C)是与顺铂前药交联的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂(GelPtcros)共培养的SK-BR-3细胞周期分布；(D)是与siPLK1装载的顺铂前药交联的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂(GelSiPtcros)共培养的SK-BR-3细胞周期分布。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，如无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物(TPGS-PLL)用于制备顺铂的前药水凝胶纳米粒制剂

顺铂是一种常用抗癌药物，它被美国食品药品监督管理局(US FDA)批准作为治疗膀胱癌，子宫颈癌，恶性间皮瘤，非小细胞肺癌，卵巢癌，头部和颈部鳞状细胞癌，睾丸癌的药物。顺铂在水中有一定的溶解度，它通常被溶解在生理盐水(0.9％NaCl)中注射。溶解在生理盐水中的顺铂制剂在具有正常肾功能的人体内的消除半衰期为1小时。通常注射或输注结束2-3小时后，90％的顺铂就会不可逆的和血液中的蛋白质结合并被代谢掉。顺铂的生理盐水制剂不具备靶向，在人体内会积累于身体各器官，引起强烈的副作用，例如积累性的肾毒性。以脂质体作为制剂的顺铂并没有达到比溶解在生理盐水中的顺铂更好的效果。因此，前药水凝胶纳米粒可能成为一种更好的顺铂制剂。为了解决小分子亲水药物从水凝胶中释放过快的问题，经过化学修饰而含有两个羧基的顺铂前药被作为化学交联剂与TPGS-PLL所含的ε-氨基交联形成酰胺键。顺铂前药中所含的酯键可以在体内特别是体内酸性环境下被水解而释放有效成分顺铂。

为了消除顺铂抗药性从而达到增强疗效的效果，polo样激酶1小干扰RNA(siPLK1)也被同时载入顺铂前药交联的水凝胶纳米粒制剂之中。polo样激酶1(plk1)在调节细胞有丝分裂中发挥了重要的作用。plk1在多种癌症中有过量的表达。抑制plk1的表达被证明可以通过上调p37α增强具有P53突变的人表皮鳞状细胞对于顺铂的化疗敏感性。原因可能是通过增强DNA损伤诱导的G2期阻滞从而增强细胞凋亡而实现的。同时，plk1也被证明会减弱p53的活性，从而减弱p53介导的DNA损伤引起的细胞凋亡。不仅如此，在顺铂引起的神经母细胞瘤SH-SY5Y凋亡的过程中，plk1的mRNA和plk1本身都显著减少了，这种减少显著的增加了p53的稳定性。从另一个侧面反映了plk1抑制剂(例如siPLK1)和顺铂在引起细胞凋亡方面所可能产生的协同作用。

一、polo样激酶1小干扰RNA(siPLK1)装载的顺铂前药交联的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物(TPGS-PLL)水凝胶纳米粒制剂的制作

包括以下步骤：

1、TPGS-PLL的合成

维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)通过与琥珀酸(succinic acid)的酯化反应被转化为羧基TPGS(TPGS-COOH)。具体步骤为：将TPGS和琥珀酸以1:5的摩尔比溶解在DMF中。混合物在氮气保护下于70度搅拌24小时。产物用冰乙醚沉淀取得。

此后，TPGS-COOH被碳二亚胺法转化为TPGS-NHS。具体过程为：将TPGS-COOH、二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以1：2：2的摩尔比例溶解于无水二氯甲烷(DCM)中，在常温氮气保护下搅拌4小时。之后用冰乙醚沉淀法提纯,并用真空烘箱烘干。紧接着，将多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐(poly(L-lysinehydrobromide，PLL)和TPGS-NHS以1:5的摩尔比混合于硼酸钠缓冲液(50mM,pH8.5)中常温搅拌反应24小时。产物用截留分子量为10kDa的离心式过滤管提纯，冻干，并储存于-20℃。此实施例中使用的多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐分子量为21000。

如图1(B)、图2所示，图1(B)为TPGS-PLL合成示意图。图2为的¹H NMR图谱，其中(A)为的¹H NMR图谱；(B)为的¹H NMR图谱；

从图2的(A)和(B)可以看出TPGS-PLL的成功合成，可以由以下几点证明：(1)TPGS-PLL的图谱中出现3.6ppm的聚乙二醇(PEG)的特征峰，证明了TPGS的存在；(2)峰B’(3.1ppm)的出现显示出一部分赖氨酸的ε-碳上的氢发生了化学位移，表明其周围化学环境发生了变化。

2、TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂的合成及药物的装载

分别将一定量的TPGS-PLL、siPLK1、二氯乙烷(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在无核酸酶的水中。将顺铂前药溶解于MES缓冲液(50mM,PH5.5)中。TPGS-PLL、siPLK1和顺铂前药的投料比决定了此水凝胶纳米粒的载药量和包埋率。因此，此实施例对这三者的摩尔比进行了优化(图3)。推荐的赖氨酸和顺铂前药的摩尔比是1：40；推荐的TPGS-PLL和siPLK1的N/P比值为40：1。在此实施例中使用的EDC,NHS和顺铂前药的摩尔比为40：10：1。之后，在300rpm的快速磁力搅拌下将水相分别滴加至正己烷中(水相总体积和正己烷体积的比值为1:25)。当正己烷挥发至初始体积的十分之一时加入含有0.03％w/v TPGS的无核酸酶的水(体积为正己烷初始体积的五分之一)。待正己烷完全挥发，用截留分子量为100kDa的离心式过滤管提纯水凝胶纳米粒制剂。

如图3(A)和图3(B)所示，图3(A)为顺铂前药交联的polo样激酶1小干扰RNA(siPLK1)装载的TPGS-PLL水凝胶纳米粒的示意图。图3(B)为顺铂前药对TPGS-PLL水凝胶纳米粒的化学交联反应式。

从图3(A)和图3(B)中可以看出，此水凝胶纳米粒由TPGS-PLL在油包水型乳液中形成反胶束，进而在有机溶剂挥发之后再加入含有TPGS的水溶液制成。siPLK1被含有正电荷的PLL吸附在水凝胶纳米粒中心；两端含羧基的顺铂前药作为交联剂在催化剂的作用下与PLL所含氨基发生化学反应，进而实现水凝胶纳米粒的化学交联。

二、siPLK1装载的顺铂前药交联的TPGS-PLL纳米水凝胶的表征

1、形貌，大小，大小分布以及zeta电位

场发射透射电子显微镜(FETEM)被用于观察水凝胶纳米粒的形貌。药品的制备为将提纯过的水凝胶纳米粒制剂直接滴在铜网上并过夜风干。Zetasizer(Malvern)激光粒度仪被用来测量水凝胶纳米粒的大小，大小分布以及zeta电位。

结果如图4所示，图4为TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂的场发射透射电子显微镜(FETEM)图片；其中(A)顺铂装载的水凝胶纳米粒制剂；(B)顺铂前药交联的水凝胶纳米粒制剂；(C)顺铂和siPLK1同时装载的水凝胶纳米粒制剂；(D)顺铂前药交联的siPLK1装载的水凝胶纳米粒制剂。

从图4上可以看出，此类水凝胶纳米粒呈球形。激光粒度仪测量的纳米粒大小为130nm左右，多分散指数(PDI)小于2.5。Zeta电位为正值。相较于PLL水凝胶纳米粒，TPGS-PLL水凝胶纳米粒具有较低的Zeta电位，从而具有降低由表面正电荷引起的非特异性毒性的潜力。

2、载药量和包埋率

顺铂的载药量和包埋率是通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测量铂含量得到的。具体操作为将一定量的顺铂或者合成的含顺铂的水凝胶纳米粒制剂溶解于浓硝酸中，并在90度加热45分钟。获得的样品用超纯水稀释并测量。

siPLK1的包埋率由琼脂糖凝胶电泳获得。具体操作为将用超滤浓缩的含有siPLK1的样品加样到3％琼脂糖凝胶中，用100V跑45分钟。

结果如图5所示，图5为顺铂前药交联的siPLK1装载的水凝胶纳米粒制剂在不同赖氨酸/顺铂前药摩尔比例下的顺铂包覆效率和载药量(A)；以及在不同赖氨酸的氮(N)和siPLK1的硫(P)的N/P比例之下siPLK1的电泳迁移率(B)。

从图5上可以看出，顺铂的包埋率主要取决于赖氨酸和顺铂前药的比例。当两者的摩尔比为40:1时，包埋率为最高(48.18％)。当赖氨酸的氮(N)和siPLK1的硫(P)的N/P比例从10:1升高到160:1，siPLK1都可以被完全包覆在纳米水凝胶之中。

3、体外药物释放的检验

药物的释放测量是在体外缓冲液中进行的。具体方法为将一定量的水凝胶纳米粒制剂溶液装入透析袋中(顺铂释放试验使用25kDa的透析袋，siPLK1使用100kDa的透析袋)。将透析袋完全浸入加入了0.1％w/v80的1倍的PBS缓冲液中(PH 7.4)，并在37度水浴中以匀速作圆周晃动。定时收集并更换透析袋外面的缓冲液。将收集的缓冲液冻干低温保存直至测量。

结果如图6所示，图6为TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂的体外累计释放曲线。(A)顺铂释放曲线。其中GelPt指顺铂装载的水凝胶纳米粒；GelPtcros是指顺铂前药交联的水凝胶纳米粒；GelSiPt指顺铂和siPLK1同时装载的水凝胶纳米粒；GelSiPtcros指顺铂前药交联的siPLK1装载的水凝胶纳米粒。(B)siPLK1释放曲线。其中GelSi指siPLK1装载的水凝胶纳米粒。

从图6中可以看出，顺铂前药对TPGS-PLL的化学交联显著的减缓了顺铂以及siPLK1的释放。水凝胶纳米粒中的药物释放呈现双阶段释放曲线：前10小时的突发释放和紧接着的缓慢持续释放。这种持续释放可延续至上百小时。相比较于顺铂装载的水凝胶纳米粒，顺铂前药交联的水凝胶纳米粒减少了9.1％的突发释放在总释放量中的比例，从而能够减少过快释放。顺铂前药的交联同样减少了siPLK1的突发释放。这可能是由于化学交联的水凝胶具有在溶液中更稳定的结构。

4、TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂对于siPLK1的转染效率

转染效率由实时定量PCR(RT-qPCR)获得。将SK-BR-3细胞种入24孔板，并在37度5％二氧化碳的培养箱中培养24小时。之后用含有siPLK1装载的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂的培养液更换之前培养液，并在培养箱中培养24小时。用试剂盒提取总RNA,并用其进行RT-qPCR的实验。

结果如图7所示，图7为SK-BR-3细胞在被50nM,25nM,12.5nM,和6.25nM的装载于TPGS-PLL水凝胶纳米粒中的siPLK1转染24小时后PLK1mRNA的相对表达水平。阴性对照为未经任何处理的SK-BR-3细胞；阳性对照为lipofectamine2000转染的50nM siPLK1(Lipo-50)。

从图7可以看出，siPLK1装载的水凝胶纳米粒制剂显示出剂量依赖性的转染效率。当siPLK1的浓度为50nM时，TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂的转染效率和lipofectamine 2000的转染效率相当。

三、细胞对于水凝胶纳米粒制剂的摄取

1、定性观察：共聚焦显微镜

将细胞(10⁴细胞/孔)种入以载玻片为底的板中过夜。之后将培养液换成含有异硫氰酸荧光素标记的阴性对照小干扰RNA(siRNA_scramble-FITC)装载的水凝胶纳米粒制剂的培养液中，并于培养箱中培养2小时。用37度的1倍PBS缓冲液清洗细胞5遍以除去残留在细胞外的荧光材料。用70％乙醇固定细胞20分钟。之后，用1倍PBS缓冲液清洗细胞2遍，并用DAPI将细胞核染色。

结果如图8(A)所示，图8(A)为共聚焦显微镜观察到的异硫氰酸荧光素标记的阴性对照小干扰RNA(siRNA_scramble-FITC)装载的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂(GelSi_scramble-FITC)(第一行)和siRNA_scramble-FITC装载的PLL水凝胶纳米粒制剂(PLLSi_scramble-FITC)(第二行)转染的NIH3T3(第一列)，SK-BR-3(第二列)，MDA-MB-231(第三列),和HCC38(第四列)细胞。

从图8(A)中可以看出，被包覆在水凝胶纳米粒中的携带绿色荧光的siRNA进入到了细胞质中。证明此水凝胶纳米粒作为一种药物制剂，能够将承载的药物带入细胞中发挥药效。

2、定量检测：酶标仪

将细胞以10⁵细胞/孔的密度种在96孔板中。24小时后，将培养液替换为含顺铂前药交联的siPLK1装载的水凝胶纳米粒制剂(GelSiPtcros)或顺铂前药交联的水凝胶纳米粒制剂(GelPtcros)的培养液，并在培养箱中培养2小时。之后，移除培养液，用1倍PBS清洗细胞2次，并加入50μl的含有0.5％Triton X-100的0.2NNaOH溶液。轻轻摇晃15分钟使细胞完全裂解，之后用酶标仪的荧光功能测量在激发波长430nm,发射波长485nm下的荧光强度。

结果如图8(B)所示，图8(B)为NIH3T3,SK-BR-3,MDA-MB-231,和HCC38细胞对于GelSi_scramble-FITC和PLLSi_scramble-FITC的定量摄取效率。数据表示平均值±标准偏差，n＝6。

从图8(B)中可以看出，siRNA装载的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂进入细胞质的效率要低于广泛研究的siRNA装载的PLL水凝胶纳米粒制剂；这个现象可能是由TPGS对表面电荷的屏蔽造成的。这种屏蔽可以减少水凝胶纳米粒和细胞的非特异性相互作用，从而极有可能减少水凝胶纳米粒制剂在体内的毒性。

四、细胞毒性测试

方法：将NIH3T3,SK-BR-3,MDA-MB-231,和HCC38细胞分别以5x10³细胞/孔的密度种在96空板中。12小时后，用含有水凝胶纳米粒制剂的培养液替换旧的培养液并在培养箱中培养一定的时间。MTT法被用来测量此时细胞的存活率。

结果如图9(A)、图9(B)和图10所示：

图9(B)为不同浓度的siPLK1装载的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂(GelSi)对NIH3T3,SK-BR-3,MDA-MB-231,和HCC38细胞48小时的细胞毒性。数据表示平均值±标准偏差，n＝6。这个实验的目的是检验TPGS-PLL本身以及GelSi的细胞毒性。

从图9(A)和图9(B)中可以看出，当TPGS-PLL水凝胶纳米粒的浓度在0.2mg/mL以下，TPGS-PLL材料自身的毒性可以被忽略。其毒性显著低于目前最广泛研究的高分子转染试剂25kDa枝化聚乙烯亚胺(PEI)。GelSi具有剂量依赖性毒性，其在MDA-MB-231细胞上具有较其它三个细胞系更强的细胞毒性。这种毒性上的差异是由于含有RAS基因突变的MDA-MB-231细胞对siPLK1引起的细胞凋亡更为敏感。

图10为在各种顺铂制剂作用下NIH3T3(A),SK-BR-3(B),MDA-MB-231(C),和HCC38(D)细胞48小时的存活率。这些顺铂制剂包括顺铂前药交联的siPLK1装载的水凝胶纳米粒制剂(GelSiPtcros)，顺铂前药交联的水凝胶纳米粒制剂(GelPtcros)，和溶解于0.9％NaCl溶液中的顺铂(cispt)。基于图7所得出的结论，siPLK1对于NIH3T3,SK-BR-3和HCC38所选取的浓度为10nM；对于MDA-MB-231所选取的浓度为5nM。数据表示平均值±标准偏差，n＝6。在此条件下水凝胶纳米粒本身的浓度小于6μg/mL。因此，在此浓度下TPGS-PLL本身不具有细胞毒性。

从图10中可以看出，三种顺铂制剂都呈现剂量依赖性毒性。相较其它两种制剂，GelSiPtcros在实验使用的4种细胞系中都具有最强的毒性(最低的IC50)。顺铂交联的水凝胶纳米粒制剂具有比顺铂的生理盐水制剂更强的细胞毒性，这种毒性并不来源于水凝胶纳米粒的材料本身，而是很大程度上源于纳米粒制剂的优势例如更高效的细胞摄取和药物的控制释放。实验还进一步证明顺铂前药交联的水凝胶纳米粒制剂对于顺铂和siPLK1的共输送带来了更强的细胞毒性，或者说更强的治疗效果。

五、细胞周期的检测

方法：流式细胞仪被用来检测PI染色细胞的细胞周期。具体操作为将SK-BR-3细胞种入6孔板中，12小时后将培养液换成含有顺铂的生理盐水(0.9％NaCl)制剂(cispt)，顺铂前药交联的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂(GelPtcros)，或者顺铂前药交联的siPLK1装载的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂(GelSiPtcros)的培养液。24小时后，收获细胞，用冷的1倍PBS清洗一遍，之后用75％的乙醇溶液在4℃固定24小时。此后，将细胞用冷的1倍PBS清洗一遍，并在室温用PI染色试剂染色30分钟。PI染色试剂的成分为含有50μg/mL PI,100μg/mL RNase A,和0.1％Triton X-100的1倍PBS溶液。将处理好的细胞通过流式细胞仪进行细胞周期分布的检测。在此试验中顺铂的浓度为0.075μg/mL，GelSiPtcros中siPLK1的浓度为10nM.共培养时间为24小时。

结果如图11所示，图11为SK-BR-3细胞的流式细胞仪细胞周期检测直方图。(A)显示没有经过任何处理的SK-BR-3细胞周期分布；(B)是与溶解在0.9％NaCl的顺铂(cispt)共培养的SK-BR-3的细胞周期分布；(C)是与顺铂前药交联的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂(GelPtcros)共培养的SK-BR-3细胞周期分布；(D)是与siPLK1装载的顺铂前药交联的TPGS-PLL水凝胶纳米粒制剂(GelSiPtcros)共培养的SK-BR-3细胞周期分布。

从图11可以看出，相较于溶解在0.9％NaCl中的顺铂，顺铂交联的水凝胶纳米粒制剂增强了23.6％的G2/M期阻滞。相较于顺铂交联的水凝胶纳米制剂，siPLK1装载的顺铂交联的水凝胶纳米制剂进一步增强了11.5％的G2/M期阻滞。G2/M期阻滞被证明与顺铂的剂量以及细胞毒性呈正相关。因此，增强了的G2/M期阻滞很有可能是引起其毒性增强的重要原因。

Claims

1.维生素E聚乙二醇琥珀酸酯及其衍生物在制备亲水性药物的前药水凝胶纳米粒制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯衍生物为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯/多聚左旋赖氨酸共聚物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的维生素E聚乙二醇琥珀酸酯或其衍生物的表面有靶向配体。