CN104364647B - 用于对在细胞悬浮液中的细胞进行探测的方法和装置 - Google Patents

Abstract

说明一种用于在对细胞悬浮液中的至少两种不同尺寸的细胞种类和/或细胞集合体种类进行区分的情况下对细胞进行量化的装置，该装置具有对磁场敏感的传感器，所述传感器具有至少第一配对和第二配对的传感器元件，其中所述第一配对的传感器元件作为惠斯通电桥的一部分连接起来，并且具有处于第一种有待测量的细胞或者细胞集合体的第一中等尺寸的一半与双倍之间的第一间距；所述第二配对的传感器元件作为惠斯通电桥的一部分连接起来，并且具有处于第二种有待测量的细胞或者细胞集合体的第二中等尺寸的一半与双倍之间的第二间距；所述配对的、彼此靠得最近的传感器元件的第三间距大于所述两种中等尺寸中的较大的尺寸。并且所述装置具有用于在所述传感器元件的旁边导引所述细胞悬浮液的通道。

Description

用于对在细胞悬浮液中的细胞进行探测的方法和装置

本发明涉及用于对在细胞悬浮液中的细胞进行探测并且尤其是进行计数的一种方法和一种装置。

借助于磁抗的方法对在同一个血样内部的细胞及细胞相互作用进行探测，这迄今为止是一种未得到解决的问题。但是，这样的相互影响对于医疗的诊断术来说很重要，用于尽快地推断出确定的临床征象。

这些临床征象之一是血小板减少症，也就是说血液中的血小板或者说血液中的板片的数量太少。血小板减少症可能由于凝血干扰或者免疫系统的、相对于身体本身的血小板的提高的活性（免疫性血小板减少症）而出现。免疫性血小板减少症因而可能是自动免疫疾病（Autoimmunerkrankung）（免疫血小板的紫癜或者先天的血小板的紫癜，ITP），对于所述自动免疫疾病来说自身的免疫系统发现并且除去血小板。但是也可能出现免疫性血小板减少症，如果在患上传染病的过程中血小板的数目急剧地下降的话。在这种情况下，血小板执行在免疫防御的过程之内的任务。在这种情况下，血小板要么与免疫细胞（单核细胞）进行直接的相互作用，并且在这过程中形成免疫细胞/血小板-聚集体，或者与所挤入的微生物（细菌、病毒、酵母/菌类）进行相接的相互作用。在这两种情况下，都由单核细胞发现并且除去血小板。单核细胞是免疫系统的、在血液中循环的细胞和尤其在组织中定位的巨噬细胞的以及树枝状的细胞的一部分的前体。在这样的聚集体内部的血小板对于在凝血或者止血过程中的任务来说不再可用。血小板数目的、由于急性的免疫反应而产生的降低现象可能会与凝血干扰相混淆。对于这两种临床征象的快速的区分（凝血干扰或者自动免疫疾病）可以使诊断过程加速。本发明尤其能够对全血中的免疫细胞/血小板-聚集体进行计数。

对由免疫细胞连同血小板构成的聚集体进行探测，这一点迄今为止就所知而言仅仅借助于光学的流量血细胞计数法来实现。这种技术要求借助于为荧光而标记的抗体来对这两种细胞类型（免疫细胞和血小板）进行特殊的标记。此外，所述光学的流量血细胞计数法要求对有待检查的细胞类型进行复杂的净化或者除去干扰的细胞类型、比如红血细胞。在没有这种净化的情况下，不能对所使用的荧光颜料进行探测。

本发明的任务是，说明用于对在细胞悬浮液中的细胞进行探测并且尤其进行量化的一种得到改进的方法和一种相应的装置，其中避免开头所提到的缺点。

该任务通过一种具有权利要求1的特征的装置得到解决。从属权利要求涉及本发明的有利的设计方案。此外，所述任务通过一种具有权利要求10的特征的方法得到解决。

所述按本发明的、用于在区分在细胞悬浮液中的至少两种不同尺寸的细胞种类和/或细胞集合体种类的情况下对细胞进行量化的装置：

具有对磁场敏感的传感器，该传感器则具有至少一个第一配对和第二配对的传感器元件，其中，

-所述第一配对的传感器元件具有处于第一种有待测量的细胞或者细胞集合体的第一中等尺寸的一半与双倍之间的第一间距，

-所述第二配对的传感器元件具有处于第二种有待测量的细胞或者细胞集合体的第二中等尺寸的一半与双倍之间的第二间距，

-所述配对的、彼此靠得最近的传感器元件的第三间距大于所述两种中等尺寸中的较大的尺寸；

并且具有用于在所述传感器元件的旁边导引细胞悬浮液的通道。

对于本发明来说，已经发现，可以借助于特殊的传感器几何关系在细胞悬浮液中的不同种类的细胞和/或团块之间进行区分。在此有利的是，不需要进行净化或者过滤或者稀释，而是可以将所述细胞悬浮液留在其原始状态中。仅仅需要用超顺磁的粒子来对至少一部分细胞进行标记，用于在磁抗的传感器上产生信号。

所述装置有利地包括用于对第二配对的第一及第二信号中的第一信号进行测评的测评机构，其中所述测评机构构造用于：不仅对所述第一及第二信号的时间间隔进行测评，而且对所述两个信号的幅度进行测评。

现在借助于附图对本发明的一种优选的、但是绝无限制性的实施例进行详细解释。在此，在此极为简化地示出了所述特征。附图示出：

图1是具有流体通道及GMR传感器的测量系统；

图2是在所述传感器上面的、由单核细胞及血小板构成的集合体以及所属的测量信号；

图3是在所述传感器上面的血小板以及所属的测量信号；

图4是在所述传感器上面的、由血小板构成的中等大小的集合体以及所属的测量信号；

图5是在所述传感器上面的、由血小板构成的较大的集合体以及所属的测量信号；并且

图6是并联地布置在惠斯通电桥中的GMR传感器的示意图；并且

图7是对角地布置在惠斯通电桥中的GMR传感器的示意图。

图1示意性地示出了一种按照本发明的、示范性的传感器10的原理构造；一流体通道20用于将细胞悬浮液导引并且导送越过GMR传感器（Giant Magnetoresistive（大磁阻））的传感器元件11。通过像比如从US 20110315635 A1中所公开的那样的、微流体的通道系统来输送所述细胞悬浮液。所述传感器元件在此形成第一配对12和第二配对13。所述两个配对12、13在此以本身熟知的方式如在图6中所示出的那样以并联的布置方式分别在一条惠斯通电桥中被联合起来。所述第一配对12产生第一传感器信号，并且所述第二配对13产生第二传感器信号。在用磁性方式来标记的细胞或者集合体在所述流体通道20中从所述传感器元件11的旁边经过时产生所述两种信号，因为所述传感器元件11能够探测到在其紧挨着的近处的磁场。在一种作为替代方案的实施方式中，所述传感器元件11也可以直接被用于进行测量，而没有将其布置在惠斯通电桥中。图6和7示出了以其正如在接下来的实施例中所使用那样的并联的布置方式或者以对角的布置方式连接成惠斯通电桥的情况。在此，以电的方式借助于印制导线61来连接真正的传感器元件11。

借助于图2到5对所述第一种实施例进行详细解释，所述第一种实施例研究对于在全血试样的内部的、由单核细胞21和/或血小板22构成的聚集体的特殊的计数。在此，事先用超顺磁的纳米粒子23对所述血小板22进行标记，所述超顺磁的纳米粒子23又与特殊的抗体相结合。如果所述血小板22与单核细胞21进行相互作用，那么它们就在其表面上呈现出抗原（比如CD154），而在止血的过程中它们不会呈现出所述抗原。通过这种方式，可以借助于专门地经过标记的纳米粒子23来将这些血小板22与参与凝血的血小板22区分开来。参与凝血的血小板22相应地未被标记。

用超顺磁的纳米粒子来标记所述血小板22，由此借助于GMR传感装置能够探测单个的细胞及聚集体。如果将一个单个的血小板22、一个单核细胞/血小板-聚集体或者一个血小板聚集体41、51导送到所述传感器上面，那就产生表示出特征的信号。如果血小板22通过特殊的抗原-抗体与单核细胞21进行相互作用，那就形成具有大约25μm的中等尺寸的细胞/细胞聚集体。

在图1中示出的传感器的传感器几何关系有利地与测量任务相匹配。因此作为所述第一配对12的传感器元件11的间距使用2μm，此外作为所述第二配对13的传感器元件11的间距使用25μm，并且作为所述两个配对12、13的、靠得最近的传感器元件11的间距使用35μm。

图2示出了由一个单核细胞21和几个血小板22构成的聚集体在两个位置上、也就是在所述第一配对12上面以及在所述第二配对13上面的情况。在经过所述两个由GMR传感器的传感器元件11构成的配对12、13的途径中，所述聚集体在此产生如同样在图2中所示出的那样的信号序列。在掠过所述第一配对12时，产生所述表示出特征的信号A。信号A的特征主要在于在时间上狭隘地受到限制的、拥有较高的幅度的摆幅。在掠过所述第二配对13时产生表示出特征的信号B。信号B的特征在于拉长的、具有两个拥有下面也被用作标准幅度24的中等幅度的同样峰值的信号曲线。所述信号B的两个峰值通过所述第一配对12的传感器元件11的较小的间距来重叠，并且就这样形成所述信号A。所述第二配对13的传感器元件11的较大的间距使得这些峰值在那里不重叠。所描述的信号由于流动速度并且由此由于所述细胞聚集体从所述第一配对12到所述第二配对13所需要的时间而通过所述时间上的间隔t1在时间上隔开。

其它种类的、在这种实施例中可能出现的细胞和细胞聚集体可以根据其表示出特征的信号来明确地区别于彼此并且彼此间区分开来。图3示出，在由一个单个的经过标记的血小板-细胞22掠过所述传感器元件11时产生何种信号序列。因此，在掠过所述第一配对12时，又产生所述表示出特征的信号序列B，因为细胞与所述第一配对12的尺寸的比例大致相当于由一个单核细胞21和几个血小板22构成的聚集体与所述第二配对13的尺寸的比例。在掠过所述第二配对13时，所述单个的、经过标记的血小板-细胞22产生一个表示出特征的、以两个明显地分开的摆幅的形式的信号C。在所述两个信号之间的时间间隔t2在这种情况下明显大于所述时间间隔t1。由此，根据所述信号可以在一个单个的血小板-细胞22与一个由这样的细胞和一个单核细胞21所构成的聚集体之间进行明确的区分。

图4示出，在由中等大小的、由几个经过标记的血小板-细胞22、在这种实施例中由刚好十一个细胞所构成的集合体41掠过所述传感器元件11时产生何种信号序列。因此，在掠过所述第一配对12时，这次又产生所述表示出特征的、具有一个拥有较大幅度的峰值的信号序列A，因为所述第一配对12的传感器元件11由于其较小的间距而不能分解所述集合体41的各个份额。用大约t1的大小的时间间隔产生所述表示出特征的信号B的式样的信号，不过，这次所述信号拥有显著扩大的幅度。由此，根据所述第二配对13的信号的幅度，也能够将这种无单核细胞21的集合体41与拥有单核细胞21的聚集体区分开来。相对于单个的血小板22的信号序列的区别还更加明显。

图5示出，在由较大的、由更大的经过标记的血小板-细胞22、在这种实施例中由三十个以上的细胞所构成的集合体51掠过所述传感器元件11时产生何种信号序列。因此，在掠过所述第一配对12时，这次又产生所述表示出特征的、具有一个拥有较大幅度的峰值的信号序列A，因为所述第一配对12的传感器元件11由于其较小的间距而不能分解所述较大的集合体51的各个份额。因为所述较大的集合体51大于所述配对12、13彼此间的间距，所以在所述第一与第二信号之间不再产生时间上的间隔，而是所述信号部分地彼此重叠。对于所述第二配对13来说，通过以下方式产生一种表示出特征的、拥有较高的幅度的信号D：所述较大的集合体51大于所述第二配对13的传感器元件11的间距。对于所述较大的集合体51来说产生的信号序列也能够与其它种类的细胞及聚合体区分开来。

由此可以借助于以下表格来区分不同的、所出现的细胞及聚合体。在这里可以看到，尽管对仅仅一个细胞类型作了标记，也可以借助于对于不同的信号形式的分析来测量不同的尺寸和细胞/细胞-聚合体。

	t1	＞t1	＜t1
				标准幅度24（第二配对13）	M/T	T
大于标准幅度24（第二配对13）	TT		TTT

第二配对13 V/第一配对12->	信号A	信号B
			信号B	M/T或TT
信号C		T
			信号D	TTT

其中：

M/T表示一个由单核细胞21和血小板22构成的聚合体，

T表示一个单个的血小板-细胞22，

TT表示中等大小的、由血小板22构成的聚合体41，

TTT表示较大的、由血小板22构成的集合体51。

因而有利地在这里一方面使所述传感器几何关系与有待测量的分析物的、可预料的几何尺寸或者尺寸相匹配，并且另一方面设定两根传感器条的间距，用于在同一个试样中将免疫细胞/血小板-聚合体（直径：15-25μm）与各个血小板（2-5μm）区分开来。所述配对12、13彼此间的间距允许额外地排除比所述细胞结构大、在当前的实施例中比大约25μm大的细胞聚合体。此外，在此产生的信号组合可以倒推出刚刚所测量的细胞或者细胞组合。

因而有利地进行以下步骤或者产生以下优点：

a）使所述传感器几何关系与分析物（磁性粒子、比如金属粒子或者以磁性的方式被标记的生化粒子、比如蛋白质或者作为也以磁性的方式被标记的生物粒子的脂质体、比如动物细胞、微生物和病毒）的尺寸相匹配。渡越时间（Time-of-Flight）-测量允许就所述分析物的尺寸作出结论。

b）两个具有不同的几何关系的传感器的布置允许通过排除法来区分不同大小的粒子及其成分。在此，各个信号的形状以及两个信号的时间顺序是一种特殊的标准。

c）所述信号的幅度允许根据具有不同成分的粒子聚合体的磁化的情况来区分所述粒子聚合体。在此，以磁性的方式对所述聚合体的一种成分作了标记（血小板22），而另一种成分则保持未作标记的状态（单核细胞21）。所述未被标记的成分影响着整个聚合体的磁化情况及尺寸。

d）可以在复合的液体（尤其是血液、尿液或者分秘液）中没有净化或者稀释步骤的情况下实施对于分析物的测量。光学上的透明性没有必要。

在当前的第一种实施例中，所使用的细胞（比如免疫系统的初级的吞噬细胞）拥有处于15与30μm之间的尺寸。而血小板则具有处于2与5μm之间的尺寸。从中产生用于所述间距的范围。比如作为所述第一配对12的传感器元件11的间距，可以使用在1与4μm 之间的尺寸，此外作为所述第二配对13的传感器元件11的间距使用在20与30μm之间的尺寸，并且作为所述两个配对12、13的、靠得最近的传感器元件11的间距使用在30与40μm之间的尺寸。可以通过试验来具体说明所述最佳的几何关系。

实施例2：对在细胞聚合体内部的血小板22连同微生物（细菌、病毒或者菌类/酵母）进行标记

血小板22在初级的免疫防御的过程中具有越来越大的重要性，不过在所述初级的免疫防御的过程中它们在用免疫细胞支持的情况下或者在ITP的情况中也直接与外来生物体—比如细菌、病毒或者菌类及酵母进行相互作用。一般来讲，对于这两种引起血小板减少症的原因（ITP或者感染）的区分对接下来针对药物的治疗的选择具有决定性的意义。

在出现病毒性疾病的情况中，血小板22也能够通过吞噬来吸收并且使其不起作用。在这个过程中，血小板22也能够在其表面上呈现出MHC-I抗原（首先可以在免疫细胞上发现，不过也可以在血小板22上发现），用于向免疫系统报警。对于血液中的MHC-1的标记以及对于所述细胞的计数可以暗示免疫性血小板减少症。在这种情况下，可以将较大的细胞识别为免疫细胞，并且将较小的细胞识别为血小板22。

实施例3：在具有较大的细胞（循环的肿瘤细胞、自身的免疫细胞）的聚合体内部对于免疫系统的、身体本身的吞噬细胞进行标记

身体本身的吞噬细胞能够使得已经被免疫系统识别为异物的、循环的肿瘤细胞通过吞噬（吞咽）并且随后进行消化这样的方式来变得无害。在这个过程中，吞噬细胞的直径一方面显著变得更大，另一方面这些细胞在这个过程中并且在这个过程结束之后也在其表面上呈现出特殊的抗原（MHC-1）。对于这些抗原的磁性的标记、对于细胞大小的检测以及随后对于这些细胞的计数间接地表明循环的肿瘤细胞的、正常的数目或者提高了的数目。

实施例4：根据凝血过程中的上升的粘度来测量纤维蛋白形成（Fibrinbildung）：

在止血过程中，血液的粘度由于由纤维蛋白原形成纤维蛋白而上升。如果通过一种微流体的通道来导送所述血液，那么所述微粒就在没有摩擦的情况下随着液体流在这条通道的内部进行运动。

如果产生纤维蛋白（在凝血过程中的最后一个步骤），那么所述血液的粘度就持续上升，直至最终达到停止状态。如果所述粘度上升并且血液的流动速度减慢，那么处于血液中的微粒的速度就增加性地变小。在凝结的血液中的微粒的减慢情况可以用作用于其增加的粘度的尺度，并且与不能溶解的纤维蛋白的上升的份额直接关联。因此，借助于渡越时间-测量也可以测量处于所述通道中的血液的粘度的变化。

所述渡越时间-测量在此比如使用在所述两个配对12、13之间的间距以及在分析物从所述配对的旁边经过时由所述配对产生的信号。

实施例5：可以将磁珠用作用于流动速度的内部标准。

因为不同供体的血液的流动速度由于不同的原始粘度而可能变化，所以应该将内部的标准加入到所述试样中，该标准允许在每次测量开始时确定所述流动速度。这样的标准可以由磁性粒子所构成，所述磁性粒子应该明确地有别于分析物（小得多或者大得多），以便能够排除与分析物、也就是真正的细胞或者细胞集合体混淆的情况。

对于所述实施例4和5来说适用这一点：开始的泵功率总是相同的泵功率。

在所述实施例中，以所述传感器元件11在惠斯通电桥中的并联的布置为出发点。配对12、13的各个传感器元件11在此提供在时间上颠倒的信号，所述信号在重叠时引起开头所解释的、取决于所述分析物的信号序列。

在使用没有被连接成惠斯通电桥的传感器元件11时，或者在使用按照图7将所述传感器元件11对角地布置在所述惠斯通电桥中的方案时，所述传感器元件11的传感器信号不再在时间上颠倒，而是在没有颠倒的情况下彼此先后相随。在所述信号在时间上重叠时，由此在与所述传感器元件11彼此间的间距的比较中，同样产生表示出特征的、取决于相应的分析物的尺寸的信号形状。

Claims (3)

1.用于在对细胞悬浮液中的、至少两种不同尺寸的细胞种类（21、22）和/或细胞集合体种类（41、51）进行区分的情况下对细胞进行量化的装置（10），具有对磁场敏感的传感器，所述传感器则具有至少第一及第二配对（12、13）的传感器元件（11），其中

-所述第一配对（12）的传感器元件（11）具有处于第一种有待测量的细胞（21、22）或者细胞集合体（41、51）的、第一中等尺寸的一半与双倍之间的第一间距（14）；

-所述第二配对（13）的传感器元件（11）具有处于第二种有待测量的细胞（21、22）或者细胞集合体（41、51）的、第二中等尺寸的一半与双倍之间的第二间距（16）；

-所述配对（12、13）的、彼此靠得最近的传感器元件（11）的第三间距（15）大于所述两种中等尺寸中的较大的尺寸；

并且所述装置具有

-用于在所述传感器元件（11）的旁边导引所述细胞悬浮液的通道（20）；

-用于对所述第一配对的第一信号和所述第二配对的第二信号进行测评的测评机构，所述装置（10）如此构成，从而不仅对所述第一及第二信号的时间间隔（t1、t2）进行测评，而且对所述两个信号的幅度（24）进行测评，

其中所述装置（10）构造用于检测并且区分具有磁性的标记的血小板（22）、与这样的血小板（22）相结合的免疫细胞（21）以及由这样的血小板（22）所构成的集合体（41、51），其中为了掠过所述传感器对（12、13）之一，保存了第一信号幅度以及在所述信号之间的第一时间间隔，

-在所述第一及第二信号的幅度大于所述第一信号幅度的情况下，检测到由血小板（22）构成的集合体（41、51）；

-在所述第一信号的幅度大于所述第一信号幅度的情况下，第一和第二信号具有不同的幅度，并且检测到与所述血小板（22）相结合的免疫细胞（21）；

-在所述时间间隔大于所述第一时间间隔的情况下，检测到单个的血小板（22）。

2.按权利要求1所述的装置（10），其中所述第一间距（14）在1与4μm 之间，所述第二间距（16）在20与30μm之间，并且所述第三间距（15）至少为30μm。

3.按权利要求1或2所述的装置（10），其中所述配对（12、13）的传感器元件（11）分别被连接成惠斯通电桥。