CN104364382B

CN104364382B - 制备烃的方法

Info

Publication number: CN104364382B
Application number: CN201380029427.8A
Authority: CN
Inventors: D·莱斯; A·J·莫菲; D·A·帕克; K·A·P·派因; N·S·斯克鲁顿
Original assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Current assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Priority date: 2012-06-11
Filing date: 2013-06-11
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2033-06-11
Also published as: CN104364382A; BR112014030440A8; EP2859105A1; US20130330795A1; WO2013186215A1; PL2859105T3; EP2859105B1; US9157099B2; BR112014030440A2

Abstract

本发明涉及制备单‑不饱和的烯烃的方法，其包括使脂肪族单‑不饱和的羧酸与包含与SEQ ID NO:1具有至少21％序列同一性的氨基酸序列的Fdc1多肽和包含与SEQ ID NO:2具有至少17％序列同一性的氨基酸序列的Pad1多肽接触。

Description

制备烃的方法

【技术领域】

本发明涉及改良的产生在生物燃料和/或生物化学品的生产中有用的烯烃的方法，及在该方法中有用的表达载体和宿主细胞。

【背景技术】

随粗矿物油减少的供给，使用可再生的能源对于生产液体燃料和/或化学品而言变得越来越重要。这些来自可再生的能源的燃料和/或化学品常常被称为生物燃料。优选源于非-可食用可再生的能源的生物燃料和/或生物化学品，由于这些不与食品生产竞争。

烃诸如烯烃是燃料和/或化学品生产中的重要成分。因此会期望自非-可食用可再生的能源产生烯烃(有时也被称为生物-烯烃)。

【发明概述】

本发明的第1方面提供制备单-不饱和的烯烃的方法，其包括使脂肪族单-不饱和的羧酸与包含与SEQ ID NO:1具有至少21％序列同一性的氨基酸序列的Fdc1多肽(在本文也被称为阿魏酸脱羧酶多肽或阿魏酸脱羧酶)和包含与SEQ ID NO:2具有至少17％序列同一性的氨基酸序列的Pad1多肽(在本文也被称为苯丙烯酸脱羧酶多肽或苯丙烯酸脱羧酶)接触。

在优选的实施方式中，本发明提供制备末端单-不饱和的烯烃的方法，其包括使脂肪族α,β-单-不饱和的羧酸与下列多肽接触：具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽，该第1多肽包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列其有至少21％，优选至少30％序列同一性，更优选至少50％序列同一性的第1氨基酸序列，及具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽，该第2多肽包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少17％，优选至少37％序列同一性，更优选至少60％序列同一性的第2氨基酸序列。

不被任何种理论束缚，相信在环境条件下工作的由生物学催化剂的羧酸脱羧常常需要使用发挥瞬时电子受体作用的辅因子(例如硫胺素；生物素；金属)。认为，产生CO₂的C-C键的异裂键断裂可产生高度不稳定的碳负离子，除非电子对可离域。不需要辅因子的酶已有报道，但该酶常常具有非常严格的底物需求。

所谓的Fdc1/Pad1酶系统属于广义地催化芳族基的可逆的脱羧的酶家族。家族成员的辅因子需求，机理或个体性质至今未见任何详细报道。

酵母Fdc1和Pad1酶已牵涉芳族底物的脱羧(见Mukai N et al.(2010)J.Biosci.Bioeng.109,564-569的文章)。Pad1酶也已单独牵涉山梨酸的脱羧(见StratfordM et al.(2007)Appl.Environ.Microbiol.73,6534-6542的文章)。全部这些底物都最少具有与羧酸基相邻的2个双键，其已预期是酶机理的关键。意外地，现在已发现，使用Fdc1和Pad1的组合，通过在α和β位置之间具有碳双键的脂肪族单-不饱和的羧酸的脱羧而产生末端烯烃是可能的。

【发明详述】

除非在本文另外定义，本文所用的科学和技术术语会具有本领域普通技术人员通常明白的含义。

一般而言，在本文描述的在生物化学，酶学，分子和细胞生物学，微生物学，遗传学和蛋白和核酸化学和交叉科学的关联技术使用的命名法是本领域熟知的及通常使用的那些。

本文提及的常规方法和技术更详细解释于，例如，Sambrook等人。(分子克隆,实验室手册[第2版]Sambrook等人.冷泉港实验室,1989)。

本说明书中提到的氨基酸序列和核苷酸序列如说明书结尾部分的表3所示。术语"多核苷酸"，"多核苷酸序列"和"核酸序列"在本文互换使用。术语"多肽"，"多肽序列"和"氨基酸序列"同样在本文互换使用。由本发明包括的其他序列在序列表中提供及参照GenBank登录号列于表4和5。

本说明书通篇提到的酶学委员会(EC)号(在本文也被称为"类")根据国际生物化学与分子生物学联合会的命名委员会(NC-IUBMB)(例如，在http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/可利用的其资源"酶命名法"(1992,包括补充6-17)中)。此是基于由各酶类催化的化学反应的数字分类方案(酶命名法1992：recommendations of the NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology onthe nomenclature and classification of enzymes.Webb,E.C.(1992)。San Diego：由学术出版社为国际生物化学与分子生物学联合会出版.ISBN 0-12-227164-5)。本领域技术人员可例如使用可获自国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的方法容易确定是否酶落入在本文提到的任何特定酶类之内。

术语"Fdc1多肽"指属于EC类No.4.1.1的阿魏酸脱羧酶。术语"Fdc1多肽"与术语"Fdc1酶"和"Fdc1蛋白"在本文互换使用。"具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽"优选是"Fdc1多肽"。"Fdc1多肽"或"具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽"可包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)Fdc1蛋白)或与SEQ ID NO:1具有至少21％同一性，更优选至少30％，甚至更优选至少50％或至少55％同一性的变体氨基酸序列(例如,表4中所列的序列,诸如SEQ ID NO:1和16～26)。更优选"Fdc1多肽"或"具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽"基本上由氨基酸序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少21％同一性，更优选至少30％，甚至更优选至少50％或至少55％同一性的变体氨基酸序列组成。最优选"Fdc1多肽"或"具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽"由氨基酸序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少21％同一性，更优选至少30％，甚至更优选至少50％或至少55％同一性的变体氨基酸序列组成。

术语"Pad1多肽"指属于EC类No.4.1.1的苯丙烯酸脱羧酶。术语"Pad1多肽"在本文与术语"Pad1酶"和"Pad1蛋白"互换使用。"具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽"优选是"多肽Pad1"。"Pad1多肽"或"具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽"可包含氨基酸序列SEQ IDNO:2(啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)Pad1蛋白)或与SEQ ID NO:2具有至少17％同一性，更优选至少37％，甚至更优选至少60％或至少65％同一性的变体氨基酸序列(例如,表5中所列的序列，诸如SEQ ID NO:2和27～37)。更优选"Pad1多肽"或"具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽"基本上由氨基酸序列SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少17％同一性，更优选至少37％，甚至更优选至少60％或至少65％同一性的变体氨基酸序列组成。最优选"Pad1多肽"或"具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽"由氨基酸序列SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少17％同一性，更优选至少37％，甚至更优选至少60％或至少65％同一性的变体氨基酸序列组成。

当脂肪族单-不饱和的羧酸与Fdc1多肽和Pad1多肽，分别与具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽和具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽接触时，产生烯烃是可能的，该烯烃包含仅一个不饱和的碳-碳键。有利地，自在α和β位置之间具有碳双键的脂肪族羧酸产生末端烯烃是可能的。即，本发明有利地允许通过使在α和β位置之间具有碳双键的脂肪族单-不饱和的羧酸与Fdc1多肽和Pad1多肽，分别与具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽和具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽接触来产生单-不饱和的末端烯烃。

在本文理解的"烯烃"是包含至少一个碳-碳双键的不饱和的脂肪族烃化合物。"烃化合物"在本文也被称为"烃"。在本文理解的"烃化合物"是由氢和碳组成的化合物。可使用本发明的方法制备(即产生的)适合的烯烃的例具有线性或分支的形态的等于或多于4至等于或少于30个碳原子及包含一个或更多双键。可通过使用本发明的方法制备的烯烃的特定例包括具有达2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或达20个碳原子的直链或支链烯烃。

通过使用本发明的方法制备的一种或更多烯烃是单-不饱和的烯烃。在本文理解的"单-不饱和的烯烃"是包含仅一个不饱和的碳-碳键的烯烃，该一个不饱和的碳-碳键是碳-碳双键。

在优选的实施方式中，使用本发明的方法制备的(即产生的)一种或更多烯烃是末端烯烃。该"末端烯烃"可在本文也称为例如"1-烯烃"，"α-烯烃"，"α-烯烃"或"α-烯烃"。在本文理解的"末端烯烃"是在烯烃中的末端碳原子和其相邻碳原子之间包含碳-碳双键的烯烃。即，在优选的实施方式中，通过使用本发明的方法制备的一种或更多烯烃是末端单-不饱和的烯烃。在本文理解的"脂肪族不饱和的羧酸"是包含不饱和的碳-碳键的脂肪族羧酸。在本文理解的"脂肪族单-不饱和的羧酸"是具有仅一个不饱和的碳-碳键的脂肪族不饱和的羧酸。不饱和的碳-碳键优选是所谓的碳-碳双键。因此，脂肪族不饱和的羧酸优选是包含单个碳-碳双键的脂肪族不饱和的羧酸。

由此，优选脂肪族单-不饱和的羧酸是链烯酸。链烯酸在本文也被称为"烯酸"。在本文理解的链烯酸是包含碳-碳双键的不饱和的脂肪族羧酸。脂肪族单-不饱和的羧酸更优选是α-链烯酸(有时也被称为例如α-链烯酸或2-链烯酸)。在本文理解的α-链烯酸是在碳链的α和β位置(相对于羧基)之间包含碳-碳双键的不饱和的脂肪族羧酸。当脂肪族单-不饱和的羧酸是该α-链烯酸时，在本发明的方法中制备的烯烃可有利地是末端烯烃。

在尤其优选的实施方式中，脂肪族单-不饱和的羧酸是脂肪族α,β-单-不饱和的羧酸。在本文理解的该"脂肪族α,β-单-不饱和的羧酸"是包含仅一个单不饱和的碳-碳键的脂肪族羧酸，读单不饱和的碳-碳键位于羧酸的α-碳和β-碳之间。脂肪族α,β-单-不饱和的羧酸优选是具有单个碳-碳双键的脂肪族α,β-单-不饱和的羧酸。该具有单个碳-碳双键的脂肪族α,β-单-不饱和的羧酸可在本文也称为"α,β-单-不饱和的链烯酸"。因此，脂肪族单-不饱和的羧酸优选是脂肪族α,β-单-不饱和的链烯酸。如以上解释，当使用该脂肪族α,β-单-不饱和的链烯酸时，制备的烯烃可有利地是末端单-不饱和的烯烃。

在实施方法之前，可在单步骤中使多于一种类型的羧酸与Fdc1和Pad1多肽接触，导致烯烃的混合物产生，依赖于起初存在的羧酸。在优选的实施方式中，通过接触包含至少一种或更多α,β-单-不饱和的链烯酸的脂肪族不饱和的羧酸的混合物来制备包含至少一种或更多末端单-不饱和的烯烃的烯烃混合物。

方法可随后包括分离烯烃和/或烯烃的混合物。术语"分离烯烃"指从其他非-烃组分分离烯烃，或烯烃的混合物。此可指在分离之后，例如，以重量计至少约50％的样品由，例如，至少约60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％99％或100％烯烃组成。在本发明的工作期间产生的烯烃可由任何知道的技术分离(即,分离)。一种例示过程是2-相(双-相)分离过程，涉及经一段时期和/或在对于允许在有机相中收集烯烃足够的条件下实施该方法，及自水相分离有机相。此可尤其相关联，当，例如，该方法在宿主细胞诸如微-生物之内实施时，如下所述。双-相分离使用烃的相对不混溶性来辅助分离。"不混溶性"指称化合物相对不能溶解于水中，及由化合物的分配系数定义，如本领域技术人员会熟知。

在本发明的一实施方式中，Fdc1和/或Pad1多肽(分别"具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽"和/或"具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽")由重组宿主细胞，诸如重组微-生物表达。因此，本发明的第1方面的方法可在宿主细胞之内发生，即，方法可至少部分为体内方法。宿主细胞可为重组体和可为，例如，遗传修饰的微生物。因此，微-生物可遗传修饰，即，自其天然的状态人工改变，以表达Fdc1和/或Pad1多肽(分别"具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽"和/或"具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽")中的至少一种及，优选，这两种。本文所述的其他酶也可由微-生物表达。优选地，酶是外源的，即，在修饰之前不存在于细胞内，已通过使用微生物方法导入，诸如在本文所述。此外，在本发明的方法中，酶可各由重组宿主细胞，在相同的宿主细胞之内或在分离的宿主细胞中表达。烃可自其所形成的宿主细胞分泌。

宿主细胞可由本领域技术人员知道适宜于此目的的任何方式遗传修饰。此包括在质粒或粘粒或在宿主细胞之内繁殖的其他表达载体上导入目标基因，诸如一种或更多编码Fdc1和/或Pad1多肽(分别"具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽"和/或"具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽")的基因。或者，质粒或粘粒DNA或质粒或粘粒DNA的部分或线性DNA序列可，例如由同源重组整合进宿主基因组。为了实施遗传修饰，可将DNA由天然的摄取导入或转化进细胞或由过程诸如电穿孔介导。遗传修饰可涉及在导入的启动子控制下表达基因。导入的DNA可编码可发挥酶的作用或可调控其他基因的表达的蛋白。

该宿主细胞可包含编码Fdc1和/或Pad1多肽(分别"具有阿魏酸脱羧酶活性的第1多肽"和/或"具有苯丙烯酸脱羧酶活性的第2多肽")的核酸序列。例如，细胞可包含包含下列之至少一种的至少一种核酸序列：多核苷酸序列SEQ ID NO:3～7或38～59或其补体，或编码酶Fdc1和/或Pad1，例如本文所述的酶的功能变体或片段的该多核苷酸的片段。编码酶的核酸序列可为外源，即，不天然存在于宿主细胞。在本发明的第2方面，重组宿主细胞，诸如微-生物，优选包含至少一种多肽，所述多肽是Fdc1酶，例如，具有与SEQ ID NO:1具有至少21％同一性的氨基酸序列及属于EC类4.1.1.-(例如SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25和/或26之任一个)；和/或优选包含至少一种多肽，所述多肽是Pad1酶，例如，具有与SEQ ID NO:2具有至少17％同一性的氨基酸序列及属于EC类4.1.1.-(例如,SEQ ID NO:27,28,29,30,31,32,33,34,35,36和/或37之任一个)，或这些序列之任何的功能变体或片段。例如，重组宿主细胞可包含编码与SEQ ID NO:1具有至少21％同一性的多肽或编码与SEQ ID NO:2具有至少17％同一性的多肽，或这些之功能变体或片段的多核苷酸。因此，多核苷酸可包含下列多核苷酸序列中的至少一种：SEQ ID NO:3，4，5，6和/或7和/或38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58和/或59。在一实施方式中，重组宿主细胞含有包含与SEQ ID NO:1具有至少21％同一性的氨基酸序列(例如,选自在本文表4中列出的序列,诸如SEQ ID NO:1和16,17,18,19,20,21,22,23,24，25和26)的多肽和包含与SEQ ID NO:2具有至少21％同一性的氨基酸序列(例如,选自在本文表5中列出的序列,诸如SEQ ID NO:2和27,28,29,30,31,32,33,34,35，36和37)的多肽。重组宿主细胞可包含多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1和2二者和/或与SEQ ID NO:1具有至少21％同一性的氨基酸序列(例如,表4中序列之任一个,诸如SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24，25或26)和与SEQ ID NO:2具有至少17％同一性的氨基酸序列(例如,表5中序列之任一个,诸如SEQ ID NO:27,28,29,30,31,32,33,34,35，36或37)。该多肽可为，例如，融合蛋白。在例示实施方式中，重组宿主细胞可包含下列多核苷酸序列之一种或更多：SEQ ID NO:3，4，5，6和/或7。在其他实施方式中，重组宿主细胞可包含下列多核苷酸序列之一种或更多：SEQID NO:38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58和/或59。

在本发明的第3方面，适合的多核苷酸可优选由同源重组导入细胞和/或可形成包含下列多核苷酸序列中的至少一种的表达载体的部分：SEQ ID NO:3，4，5，6和/或7(或SEQID NO:38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58和/或59)或其补体。对于该表达载体的构建适合的载体为本领域所熟知(例在以上提及)和可被排列而包含与一个或更多表达控制序列可操作地连接的多核苷酸，以对于在宿主细胞，上述例如微-生物中表达需要的酶有用。

在一些实施方式中，贯穿此说明书提及的重组体或遗传修饰的宿主细胞可为任何微-生物或微-生物的部分，所述微-生物选自：真菌(诸如糖酵母属(Saccharomyces)的成员)，原生生物，藻，细菌(包括蓝细菌)和古细菌。细菌可包括革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌和/或可选自埃希氏菌属(Escherichia)，芽孢杆菌属(Bacillus)，乳杆菌属(Lactobacillus)，红球菌属(Rhodococcus)，假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)。蓝细菌可选自：细长聚球藻(Synechococcus elongatus)，集胞藻属(Synechocystis)，海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)，多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)，点形念珠藻(Nostoc punctiforme)，青紫粘杆菌(Gloeobacter violaceus)，蓝丝菌属(Cyanothece sp.)和聚球藻属(Synechococcus sp.)。选择适合的微-生物(或其他表达系统)在本领域技术人员的常规能力之内。特别适合的微-生物包括大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，例如。

在本发明的相关的实施方式中，Fdc1和/或Pad1多肽或这些的功能变体或片段可在非-微-生物细胞诸如培养的哺乳动物细胞或植物细胞或昆虫细胞。哺乳动物细胞可包括CHO细胞，COS细胞，VERO细胞，BHK细胞，HeLa细胞，Cvl细胞，MDCK细胞，293细胞，3T3细胞和/或PC12细胞中表达。

重组宿主细胞或微-生物可用于由标准方法表达上述酶和获得的无细胞的提取物，用于在根据本发明的第1方面的方法中使用。

本发明也包括本文定义的多肽的变体。如本文所用，"变体"是指氨基酸序列，自其所来源的碱基序列，序列之内的一个或更多氨基酸被其他氨基酸代替而不同的多肽。例如，SEQ ID NO:1的变体与SEQ ID NO:1具有类似或同一阿魏酸脱羧酶特征，由上述NC-IUBMB的酶命名法分类进酶类EC 4.1.1.-。其可具有与SEQ ID NO:1具有至少约21％同一性，例如，至少约25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或约100％同一性的氨基酸序列。适合的变体可包括表4中所列的蛋白，特定例是SEQ ID NO:16～26之任何。变体是变体序列与本文所述的具有非-变体氨基酸序列的酶具有类似或，优选，同一功能酶活性特征的功能变体(且此是贯穿此说明书使用的术语"功能变体"的含义)。以上提及的与SEQ ID NO:1类似或同一阿魏酸脱羧酶特征可例如，通过比较肉桂酸由变体(在SEQ ID NO:2的存在下)转变为苯乙烯的速度与在SEQ ID NO:2的存在下由SEQ ID NO:1达到的速度来评定。对于功能变体，此速度可相同于或类似于，例如至少约60％，70％，80％，90％或95％由SEQ ID NO:1(啤酒糖酵母(S.cerevisiae)Fdc1蛋白)达到的速度。

同样，SEQ ID NO:2的变体与SEQ ID NO:2具有类似或同一苯丙烯酸脱羧酶特征，及分类进酶类EC 4.1.1.-。其可具有与SEQ ID NO:2具有至少约17％同一性，例如，至少约20％，25％，30％，35％，37％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或约100％同一性的氨基酸序列。适合的变体可包括表5中所列的蛋白，特定例是SEQ ID NO:27～37之任何。再次，SEQ IDNO:2的变体的活性可通过测量肉桂酸由变体(在SEQ ID NO:1的存在下)转变为苯乙烯的速度与在SEQ ID NO:1的存在下由SEQ ID NO:2达到的速度来测定。

当氨基酸被具有广义地类似性质的不同氨基酸取代时，氨基酸取代可被认为是"保守性的"。当氨基酸被不同类型的氨基酸取代时是非-保守性取代。

"保守性取代"是指氨基酸被相同的类的另一氨基酸取代，其中类定义如下：

类	氨基酸例
		非极性的氨基酸	A，V，L，I，P，M，F，W
不带电的极性氨基酸	G，S，T，C，Y，N，Q
		酸性氨基酸	D，E
碱性氨基酸	K，R，H

如为本领域技术人员所熟知，由保守性取代改变多肽的一级结构可不显著地改变该多肽的活性，因为被插入序列的氨基酸侧链可能与已被取代出的氨基酸侧链形成类似键和接触。当取代在确定多肽的构象中是关键的区中时，此甚至也是如此。

在本发明中，只要这些不间断多肽的酶活性，非-保守性取代也是可能的，如在本文别处定义。

广义地讲，只要不改变多肽的生物学活性，相比保守性取代更少的非-保守性取代会是可能的。任何取代(及实际上任何氨基酸缺失或插入)的效应的确定完全在本领域技术人员的常规能力之内，其可容易测定是否变体多肽保留本发明的酶活性，如上所述。例如，当确定是否多肽变体落入本发明的范围之内(即,是以上定义的"功能变体或片段")时，本领域技术人员会测定是否变体或片段保留是非-变体多肽的至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约80％，仍更优选约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或约100％活性的底物转变酶活性。在一些情况中，变体可具有大于非-变体多肽的100％活性的酶活性，即，变体可相比非-变体改善了酶活性，和在相同的条件(例如,底物浓度,温度)下，相比由非-变体达到的速度，增加关联于特定酶的底物转变速度。全部该变体在本发明的范围之内。

除了本文公开的那些之外，使用标准遗传密码，其他编码多肽的核酸序列可由本领域技术人员容易想出及生产。核酸序列可为DNA或RNA及，当其是DNA分子时，其可例如包含cDNA或基因组DNA。核酸可含在表达载体之内，如在本文别处描述。

因此，本发明包括编码本发明的多肽的变体核酸序列。术语"变体"关于核酸序列是指自或向多核苷酸序列一个或更多核酸的任何替代，变异，修饰，取代，缺失或添加，只要得到的由多核苷酸编码的多肽序列与由基础序列编码的多肽呈现至少相同的或类似酶促性质。术语因此包括等位基因变体，也包括与本发明的多核苷酸序列基本上杂交的多核苷酸("探针序列")。该杂交可在低和高严格度条件下或在低和高严格度条件之间发生。总而言之，低严格度条件可定义为杂交中的洗涤步骤在比探针序列的计算的或实际熔解温度(T_m)低约40～48℃的温度(例如,约环境实验室温度至约55℃)，在0.330-0.825M NaCl缓冲溶液中发生；而高严格度条件涉及在比探针序列的计算的或实际T_m低约5～10℃的温度(例如,约65℃)，在0.0165-0.0330M NaCl缓冲溶液中洗涤。缓冲溶液可为，例如，SSC缓冲剂(0.15M NaCl和0.015M柠檬酸三钠)，低严格度洗涤在3×SSC缓冲剂中发生和高严格度洗涤在0.1×SSC缓冲剂中发生。核酸序列的杂交中涉及的步骤已描述于例如Sambrook等人(10)。

适宜地，核酸序列变体与本发明的核酸序列具有约55％或更多的共同核苷酸，更适宜地具有60％，65％，70％，80％，85％或甚至90％，95％，98％或99％或更大序列同一性。

本发明的变体核酸可为为在特定宿主细胞中表达而密码子-优化的。

氨基酸序列之间的序列同一性可通过使用自美国生物技术信息中心(NCBI)，Bethesda，Maryland，USA，例如经http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi可利用的Needleman-Wunsch全局序列比对工具，使用默认参数设置(为蛋白比对,空位值存在：11，延伸：1)比较序列比对来测定。此说明书中提及的序列比较和百分率同一性已通过使用此软件确定。当比较与例如，SEQ ID NO:1的序列同一性水平时，此适宜地可相对于SEQ ID NO:1的全长(即,使用全局比对方法)进行，以避免高同一性重叠的短区，导致同一性的高总体评定。例如，具有，例如，5个氨基酸的短多肽片段可与SEQ ID NO:1全体之内的5个氨基酸区具有100％同一序列，但根据本定义，此不提供100％氨基酸同一性，除非片段形成在与SEQ IDNO:1中的位置相当的其他位置也具有同一氨基酸的更长序列的部分。当比较的序列中的相当的位置被相同的氨基酸占据时，则分子在该位置同一。将比对评分为同一性百分率是在由比较的序列共享的位置同一氨基酸数的函数。当比较序列时，最佳比对可需要将间隔导入一种或更多序列，以考虑序列中可能的插入和缺失。序列比较方法可采用空位罚分，从而，对于被比较的序列中相同的数的同一分子，具有尽可能少的间隔的序列比对(反映2个比较的序列之间更高亲缘关系)会相比具有许多间隔的达到更高分值。最大百分率同一性的计算涉及考虑空位罚分而产生最佳比对。如上所述，百分率序列同一性可通过使用Needleman-Wunsch全局序列比对工具，使用默认参数设置确定。Needleman-Wunsch算法公开于J.Mol.Biol.(1970)vol.48:443-53。

用于本发明的方法，载体和宿主细胞的多肽和多核苷酸序列显示于序列表及表4和5。

根据本发明的第4方面，提供生产烷烃的方法，其包括根据本发明的第1方面的方法中产生的分离的烯烃的氢化。

在优选的实施方式中，本发明因此提供产生烷烃的方法，其包括下列步骤或由下列步骤组成：

(a)使一种或更多脂肪族不饱和的羧酸，优选包含至少一种α,β-单-不饱和的链烯酸与包含与SEQ ID NO:1具有至少21％序列同一性的氨基酸序列的Fdc1多肽和包含与SEQID NO:2具有至少17％序列同一性的氨基酸序列的Pad1多肽接触而产生一种或更多烯烃，优选包含至少一种末端单-不饱和的烯烃；

(b)分离一种或更多烯烃，优选包含至少一种末端单-不饱和的烯烃而产生一种或更多分离的烯烃，优选包含至少一种分离的末端单-不饱和的烯烃；

(c)氢化一种或更多分离的烯烃，优选包含至少一种分离的末端单-不饱和的烯烃，而产生一种或更多烷烃。

步骤(a)和(b)的优先选择如以上为本发明的第1，第2和第3方面描述。

分离的烯烃中的不饱和的键可被氢化而产生烷烃。氢化可以本领域技术人员知道适宜于不饱和的化合物的氢化的任何方式实施。氢化催化剂可为本领域技术人员知道适宜于此目的的任何类型的氢化催化剂。氢化催化剂可包含，例如，在催化剂支持物上支持的一种或更多氢化金属。一种或更多氢化金属可选自元素周期表的组VIII和/或组VIB。氢化金属可以许多形式存在：例如，其可提供为混合物，合金或有机金属化合物。一种或更多氢化金属可选自：镍(Ni)，钼(Mo)，钨(W)，钴(Co)和其混合物。催化剂支持物可包含耐高温氧化物或其混合物，例如，矾土，无定形氧化硅-矾土，二氧化钛，氧化硅，铈土，氧化锆；或其可包含惰性组分诸如碳或碳化硅。

氢化温度可为，例如，300℃～450℃，例如，300℃～350℃。压力可为，例如，50巴(绝对)～100巴(绝对)，例如，60巴(绝对)～80巴(绝对)。

本发明的第5方面提供产生分支的烷烃的方法，其包括根据本发明的第1方面的方法中产生的分离的烯烃，或根据本发明的第4方面的方法中产生的烷烃的氢异构化。氢异构化可以本领域技术人员知道适宜于烷烃的氢异构化的任何方式实施。氢异构化催化剂可为本领域技术人员知道适宜于此目的的任何类型的氢异构化催化剂。一种或更多氢化金属可选自元素周期表的组VIII和/或组VIB。氢化金属可以许多形式存在，例如其可提供为混合物，合金或有机金属化合物。一种或更多氢化金属可选自：镍(Ni)，钼(Mo)，钨(W)，钴(Co)和其混合物。催化剂支持物可包含耐高温氧化物，沸石或其混合物。催化剂支持物的例包括矾土，无定形氧化硅-矾土，二氧化钛，氧化硅，铈土，氧化锆；及沸石Y，沸石β，ZSM-5，ZSM-12，ZSM-22，ZSM-23，ZSM-48，SAPO-11，SAPO-41及镁碱沸石。

氢异构化可在例如，280～450℃范围的温度和例如，20～160巴(绝对)范围的总压力实施。

在一实施方式中，氢化和氢异构化同时实施。

本发明的第6方面提供产生生物燃料和/或生物化学品的方法，其包括将根据本发明的第1方面的方法产生的烯烃与一种或更多另外的组分组合而产生生物燃料和/或生物化学品。

根据本发明的第7方面提供产生生物燃料和/或生物化学品的方法，其包括将根据本发明的第4或第5方面产生的烷烃与一种或更多另外的组分组合而产生生物燃料和/或生物化学品。

在第6和第7方面，可将烷烃和/或烯烃作为生物燃料组分和/或生物化学组分与一种或更多其他组分混合而产生生物燃料和/或生物化学品。在本文理解的生物燃料或生物化学品分别是至少部分来源于可再生的能源的燃料或化学品。可与烷烃和/或烯烃混合的一种或更多其他组分的例包括抗氧化剂，腐蚀抑制物，无灰去污剂，去霾剂，染料，润滑性改良剂和/或矿物质燃料组分，也有常规石油来源的汽油，柴油和/或煤油级分。

本发明的再一方面提供根据本发明的第2方面的宿主细胞作为生物燃料/生物化学烃前体源的用途。"生物燃料/生物化学烃前体"是烃，适宜地烯烃或烯烃的混合物，其可用于制备生物燃料和/或生物化学品，例如在根据本发明的第6或第7方面的方法中。宿主细胞用作该前体的源的用途指根据本发明的第2方面的宿主细胞产生适合于在生物燃料/生物化学产生方法中使用的烃，烃可分离自重组宿主细胞，如在本文别处描述。

贯穿本申请的说明书和权利要求书，词汇"包含(comprise)"和"含有(contain)"和该词汇的变体，例如"包含(comprising)"和"包含(comprises)"，是指"包括但不限于"及不排除其他部分，添加物，组分，整体或步骤。贯穿本申请的说明书和权利要求书，单数包括复数个，除非情景另外需要。尤其是，当使用无限的物品时，说明应被理解为涵盖多数以及单数，除非情景另外要求。

本发明的各方面的优选的特征可如关联任何其他方面描述。

本发明的其他特征会自下列实施例变得显而易见。一般而言，本发明扩展到此说明书中公开的特征的任何新一种，或任何新组合(包括随附权利要求和图)。由此，结合本发明的特定方面，实施方式或例描述的特征，整体，特征，化合物或化学部分应被理解为可应用于文所述的任何其他方面，本实施方式或例，除非与之不相容。

而且，除非另外陈述，本文公开的任何特征可被服务于相同的或类似目的的替代性的特征取代。

【附图说明】

现在会参照以下图1～6，由仅例示方式显示本发明的实施方式：

图1显示一系列蛋白纯化表达试验的SDS-PAGE凝胶：对于含有Fdc1的样品，条带可对应于58kDa His-标记的Fdc1容易观察；相反，Pad1表达水平非常低；

图2显示Pad1-TF融合蛋白的异源表达：融合蛋白是可溶性和可通过使用亲和层析纯化；融合蛋白结合黄素，指示Pad1折叠；

图3显示自表达Fdc1/Pad1的细胞(自顶部第3描迹图)及自纯蛋白提取物(顶部描迹图)的顶部空间样品的GC-MS分析，确认与肉桂酸温育之后苯乙烯产生；自顶部第2描迹图是仅缓冲剂样品和最后的描迹图是空pCOLAduet质粒样品；

图4显示纯化的Fdc1/Pad1的酶促活性的高-通量基于pH的筛选的结果；

图5显示使用UV-VIS光谱学的酶反应性的直接监测：小图A显示在230～400nm范围监测的辛三烯酸的酶催化的转变，和B显示酶添加之后观察的在单个波长的吸光度线性减小；以及

图6显示由GC-MS的1-戊烯鉴定，指示自2-己烯酸酶-催化产生1-戊烯(A)，相比无酶的对照(B)。

【实施例】

除非另外说明，任何溶液和/或浓度是在蒸馏水中的。

【异源表达】

将fdc1基因和pad1基因为在大肠埃希氏菌(E.coli)中表达而密码子优化，并如在此文本内详述合成。将密码子优化的fdc1和pad1基因使用聚合酶链反应(PCR)克隆进pCOLAduet-1载体(可商购的自Merck Millipore)，以确保酶的两个亚基的高表达。pCOLADuet-1载体携带COLA复制子，lacI基因和卡那霉素抗性基因。引物用于与密码子优化的基因序列互补。通过使用In-fusion Advantage PCR克隆试剂盒(商业上获自Clontech,In-fusion是商标)克隆fdc1和pad1基因。使用的引物显示于下表1。

表1：引物

为在大肠埃希氏菌(E.coli)中表达密码子优化的酵母fdc1基因(Genbank登录号No.NM_001180847.1)和酵母pad1基因(Genbank登录号No.NM_001180846)的版本(分别是SEQ ID NO:3和4)商业上获自GenScript及在pUC57构建体中提供。

为个别表达各酶，将fdc1基因和pad1基因分别从pUC57构建体由聚合酶链反应(PCR)，使用Pfu Ultra II融合HS DNA聚合酶(可商业上获自Agilent)扩增。由DpnI(肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)核酸酶-I)消化(可商业上获自New England Biolabs)去除模板，使用以下描述的In-fusion Advantage PCR克隆试剂盒(商业上获自Clontech,In-fusion是商标)，将基因克隆进pCOLAduet-1载体(可商购的自Merck Millipore)中的多克隆位点1(MCS1)的SacI/AflII位点。

为各酶个别表达，分别将fdc1基因和pad1基因个别克隆进pCOLAduet-1载体(可商购的自Merck Millipore)中的多克隆位点1(MCS1)的SacI/AflII位点。为两个基因的共表达，首先将fdc1基因克隆进pCOLAduet-1载体的MCS1的SacI/AflII位点，然后将pad1基因克隆进pCOLAduet-1载体的多克隆位点2(MCS2)的NdeI/XhoI位点。

为了克隆进pCOLAduet-1载体(也有时被称为表达载体)，将pCOLAduet-1载体通过用2种关联限制酶(即.SacI/AflII分别NdeI/XhoI)消化来线性化，并将PCR产物和线性化的pCOLAduet-1载体通过使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(可商业上获自Qiagen)纯化。将纯化的PCR产物及纯化的线性化的pCOLAduet-1载体以2:1比(PCR产物比载体)加入10ml反应体积中2ml的5×In-fusion缓冲剂和1ml In-fusion酶(获自In-fusion Advantage PCR克隆试剂盒,Clontech)。将反应物于37℃温育15分钟，之后是于50℃温育15分钟。之后将反应混合物用10mM Tris(三(羟甲基)甲氨基)丙烷)/Cl pH8.5缓冲剂稀释至50mL，并将2.5ml转化进50ml化学感受态大肠埃希氏菌(E.coli)NEB5a(可商业上获自New England Biolabs)。将来自许多转化体的质粒通过使用Qiaprep miniprep试剂盒(可商业上获自Qiagen)纯化。基因插入pCOLAduet-1载体通过限制消化(如上所述)及测序确认。

使Fdc1和/或Pad1多肽在于37℃在补充40μg/ml(微克/毫升)卡那霉素的Luria-Bertani(LB)中生长的大肠埃希氏菌(E.coli)B121(DE3)中表达。在中-对数期，用0.25mM(毫摩尔每升,在蒸馏水中)异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导细胞及于25℃生长过夜。

为了纯化Fdc1和/或Pad1多肽，使细胞沉淀重悬浮于补充约1mg/ml(豪克/毫升)母鸡卵白溶菌酶(可商业上获自Sigma)，10μg/ml(微克/毫升)脱氧核糖核酸酶I(可商业上获自Sigma)，10μg/ml核糖核酸酶A(可商业上获自Sigma)和完全无EDTA蛋白酶抑制物混剂(可商业上获自Roche)的纯化缓冲剂(蒸馏水中的200mM NaCl,50mM磷酸钠(NaPi),pH7.5)。由弗压碎器裂解细胞，并将约48384g的裂解物离心而产生上清液和沉淀残留物。将咪唑添加到澄清的上清液，直到获得10mM(毫摩尔每升)咪唑终浓度。随后将含有咪唑的上清液应用于5ml镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖(也被称为Ni²⁺-琼脂糖,可商业上获自Qiagen)。将柱用3柱体积的补充10mM咪唑的纯化缓冲剂和随后另一3柱体积的含50mM咪唑的纯化缓冲剂洗涤，及将多肽4×1ml含有250mM咪唑的纯化缓冲剂洗脱。将级分由SDS-PAGE(十二烷基-硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，以检测Fdc1/Pad1多肽的存在。将含有期望的多肽的级分合并，及使用Econo-Pac 10DG(即包含10ml Bio-GelP-6DG凝胶)脱盐柱(BioRad)缓冲剂更换为200mM NaCl，50mM NaPi pH7.5，以去除咪唑。

在各种表达条件/大肠埃希氏菌(E.coli)株下Fdc1和/或Pad1多肽产率的分析揭示，可容易达到显著量的Fdc1多肽(图1)。相反，使用SDS-PAGE，Pad1蛋白不作为不同条带可见，指示低表达水平。(从在存在或不在在pad1基因下生长的含有fdc1基因的细胞)Fdc1多肽的多肽纯化是简单的，产生大量的纯Fdc1多肽。Pad1多肽的存在可通过用抗-组氨酸(His)-标签抗体的蛋白印迹，或经通过凝胶内胰蛋白酶消化的Pad1多肽的直接检测检测(未显示)。Pad1水平被发现是对应Fdc1水平的<5％。

发明人发现，Pad1水平可通过蛋白与引发因子类型伴侣的融合增加。通过使用扩增引物实现Pad1引发因子的克隆及表达：

Pad1TFF(SEQ ID NO:14)：5‘-TCGAAGGTAGGCATATGCTGCTGTTCCCGCGTCGCACC-3'

Pad1TFR(SEQ ID NO:15)：5‘-ATTCGGATCCCTCGAGCTATTTGCTTTTGATACCTTCCCAGCGCGG-3'

从pUC57载体中的密码子优化的基因，由PCR，使用Phusion DNA聚合酶(NEB)反应扩增Pad1基因。由DpnI消化移出模板，并将基因使用输注HD克隆试剂盒(可商业上获自Clontech)插入线性化的pCold TF载体(可商业上获自Takara Bio Inc.)的NdeI/XhoI位点。Takara的pCold TF DNA载体是表达引发因子(TF)伴侣作为可溶性融合标签的融合冷休克表达载体。引发因子是大肠埃希氏菌(E.coli)来源的原核生物核糖体-关联的伴侣蛋白(48kDa)。pCold TF DNA载体由cspA启动子加包括5‘非翻译区(5’UTR)，翻译增强元件(TEE)，His-Tag序列，及多克隆位点(MCS)的另外的下游序列组成。Lac操纵子被插入到cspA启动子的下游，以确保表达的严格的调节。此外，HRV 3C蛋白酶，凝血酶和因子Xa的识别位点位于TF-Tag和MCS之间及发挥辅助标签自表达的融合蛋白移出的功能。

使大肠埃希氏菌(E.coli)B121(DE3)中的pad1pCold TF在补充50μg/ml氨苄西林的LB肉汤中于37℃生长至0.6～0.8的OD₆₀₀。通过添加0.25mM ITPG来诱导表达，使培养物于15℃生长过夜。

将细胞沉淀重悬浮于补充溶菌酶，DNA酶，RNA酶和无EDTA完全蛋白酶抑制物混剂(Roche)的纯化缓冲剂(400mM NaCl,50mM NaPi pH7.5)中。将细胞由弗压碎器裂解，并将裂解物离心。澄清的上清液补充10mM咪唑，及应用于5ml Ni²⁺-琼脂糖(Qiagen)。将柱用3柱体积的补充10mM咪唑的纯化缓冲剂，并随后另一3柱体积的含50mM咪唑的纯化缓冲剂洗涤，及将蛋白用4×1ml补充250mM咪唑的纯化缓冲剂洗脱。将级分由SDS-PAGE分析，以确认引发因子-Pad1融合蛋白的存在(图2A)。

【酶活性研究】

在培养基中使用外源供给的底物(即山梨酸)实施体内酶活性测定。显著酶活性导致可测量的pH增加(通过CO₂释放和H⁺摄取碱化)。

为体内pH测定，给LB琼脂板补充蒸馏水中的40mg/ml卡那霉素，6mM山梨酸和0.004％w/v酚红，并缓冲至pH6.2。将含有共表达质粒或空pCOLAduet-1的大肠埃希氏菌(E.coli)B121(DE3)细胞接种到板，及于37℃生长过夜。使用酚红作为pH指示物，发明人可建立，底物依赖性体内碱化(即,观察的黄色至红色变化)明显关联于fdc1/pad1基因的存在。此允许酶活性水平的快速视觉指示。

为体外pH测定，在含有200μl 50mM KCl，0.06～1mM Hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，0.002％酚红和0～50mM底物，pH6.8的96孔板中检定纯化的His-Fdc1/Pad1的活性。使用协同高通量(HT)平板读数仪(可商业上获自BioTek)，通过在560nm波长(A₅₆₀)处的吸光度增加追踪碱化率。

根据体外酶活性的阳性指示，通过使用顶部空间气相层析-质量光谱法(GC-MS)分析实施挥发性烯烃的直接产物分析。为体内分析，使大肠埃希氏菌(E.coli)B121(DE3)中的pCOLAduet和空pCOLAduet中的fdc1/pad1在补充40μg/ml卡那霉素的LB中，于37℃生长至约0.7的OD₆₀₀，并用0.25mM IPTG诱导。将11.5ml诱导的培养物和约7.5的pH的3.5ml蒸馏水中20mM底物的溶液放入带有蜷曲顶盖密封的20ml顶部空间管形瓶。使培养物在振摇温育器中于25℃温育约12～48小时。

为体外分析，将纯化的His-Fdc1/Pad1多肽缓冲剂交换为pH7.5的水中150mM NaCl和50mM NaPi的溶液。随后水或缓冲剂中的pH7.5的11.5ml 150mM NaCl和50mM NaPi溶液，pH7.5的3.5ml20mM底物溶液及150μl 30mg/ml酶溶液添加到带蜷曲顶盖密封的20ml顶部空间管形瓶中。将反应随振摇于25℃温育约12～48小时。

样品由GC-MS，使用Thermofisher DSQ II分析。将管形瓶于80℃伴随搅拌温育3分钟。用105℃注射器和1/10的分流比注射0.5ml顶部空间。分析物在用1.5ml/min He流运行的(替代性地可使用30m×0.25mm i.d.x 0.1μVarian VF-5HT柱)30m 0.25mm 0.25μZB5-MS(可商业上获自Zebron)柱上分离。使炉温度保持于35℃2分钟，之后以10℃/min渐变达250℃。通过搜索对应质量峰来鉴定产物。

这些GC-MS研究使用体内酶促转变确证了山梨酸，肉桂酸和阿魏酸的预期的脱羧产物的存在(即.1,3-戊二烯,苯乙烯和4-乙烯基愈创木酚)(图3)。

发明人然后转向纯化和酶活性的体外检定。使用标准Ni-亲和层析纯化(其中需要与凝胶-过滤组合)，可容易纯化Fdc1(/Pad1)。不幸的是，Pad1水平是Fdc1水平的<5％(图1)。用于体内研究的(间接)酶活性pH-测试容易扩展到对纯化的蛋白的体外-研究(图4)。在此情况中，纯化的Fdc1(/Pad1)被显示在任何外部添加的辅因子的缺失下导致一系列底物的底物依赖性碱化。

通过记录溶液的UV-VIS谱，酶活性的直接观察是可能的。缀合于酸性基的具有2个或更多双键的芳族底物和脂肪族底物在UV区吸收。在1mm程长比色杯中，于20℃针对400μl50mM KCl，50mM NaPi pH6中这些底物的改变的浓度测定纯化的His-Fdc1/Pad1的活性。通过使用Cary 50Bio分光光度计(varian)，以扫描模式，或以动力学实验的特定波长监测底物消费。肉桂酸消费速度在270nm处监测，阿魏酸在312nm处监测，2,4-戊二烯酸在242nm处监测，山梨酸在260nm处监测，2,4,6-辛三烯酸在290nm处监测和2,4-壬二烯酸在260nm处监测。

多数底物显示不同于对应产物的光谱。可容易经时监测酶依赖性光谱变化，及确认了具有广范围的烯醇-型底物的酶活性(图5)。其是在目前对于酶活性研究最严格和有效的方法。

最终，GC-MS产物分析(见以上)使用体外方法为标准底物山梨酸，肉桂酸和阿魏酸确认了产物形成(即.1,3-戊二烯,苯乙烯和4-乙烯基愈创木酚；图3)。UV-vis方法用于评定各种底物(山梨酸,肉桂酸,阿魏酸,辛三烯酸)的Michaelis Menten参数，多数具有亚mM范围内的K_M(见下表2)。

【Fdc1/Pad1的机理研究】

这里的数据意味着Fdc1负责催化，Pad1的作用仍不清楚。然而，当Pad1存在于溶液/细胞中时，尽管在亚-化学计量水平，Fdc1的比活性显著地更高。

【Fdc1/Pad1底物范围】

为了评定什么限制该酶强加不饱和的程度，发明人体内和体外测试了广范围的饱和的及不饱和的底物。在何条件下都未观察到与饱和的脂肪酸的脱羧，及酶明显不支持烷烃产生。但是，单-不饱和的酸(单不饱和的链烯酸)被发现引起对应α-烯烃(末端烯烃)化合物。用后来的化合物观察的活性可仅在与高酶浓度延长的温育及如下使用产物检测之后检测到。

【末端烯烃的GC-MS检测】

如上所述，为体内研究，将pCOLAduet-1和空pCOLAduet-1载体中的Fdc1/Pad1转化进大肠埃希氏菌(E.coli)B121(DE3)。使培养物在补充40μg/ml卡那霉素的LB中，于37℃生长至～0.7的OD₆₀₀，及用1mM IPTG诱导。在密封的顶部空间管形瓶中，向3.5ml20mM底物pH～7.5每管添加11.5ml的诱导的培养物。

为体外反应，由Ni²⁺亲和性部分纯化Fdc1/Pad1和缓冲剂交换为150mM NaCl，50mMNaPi pH7.5。将11.5ml 300mM NaCl，100mM NaPi pH7.5，3.5ml 20mM底物pH7.5和150μl30mg/ml酶或无酶缓冲剂加入密封的顶部空间管形瓶。

全部Fdc1/Pad1反应在振摇温育器中，于25℃温育～36小时。

样品由GC-MS，使用Thermofisher DSQ II分析。将管形瓶于80℃伴随搅拌温育3分钟。用105℃注射器和1/10的分流比注射0.5ml顶部空间。在用1.5ml/min He流运行的30m0.25mm 0.25μZB5-MS(或30m×0.25mm i.d.x 0.1μVarian VF-5HT)柱上分离分析物。炉温度保持在35℃2分钟，之后以10℃/min升高到250℃。产物通过搜索对应质量峰鉴定。

芳族和二/三-不饱和的脂肪族底物使用1/100的分流比，由于自这些产生的产物量远更高。图6显示，1-戊烯产物已用2-己烯酸体外检测；其也已体内检测。用2-庚烯酸和2-辛烯酸的活性至今仅已被体内检测。

总之，用2,4-戊二烯酸-，山梨酸(2,4-己二烯酸)-，2,4,6-辛三烯酸-，2,4-壬二烯酸-，肉桂酸-及阿魏酸观察到高体外和体内活性。用2-己烯酸观察到更低水平活性。也已用2-庚烯酸或2-辛烯酸检测体内活性。饱和的羧酸未观察到活性。已由GC-MS观察1,3-丁二烯，1,3-戊二烯，1,3,5-庚三烯，1,3-辛二烯，苯乙烯，4-乙烯基愈创木酚(3-甲氧基-4-乙烯基苯酚)，1-戊烯，1-己烯和1-庚烯产物的直接鉴定。

表2A：芳族底物

表2B：脂肪族底物

*由于该方法对于测量更低存在水平不足够敏感，pH测定是非-阳性的。

【表3：本申请中包括的序列的鉴定】

【表4：Fdc1同源物多肽】

GenBank登录号No.	与SEQ ID NO:1的总体％序列同一性
		NP_010828.1	100％
BAG32392.1	99％
		BAG32381.1	99％
EHN07793.1	99％
		EDN60854.1	99％
EGA83279.1	99％
		EHN02917.1	89％
GAA22747.1	68％
		XP_461563.1	60％
XP_002499372.1	59％
		XP_002421128.1	59％
EEQ46648.1	59％
		XP_718068.1	58％
XP_003195517.1	47％
		XP_002564382.1	47％
XP_001261424.1	47％
		EFX01410.1	47％
XP_001818650.1	47％
		EGU80878.1	45％
EHK48809.1	46％
		XP_001218695.1	46％

EFZ02049.1	46％
		XP_003195387.1	45％
GAA90861.1	47％
		CCD33957.1	46％
EDZ72732.1	46％
		XP_001390534.1	46％
XP_001545682.1	46％
		EHK20699.1	44％
XP_003039530.1	44％
		EGU86506.1	43％
EHK46069.1	42％
		EFX01795.1	43％
XP_384845.1	41％
		EFY97969.1	41％
EDZ72739.1	37％
		XP_003041887.1	40％
XP_003044170.1	40％
		EGZ23463.1	41％
XP_386610.1	37％
		AC072979.1	37％
EGU82090.1	42％
		EHK21882.1	40％
EHK42408.1	38％
		EFY85845.1	39％
CAK45837.1	40％
		EHA28102.1	41％
XP_001395986.1	36％
		GAA87759.1	35％
XP_002374905.1	38％
		XP_001819606.1	38％
EHA25577.1	35％
		ZP_07797950.1	37％
AE072739.1	37％
		YP_001345734.1	38％
YP_788405.1	37％
		ZP_06876238.1	37％
NP_248945.1	37％
		YP_002437859.1	37％
EGM13823.1	37％
		ZP_01363161.1	37％
ZP_04936675.1	37％
		ZP_09387347.1	36％
XP_001393328.2	39％
		GAA19696.1	37％
XP_572217.1	35％
		YP_003114400.1	37％
ZP_06711456.1	35％
		BAG32388.1	30％
XP_001217436.1	37％
		YP_004902842.1	35％

ZP_09000373.1	35％
		YP_003111840.1	36％
ZP_03780130.1	35％
		ZP_09425197.1	34％
BAG32384.1	28％
		XP_664768.1	27％
AAO72071.1	29％
		YP_004828050.1	32％
YP_001535961.1	31％
		ZP_09054416.1	28％
ABI94382.1	32％
		ZP_05967166.1	32％
ZP_07293769.1	31％
		YP_001007209.1	30％
CBY26238.1	30％
		YP_004297415.1	30％
XP_002397336.1	23％
		YP_001703500.1	27％
ADJ93893.1	28％
		ADJ93969.1	31％
CAC12690.1	28％
		ADJ93946.1	30％
YP_158784.1	28％
		ADJ94002.1	25％
BAL27017.1	27％
		ADJ93979.1	30％
CBX30514.1	27％
		CBX73487.1	21％

【表5：Pad1同源物多肽】

GenBank登录号No.	与SEQ ID NO:2的总体％序列同一性
		NP_010827.1	100％
AAA20484.1	99％
		EDN60853.1	99％
BAG32352.1	98％
		BAG32360.1	98％
BAG32371.1	98％
		EHN02916.1	80％
EGA79325.1	85％
		XP_461564.2	56％
XP_002499371.1	58％
		XP_002421129.1	56％
XP_718069.1	56％
		EEQ46647.1	56％
EFY97970.1	50％
		XP_002374906.1	51％
XP_001819605.2	49％
		XP_386611.1	48％

EHK46071.1	48％
		EFZ02050.1	48％
XP_002380060.1	48％
		XP_001818651.1	48％
EHK20701.1	47％
		XP_002564375.1	47％
XP_001261423.1	45％
		GAA90863.1	47％
XP_001390532.1	47％
		XP_001545681.1	44％
EGU80879.1	45％
		XP_001218694.1	17％
XP_001393326.1	46％
		YP_004828051.1	42％
EHK21881.1	47％
		XP_003195392.1	44％
EFX01028.1	38％
		ZP_07293770.1	42％
EGU86507.1	41％
		EFY85844.1	42％
NP_388245.1	44％
		ZP_05227335.1	39％
YP_077665.1	42％
		YP_004206319.1	43％
AEP89434.1	43％
		EHA29008.1	43％
BAI83837.1	43％
		YP_003944634.1	41％
YP_003868777.1	41％
		AET58676.1	41％
YP_004517954.1	41％
		YP_001211446.1	42％
ZP_08624297.1	42％
		YP_004875917.1	43％
ZP_06875184.1	42％
		CAD19476.1	40％
YP_174133.1	40％
		ABV91288.1	40％
AEB22516.1	40％
		ABI94381.1	39％
YP_003192438.1	42％
		YP_003918919.1	41％
EHM06418.1	40％
		CCF03850.1	41％
YP_001703499.1	40％
		YP_003975944.1	41％
YP_004497687.1	40％
		ZP_09000374.1	42％
ZP_08499357.1	40％
		YP_001420010.1	41％

ZP_08113998.1	40％
		XP_003306895.1	37％
ZP_06355238.1	40％
		AEG59431.1	41％
EGA75335.1	42％
		ZP_08273725.1	39％
YP_003211671.1	40％
		YP_002330491.1	40％
YP_428976.1	40％
		XP_001395985.1	40％
YP_217838.1	40％
		NP_461842.1	40％
YP_002227663.1	40％
		YP_003614566.1	40％
CBK86407.1	40％
		YP_001354955.1	41％
ZP_09039132.1	40％
		YP_001464062.1	39％
ZP_05970041.1	40％
		EGA83277.1	41％
ZP_02667593.1	39％
		YP_002413752.1	40％
NP_457310.1	39％
		ZP_06541550.2	40％
EHP66767.1	40％
		YP_002216887.1	39％
YP_004953406.1	40％
		EFW76961.1	40％
ZP_02884445.1	41％
		YP_001101250.1	40％
YP_002638497.1	39％
		YP_145845.1	39％

Claims

1.制备具有2～20个碳原子的单-不饱和的烯烃的方法，其包括使脂肪族α,β-单-不饱和的羧酸与下列多肽接触：

具有阿魏酸脱羧酶活性的Fdc1多肽、和

具有苯丙烯酸脱羧酶活性的Pad1多肽。

2.权利要求1的方法，其中所述烯烃是末端烯烃。

3.权利要求1的方法，其中所述烯烃是直链或支链烯烃。

4.权利要求1的方法，其中所述烯烃包括4个和15个之间的碳原子。

5.权利要求1的方法，其中所述Fdc1多肽和/或Pad1多肽由重组宿主细胞表达。

6.权利要求5的方法，其中所述Fdc1多肽由选自下列的氨基酸序列构成：SEQ ID NO:1和16～26。

7.权利要求5的方法，其中所述Pad1多肽由选自下列的氨基酸序列构成：SEQ ID NO:2和27～37。

8.权利要求5的方法，其中所述重组宿主细胞是被遗传修饰为表达至少一种选自下列的外源多肽的遗传修饰的微生物：SEQ ID NO:1、2和16～37。

9.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞包含至少一种编码下列氨基酸序列中的一个或多个的核酸序列：SEQ ID NO:1、2和16～37。

10.权利要求9的方法，其中所述核酸序列选自下列中的一个或多个：SEQ ID NO:3～7和38～59。

11.权利要求5～10之任一项的方法，其中所述重组宿主细胞是酵母或细菌。

12.权利要求11的方法，其中所述重组宿主细胞是酵母啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)或重组宿主细胞是细菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

13.权利要求1的方法，其中所述单-不饱和的烯烃随后与一种或多种另外的组分组合，及在生物燃料和/或生物化学品中使用。

14.生产烷烃的方法，其包括：

使脂肪族α,β-单-不饱和的羧酸与下列多肽接触而产生具有2～20个碳原子的单-不饱和的烯烃：

具有阿魏酸脱羧酶活性的Fdc1多肽、和

具有苯丙烯酸脱羧酶活性的Pad1多肽；

分离所述单-不饱和的烯烃；以及

氢化和/或氢异构化所述分离的单-不饱和的烯烃而产生烷烃。

15.权利要求14的方法，其中所述烷烃随后与一种或多种另外的组分组合，及在生物燃料和/或生物化学品中使用。