CN104359870A - 一种表面等离子体共振(spr)生物传感芯片的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表面等离子体共振SPR生物传感芯片的制备方法，通过在镀有50nm金膜的基质玻璃片上依次组装L-半胱氨酸、纳米金和牛血清白蛋白偶联的抗原分子，即制得SPR生物传感芯片。本发明简单、快速，成本低，不需要繁琐的活化处理，适合检测三聚氰胺、盐酸克伦特罗和氨苄青霉素等多种微量小分子物质，再生性能好，可广泛应用于食品安全、环境和生物科学等领域。

Description

一种表面等离子体共振(SPR)生物传感芯片的制备方法
技术领域
本发明涉及光学传感器芯片制备领域，具体是一种表面等离子体共振SPR生物传感芯片的制备方法。 
背景技术
表面等离子体共振(SPR)是一种物理光学现象，20世纪90年代后发展成为一种研究生物分子相互作用的新技术。其技术原理为在传感芯片表面固定一层生物分子，当待测样品流过芯片表面时，样品中与芯片表面生物分子相互作用的分子结合在一起而引起金属膜表面折射率或厚度的变化，最终表现为SPR共振角度的变化，据此可以获得目标分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等信息。SPR技术具有灵敏度高、检测速度快、样品消耗量小、前处理简单、无需生物标记等优势，在快速分析领域具有巨大的潜力，也可广泛应用于化学、生物、环境、食品、医疗、制药等行业。 
传感芯片是SPR技术仪器的核心单元之一，决定着该仪器的操作简易性、可靠性和应用范围。目前市面上所用的SPR传感芯片价格昂贵，制作工艺繁琐且很难检测微量小分子物质，这无形中增加了仪器使用成本，降低了仪器利用效率，大大制约了SPR技术的广泛应用。低成本、制备工艺简单、检测速度快、能检测微量小分子物质的新型SPR传感芯片不仅使检测成本大大降低，而且使用方便，应用范围将得到很大的扩展。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种表面等离子体共振SPR生物传感芯片的制备方法，具有制作成本低、检测速度快、能检测微量小分子的优点。 
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 
一种SPR生物传感芯片，采用多层自组装方式制作，芯片层次结构从上到下依次为目标分析物的抗原、牛血清白蛋白或抗体、纳米金、L-半胱氨酸、纳米金、L-半胱氨酸、金膜、玻璃基质。 
所述的SPR生物传感芯片的制备方法，具体步骤为： 
1)先在镀有金膜的玻璃基质表面自组装上一层L-半胱氨酸，接着将纳米金连接到L-半胱氨酸的氨基上，重复上述步骤； 
2)最后将抗体或牛血清白蛋白偶联的抗原连接到纳米金上； 
3)裸露的纳米金用磷酸盐缓冲液配制的牛血清白蛋白封闭，即得。 
作为本发明进一步的方案：将镀有金膜的玻璃基质依次在浓度为0.5-5％的L-半胱氨酸溶液、浓度为1000mg·L-1的纳米金溶液以及浓度为1-5mg·mL-1的牛血清白蛋白偶联物溶液中浸泡或滴加，即得。 
作为本发明进一步的方案：所述金膜依次在L-半胱氨酸中浸泡2-8小时，在纳米金溶液浸泡2-8小时，在牛血清白蛋白偶联物溶液中浸泡2-8小时。 
作为本发明进一步的方案：所述金膜的厚度为20-100nm。 
作为本发明进一步的方案：所述L-半胱氨酸溶液为L-半胱氨酸的乙酸溶液。 
作为本发明进一步的方案：所述纳米金溶液为纳米金的水溶液。 
作为本发明进一步的方案：所述牛血清白蛋白偶联物溶液由磷酸盐缓冲液配制。 
作为本发明进一步的方案：所述纳米金的直径为15-50nm。 
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明对微量目标小分子具有高灵敏性和选择特异性；制备方法简单，造价极其低廉，反应时间短，无毒无污染，便于推广；再生性能好，可多次重复使用，保存时间长；检测样品速度快；其优秀的响应效率和特异性使其广泛适用于食品违法添加剂、环境污染物和生命科学目标分子的检测，检测时采用直接法或竞争抑制法，芯片一次制备多次使用，且使用前不需要活化，这将为食品违法添加剂、环境污染物检测和生命科学目标分子的研究提供了技术支持和实践依据。 
附图说明
图1是SPR生物传感芯片的结构示意图； 
图2是SPR生物传感芯片在SPR生化分析仪上的响应图谱； 
图3是实施例2的SPR生物传感芯片的标准曲线图； 
图中：1-抗原、2-牛血清白蛋白、3-纳米金、4-L-半胱氨酸、5-金膜、6-玻璃基质、7-抗体；a为磷酸盐缓冲液响应曲线，b为待测样品响应曲线，Δθ为入射光角度偏移量。 
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 
实施例1 
请参阅图1，本发明实施例中，一种SPR生物传感芯片，采用多层自组装方式制作，芯片层次结构从上到下依次为目标分析物的抗原1、牛血清白蛋白2或抗体7、纳米金3、L-半胱氨酸4、纳米金3、L-半胱氨酸4、金膜5、玻璃基质6。其中纳米金的直径为15-50nm。 
所述的SPR生物传感芯片的制备方法，具体步骤为： 
1)先在镀有金膜5的玻璃基质6表面自组装上一层L-半胱氨酸4，接着将纳米金3连接到L-半胱氨酸4的氨基上，重复上述步骤； 
2)最后将抗体7或牛血清白蛋白2偶联的抗原1连接到纳米金3上； 
3)裸露的纳米金3用磷酸盐缓冲液配制的牛血清白蛋白2封闭，即得。 
所述的SPR生物传感芯片的制备方法，具体工艺为将镀有金膜5的玻璃基质6依次在浓度为0.5-5％的L-半胱氨酸4溶液中浸泡2-8小时，在浓度为1000mg·L-1的纳米金3溶液浸泡2-8小时，在浓度为1-5mg·mL-1的牛血清白蛋白2偶联物溶液中浸泡2-8小时，其中微量液体采用滴加的方法。 
请参阅图2，采用SPR生化分析仪对本发明实施例制备的SPR生物传感芯片进行分析，其中a为磷酸盐缓冲液响应曲线，b为待测样品响应曲线，Δθ为入射光角度偏移量。从图2中可以看出明显的共振峰，共振角产生于光的反射率明显降低的时候。结果显示，磷酸盐缓冲液、待测样品通过该SPR生物传感芯片时的共振角分别为67.1°和67.4°。从图中还可以看出，磷酸盐缓冲液的入射光角度偏移量与待测样品的入射光角度偏移量的差 值即Δθ为0.3°，约合3000RIU的响应，考虑采用的SPR生化分析仪的响应灵敏度为1×10-5RIU，说明本发明制备的SPR生物传感芯片灵敏度高和选择特异性好。 
实施例2 
采用本发明制备的SPR生物传感芯片检测牛奶中三聚氰胺含量的操作方法，具体步骤如下： 
(A)样品处理方法： 
(A1)取50μL牛奶于2mL离心管中，加入950μL无水乙醇，旋涡混匀30s，静置2min后，取上清液用于下一步处理； 
(A2)取100μL上述上清液于1mL离心管，70℃烘干或自然风干后加入100μL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)70℃充分溶解后待测。 
(B)仪器检测方法 
(B1)将制备好的SPR生物传感芯片插入SPR生化分析仪检测通道； 
分别进样0、6.25、12.5、25、50、100nM含恒定过量浓度三聚氰胺抗体的三聚氰胺溶液，记录SPR响应信号并制作校准曲线，如图3所示； 
(B2)根据(A)样品处理方法，将待测样品进行预处理； 
(B3)将(B2)中的预处理样品加入恒定浓度的三聚氰胺抗体混匀，37℃孵育1小时； 
(B4)将(B3)中混合液注入SPR生化分析仪检测通道，记录SPR响应信号的相对响应值RU； 
(B5)根据样品的SPR响应信号即可从校准曲线确定样品中的三聚氰胺浓度； 
(B6)继续往SPR生化分析仪检测通道注射氢氧化钠溶液，将SPR生物传感芯片表面再生，为下一个样品的检测做准备。 
请参阅图3，本发明实施例制备的SPR生物传感芯片检测牛奶中的三聚氰胺反应的标准曲线。从图中可以看出，SPR响应信号的相对响应值随着待测样品浓度的增加而降低，具体为待测样品三聚氰胺的浓度在0-100ng/mL范围内时，两者并不是成线性关系，根据计算得到标准曲线的二元回归方程为y＝0.1197x2-7.9885x+139.75，其中判定系数R2为 0.9993，即采用该二元回归方程来表示标准曲线的精度为0.9993，误差非常小。尤其在待测样品三聚氰胺的浓度低时，本发明实施例制备的SPR生物传感芯片的SPR响应信号的相对响应值较高，说明该SPR生物传感芯片能够检测出待测样品中所含有的微量的三聚氰胺小分子。 
本发明对微量目标小分子具有高灵敏性和选择特异性；制备方法简单，造价极其低廉，反应时间短，无毒无污染，便于推广；再生性能好，可多次重复使用，保存时间长；检测样品速度快；其优秀的响应效率和特异性使其广泛适用于食品违法添加剂、环境污染物和生命科学目标分子的检测，检测时采用直接法或竞争抑制法，芯片一次制备多次使用，且使用前不需要活化，这将为食品违法添加剂、环境污染物检测和生命科学目标分子的研究提供了技术支持和实践依据。 
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。 
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。 

Claims (9)

1.一种SPR生物传感芯片，其特征在于，采用多层自组装方式制作，芯片层次结构从上到下依次为目标分析物的抗原(1)、牛血清白蛋白(2)或抗体(7)、纳米金(3)、L-半胱氨酸(4)、纳米金(3)、L-半胱氨酸(4)、金膜(5)、玻璃基质(6)。
2.一种如权利要求1所述的SPR生物传感芯片的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
1)先在镀有金膜(5)的玻璃基质(6)表面自组装上一层L-半胱氨酸(4)，接着将纳米金(3)连接到L-半胱氨酸(4)的氨基上，重复上述步骤；
2)最后将抗体(7)或牛血清白蛋白(2)偶联的抗原(1)连接到纳米金(3)上；
3)裸露的纳米金(3)用磷酸盐缓冲液配制的牛血清白蛋白(2)封闭，即得。
3.一种如权利要求2所述的SPR生物传感芯片的制备方法，其特征在于，将镀有金膜(5)的玻璃基质(6)依次在浓度为0.5-5％的L-半胱氨酸(4)溶液、浓度为1000mg·L-1的纳米金(3)溶液以及浓度为1-5mg·mL-1的牛血清白蛋白(2)偶联物溶液中浸泡或滴加，即得。
4.一种如权利要求2所述的SPR生物传感芯片的制备方法，其特征在于，所述金膜(5)依次在L-半胱氨酸(4)中浸泡2-8小时，在纳米金(3)溶液浸泡2-8小时，在牛血清白蛋白(2)偶联物溶液中浸泡2-8小时。
5.一种如权利要求2所述的SPR生物传感芯片的制备方法，其特征在于，所述金膜(5)的厚度为20-100nm。
6.一种如权利要求2所述的SPR生物传感芯片的制备方法，其特征在于，所述L-半胱氨酸(4)溶液为L-半胱氨酸(4)的乙酸溶液。
7.一种如权利要求2所述的SPR生物传感芯片的制备方法，其特征在于，所述纳米金(3)溶液为纳米金(3)的水溶液。
8.一种如权利要求2所述的SPR生物传感芯片的制备方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白(2)偶联物溶液由磷酸盐缓冲液配制。
9.一种如权利要求2所述的SPR生物传感芯片的制备方法，其特征在于，所述纳米金(3)的直径为15-50nm。
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