CN104353116B - Bmp-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法 - Google Patents
Bmp-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104353116B CN104353116B CN201410513420.XA CN201410513420A CN104353116B CN 104353116 B CN104353116 B CN 104353116B CN 201410513420 A CN201410513420 A CN 201410513420A CN 104353116 B CN104353116 B CN 104353116B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bone
- bmp
- cell
- genetic modification
- weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 77
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 title claims abstract description 21
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000003144 genetic modification method Methods 0.000 title abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 12
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000009328 Perro Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims abstract description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 claims description 38
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 claims description 38
- 229920002961 polybutylene succinate Polymers 0.000 claims description 23
- 239000004631 polybutylene succinate Substances 0.000 claims description 23
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 claims description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 16
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 14
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004088 foaming agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 6
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 3-aminonaphthalene-1,5-disulfonic acid Chemical compound C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=CC(N)=CC(S(O)(=O)=O)=C21 MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 4
- IBFYXTRXDNAPMM-BVTMAQQCSA-N Geniposide Chemical compound O([C@@H]1OC=C([C@@H]2[C@H]1C(=CC2)CO)C(=O)OC)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O IBFYXTRXDNAPMM-BVTMAQQCSA-N 0.000 claims description 4
- IBFYXTRXDNAPMM-FZEIBHLUSA-N Geniposide Natural products COC(=O)C1=CO[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]2O)[C@H]2[C@@H]1CC=C2CO IBFYXTRXDNAPMM-FZEIBHLUSA-N 0.000 claims description 4
- VGLLGNISLBPZNL-RBUKDIBWSA-N arborescoside Natural products O=C(OC)C=1[C@@H]2C([C@H](O[C@H]3[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)OC=1)=C(CO)CC2 VGLLGNISLBPZNL-RBUKDIBWSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 4
- -1 poly butylene succinate Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 4
- 229940078499 tricalcium phosphate Drugs 0.000 claims description 4
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- AZKVWQKMDGGDSV-BCMRRPTOSA-N Genipin Chemical compound COC(=O)C1=CO[C@@H](O)[C@@H]2C(CO)=CC[C@H]12 AZKVWQKMDGGDSV-BCMRRPTOSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 2
- AZKVWQKMDGGDSV-UHFFFAOYSA-N genipin Natural products COC(=O)C1=COC(O)C2C(CO)=CCC12 AZKVWQKMDGGDSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 19
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229920000431 shape-memory polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 230000010148 water-pollination Effects 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229920003232 aliphatic polyester Polymers 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005253 cladding Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- OBNCKNCVKJNDBV-UHFFFAOYSA-N ethyl butyrate Chemical compound CCCC(=O)OCC OBNCKNCVKJNDBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 210000001847 jaw Anatomy 0.000 description 1
- 235000020888 liquid diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 1
- 210000004373 mandible Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000006386 memory function Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 210000004261 periodontium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012781 shape memory material Substances 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明属于生物领域，具体涉及一种BMP-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法。其由骨支架材料和BMP-2基因修饰的骨髓间质干细胞(bMSCs)构建而成。所述组织工程骨的制备方法为：1)腺病毒介导的BMP-2转染体外培养的骨髓间质干细胞；2)将步骤1)得到的产物、骨支架材料复合构建组织工程化骨，其中，BMP-2腺病毒载体工作浓度分别为50pfu/细胞；腺病毒介导的BMP-2以MOI＝50pfu/cell转染体外培养的骨髓间质干细胞，所述骨髓基质细胞来源鼠、兔、羊、狗、猪骨髓基质细胞，所述复合构建是指细胞密度为5×107/ml的细胞悬液与生物支架材料复合。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种BMP-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法。
背景技术
骨组织工程学的兴起为颌骨缺损修复带来了希望。骨组织工程是细胞体外扩增与可降解材料复合，体内构建具有活力的组织和器官的新兴技术，成为现阶段研究的热点。骨组织工程学修复骨缺损较现行诸多方法有着明显的优点，例如，其不受供体来源的限制，可避免免疫排斥反应，需要的供体组织少(细胞在体外培养增殖)，可根据修复缺损的需要，将植入物制成精确的三维立体结构。良好的支架材料是具有一定稳定性的三维支架，例如长方体、立方体、圆柱体等，以便于植入体内后形成一个较固定的新生组织生长空间，但临床上很多骨缺损均为非规则性缺损，形状固定的材料难以完整修复缺损空间。同时随着医疗科技的飞速发展，良好的骨组织工程材料应最大限度地减少材料对机体的长期影响，大多患者希望植入物在体内只是起到暂时替代作用，随着自身骨组织的再生，植入材料逐渐降解吸收。而不同类型和部位的骨缺损要求材料还应具有良好的机械性能，易于加工成型，可改变成易于植入人体的各种形状，植入人体后，在人体温度下恢复成治疗需要的形状。基于这些要求，可降解的形状记忆材料(Shape-Memory Polymers，SMP)以其灵活的可变型性，可适应不同形状的骨缺损，为组织工程修复骨缺损提供一种新的研究方向。
脂肪族聚酯，如聚乳酸(PLA)、聚羟基丁酸酯(PHB)及聚己内酯(PCL)等，其结构中均含有酯键，使得它们能够被自然界中的微生物分解，因而都具有良好的生物降解性能。其中，聚己内酯PCL因其具有优异的力学性能、加工特性及形状记忆性能，已成为近年来研究开发的热点，其在临床上被大量应用于生物医学工程领域，如骨组织固定装置、手术缝合线、组织工程支架及药物控释体系等，被认为是具有很大发展潜力的生物可降解形状记忆聚合物。但PCL也有一些性能上的缺陷。其熔点约为60℃左右，耐热性能及机械加工性能均不佳，且其形状记忆性能只有约20％，而形变回复温度则达到40℃以上(高于37℃的人体正常体温)，这些缺陷在很大程度上限制了PCL作为临床植入材料的应用。聚己内酯是一种结晶性聚合物，对其进行交联的方法主要有两种，即引入过氧化物或对其进行辐射交联。但是，目前的一些研究报道指出，PCL的辐射交联效率是比较低的，在交联的同时，裂解也在进行，且占据了主导地位。当辐射剂量较高时，还会引起PCL的拉伸强度及断裂伸长率等力学性能的明显下降。
骨形成蛋白(BMP)属于转化生长因子超家族，其中BMP 2、4、5、6、7等与骨、软骨、肌腱、牙周组织、牙本质的形成有极为密切的关系，均有明确的诱导成骨的作用。但传统的BMP蛋白制备，无论是从骨基质中提纯，还是用基因工程表达，程序复杂，产量低，活性不稳定；在修复大面积骨缺损时，BMP的用量大，可能会生毒性反应；BMP作为外源性蛋白植入体内，也可能引起免疫反应。近年有学者探索应用BMP基因治疗的方法加速骨缺损的修复。1988年Wozney等首先克隆出hBMP1-4cDNA。随后陆续克隆获得了BMP家族中的其它成员，为骨缺损修复的BMP基因治疗奠定了基础。BMP基因转移的载体各有特点，反转录病毒能将目的基因整合到靶细胞基因组中，可长期表达，腺病毒不论靶细胞增殖状况均可高效转移，介导的基因转移是非整合型的；裸DNA直接转导方法简单，无免疫原性，安全，费用低，缺点是转导效率低。应用BMP基因治疗结合组织工程技术促进新骨的形成已成为目前骨再生领域的研究热点。
现有技术研究表明，PCL和PBS制备的多孔组织工程支架材料虽然可以改善骨支架材料的亲水性以及力学性能，但是需要将PBS的含量提高到80％，这不可避免的牺牲了PCL的形状记忆功能，PCL和PBS具有良好的生物相容性，实际应用中虽然其对种子细胞的生长无明显毒性作用，但是对种子细胞生长的促进作用也不明显，因此有必要对其进一步地改进。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种BMP-2基因修饰的组织工程骨，其由骨支架材料和BMP-2基因修饰的骨髓间质干细胞(bMSCs)构建而成。
在本发明中，所述骨支架材料可以由100重量份的聚己内酯(PCL)，20重量份的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，20重量份的聚丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)和50重量份的磷酸三钙(TCP)组成；所述骨支架材料也可以由100重量份的聚己内酯(PCL)，30重量份的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，25重量份的聚丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)和40重量份的磷酸三钙(TCP)组成。
在本发明优选的实施方案中，所述骨支架材料还经过天然高分子修饰，所述的天然高分子是高分子明胶(优选重均分子量为30,000～50,000的明胶)、胶原蛋白或壳聚糖。
所述骨支架材料是具有两种不同孔径的介孔，所述介孔的孔径(直径)为75～100μm和450～500μm。现代研究一般认为PCL支架中介孔孔径为单一350μm时，体内颅骨骨修复速率最佳，而体外的种子细胞培养中孔径的影响不是十分明显，但是本发明发现由于不同组织的微环境存在着明显不同，具有不同孔径的骨支架材料在不同部位的骨修复中其表现也不近相同，本发明通过大量试验研究发现本发明骨支架材料的孔径在体内的颌骨修复出表现出极高的骨修复率。
在本发明中，所述的PBS分子量范围为4～20万，熔点为110～120℃；
所述的PCL的分子量范围为4～20万，熔点为55～65℃；
所述的PLGA的分子量范围为1～5万，熔点为45～55℃。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述组织工程骨的方法，具体步骤如下：
1)腺病毒介导的BMP-2转染体外培养的骨髓间质干细胞；
2)将步骤1)得到的产物、骨支架材料复合构建组织工程化骨；
其中，BMP-2腺病毒载体工作浓度分别为50pfu/细胞；腺病毒介导的BMP-2以MOI＝50pfu/cell转染体外培养的骨髓间质干细胞，所述骨髓基质细胞来源鼠、兔、羊、狗、猪骨髓基质细胞，所述复合构建是指细胞密度为5×107/ml的细胞悬液与生物支架材料复合。
在本发明中所述骨支架材料的制备方法为：
1)将PCL、PBS和PLGA搅拌溶解于二氧六环中，在40℃下高速搅拌使其溶解充分，得到澄清溶液；PCL、PBS和PLGA在溶液中的总浓度为0.2g/ml；
2)将磷酸三钙粉体、粒径(直径)为450～500μm的NaCl粒子和粒径(直径)为75～100μm的NaHCO3粒子加入到步骤1的溶液中，超声使无机物分散均匀，-20℃冷冻过夜得固形物；PCL、PBS和PLGA的重量为致孔剂重量的1/4，所述致孔剂为NaCl和NaHCO3，两者的重量比为1:1；
3)将固形物依次置于-20℃的无水乙醇溶液中12h和pH值为5的盐酸溶液中24h，最后将固形物浸没与双蒸水中，每12h换水一次，6天后取出，冷冻干燥即得；
4)在负压条件下，以京尼平(Genipin)为交联剂、水为分散介质，由步骤3)获得的骨支架材料与天然高分子交联获后获得。
本发明的另一个目的是所述组织工程骨在制备治疗颌骨损伤中的应用。
具体实施方式
下面将进一步的详细说明本发明。
实施例1
骨支架材料制备
1)将PCL、PBS和PLGA搅拌溶解于二氧六环中，在40℃下高速搅拌使其溶解充分，得到澄清溶液；PCL、PBS和PLGA的总浓度为0.2g/ml；
2)将TCP粉体、粒径(直径)为450～500μm的NaCl粒子和粒径(直径)为75～100μm的NaHCO3粒子加入到步骤1的溶液中，超声使无机物分散均匀，-20℃冷冻过夜得固形物；致孔剂为NaCl和NaHCO3，重量比为1:1，PCL、PBS和PLGA的总重量为致孔剂的1/4；
3)将固形物依次置于-20℃的无水乙醇溶液中12h和pH值为5的盐酸溶液中24h，最后将固形物浸没与双蒸水中，每12h换水一次，6天后取出，冷冻干燥即得。所述骨支架材料中PCL为100重量份，PBS为20重量份，PLGA为20重量份，TCP为50重量份；
4)将壳聚糖溶于水中，浓度为4％(重量)，向壳聚糖溶液中加入京尼平，浓度为0.2％(重量)，将步骤3获得骨支架材料浸入壳聚糖-京尼平溶液中，在0.04～0.01MPa条件下，水浴15min，温度为40℃，从溶液中取出骨支架材料，置于37℃培养箱中10h，冷冻干燥后即得。
实施例2
骨支架材料制备
1)将PCL、PBS和PLGA搅拌溶解于二氧六环中，在40℃下高速搅拌使其溶解充分，得到澄清溶液；PCL、PBS和PLGA的总浓度为0.2g/ml；
2)将TCP粉体、粒径(直径)为450～500μm的NaCl粒子和粒径(直径)为75～100μm的NaHCO3粒子加入到步骤1的溶液中，超声使无机物分散均匀，-20℃冷冻过夜得固形物；致孔剂为NaCl和NaHCO3，重量比为1:1，PCL、PBS和PLGA的总重量为致孔剂的1/4；
3)将固形物依次置于-20℃的无水乙醇溶液中12h和pH值为5的盐酸溶液中24h，最后将固形物浸没与双蒸水中，每12h换水一次，6天后取出，冷冻干燥即得。所述骨支架材料中PCL为100重量份，PBS为30重量份，PLGA为25重量份，TCP为40重量份；
4)将壳聚糖溶于水中，浓度为4％(重量)，向壳聚糖溶液中加入京尼平，浓度为0.2％(重量)，将步骤3获得骨支架材料浸入壳聚糖-京尼平溶液中，在0.04～0.01MPa条件下，水浴15min，温度为40℃，从溶液中取出骨支架材料，置于37℃培养箱中10h，冷冻干燥后即得。
实施例3
PCL/PBS/PLGA/TCP不同重量比对骨支架材料的影响
采用不同的重量配比的PCL/PBS/PLGA/TCP，按照实施例1的方法分别制备骨支架材料，具体配比如下：
| 重量份 | PCL | PBS | PLGA | TCP |
| 对比例1 | 100 | 50 | 40 | 60 |
| 对比例2 | 100 | 10 | 10 | 30 |
| 对比例3 | 100 | 50 | 10 | 60 |
| 对比例4 | 190 | 0 | 0 | 0 |
| 对比例5 | 38 | 152 | 0 | 0 |
分别测定骨支架材料的拉伸性能(拉伸强度和弯曲强度)、形状回复率。
拉伸性能参照国家标准GB/T528-2009进行，
形状回复率的测定方法为，在样条上取10mm间距，标记为L0，以5kg载荷，在拉伸比为100％(L1)条件下固定12h，然后放入烘箱中恒温37℃进行回复，回复后标记间距L2，回复率＝(L1-L2)/(L1-L0)×100％；
采用压汞仪(美国康塔公司Poremaster)测量样品的孔隙率和孔径尺寸，
测定支架的亲水性，将骨支架材料干燥后称重，浸入双蒸水中，置于37℃水箱中24h后取出，擦去表面水分后称重，通过重量差计算吸水率。
具体结果如下：
1、拉伸性能
| 拉伸强度(MPa) | 弯曲强度(MPa) | |
| 实施例1 | 19.8 | 14.8 |
| 实施例2 | 20.5 | 15.6 |
| 对比例1 | 10.5 | 8.9 |
| 对比例2 | 13.4 | 10.3 |
| 对比例3 | 12.3 | 9.5 |
| 对比例4 | 12.2 | 8.3 |
| 对比例5 | 13.8 | 10.7 |
2、孔隙率和孔径尺寸
| 孔隙率(％) | 孔径尺寸(μm) | |
| 实施例1 | 81.5 | 450～500μm；75～100μm |
| 实施例2 | 79.5 | 450～500μm；75～100μm |
| 对比例1 | 75.4 | 350～600μm；45～120μm |
| 对比例2 | 77.6 | 400～550μm；45～130μm |
| 对比例3 | 76.8 | 350～600μm；55～120μm |
| 对比例4 | 74.8 | 350～550μm；45～110μm |
| 对比例5 | 77.4 | 350～500μm；45～100μm |
3、回复率
| 回复率(％) | |
| 实施例1 | 92.4 |
| 实施例2 | 94.6 |
| 对比例1 | 67.2 |
| 对比例2 | 77.9 |
| 对比例3 | 71.3 |
| 对比例4 | 96.7 |
| 对比例5 | 14.5 |
实施例4
组织工程骨的构建
原代bMSCs的获取及培养：无菌状态下，取SPF级6周龄雄性Fischer344大鼠胫骨和股骨骨髓，所得细胞悬液离心，吸去上清液和漂浮于液面的脂肪，加DMEM培养液，均匀吹散，置于培养条件为37℃恒温混合气体(含95％空气，5％CO2)，100％饱和湿度的培养箱中培养。每周换液3次，待90％左右的细胞融合时予以传代，培养至第2至3代时，更换培养液为DMEM成骨诱导培养液，用于研究。
BMP-2基因转染bMSCs：第3代细胞生长至70-80％融合时，予以传代，24小时后细胞全部附着于底壁，此时吸去DMEM诱导分化培养液，无血清DMEM成骨诱导培养液洗涤2次，加入半量工作浓度BMP-2腺病毒载体的无血清DMEM成骨诱导培养液，加入稀释的携基因的腺病毒载体后，在培养箱中培养一小时，期间每隔15分钟均匀轻摇晃，使病毒充分接触细胞，提高转染效率。一小时后加入另外半量的含20％血清的培养液。此时培养液中FBS含量为10％。置培养箱培养24小时后，吸去培养液，PBS液洗涤两次，加入全量成骨诱导分化培养液，继续培养。每3天换液。BMP-2基因从美国Origen公司获得。
组织工程化骨的构建：将基因转染的bMSCs消化，制成细胞密度为5×107/ml的细胞悬液，缓慢滴加到实施例及对比例制备的直径为5mm的圆柱形骨支架材料至饱和状态，使得材料湿润，而液体不流出。
实施例5
SD大鼠下颌骨缺损模型创建及组织工程骨缺损修复实验
SD大鼠麻醉后，仰卧固定在手术台上，与右侧下颌骨区切开皮肤，分离肌肉组织至完全显露出下颌骨基部，刮除骨膜，牙科电钻低俗钻孔(3000r/min)去除牙槽骨，形成5mm×2mm×5mm的穿通型骨缺损，将预制组织工程骨材料填充于缺损区域，对照组不做任何处理，缝合肌层和皮肤，肌肉注射抗生素。术后1周内给予流质饮食，逐步食用固体饲料。术后8周处死大鼠，取出下颌骨进行骨组织形态学计量测定。
具体结果如下：
8周后植骨区新生骨板面积
| 万Unit：μm3 | |
| 对照组 | 4.3±0.8 |
| 实施例1 | 25.6±1.8 |
| 实施例2 | 27.5±2.1 |
| 对比例1 | 11.4±2.2 |
| 对比例2 | 14.7±1.9 |
| 对比例3 | 12.6±2.4 |
| 对比例4 | 7.9±1.3 |
| 对比例5 | 8.6±1.5 |
| 对比例6 | 19.8±1.5 |
植骨区新生骨板面积为100倍光镜下测量，每一张切片测量五个视野取平均值，对比例6为实施例2骨支架材料制备的组织工程骨(方法见实施例4)，区别在于骨髓间质干细胞不经BMP-2修饰，以下皆同。
PCNA免疫组化染色阳性细胞核百分率
| 四周(％) | 八周(％) | |
| 对照组 | 21.6±6.8 | 32.5±7.9 |
| 实施例1 | 59.4±9.4 | 38.3±6.4 |
| 实施例2 | 62.5±10.5 | 41.2±8.7 |
| 对比例1 | 34.7±8.2 | 27.3±5.6 |
| 对比例2 | 39.3±7.9 | 31.3±7.1 |
| 对比例3 | 31.5±6.4 | 24.6±6.3 |
| 对比例4 | 27.5±7.3 | 19.3±5.3 |
| 对比例5 | 28.4±5.5 | 22.3±4.9 |
| 对比例6 | 48.9±6.1 | 32.4±5.1 |
PCNA免疫组化染色阳性细胞核百分率：在200倍光镜下测定，每一张切片测量五个视野取平均值。
植骨区骨矿化量
| Unit：μm | |
| 对照组 | 27.3±11.8 |
| 实施例1 | 46.3±8.2 |
| 实施例2 | 50.7±8.3 |
| 对比例1 | 31.4±8.9 |
| 对比例2 | 29.5±7.4 |
| 对比例3 | 25.3±6.5 |
| 对比例4 | 14.3±5.1 |
| 对比例5 | 18.9±5.3 |
| 对比例6 | 39.4±9.1 |
植骨区骨矿化量：测量两条四环素荧光标记线内缘之间的宽度。在200倍荧光显微镜下测定，每一张切片测量五个视野取平均值。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (5)
1.BMP-2基因修饰的组织工程骨，其特征在于，其是由骨支架材料和BMP-2基因修饰的骨髓间质干细胞bMSCs构建而成，其中所述的骨支架材料是由100重量份的聚己内酯PCL，20重量份的聚丁二酸丁二醇酯PBS，20重量份的聚丙交酯乙交酯共聚物PLGA和50重量份的磷酸三钙TCP组成；或者是由100重量份的聚己内酯PCL，30重量份的聚丁二酸丁二醇酯PBS，25重量份的聚丙交酯乙交酯共聚物PLGA和40重量份的磷酸三钙TCP组成。
2.根据权利要求1所述的BMP-2基因修饰的组织工程骨，其特征在于，所述骨支架材料还经过天然高分子修饰，所述的天然高分子是高分子明胶，所述的高分子明胶为重均分子量为30,000～50,000的明胶。
3.根据权利要求1所述的BMP-2基因修饰的组织工程骨，其特征在于，所述骨支架材料是具有两种不同孔径的介孔，所述介孔的孔径直径为75～100μm和450～500μm。
4.一种制备权利要求1所述的BMP-2基因修饰的组织工程骨的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)腺病毒介导的BMP-2转染体外培养的骨髓间质干细胞；
2)将步骤1得到的产物、骨支架材料复合构建组织工程化骨，其中，BMP-2腺病毒载体工作浓度为50pfu/细胞；腺病毒介导的BMP-2以MOI＝50pfu/cell转染体外培养的骨髓间质干细胞，所述骨髓基质细胞来源鼠、兔、羊、狗、猪骨髓基质细胞，所述复合构建是指细胞密度为5×107/ml的细胞悬液与生物支架材料复合；
所述骨支架材料的制备方法为：
1)将PCL、PBS和PLGA搅拌溶解于二氧六环中，在40℃下高速搅拌使其溶解充分，得到澄清溶液；PCL、PBS和PLGA在溶液中的总浓度为0.2g/ml；
2)将磷酸三钙粉体、粒径直径为450～500μm的NaCl粒子和粒径直径为75～100μm的NaHCO3粒子加入到步骤1)的溶液中，超声使无机物分散均匀，-20℃冷冻过夜得固形物；PCL、PBS和PLGA的重量为致孔剂重量的1/4，所述致孔剂为NaCl和NaHCO3，两者的重量比为1:1；
3)将固形物依次置于-20℃的无水乙醇溶液中12h和pH值为5的盐酸溶液中24h，最后将固形物浸没与双蒸水中，每12h换水一次，6天后取出，冷冻干燥即得；
4)在负压条件下，以京尼平Genipin为交联剂、水为分散介质，由步骤3)获得的骨支架材料与天然高分子交联获后获得。
5.权利要求1-3任一项所述的BMP-2基因修饰的组织工程骨在制备治疗颌骨损伤的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410513420.XA CN104353116B (zh) | 2014-09-29 | 2014-09-29 | Bmp-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410513420.XA CN104353116B (zh) | 2014-09-29 | 2014-09-29 | Bmp-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104353116A CN104353116A (zh) | 2015-02-18 |
| CN104353116B true CN104353116B (zh) | 2016-08-24 |
Family
ID=52520487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410513420.XA Expired - Fee Related CN104353116B (zh) | 2014-09-29 | 2014-09-29 | Bmp-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104353116B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2019354340A1 (en) | 2018-10-04 | 2021-04-01 | Nipro Corporation | Bone regeneration material |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101037674A (zh) * | 2006-03-15 | 2007-09-19 | 上海中信国健药业有限公司 | 一种含有bmp－7基因的重组腺病毒及其用途 |
| CN101249277A (zh) * | 2008-04-11 | 2008-08-27 | 东华大学 | 三维多孔组织工程支架材料、其纤维粘结法制备及应用 |
| CN101319228A (zh) * | 2008-07-16 | 2008-12-10 | 深圳市第二人民医院 | 一种含人bmp重组腺病毒载体及其构建方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7309361B2 (en) * | 2002-10-23 | 2007-12-18 | Wasielewski Ray C | Biologic modular tibial and femoral component augments for use with total knee arthroplasty |
-
2014
- 2014-09-29 CN CN201410513420.XA patent/CN104353116B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101037674A (zh) * | 2006-03-15 | 2007-09-19 | 上海中信国健药业有限公司 | 一种含有bmp－7基因的重组腺病毒及其用途 |
| CN101249277A (zh) * | 2008-04-11 | 2008-08-27 | 东华大学 | 三维多孔组织工程支架材料、其纤维粘结法制备及应用 |
| CN101319228A (zh) * | 2008-07-16 | 2008-12-10 | 深圳市第二人民医院 | 一种含人bmp重组腺病毒载体及其构建方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA/PCL支架体外构建组织工程骨;卜丽莎等;《中国矫形外科杂志》;20040505;第12卷(第9期);第677-678页摘要部分和"1.2 实验方法"部分、第679页"3 讨论"部分 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104353116A (zh) | 2015-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107281550B (zh) | 一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法 | |
| US11642849B2 (en) | In vivo live 3D printing of regenerative bone healing scaffolds for rapid fracture healing | |
| Korn et al. | 3D printing of bone grafts for cleft alveolar osteoplasty–in vivo evaluation in a preclinical model | |
| CN108310467B (zh) | 一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料及其制备方法和应用 | |
| Volkov et al. | Poly (3-hydroxybutyrate)/hydroxyapatite/alginate scaffolds seeded with mesenchymal stem cells enhance the regeneration of critical-sized bone defect | |
| Meinel et al. | Silk implants for the healing of critical size bone defects | |
| CN109054047A (zh) | 一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶及其制备方法和应用 | |
| CN104353110B (zh) | 用于颌骨修复的具有形状记忆功能的骨支架材料及其制备方法 | |
| Liao et al. | The Osteogenesis of Bone Marrow Stem Cells on mPEG‐PCL‐mPEG/Hydroxyapatite Composite Scaffold via Solid Freeform Fabrication | |
| CN108939151B (zh) | 纳米多孔微支架在组织再生修复中的应用 | |
| CN102294049B (zh) | 生物活性玻璃与壳聚糖复合骨修复材料及其制法和用途 | |
| CN105688274A (zh) | 一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺 | |
| CN108939164A (zh) | 3D打印PCL-Mg骨组织工程支架及其制备方法 | |
| CN110947031B (zh) | 一种具有高生物活性的骨组织工程支架材料及其制备方法和应用 | |
| CN110408058A (zh) | 一种促进骨缺损修复的埃洛石复合水凝胶及其制备方法和应用 | |
| Groppo et al. | The effect of a hydroxyapatite impregnated PCL membrane in rat subcritical calvarial bone defects | |
| CN101564555B (zh) | 一种组织工程骨移植物及其构建方法 | |
| CN107446885A (zh) | 一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料及其应用 | |
| CN105073150A (zh) | 由人bmp-2蛋白的模拟肽接枝的骨替代物 | |
| İşoğlu et al. | Stem cells combined 3D electrospun nanofibrous and macrochannelled matrices: a preliminary approach in repair of rat cranial bones | |
| CN104548196A (zh) | 一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料及其制备方法 | |
| CN104353116B (zh) | Bmp-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法 | |
| CN110624133B (zh) | 一种用于神经修复的神经基质导管及其制备方法 | |
| Marshall et al. | Bioactive coatings on 3D printed scaffolds for bone regeneration: Translation from in vitro to in vivo models and the impact of material properties and growth factor concentration. | |
| CN109010926A (zh) | 一种多孔微支架的制备方法及其复合体系 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160824 |