CN104344864B

CN104344864B - 用于连续流操作的集成微流设备以及执行连续流操作的方法

Info

Publication number: CN104344864B
Application number: CN201410389573.8A
Authority: CN
Inventors: 帕梅拉·安·多希; 丹尼尔·克里斯托弗·斯班塞
Original assignee: Sharp Life Science EU Ltd
Current assignee: Sharp Life Science EU Ltd
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2014-08-08
Publication date: 2018-08-24
Anticipated expiration: 2034-08-08
Also published as: US9808802B2; US20150044696A1; CN104344864A; US9440233B2; EP2842628A1; CN108917874A; US20160346782A1

Abstract

一种用于执行一系列流操作的集成微流设备，包括：外壳(18)，外壳(18)包括数量为n的多个微流导管(20、22、24)，其中n至少为3，以及具有内部通道(12)的旋转阀(10)，其中所述内部通道具有在角度上分离的入口端口和出口端口。所述旋转阀能够位于第一位置，以经由内部通道连接所述n个流导管中的两个流导管(20、22)，并且在将所述阀旋转到第二位置时，所述n个流导管中的两个其它流导管(22、24)由内部通道连接。所述设备还包括分别与各个流导管流连通的一个或多个流室(44、46)。通过施加正或负气压可以经由内部通道将一个流室中包含的流体通过相关联的流导管转移到另一流室中。可利用所述设备来执行多种流操作。

Description

用于连续流操作的集成微流设备以及执行连续流操作的方法

技术领域

本发明涉及用于计量液体体积的装置。具体地，本发明涉及能够准确地计量小量流体并在所计量的样本上执行一系列流操作(fluidic operation)的微流(microfluidic)设备。

背景技术

已知的技术描述了使用旋转阀内的线形、直通计量通道来计量小量流体的微流计量装置。在现有技术中，经由旋转阀中的线形、直通内部通道只能连接两个流导管。已知的技术只限于操作性的功能，这是由于它只能将第一流室的流体内容经由旋转阀中的线形计量通道转移到正对第一室的第二流室。然而，能够在多于两个流室之间转移流体内容是让人期待的，但这在传统系统中一般不能实现。

专利WO98/22797(1998年5月18日公布，Berndtsson等人)、WO99/01742(1999年1月14日公布，Berndtsson)、以及相关专利申请WO02/089760A1(2002年11月14日公布，Rodriguez等人)、WO03/104770A2(2003年12月18日公布，Larsen等人)、WO03/104771A1(2003年12月18日公布，Larsen等人)、以及WO03/104772A1(2003年12月18日公布，Larsen)都公开了传统的微流计量设备。作为这些设备的代表，图1A描述了包括具有直通通道4的旋转阀2的这种设备，其中直通通道4与外壳中的第一对相对的流导管6相连通。旋转阀转过90度，从而对阀内的小量流体进行计量，并如图1B所示，连接第二对相对的流导管8。

WO03/044488A1(2003年5月30日公布，Berndtsson)公开了具有三个直通通道的旋转阀，其中三个通道都延伸直接通过旋转阀的轴心。每个直通通道相对于阀内的其它两个直通通道以一定角度旋转放置。在任一时间，旋转阀中的两个不同的直通通道能够连接外壳中的不同的两对相对的流导管。不同的两对相对的流导管不能经由旋转阀内的内部通道彼此连通。EP1535667A1(2005年6月1日公布，Mototsu)公开了旋转阀，在旋转阀的轴向以及旋转阀的外壁中形成有凹部。凹部能够计量限定体积的流体。旋转阀能够将沿旋转阀的轴向彼此偏移的两个外部导管接通。

虽然现有技术公开了使用能够计量限定体积的流体并连接两个相对的流导管的线形、直通通道，但它们在执行需要多于两个的多个流导管和/或室的各种不同流操作方面的能力是受限的，例如在传统设备中，第一流室的全部流内容只能经由旋转阀中的直通通道被转移到正对第一流室的第二流室。需要将流体不只是在两个正对的流室之间转移的其它配置(包括两个室之外的附加室)则不能被执行。

发明内容

需要能够在以旋转阀为中心的多个可依次连接的导管和/或室中连续执行多种不同的流操作的微流设备，其中相邻的流导管和/或室经由所述旋转阀中的内部通道连接。

本发明的一个方面是一种用于执行一系列流操作的集成微流设备。集成微流设备的实施方式包括：外壳和旋转阀，该外壳包括数量为n的多个微流导管，其中n至少为3，所述旋转阀具有内部通道，其中所述内部通道具有在角度上分离的入口端口和出口端口。所述旋转阀能够位于第一位置，以经由内部通道连接所述n个流导管中的两个流导管，并且在将所述阀旋转到第二位置时，所述n个流导管中的包括不同于在第一位置处连接的流导管的至少一个流导管在内的两个流导管由内部通道连接。在第一位置或第二位置处，经由所述内部通道连接两个依次相邻的流导管。

本发明的另一方面包括一种用于执行完全血细胞计数的微流箱(cartridge)。所述微流箱包括外壳，该外壳包括多个流导管；分别与所述多个流导管中的各个流导管流连接的多个流室，其中所述多个流室包括至少一个血液样本输入室、多个血液试剂室和多个血液样本混合室；能够连接到所述多个流导管中的至少一个的至少一个血液细胞计数器，所述至少一个血液细胞计数器能够对白血细胞、红血细胞或血小板中的至少一个进行计数；以及具有第一内部通道的第一旋转阀，其中所述第一内部通道用于以流连通的方式连接所述多个流导管中的流导管对。第一旋转阀能够旋转到第一位置，以用于计量来自血液样本输入室的血液样本的第一部分；第一旋转阀能够旋转到第二位置，以用于将试剂从血液试剂室转移到血液样本的所计量的第一部分，第一旋转阀能够旋转到第三位置，以将血液样本的所计量的第一部分和血液试剂转移到血液样本混合室之一，以生成第一制备血液样本，以及第一旋转阀能够旋转到第四位置，以将第一制备血液样本转移到所述至少一个血液细胞计数器，以用于对白血细胞进行计数。所述箱还包括具有第二内部通道的第二旋转阀，其中所述第二内部通道用于以流连通的方式连接所述多个流导管中的流导管对。第二旋转阀能够旋转到第五位置，以用于计量来自血液样本输入室的血液样本的第二部分，第二旋转阀能够旋转到第六位置，以用于将试剂从血液试剂室转移到血液样本的所计量的第二部分，第二旋转阀能够旋转到第七位置，以将血液样本的所计量的第二部分和血液试剂转移到血液样本混合室中的另一个，以生成第二制备血液样本，以及第二旋转阀能够旋转到第八位置，以将第二制备血液样本转移到所述至少一个血液细胞计数器，以用于对红血细胞和血小板进行计数。

本发明的另一方面是一种在集成微流设备中执行一系列流操作的方法。所述方法包括以下步骤：提供包括数量为n的多个微流导管的外壳，其中n至少为3；提供具有内部通道的旋转阀，其中所述内部通道具有在角度上分离的入口端口和出口端口；将所述旋转阀置于第一位置，以经由内部通道连接所述n个流导管中的两个流导管；将来自所述n个流导管中的第一流导管的流体的至少一部分转移到所述n个流导管中的经由内部通道连接到第一流导管的第二流导管中；将旋转阀旋转到第二位置，其中在第二位置处，所述n个流导管中的第三流导管经由内部通道连接到第二流导管；经由内部通道将流体的至少一部分在第二流导管和第三流导管之间转移；以及对所述流体执行至少一个流操作。

本发明的一个或多个实施方式的优势包括：

·对旋转阀内的至少一个内部通道内的限定体积的流体进行计量的能力；

·提供允许在单个流设备上执行多种流操作的灵活平台；

·连续执行多个不同的流操作的能力；

·分离流设备中的多种流体/试剂；

·将一个流导管和/或室的全部流体内容转移到相邻流导管和/或室，然后再转移到进一步相邻的流导管和/或室并以此类推的能力；

·执行复杂的化学和/或生化反应所需的试剂量减少

·半熟练操作人员容易使用

·密封所述设备的手段，从而生物样本和/或化学药品被封在设备内，不带来污染危害；

·完全集成的流控制机制；

·自校准方法，以确认在旋转阀中的内部通道中计量的流体的实际体积；

·使用单个设备并行地对两个或更多个不同的样本连续执行流操作的方法；

·将传感器集成到流导管中以分析微流设备中的流体的手段。

附图说明

在附图中，相似的符号指示相似的部件或特征：

图1A-B示出了用于在旋转阀中进行流体计量的传统设备；

图2A-D示出了与本发明有关的旋转阀内的示例性内部通道的三种实施方式；

图3A-E示出了本发明的六种实施方式，每一种具有不同的导管配置；

图4A-C每一个都示出了关于本发明的展示了集成流体控制的本发明的示例实施方式的一个平面图和两个截面图；

图5A-B每一个都示出了关于本发明的外壳内的流室几何结构的示例实施方式的一个平面图和一个截面图；

图6A-J每一个都示出了关于本发明的集成流体控制的另一示例实施方式的一个平面图和两个截面图；

图7A-C每一个都示出了关于本发明的集成流体控制的又一示例实施方式的一个平面图和两个截面图；

图8A-E描述了根据本发明的示例实施方式的如何在流设备中进行光学测量的示例；

图9A-C描述了根据本发明的示例实施方式的如何将磁搅拌条(magnetic flea)优化用于细胞溶解(lysing)和/或混合流操作的示例；

图10A-J根据所描述的示例1描述了如何使用本发明；

图11A-H根据所描述的示例2描述了如何使用本发明；

图12A-J根据所描述的示例3描述了如何使用本发明；

图13根据所描述的示例4描述了如何使用本发明；

图14描述了所描述的示例4的第二实施方式；

图15根据所描述的示例5描述了如何使用本发明；

图16根据所描述的示例6描述了如何使用本发明。

附图标记描述

2 现有技术的旋转阀

4 直通通道

6 第一对相对流导管

8 第二对相对流导管

10 旋转阀

12 “V”型内部通道

14 “U”型内部通道

16 “L”型内部通道

17 “三角”型内部通道

18 外壳

20 第一流导管

22 第二流导管

24 第三流导管

26 第四流导管

28 第五流导管

30 第六流导管

32 第七流导管

34 第八流导管

36 第九流导管

38 第十流导管

40 第十一流导管

42 第十二流导管

44 第一流室

46 第二流室

48 第三流室

50 第四流室

52 第五流室

54 第六流室

56 第七流室

58 第八流室

60 第九流室

62 第十流室

64 第十一流室

66 第十二流室

68 输入端口

70 输出端口

72 第二“V”型内部通道

74 限定体积的流体

76 限定体积的气体

78 第一可移动活塞

80 第二可移动活塞

82 第三可移动活塞

84 第四可移动活塞

86 计量体积的流体

88 第一集成气孔

90 第二集成气孔

92 第二限定体积的流体

94 第三限定体积的流体

96 第四限定体积的流体

98 第五限定体积的流体

100 第二限定体积的气体

102 第三限定体积的气体

104 传感器

106 气体连通导管

108 活塞外壳

110 步进电机

112 第一光源

114 第二光源

116 第三光源

118 第四光源

120 第一光检测器

122 第二光检测器

124 第三光检测器

126 第四光检测器

128 磁搅拌条

130 高宽比(aspect ratio)为0.38的流体体积

132 预限定体积的细胞溶解溶剂

134 预限定体积的终结(quench)溶剂

136 第一计量体积的血液

138 预限定体积的荧光标签溶剂

140 64.5μl的稀释溶剂

142 1∶21.5稀释血液样本

144 1∶462.25稀释血液样本

146 1∶9,938稀释血液

148 流箱

150 预限定体积的稀释溶剂

152 第二旋转阀

154 第十三流导管

156 第十四流导管

158 第十五流导管

160 第十六流导管

162 第十三流室

164 第一微流细胞计数器

166 第二微流细胞计数器

168 血红蛋白测量室

170 废物室

172 限定体积的羧酸溶液

174 限定体积的活化剂

176 限定体积的n-羟基丁二酰亚胺

178 限定体积的pH 8缓冲剂

180 限定体积的胺溶液

具体实施方式

本发明是包括具有旋转阀的外壳的流设备。外壳包含多个流导管，流导管向旋转阀延伸。可选地，每个单独流导管还可以与位于外壳内的流室连通。外壳中的流导管以旋转阀为中心，具有限定的角度分离。旋转阀内的内部通道可被放置为将外壳中的两个依次相邻的流导管连接在一起。

本发明的一个方面是一种用于执行一系列流操作的集成微流设备。一般来讲，集成微流设备包括外壳和旋转阀，其中外壳包括数量为n的多个微流导管，n至少为3，旋转阀具有内部通道，内部通道带有在角度上分离的入口端口和出口端口。旋转阀可位于第一位置，以经由内部通道连接n个流导管中的两个，并且在将所述阀旋转到第二位置时，n个流导管中的两个(包括不同于在第一位置处连接的流导管的至少一个流导管)由内部通道相连接。在示例实施方式中，n可以从5到36个流导管。设备还可包括与各个流导管流连通的一个或多个流室。通过相关联的流导管应用正或负气压，可以经由内部通道将一个流室中所包含的流体转移到另一流室中。如下文所详述，可利用设备来执行多种流操作。

在输入和输出端口之间的角度能够将外壳中的两个依次相邻的流导管连接在一起的情况下，旋转阀内的通道可以是任何形状或长度的。优选地，旋转阀中的内部通道的输入端口和输出端口之间的限定的角度分离与周围的流导管的角度分离相同。优选地，内部通道的输入和输出端口之间分开大于等于10度且小于等于72度。优选地，旋转阀内的内部通道将具有圆形的、直线的、或方形的截面，且基本上是“V”、“U”或“L”形的。针对多种应用的一种尤其适合的实施方式中，旋转阀内的通道基本上是“V”形的，且具有圆形截面。旋转阀的另一适合实施方式基本上是三角形的，其中进口和出口限定角度分离。

图2A的实施方式中，旋转阀10具有基本上“V”形的内部通道12。

图2B的实施方式中，旋转阀10具有基本上“U”形的内部通道14。

图2C的实施方式中，旋转阀10具有基本上“L”形的内部通道16。

图2D的实施方式中，旋转阀10具有基本上三角形的内部通道17。

旋转阀中的内部通道带来了两个主要优点：

·提供了用来使外壳中的两个(优选地，依次相邻的)流导管彼此连通的手段；

·使得能够准确地计量小量的流体，其中流体的计量体积基本上等于内部通道的容积。

举例来讲，旋转阀内的通道的容积为1-50μl、或1-20μl、或1-5μl。可选地，旋转阀内的内部通道的容积可以小于1μl或大于50μl。

外壳包含向旋转阀延伸的多个流导管。可选地，每个单独的流导管还可以与位于外壳内的流室连通。外壳中的流导管以旋转阀为中心，并具有限定的角度分离。可经由旋转阀中的内部通道，在外壳中的多个分离的流导管和/或室之间执行多个流操作。可在依次相邻的流导管和/或室之间执行流操作。外壳中的流导管可以具有基本上圆形的、直线的或方形的截面。

在示例实施方式中，可在外壳中的至少三个分离的、潜在相邻的流导管和/或室之间连续地执行至少三个流操作。流操作可包括但不限于以下各项的任意组合：计量、重新计量、混合、标定、染色、培养、细胞溶解、终结、稀释、滴定、分离、在旋转阀中的内部通道内保持计量体积的流体、和/或在相邻的外部室之间转移流体。这些流操作可连续执行。

计量被定义为从流体样本准确地测量并然后隔离小量流体的能力。

标定被定义为向例如细胞、液滴或其它生物实体添加标记(比如荧光或放射性标记)的处理。

培养被定义为，为特定处理(例如对血液细胞进行荧光标定)的发生提供良好的条件。

细胞溶解被定义为通过比如化学和/或机械手段对细胞进行破坏或溶解。

终结被定义为通过比如化学手段停止、中止或大大降低细胞溶解速率。

滴定被定义为通过添加小量已知浓度的滴定溶液以及测量将给定分析物(比如具有某些指示剂流体)转变成不同的形式所需的滴定剂的体积来确定分析物(或指示剂)的浓度的处理。

分离被定义为对流体样本内的不同组分或元素进行分类或隔离。这可通过使用磁珠和磁体、共价结合等来实现。

本发明中通过使用旋转阀内的内部通道来实现计量。流体的计量体积基本上等于旋转阀内的内部通道的容积。使用一种方法，可通过使例如第一流导管和第二流导管经由旋转阀中的内部通道彼此连通来计量流体。引入到第一流导管的流体填充第一流导管、旋转阀中的内部通道，并至少部分地填充第二流导管。旋转所述旋转阀将旋转阀中的内部通道与第一流导管和第二流导管隔离，并从而包含计量体积的流体。可替换地，第二流导管可包含流体排斥涂层，比如用来排斥基于水的流体的疏水涂层。在这种情况中，引入到第一流导管中的流体将只填充第一流导管和旋转阀中的内部通道。第二流导管仅仅充当气孔。第二流导管的尺寸可被配置为充当毛细管栓塞(stop)。旋转所述旋转阀将旋转阀中的内部通道与第一流导管隔离，并从而包含计量体积的流体，并且流体不会溢出到第二流导管中。

图3A示出了本发明的一种实施方式，其中外壳18中存在以旋转阀10为中心的五个流导管20、22、24、26和28。流导管在角度上分离60度。第一流导管20与第一流室44连通。第二流导管22与第二流室46连通。第三流导管24与第三流室48连通。第四流导管26与第四流室50连通，以及第五流导管28与第五流室52连通。旋转阀具有基本上为“V”形的内部通道12，其中内部通道12的输入端口68和输出端口70分开60度。可旋转所述旋转阀，以经由旋转阀中的内部通道依次连接外壳中任何两个相邻的流导管。

图3B示出了本发明的一种实施方式，其中外壳18中存在以旋转阀10为中心的在角度上分离45度的五个流导管20、22、24、26、28。第一流导管20与第一流室44连通。第二流导管22与第二流室46连通。第三流导管24与第三流室48连通。第四流导管26与第四流室50连通，以及第五流导管28与第五流室52连通。旋转阀具有基本上为“V”形的内部通道12，其中内部通道12的输入端口68和输出端口70分开45度。可旋转位于所述旋转阀内的内部通道，以连接外壳中任何两个依次相邻的流导管。

图3C示出了本发明的一种实施方式，其中外壳18中存在以旋转阀10为中心的在角度上分离30度的十二个流导管20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42。第一流导管20与第一流室44连通。第二流导管22与第二流室46连通。第三流导管24与第三流室48连通。第四流导管26与第四流室50连通。第五流导管28与第五流室52连通。第六流导管30与第六流室54连通。第七流导管32与第七流室56连通。第八流导管34与第八流室58连通。第九流导管36与第九流室60连通。第十流导管38与第十流室62连通。第十一流导管40与第十一流室64连通，以及第十二流导管42与第十二流室66连通。旋转阀具有基本上为“V”形的内部通道12，其中内部通道12的输入端口68和输出端口70分开30度。可旋转所述旋转阀，以经由旋转阀中的内部通道依次连接外壳中任何两个相邻的流导管。

图3D示出了本发明的一种实施方式，其中外壳18中存在以旋转阀10为中心的在角度上分离30度的十二个流导管20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42。第一流导管20与第一流室44连通。第二流导管22与第二流室46连通。第三流导管24与第三流室48连通。第四流导管26与第四流室50连通。第五流导管28与第五流室52连通。第六流导管30与第六流室54连通。第七流导管32与第七流室56连通。第八流导管34与第八流室58连通。第九流导管36与第九流室60连通。第十流导管38与第十流室62连通。第十一流导管40与第十一流室64连通，以及第十二流导管42与第十二流室66连通。旋转阀具有两个基本上为“V”形的内部通道12、72，内部通道12和72彼此不连通，但分别同时与外壳中的不同相邻流导管连通。第一个基本“V”形的内部流通道12与第一流导管20和第二流导管22连通。第二个基本“V”形的内部流通道72与第七流导管32和第八流导管34连通。这一实施方式使得两个流样本能够在相同设备上被输入、计量并且同时受到一系列的流操作。可选地，旋转阀内的两个内部通道可被配置为使得在任何一个时间只有一个内部通道与外壳内的一对相邻流导管连通。这一实施方式还可被配置为将任何给定的或特定的流处理执行三次或四次，或执行至少一次样本测量和控制测量。

图3E示出了本发明的另一种实施方式，其中在外壳18内包含以旋转阀为中心的十二个流导管20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42，其中相邻流导管在角度上分离30度。第一流导管20与第一流室44连通。第二流导管22与第二流室46连通。第三流导管24与第三流室48连通。第四流导管26与第四流室50连通。第五流导管28和第六流导管30都与第五流室52连通。第七流导管32与第六流室54连通。第八流导管34与第七流室56连通。第九流导管36与第八流室58连通。第十流导管38与第九流室60连通。第十一流导管40与第十流室62连通，以及第十二流导管42与第十一流室64连通。旋转阀具有单个基本上为“V”形的内部通道12，内部通道12可被放置为依次连接外壳中任何两个相邻的流导管。

旋转阀中的内部通道可以与外壳中它所连通的导管基本上沿相同的纵轴延伸。旋转阀中的内部通道的截面可以与外壳中它所连通的导管的截面相同或不同。旋转阀中的内部通道的截面可与它所连通的导管的截面相匹配。

流室的容积可被设计为保持期望体积的流体。例如，流室的容积可被设计为小至10μl或大到10ml。在示例性实施方式中，流室的容积在20μl和3ml之间，或者流室的容积在20μl和500μl之间。单个微流设备中的不同流室不需要具有相同的容积，可为了任何给定或特定应用优化每个流室的容积设计。

可从与操作流体兼容的任何适合的材料构造微流设备。兼容性意味着流体基本上不黏附或非特别结合到材料的表面，而且材料不会被流体所破坏或溶解。若干工业聚合物可被用来构造本发明，其中包括但不限于PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、聚丙烯、PTFE(聚四氟乙烯)和尼龙。本发明可使用任何适合的加工处理来构造，其中包括注入铸模、激光切割、钻孔和/或研磨。可替换地，可通过使用软光刻印刷(lithography)技术以抗蚀的方式形成外壳中的流导管的图案，并且使用例如湿刻蚀和/或干刻蚀技术等来进行处理。

输入和计量流体可以是化学制剂(例如测试试剂、还原剂、功能化珠等)、生物制剂(例如血液、尿液、唾液、DNA等)、环境制剂(例如水样、冰核样本等)，或用于监测食品(例如牛奶、水等)质量和/或安全。明显的是，本发明可被用来执行滴定、结合反应、化学功能化处理、荧光标定处理、流体样本制备处理、肽合成处理、连续稀释、以及任何其它合适的处理。进一步明显的是，所描述的微流设备可形成现场护理诊断系统的一部分。

可通过使用毛细管力、和/或正和/或负气压、和/或正和/或负置换压，使流体绕微流设备移动。进一步明显的是，流体控制机制可以在微流外壳的外部，或可以被集成到微流设备外壳中。在本方面的一个方面中，微流设备中的特定的单独流室都可以连接到外部气体源，以在室之间泵送流体。

图4A-C介绍了一种实施方式，其中使用集成的、可移动的活塞在相邻流导管之间泵送流体。外壳18包含具有基本为“V”形的内部通道12的旋转阀10。围绕着旋转阀的一半，五个流导管在角度上分离30度。第一流导管20与对周围环境开放的第一流室44连通。第二流导管22与对周围环境开放的第二流室46连通。第三流导管24与使用第一可移动活塞78密封的第三流室48连通。第四流导管26与使用第二可移动活塞80密封的第四流室50连通。第五流导管28与使用第三可移动活塞82密封的第五流室52连通。在这一特殊实施方式中，第三流室48预先填充了限定体积的流体74。在图4A中，第一可移动活塞78将限定体积流体74密封在第三流室48中，并被保持在第三流室的底部之上高度“h”的第一位置处。从而，密封的第三流室包含预先限定体积的流体74，其中限定体积的气体76将第一可移动活塞78与预加载的限定体积的流体分离。使用第二可移动活塞80密封空的第四流室50，其中第二可移动活塞80被保持在第四流室的底部之上高度h＝0的第二位置处。在图4B中，旋转阀10被旋转放置为将第三流导管24和第四流导管26接通。在这一实施方式中，第三流室48和第四流室50容积相等。随着第一移动活塞78被按压，限定体积的流体74被推动通过第三流导管24，通过旋转阀中的内部通道12，并进入到第四流导管26，然后进入第四流室50。结果，第二可移动活塞80被垂直推动到等于第一可移动活塞78被按压的高度的高度。如图4C所示，一旦第一可移动活塞78被按压到第三流室48的底部之上高度h＝0处，来自第三流室的所有流体都已经被推动通过旋转阀10中的内部通道12，并进入到第四流室50中。第二可移动活塞80的最终位置位于第四流室50的底部之上高度为h的地方。第四流室现在包含限定体积的流体74。

限定体积的气体76必须足以将限定体积的流体74推动通过第三流导管24，通过旋转阀10中的内部通道12，通过第四流导管26，并进入到第四流室50中。

使用第三可移动活塞82密封第五流室52(在本例中是空的)，其中第三可移动活塞82被保持在第五流室的底部之上高度h＝0处。第五流室的总容积等于第四流室的总容积。可将旋转阀10沿顺时针方向旋转45度，使第四流导管26和第五流导管28经由旋转阀10中的内部通道12连通，并且通过按压第二可移动活塞80重复相同的处理，以继续将流体从例如第四流室50移动通过第四流导管26，通过旋转阀中的内部通道12，通过第五流导管28，并进入到第五流室52中。第三可移动活塞82将被垂直向上移位(displace)，移位的高度等于第二可移动活塞80被按压的高度。

可选地，在所描述的流体移动操作的开始，旋转阀中的内部通道可包含计量体积的流体。可通过将旋转阀放置成使得旋转阀内的内部通道与第一流导管和第二流导管两者都连通来计量流体。作为将输入流体输入通过第一流导管，进入到旋转阀中的内部通道，并至少部分地进入第二流导管，以及然后(参考图4A-C中所描述的实施方式)将旋转阀沿顺时针方向旋转90度的结果，计量体积的输入流体被包含在内部通道内。旋转阀中的内部通道还使得第三流导管和第四流导管连通。在这种情况中，当第一可移动活塞被按压时，第三流室中的限定体积的流体和限定体积的气体将旋转阀中的内部通道中的计量体积的流体冲入第四流导管，并从而进入第四流室。

对于本领域技术人员来讲明显的是，并不是所有的流室都需要具有相同的容积，而且室和/或活塞的几何结构可被设计为最佳地容纳(a)室所预加载的流体体积和/或(b)需要在室之间移动的流体体积和/或(c)特定室在操作期间必须保持的流体的最大体积。

进一步对本领域技术人员来讲显然的是，不同的流室能够被设计为最佳地适应它们的目的，例如，如图5A中所示用于特定地分发(dispense)流体或如图5B中所示用于特定地接收流体。举例来讲，如果第三流室48被特别地设计为只分发流体，则可将第三流室的底部设计成便于分发流体，例如，如图5A所示，使第三流室48的底部弯曲，从而流体自然地与位于进行分发的第三流室的底部的第三流导管24连通。可替换地，如图5B所示，对于只接收流体的室来讲，能够将微流设备设计成使得例如与旋转阀10内的内部通道12连通的第四流导管26还与进行接收的第四流室50的顶部连通。

图6A-J介绍了一种实施方式，其中使用集成的、可移动的活塞，经由旋转阀中的内部通道在相邻流导管之间泵送流体，其中设备内的任何多余的气体可被排出。外壳包含具有基本为“V”形的内部通道的旋转阀和以旋转阀为中心、在角度上分离45度的六个流导管(图6A)。第一流导管20与对周围环境开放的第一流室44连通。第二流导管22与对周围环境开放的第二流室46连通。第三流导管24与使用第一可移动活塞78密封的第三流室48连通。第四流导管26与使用第二可移动活塞80密封的第四流室50连通。第五流导管28与使用第三可移动活塞82密封的第五流室52连通。第六流导管30与使用第四可移动活塞84密封的第六流室54连通。流体接收第四流室50与第一集成气孔88连通，第五流室52与第二集成气孔90连通。在所示出的实施方式中，第三流室48预先填充了限定体积的流体74。第一可移动活塞78将限定体积流体74封闭在第三流室48中，并被保持在第三流室的底部之上高度“h”的第一位置处。从而，封闭的第三流室包含预先限定体积的流体74，其中限定体积的气体76将第一可移动活塞78与预加载的限定体积的流体分离。使用第二可移动活塞80密封空的第四流室50，其中第二可移动活塞80被保持在第四流室的底部之上高度“h”的第二位置处。第一集成气孔88与第四流室和周围环境连通。旋转阀(其可选地在内部通道中包含计量体积的流体)被旋转放置成将第三流导管24和第四流导管26接通在一起。随着第一移动活塞78被按压(图6B)，限定体积的流体74被推动通过第三流导管24，通过旋转阀中的内部通道12，并进入到第四流导管26，然后进入第四流室50。一旦第一可移动活塞78被按压到室的底部之上高度h＝0处(图6C)，则来自第三流室的所有限定体积的流体74都已经被推动通过第三流导管24、旋转阀10中的内部通道12、第四流导管26，并进入到第四流室50中。限定体积的气体76必须足以将限定体积的流体74推动通过第三流导管，通过旋转阀10中的内部通道12，通过第四流导管26，并进入到第四流室50中。任何多余的气体能够以气泡的形式通过第四流室50中的限定体积的流体74，并通过第一集成气孔88排出。如果最初包含在第三流室内的限定体积的气体和限定体积的流体大于第四流室的总容量，则由于所有多余的气体都被通过第一集成气孔排出，所以第一可移动活塞仍然能够被按压到其最大程度(在第四流室的容量足以容纳限定体积的流体的情况下)。由于不要求对第一可移动活塞进行精细按压控制，因此这是有利的。第一集成气孔88优选地包含流体排斥涂层和/或膜，以用来防止泵送入第四流室50中的流体意外地漏到设备之外。

可将旋转阀沿顺时针方向旋转45度，使第四流导管26和第五流导管28连通(图6D)。第三可移动活塞82将第二限定体积的流体92密封在第四流室50中，并被保持在第四流室的底部之上高度“h”的第一位置处。第三流室与第二集成气孔90连通。从而，封闭的第四流室包含预先限定的第二体积的流体92，其中第二限定体积的气体100将第三可移动活塞82与预加载的限定体积的流体92分离。第四流室50已经包含限定体积的流体74。随着第三移动活塞82被按压，第二限定体积的流体92被推动通过第五流导管28，通过旋转阀10中的内部通道12，并进入到第四流导管26，然后进入第四流室50(图6E)。一旦第三可移动活塞82已经被按压到第五流室52的底部之上高度h＝0处，则来自第五流室52的所有第二限定体积的流体92都已经被推动通过第五流导管28、旋转阀10中的内部通道12、第四流导管26，并进入到第四流室50中。第二限定体积的气体100必须足以将第二限定体积的流体92推动通过第五流导管28，通过旋转阀10中的内部通道12，通过第四流导管26，并进入到第四流室50中。第四流室50现在包含第三限定体积的流体94，其等于第一限定体积的流体74与第二限定体积的流体92之和(图6F)。从而，第四流室50的容量必须足以保持第一限定体积的流体和第二限定体积的流体两者。作为完全按压第五流室52中的第三可移动活塞82的结果而被推动通过第五流导管，通过旋转阀中的内部通道，通过第四流导管并进入第四流室的任何多余的气体，能够以气泡的形式通过第四流室50中的第三限定体积的流体94，并通过第一集成气孔88排出。

第二集成气孔90优选地包含流体排斥涂层和/或膜，以用来防止第五流室52中的任何流体意外地经由所述第二集成气孔漏到设备之外。

然后，将旋转阀沿顺时针方向再旋转45度，使第五流导管28和第六流导管30连通(图6G)。第四可移动活塞84将第四限定体积的流体96密封在第六流室54中，并被保持在第六流室的底部之上高度“h”的第一位置处。从而，封闭的第六流室包含预先限定的第四体积的流体96，其中第三限定体积的气体102将第四可移动活塞84与预加载的第四限定体积的流体96分离。第五流室52是空的，并且第三可移动活塞82位于第五流室的底部之上高度h＝0的地方。随着第四移动活塞84被按压，第四限定体积的流体96被推动通过第六流导管30，通过旋转阀10中的内部通道12，并进入到第四流导管26，然后进入第五流室52(图6H)。结果，作为施加在第三可移动活塞82上的压力的结果，第三可移动活塞82被垂直向上推动。一旦第四可移动活塞84已经被按压到第六流室54的底部之上高度h＝0处，则来自第六流室54的所有第四限定体积的流体96都已经被推动通过第六流导管30、旋转阀10中的内部通道12、第五流导管28，并进入到第五流室52中。第三限定体积的气体102必须足以将第四限定体积的流体96推动通过第六流导管30，通过旋转阀10中的内部通道12，通过第五流导管28，并进入到第五流室52中。第五流室52现在包含第四限定体积的流体96(图6I)。从而，第五流室52的容量必须足以保持第四限定体积的流体。一旦第三可移动活塞82达到其在第五流室52的底部之上的最大高度“h”，则作为完全按压第六流室54中的第四可移动活塞84的结果而被推动通过第六流导管30，通过旋转阀10中的内部通道12，通过第五流导管28并进入第五流室52的任何多余的气体，能够以气泡的形式通过第五流室52中的第四限定体积的流体96，并通过第二集成气孔90排出。

然后，可将旋转阀沿逆时针方向旋转45度，从而旋转阀中的内部通道使第四流导管和第五流导管连通。第三可移动活塞82然后能够被完全按压，以推动来自第五流室52的第四限定体积的流体，通过第五流导管28，通过旋转阀10中的内部通道12，进入到第四流导管26，并进入第四流室50。然后，第四流室50包含第五限定体积的流体98，其等于第一限定体积的流体74与第二限定体积的流体92以及第四限定体积的流体96之和(图6J)。从而，第四流室50的容量应该足以保持第五限定体积的流体98。任何多余的气体可通过第一集成气孔88被排出。

在一些实施方式中，传感器可与微流芯片合并和/或集成到微流芯片中，以监测一个或多个流导管和/或一个或多个流室中的流体。传感器可以是用于监测流体的化学、光学和/或电学属性和/或成分的任意传感器，其可包括但不限于阻抗传感器、粒子计数器、激光器、LED、光电二极管、PMT、pH传感器、EWOD、AM-EWOD、以及其它适合的传感器设备。

图7A-C介绍了一种实施方式，其中通过使用与至少一个流室垂直地放置的至少一个集成活塞来实现精细流体控制。具体地，活塞被设计为使流体以恒定的流速率流经至少一个流导管中的至少一个传感器。在这一所示出的实施方式中，外壳包含具有基本为“V”形的内部通道的旋转阀和以旋转阀为中心、在角度上分离60度的六个流导管(图7A)。第一流导管20与对周围环境开放的第一流室44连通。第二流导管22与对周围环境开放的第二流室46连通。第三流导管24与使用第一可移动活塞78封闭的第三流室48连通。第四流导管26与使用第二可移动活塞80封闭的第四流室50连通。第五流导管28与第五流室52连通，第五流室52还经由通气导管106与位于垂直于第五流室52的活塞外壳108内的第三可移动活塞82连通。活塞外壳108延伸至微流设备外壳18的边缘，其中活塞外壳可以与外部步进电机110集成。第六流导管30与具有第一集成气孔88的第六流室54连通。第六流导管30还与传感器104连通。假定已经在第一流导管、第二流导管、第三流导管、第四流导管和第五流导管之间执行了一系列的流操作，使得第五流室52中存在限定体积的流体74。通气导管106可包含流体排斥涂层和/或膜，以用来防止第五流室52中的预加载的流体意外地通过进入到活塞外壳108中。例如，通气导管的疏水属性排斥基于水的液体，但仍然允许加压气体从活塞外壳108，经由通气导管106通过进入到第五流室52中。

将旋转阀放置为使第五流导管28和第六流导管30经由旋转阀10中的内部通道12连通。使用步进电机110从活塞外壳108的外部边缘以恒定的速率按压第三可移动活塞82，推动来自第五流室52的预先限定体积的流体74，通过第五流导管28，通过旋转阀10中的内部通道12，并进入到第六流导管30中(图7B)。限定体积的流体优选地以由步进电机110按压活塞的速率所确定恒定流速率经过第六流导管中的传感器104，并在其流经传感器104时被分析。位于第六流室54之上的第一集成气孔88允许多余的气体逸出。

继续以恒定速率按压第三可移动活塞82，直到其最终位置(第三可移动活塞82在此处与通气导管106相接触)为止(图7C)。活塞外壳108中包含有足够体积的气体，以将全部限定体积的流体推出第五流室52，通过第五流导管28、旋转阀10中的内部通道12、第六流导管30，并进入到第六流室54。

传感器可以是用于监测流体的化学、光学、热学或电学属性和/或成分的任意传感器，其可包括但不限于阻抗传感器、粒子计数器、激光器、LED、光电二极管、PMT、pH传感器、EWOD、AM-EWOD、流传感器、温度传感器以及其它适合的传感器设备。

在另一实施方式中，可使用多个传感器来准确地确定在旋转阀中的内部通道内计量的流体的体积。工程容差可使得具有设计为5μl的内部通道的旋转阀实际上可以是5+/-0.5μl，例如+/-10％。对于需要准确、定量样本分析的应用，这可以意味着意外地报告例如伪负或伪正结果。因此，本发明的一种实施方式用来提供自校准微流流操作设备。根据一个方面，可确定旋转阀中的内部通道内计量的流体的实际体积。这可通过在适当的流导管和/或流室处每次进行流操作之前和/或之后进行光学测量来实现。然后，可将在每次流操作之前和/或之后测量的值与针对所考虑的处理的校准曲线进行对比，所述处理包括例如计量、稀释、细胞溶解、混合、结合、滴定等。对于计量操作，技术使得计量的流体中的任何改变(例如由于工程容差的变化或由于旋转阀中的内部通道中存在气泡)都能被准确地加以考虑。技术还可被采用为通过将实际输出与针对所述处理的校准曲线进行比较来确认已经在导管和/或室之间移动了正确体积的流体，例如已经将50μl的荧光材料与50μl的缓冲剂准确地混合。

图8A-E示出了微流设备的一种实施方式，其中在外壳18内具有十个流导管和十个流室，以及具有基本为“V”形的内部通道12的旋转阀10(图8A)，其中策略性地放有外部传感器，以用于对正在微流设备内的流室中处理的流进行光学测量，以产生能够在使用时单独校准的微流设备。第一流导管20与第一流室44连通。第二流导管22与第二流室46连通。第三流导管24与第三流室48连通。第四流导管26与第四流室50连通。第五流导管28与第五流室52连通。第六流导管30与第六流室54连通。第七流导管32与第七流室56连通。第八流导管34与第八流室58连通。第九流导管36与第九流室60连通，以及第十流导管38与第十流室62连通。图8B介绍了放置于第一流室44之下的第一光源112，以及放置于第一流室44之上的第一光检测器120。图8C介绍了放置于第四流室50之下的第二光源114，以及放置于第四流室50之上的第二光检测器122。图8D介绍了放置于第七流室56之下的第三光源116，以及放置于第七流室56之上的第三光检测器124。图8E介绍了放置于第十流室62之下的第四光源118，以及放置于第十流室62之上的第四光检测器126。光源可以是LED、激光或其它适合的光源，光检测器可以是光电二极管、PMT或用于感测来自相关联的光传感器的光的其它适合光检测器。可替换地，可使用单个光源和光检测器，并且微流设备进行旋转，以使得可分别在第一流室44、第四流室50、第七流室56和第十流室62处进行光学测量。

根据本发明的另一方面，使用磁搅拌条来对一个或多个流室中的流体进行混合和/或细胞溶解。为了在具有磁搅拌条的流室中实现最有效地混合和/或细胞溶解，流室中的流体体积、混合井的几何结构、磁搅拌条的大小以及磁搅拌条的旋转速度可被优化。

流室内的流体体积的高宽比被定义为室中流体的高度与室中流体的宽度之比。较低的高宽比与更有效地细胞溶解和/或混合相关联。在本发明的特定实施方式中，细胞溶解和/或混合流室具有的高宽比在0.1到4之间。高宽比可以在0.1和2之间或在0.2和0.95之间。

磁搅拌条的边缘可紧靠流室的内壁，或可以与流室的壁隔开一定距离。在特定实施方式中，磁搅拌条的长度与流室的直径的比大于0.5，并且可以大于0.6或大于0.7。

在特定实施方式中，流体的高度与磁搅拌条的高度之比至少为1。

磁搅拌条旋转的越快，混合和/或细胞溶解就越有效率。在一种实施方式中，磁搅拌条的转速可以大于300转每分钟(rpm)，或大于500rpm，或为1400rpm。

图9A-C介绍了一种实施方式，其中针对细胞溶解和混和优化磁搅拌条和井几何结构。图9A示出了具有五个流导管、五个流室和具有基本为“V”形的内部通道12的旋转阀10的微流外壳18。第一流导管20与第一流室44连通。第二流导管22与第二流室46连通。第三流导管24与第三流室48连通。第四流导管26与第四流室50连通，其中磁搅拌条128位于第四流室50内。第五流导管28与第五流室52连通。图9B示出了具有磁搅拌条128的第四流室50，其中磁搅拌条的长度与流室的直径之比为0.82。图9C进一步示出了所述具有磁搅拌条128的第四流室50，其中包含高宽比为0.38的流体130，所述高宽比定义为室中流体的高度与室中流体的宽度之比。

下文描述了可使用根据上文描述的一个或多个实施方式配置的微流设备执行的示例。以下示例总体来讲是对在集成微流设备中执行一系列流体操作的方法的说明。方法可包括以下步骤：提供包括数量为n的多个微流导管的外壳，其中n至少为3；提供具有内部通道的旋转阀，其中内部通道具有在角度上分离的入口端口和出口端口；将旋转阀放置在第一位置，以经由内部通道连接n个流导管中的两个；将来自n个流导管中的第一流导管的流体转移到n个流导管中的经由内部通道连接到第一流导管的第二流导管中；将旋转阀旋转到第二位置，其中在第二位置，n个流导管中的第三流导管经由内部通道连接到第二流导管；经由内部通道将流体从第二流导管转移到第三流导管；以及对流体执行至少一个流体操作。所执行的流体操作可包括以下中的至少一个：计量或重新计量流体；混合流体内的成分；标定、培养、细胞溶解、终结、稀释、滴定或分离流体内的成分；和/或在与n个流导管中的一个或多个流连通的外部导管或室之间转移流体。结合以下示例对这些类型的流体操作的其它细节进行描述。

示例1-对来自全血样本的红血细胞进行细胞溶解

1μl的人类全血包含约5百万红血细胞(RBC)、约1万白血细胞(WBC)、以及约50万血小板。为了准确地计数WBC的数量，必须将RBC移除，即细胞溶解。

图10A-J介绍了本发明如何能被用来对来自全血样本的RBC进行细胞溶解，使得能够对WBC进行计数。

本实施方式中，流设备具有以旋转阀为中心的五个流导管，其中每个流导管之间有60度的角度分离。旋转阀10包含基本为“V”形的内部通道12，内部通道12的输入端口和输出端口分离60度。内部通道12限定了已知的体积，使得能够对流体(本示例中是血液)样本进行准确计量。第一流室44充当样本输入室，第一流导管20充当样本输入导管。第二流导管22充当溢出通道，第二流室46作为气孔。第三流室48保持预先限定体积的细胞溶解试剂132，而第五流室52保持预先限定体积的终结试剂134。第四流室50包含磁搅拌条128，以用于执行细胞溶解和终结反应。基于旋转阀中的内部通道的容积计算细胞溶解和终结试剂的所需体积，其将被用来计量限定体积的全血。

旋转阀10被设到第一位置，其中旋转阀中的内部通道12连接第一流导管20和第二流导管22(图10A)。经由第一流室44将全血引入到设备中(图10B)。血毛细管填充第一流导管20、旋转阀10中的内部通道12，并开始填充第二流导管22的至少一部分(图10C)。旋转阀10的内部通道12还被填充了血液。将旋转阀沿顺时针方向旋转60度，使第二流导管与第三流导管连通。第二和第三流导管被保持在相等的压力，从而将计量体积的流体保持在旋转阀中的内部通道内。这防止任何所计量的流体意外地进入第二或第三流导管。将旋转阀再沿顺时针方向旋转60度，从而对旋转阀中的内部通道内的第一计量体积的血液136进行计量(图10D)。这一旋转动作还将第一计量体积的血液136与第一流导管20和第二流导管22隔离，并使第三流导管24与第四流导管26连通。

使用正气压将限定体积的细胞溶解试剂132从第三流室48移出，将第一计量体积的血液136冲出旋转阀10的内部通道12，并进入到第四流室50(图10E)。磁搅拌条128将第一计量体积的血液136与限定体积的细胞溶解试剂132混合预定时间长度，引入红血细胞的最佳细胞溶解所需的最小剪切(shear)量(图10F)。

然后将旋转阀再沿顺时针方向旋转60度，以连接第五流导管28和第四流导管26(图10G)。使用正气压将限定体积的终结试剂134从第五流室52移出，通过旋转阀10的内部通道12，并进入到第四流室50(图10H)。然后使用磁搅拌条128将限定体积的终结试剂与第四流室50中已经存在的细胞溶解的血液进行混合，以停止细胞混合反应并保留白血细胞用于计数(图10I)。

然后，能够可选地将旋转阀10移动到最终位置，在最终位置，内部通道12不将外壳中的任何流导管连接在一起，从而防止流体绕设备意外地移动(图10J)。然后能够移除样本并使用适合的血液细胞计数器对样本进行分析。

优选地，被输入到设备的血液将被暴露给抗凝血剂，例如EDTA盐、肝素等。优选地，第一流室44、第一流导管20和/或旋转阀10中的内部通道12的表面将使用抗凝血剂预先处理。这种复合物可被黏附到导管壁的表面。可替换地，可将抗凝血剂添加到第三流室48中的预加载的限定体积的细胞溶解试剂132。

细胞溶解试剂是包含已知用来对RBC进行细胞溶解的化学制品(比如皂素、季铵盐等)的任意试剂混合。优选地，所使用的细胞溶解试剂包含皂素。细胞溶解试剂可以是0.12％v/v的甲酸和0.05％w/v的皂素。终结试剂是已知用来停止或充分降低RBC细胞溶解速率的任意试剂混合。终结试剂可以是0.6％w/v的碳酸钠和3％w/v的氯化钠。在示例性实施方式中，血液：细胞溶解试剂：终结试剂的混合比例是1∶12∶5.3。

示例2-血细胞标定、细胞溶解和终结：

图11A-H介绍了如何能够在微流设备中对全血样本中的白血细胞进行荧光标定并准备用于分析。

在本实施方式中，流外壳18具有以旋转阀为中心的六个流导管，其中每个流导管之间有45度的角度分离。旋转阀10包含基本为“V”形的内部通道12，内部通道12的输入端口和输出端口分离45度。内部通道12限定了已知的体积，使得能够对全血进行准确地计量。

设备包括第一流室44和第一流导管20，它们充当血样输入室和导管。第三流室48保持预先限定体积的荧光标签试剂138，荧光标签试剂138适于在白血细胞上标出预先限定的标记。第四流室50包含磁搅拌条128，并充当混合、细胞溶解和终结室。第五流室保持预先限定体积的细胞溶解试剂132，第六流室保持预先限定体积的终结试剂134。基于旋转阀中的内部通道的容积计算荧光标定、细胞溶解和终结试剂的所需的预先确定体积。

旋转阀10被设到第一位置，其中旋转阀10中的内部通道12使第一流导管20和第二流导管22连通。经由第一流室44将全血引入到设备中(图11A)。

血毛细管填充第一流导管20、旋转阀10中的内部通道12，并开始填充第二流导管22的至少一部分。旋转阀10的内部通道12被血液完全填充(图11B)。

将旋转阀沿顺时针方向旋转45度，使第二流导管与第三流导管经由旋转阀中的内部通道连通。第二和第三流导管被保持在相等的压力，从而防止旋转阀中的内部通道中的任何流体意外地流出旋转阀中的内部通道。再将旋转阀沿顺时针方向旋转45度，在处理过程中，对旋转阀10内的内部通道12内的限定体积的血液136进行计量。从而将计量体积的血液136与第一流导管20和第二流导管22隔离。对旋转阀的旋转还使得第三流导管24与第四流导管26经由旋转阀10中的内部通道12连通，其中内部通道12包含计量体积的血液136(图11C)。

使用正气压将限定体积的荧光标签试剂138从第三流室48移出，通过第三流导管24，将计量体积的血液136冲出旋转阀10的内部通道12，并经由第五流导管28进入到第五流室52，以用于培养。这提供了用来促进荧光标签与白血细胞结合的环境(图11D)。磁搅拌条轻柔地搅动全血和荧光标签试剂，以培养预定长度的时间。在这一点，磁搅拌条的一个作用是用来帮助防止样本沉淀。

然后再将旋转阀沿顺时针方向旋转45度，从而旋转阀10内的内部通道12使第五流导管28和第四流导管26连通(图11E)。

使用正气压将限定体积的细胞溶解试剂132从第五流室52移出，通过旋转阀10的内部通道12，并经由第四流导管26进入到第四流室50(图11F)。然后使用磁搅拌条128将限定体积的细胞溶解试剂与经过荧光标定的白血细胞进行混合，以对红血细胞进行细胞溶解(例如移除)。

当对标定的血液进行细胞溶解时，将旋转阀10顺时针旋转45度，以使得旋转阀10内的内部通道12连接第五流导管28和第六流导管30。将正气压施加到包含限定体积的终结试剂134的第六流室54。正气压推动限定体积的终结试剂134，通过第六流导管30，通过旋转阀10中的内部通道12，通过第五流导管28，进入到第五流室(图11G)。

然后，将旋转阀逆时针旋转45度，以使得经由旋转阀10中的内部通道12重新连接第四流导管26和第五流导管28。施加到第五流室52的正气压推动限定体积的终结试剂，通过第五流导管28，旋转阀10中的内部通道12，并进入到第五流室50，终结试剂在此消除细胞溶解反应(图11H)。

如果期望的话，还能够将旋转阀移动到最终位置，在最终位置，内部通道12不连接外壳中的任何流导管，从而防止流体绕设备意外地移动。然后使用具有荧光检测能力的适合的血液细胞计数器对进行了标定以及细胞溶解的血液样本进行分析。

被输入到设备的血液可暴露给抗凝血剂，例如EDTA盐、肝素等。第一流室44、第一流导管20和/或旋转阀10中的内部通道12的表面将使用抗凝血剂预先处理。这种复合物可被黏附到导管壁的表面。可替换地，可将抗凝血剂添加到第三流室48中的预加载的限定体积的荧光标签试剂138。

细胞溶解试剂是包含已知用来对RBC进行细胞溶解的化学制品(比如皂素、季铵盐等)的任意试剂混合。所使用的细胞溶解试剂可包含皂素。细胞溶解试剂可以是0.12％v/v的甲酸和0.05％w/v的皂素。终结试剂是已知用来停止或充分降低RBC细胞溶解速率的任意试剂混合。终结试剂可以是0.6％w/v的碳酸钠和3％w/v的氯化钠。在示例性实施方式中，血液：细胞溶解试剂：终结试剂的混合比例是1∶12∶5.3。

荧光标签可以被设计为结合到WBC的表面上的CD标记。在一些实施方式中，荧光标签试剂可包括结合到不同CD标记的若干不同荧光标签。

示例3-对样本的高比例连续稀释

1μl的人类全血包含约5百万红血细胞(RBC)。具体地，这一示例示出了本发明如何能被用来对全血执行高比例稀释从而能够对红血细胞和血小板进行计数。图12A-J介绍了如何能够使用与传统单步稀释(例如1μl全血稀释到10ml稀释试剂中)相比充分降低体积的稀释试剂，以约1∶10,000的比例稀释全血样本。

在本例中，流设备具有以旋转阀为中心的十个流导管，其中每个相邻流导管之间有30度的角度分离。旋转阀10包含“V”形的内部通道12，内部通道12的输入端口和输出端口分离30度。内部通道12限定了已知的3μl体积，使得能够对血液样本进行准确地计量。第一流室44充当血液输入室，第一流导管20充当血液输入导管。第二流导管22充当第一溢出导管，第二流室46作为气孔。第三流室48、第六流室54以及第九流室60均包含64.5μl的稀释试剂。第四流室50、第七流室56以及第十流室62均包含磁搅拌条(为了清楚起见未示出)。第五流导管28充当第二溢出导管，第五流室52作为第二气孔。第八流导管34充当第三溢出导管，第八流室58作为第三气孔。

旋转阀被设至第一位置，从而旋转阀10中的内部通道12使第一流导管20和第二流导管22连通(图12A)。

经由第一流室44将全血样本引入到设备中。全血样本毛细管填充第一流导管20、旋转阀10中的内部通道12，并开始填充第二流导管22的至少一部分。旋转阀10的内部通道12现在包含限定的3μl体积的全血(图12B)。

将旋转阀沿顺时针方向旋转60度，使第一计量体积的血液136与第一流导管20和第二流导管22隔离，并连接第三流导管24与第四流导管26(图12C)。通过这一旋转，第二和第三流导管短暂地经由旋转阀中的内部通道彼此连通，但在第二和第三流导管之间没有执行任何流操作；旋转阀内的内部通道内的流体的体积被维持在旋转阀的内部通道内。

使用正气压将64.5μl的稀释试剂140从第三流室48移出，将所计量的样本血液136冲出旋转阀10的内部通道12，并经由第四流导管26进入到第四流室50。第四流室50中的磁搅拌条(未示出)轻柔地搅动所计量的全血和稀释试剂，以实现完全混合以及第一次1∶21.5稀释(图12D)。第四流室50现在包含限定体积的1∶21.5稀释血液样本142。

然后将旋转阀沿顺时针方向再旋转30度，经由旋转阀10中的内部通道12将第四流导管26和第五流导管28接通。向第四流室50施加正气压，推动1∶21.5稀释血液样本流体样本进入第四流导管26、旋转阀10的内部通道12，而且1∶21.5稀释血液样本流体的至少一部分进入第五流导管28(图12E)。旋转阀10中的内部通道12现在包含3μl的1∶21.5稀释血液样本。

在这一点，沿顺时针方向将旋转阀旋转60度，以将计量体积的1∶21.5稀释血液样本流体与第四流导管26和第五流导管28隔离，并使第六流导管30经由包含3μl的1∶21.5稀释血液样本的旋转阀中的内部通道12与第七流导管32连通(图12F)。

使用正气压将64.5μl的稀释试剂140从第六流室54移出，将所计量的1∶21.5稀释血液样本冲出旋转阀10内的内部通道12，并经由第七流导管32进入到第七流室56。第七流室56中的磁搅拌条(为了清楚未示出)轻柔地搅动样本，以实现完全混合以及第二次1∶21.5稀释(图12G)。在这一级的总稀释是1∶462.25。

然后将旋转阀沿顺时针方向再旋转30度，经由旋转阀10中的内部通道12将第七流导管32和第八流导管34接通。向第二混合室施加正气压，以推动1∶462.25稀释血液样本144流体进入第七流导管32，进入旋转阀10的内部通道12，而且1∶462.25稀释血液样本的至少一部分进入第八流导管34。旋转阀10中的内部通道12现在包含3μl的1∶462.25稀释血液样本(图12H)。

在这一点，沿顺时针方向将旋转阀旋转60度，以将旋转阀10中的内部通道12中的计量体积的1∶462.25稀释血液样本与第七流导管32和第八流导管34隔离，并使第九流导管36经由旋转阀10中的内部通道12与第十流导管38连通(图12I)。

使用正气压将64.5μl的稀释试剂140从第九流室60移出，将所计量的1∶462.25稀释血液样本冲出旋转阀10的内部通道12，并进入到第十流室62。第十流室62中的磁搅拌条(为了清楚起见未示出)轻柔地搅动样本，以实现完全混合以及第三次1∶21.5稀释。最终的稀释比是1∶9938，其中第十流室50包含限定体积的1∶9938稀释血液146。

在本例中，能够使用总量为64.5*3＝193.5μl的稀释试剂执行1∶9938(21.5*21.5*21.5＝9938)稀释。这大大少于9.938ml的稀释试剂(如果像传统执行那样在单步中执行稀释的话将需要的量)。根据类似原理操作的类似设备可被用来执行约1∶10000的稀释，其中使用相同的3μl计量阀，但只经过两个稀释步骤。在这一情况中，将存在两个流室，每个流室保持300μl的稀释试剂。第一稀释步骤将3μl的全血稀释到300μl的稀释试剂中(1∶100稀释)。然后将在旋转阀中的内部通道中计量这一稀释样本中的3μl，并将其稀释到包含另一300μl的稀释试剂的第二流室中(第二次1∶100稀释)。最终稀释溶液将通过使用总量为600μl的稀释试剂以1∶10000的比例稀释得到，仍然大大地小于在传统的单个步骤中完成稀释所需的10ml，但与上文中描述的使用三步获得1∶9938稀释所需的稀释试剂的总体积193.5μl相比，这一方法所需的稀释试剂总体积将达三倍多。

可选地，可通过第一流室、第四流室、第七流室、和/或第十流室中的至少三个进行光学测量，例如荧光和/或吸收测量。通过将来自每个流室的光学测量与针对稀释的校准曲线进行比较，并且在已知每个步骤的稀释试剂的体积的情况下，可确定在每个计量阶段在旋转阀内计量的流体的确切体积。注意：任何校准曲线都不太可能在10000倍稀释范围内完全线性。继而，可准确地计算在三个计量和稀释步骤之后的确切稀释比。这使得能够准确地考虑旋转阀内的内部通道内计量的体积中的任何改变(例如由于加工过程中的容差所导致的内部通道体积中的微小变化)。可替换地，可在第一流导管、第四流导管、第七流导管和/或第十流导管处进行光学测量。

知道已经在旋转阀中的内部通道中计量了多少血液是非常重要的，这是因为计量中的任何微小变化都能对最终的稀释比产生显著的影响，并因此可导致诊断的不准确。例如，假定制作旋转阀内的3μl内部通道的工程容差是+/-10％。旋转阀中的内部通道可具有2.7μl和3.3μl之间的任何容积。假定连续执行三次1∶21.5稀释(例如按上文所述，在三个流室中预先加载64.5μl)，则只有在旋转阀内的内部通道实际计量为3μl的情况下，所预期的1∶9938最终稀释比才是正确的。假定1μl的人类全血包含5百万RBC，这一1∶9938稀释导致平均值为503RBC/μl。

然而，如果内部通道实际只计量为2.7μl而不是3μl，则在每个稀释阶段的稀释比是1∶23.89而不是1∶21.5，得到最终稀释比为1∶13633，以及平均值为367RBC/μl。如果内部通道实际计量为3.3μl而不是3μl，则在每个稀释阶段的稀释比变成1∶19.55，产生的最终总稀释比为1∶7472，以及平均值为669RBC/μl。这些数字总结于表1中：

表1：

假定在1∶9938稀释之后RBC的异常高数量是604RBC/μl，则明显的是，如果当期望计量为3μl时内部通道计量为3.3μl，则返回伪正结果(除非采用附加的校准措施)，这是因为3.3μl的计量且稀释的血液给出669RBC/μl的当量，这大于604RBC/μl的截止值。

优选地，样本流体是全血，以及微流设备用于为RBC计数制备全血样本。随后可使用任何合适的细胞计数器来分析最终稀释样本中的RBC的数量。

可替换地，这一稀释方法可被用于需要稀释(特别是最终高比例稀释)的任何样本。

示例4-全血计数：

1μl的人类全血包含约5百万红血细胞(RBC)、约1万白血细胞(WBC)、以及约50万血小板。为了准确地对WBC的数量进行计数，必须将RBC移除，即细胞溶解。为了使得能够准确地对RBC进行计数，以例如1∶5000到1∶40000的比例对全血样本进行稀释。可以以1∶10000到1∶20000的比例对全血样本进行稀释，或以1∶10000的比例进行稀释。优选地，将血小板与RBC一起进行计数。从而，存在两种不同的样本制备方案，一种用于WBC，另一种用于RBC和血小板的组合。

图13介绍了本发明如何能被用来制备全血样本，以使得能够使用单个流箱(cartridge)中的两个单独的集成微流细胞计数器对WBC、RBC和血小板进行计数。流箱包含两个旋转阀样本制备设备，其中每个设备对来自相同血液输入样本的限定体积的血液进行计量。

集成的流箱148包括第一流室44(其作为样本输入室)、第一流导管20、第一旋转阀10中的第一基本为“V”形的内部通道12(其中输入和输出端口分离60度)、连接到包含预先限定体积的细胞溶解试剂132的第二流室46的第二流导管22、连接到包含磁搅拌条128的第三流室48的第三流导管24、连接到包含磁搅拌条128以及预先限定体积的终结试剂134的第四流室50的第四流导管26。第五流导管28与第一集成微流细胞计数器164连通，第一集成微流细胞计数器164与血红蛋白测量室168连通，并从而与废物室170连通。第六流导管30用来使第一旋转阀10与第二旋转阀152连通。第一流导管20、第二流导管22、第三流导管24、第四流导管26、第五流导管28和第六流导管30都以第一旋转阀10为中心，其中依次相邻的流导管在角度上分离60度。

第六流导管30与第二旋转阀152连通，第二旋转阀152包含第二基本为“V”形的内部通道72。第二内部通道72的输入和输出端口分离30度。第七流导管32与第五流室52连通，其中第五流室52作为气孔。第八流导管34与第六流室54连通，其中第六流室54包含预先限定体积的稀释试剂150。第九流导管36与第七流室56连通，其中第七流室56包含磁搅拌条128。第十流导管38与第八流室58连通，其中第八流室58作为气孔。第十一流导管40与第九流室60连通，其中第九流室60包含预先限定体积的稀释试剂150。第十二流导管42与第十流室62连通，其中第十流室62包含磁搅拌条128。第十三流导管154与第十一流室64连通，其中第十一流室64充当气孔。第十四流导管156与第十二流室66连通，其中第十二流室66包含限定体积的稀释试剂150。第十五流导管158与第十三流室162连通，其中第十三流室162包含磁搅拌条128。第十六流导管160与第二微流细胞计数器166连通，第二微流细胞计数器166继而与废物室170连通。第六流导管30、第七流导管32、第八流导管34、第九流导管36、第十流导管38、第十一流导管40、第十二流导管42、第十三流导管154、第十四流导管156、第十五流导管158以及第十六流导管160都以第二旋转阀152为中心，其中依次相邻的流导管在角度上分离30度。

第一旋转阀对为了对WBC进行计数而将被处理的第一限定体积的血液进行计量，而第二旋转阀对为了对RBC和血小板进行计数而将被处理的第二限定体积的血液进行计量。存在两个集成细胞计数器；一个用于对WBC的数量进行计数，另一个用于对所处理的血液样本中的RBC和血小板进行计数。废物室在计数后收集并存储所处理的血液。

经由第一流室44、第一流导管20、第一旋转阀10中的第一内部通道12、第六流导管30、第二旋转阀152中的第二内部通道72输入全血，并且至少部分地输入到第七流导管32中。优选地，毛细管力将血液样本汲取到第一流导管20中，通过第一旋转阀10中的第一内部通道12，通过第六流导管30，进入第二旋转阀152的第二内部通道72中，并进入到第七流导管32中。

输入到设备中的血液将被暴露给抗凝血剂，例如EDTA盐、肝素等。第一流室、第一流导管、第一旋转阀中的内部通道、第六流导管和/或第二旋转阀中的内部通道的表面可使用抗凝血剂预先处理。这种复合物可被黏附到通道壁的表面。可替换地，可将抗凝血剂添加到第一流室和第六流室中的预加载的流体。

填充第一旋转阀10的内部通道12的血液将被处理为使得WBC能够被计数。将第一旋转阀10顺时针旋转120度，计量第一旋转阀10内的内部通道12中的限定体积的全血，并经由第一旋转阀10内的内部通道12连接第二流导管22与第三流导管24。使用正气压将限定体积的细胞溶解试剂132推出第二流室46，将所计量的血液样本冲出第一旋转阀10的内部通道12，并经由第三流导管24进入到第三流室48。在第三流室48中对血液进行细胞溶解达预定长度的时间，并使用磁搅拌条128产生混合和剪切。

将第一旋转阀顺时针旋转60度，将第三流导管24和第四流导管26接通。第四流室50包含限定体积的终结试剂134。使用正气压将经过细胞溶解的血液从第三流室48经由第三流导管24、第一旋转阀10中的内部通道12和第四流导管26转移到第四流室50，其中化学细胞溶解处理被限定体积的终结试剂134停止。磁搅拌条128将经过细胞溶解的血液与限定体积的终结试剂134混合预定长度的时间。

再沿顺时针方向将第一旋转阀10转45度，将第四流导管26连接到第五流导管28，第五流导管28继而与第一微流细胞计数器164连通。施加到第四流室50的正气压推动经过细胞溶解和终结的血液样本以恒定的流速率经由第四流导管26、第一旋转阀10中的内部通道12和第五流导管28通过第一微流细胞计数器164，使得WBC能被计数。

细胞溶解试剂是包含已知用来对RBC进行细胞溶解的化学制品(比如皂素、季铵盐等)的任意试剂混合。所使用的细胞溶解试剂可包含皂素。细胞溶解试剂可以是0.12％v/v的甲酸和0.05％w/v的皂素。终结试剂是已知用来停止或充分降低RBC细胞溶解的速率的任意试剂混合。终结试剂可以是0.6％w/v的碳酸钠和3％w/v的氯化钠。在示例性实施方式中，血液：细胞溶解试剂：终结试剂的混合比例是1∶12∶5.3。第一旋转阀中的内部通道可具有1-20μl、或1-10μl、或3-5μl的容积。旋转阀中的内部通道可具有5μl的容积，并从而计量5μl的全血。可将60μl的0.12％v/v的甲酸和0.05％w/v的皂素预先加载到第二流室中，以及将26.5μl的0.6％w/v的碳酸钠和3％w/v的氯化钠预先加载到第四流室中。在计量、细胞溶解和终结之后，经过细胞溶解和终结的血液的总体积将是91.5μl。

填充第二旋转阀152的第二“V”形内部通道72的血液将被处理为使得RBC和血小板能够被计数。将第二旋转阀152逆时针旋转60度，计量第二旋转阀152中的第二内部通道72内的第二限定体积的全血，并经由第二旋转阀152中的第二内部通道72使第八流导管34与第九流导管36连通。

施加到第六流室54的正气压将限定体积的稀释试剂150推出第六流室54，通过第八流导管34，将第二计量限定体积的全血经由第九流导管36冲入第七流室56，其中在第七流室56中使用磁搅拌条128对样本进行混合，以实现第一次1∶21.5稀释。

再将第二旋转阀152逆时针旋转30度，将第九流导管36和第十流导管38接通。将正气压施加到第七流室56，以将第一稀释血液推动通过第九流导管36，进入第二旋转阀152中的第二内部通道72，并至少部分地进入第十流导管38。

在这一点，将旋转阀逆时针旋转60度，计量第二旋转阀152中的第二内部通道内部的限定体积的第一稀释血液，并经由第二旋转阀152中的第二内部通道72将第十一流导管40与第十二流导管42接通在一起。第九流室60预先填充有预先限定体积的稀释试剂150，而且第十流室62包含磁搅拌条128。

在处理过程中，施加到第九流室60的正气压将预先限定体积的稀释试剂150推动通过第十一流导管40、第二旋转阀152中的第二内部通道72、通过第十二流导管42并进入第十流室62，将计量体积的第一稀释血液冲出第二旋转阀152的第二内部通道72并经由第十二流导管42进入第十流室62。使用第十流室62中的磁搅拌条128将计量体积的第一稀释血液与第二预先限定体积的稀释试剂相混合，以实现第二次1∶21.5稀释。

再将第二旋转阀152逆时针旋转30度，以经由第二旋转阀152中的第二内部通道72将第十二流导管42与第十三流导管154接通。将正气压施加到第十二流室62，以将第二稀释血液推动通过第十二流导管42，进入第二旋转阀152中的第二内部通道72，并至少部分地进入第十三流导管154。

在这一点，将第二旋转阀152逆时针旋转60度，从而计量第二旋转阀152中的第二内部通道内部的限定体积的第二稀释血液，并经由第二旋转阀152中的第二内部通道72将第十四流导管156与第十五流导管158连在一起。第十二流室66预先填充有预先限定体积的稀释试剂150，而且第十三流室162包含磁搅拌条128。

在处理过程中，施加到第十二流室66的正气压将预先限定体积的稀释试剂150推动通过第十四流导管156、第二旋转阀152中的第二内部通道72、第十五流导管158并进入第十三流室162，将计量体积的第二稀释血液冲出第二旋转阀152的第二内部通道72并经由第十五流导管158进入第十三流室162。使用第十三流室162中的磁搅拌条128将计量体积的第二稀释血液与第二限定体积的稀释试剂相混合，以实现第三次1∶21.5稀释。

一旦混合，再将第二旋转阀152逆时针旋转30度，以经由第二旋转阀152中的第二内部通道72使第十五流导管158与第十六流导管160连通。施加到第十三流室162的正气压推动1∶9938的稀释血液样本以恒定的流速率通过第十五流导管158、第二旋转阀152中的第二内部通道72，通过第十六流导管160，然后通过第二微流细胞计数器166，使得能够对RBC和血小板进行计数。

第二旋转阀中的第二内部通道可具有1-10μl、或1-5μl、或3μl的容积。在一种实施方式中，第二旋转阀中的第二内部通道将计量3μl的全血，并随后计量3μl的第一稀释血液和3μl的第二稀释血液。第六流室、第九流室和第十二流室均可预加载有3*21.5＝64.5μl的稀释试剂。稀释试剂是与RBC和血小板兼容的。兼容意味着所考虑的试剂不会引起样品严重降解，也不会促进RBC或血小板凝结。稀释试剂可包括但不限于PBS、电泳缓冲剂(包括PBS、2mM EDTA、0.5％的BSA)等。

第一和第二微流细胞计数器可以是微通道阻抗传感器，其中具有至少两对电极，以用于随着血液细胞在第一电极对的两个电极之间通过，然后在第二电极对的两个电极之间通过，测量差分电流。阻抗传感器内的微流通道可具有40um x 40um见方的截面，第一和第二电极对中的每个电极也测量40um x 40um见方。可将包含将被计数的血液细胞的流体以恒定的流速率(例如以40μl/分钟的流速率)泵送通过微通道阻抗传感器。

所述实施方式还可包括在血红蛋白测量室168中进行血红蛋白测量。为了准确地测量血红蛋白，必须对RBC进行细胞溶解。从而，血红蛋白测量的最优选的位置是在已经根据WBC计数方案对RBC进行细胞溶解之后。还优选地通过添加化学血红蛋白试剂混合，将血红蛋白转换成稳定的氧化形式(高铁血红蛋白)。合适的试剂包括但不限于Drabkin试剂(其中包含碳酸氢钠、铁氰化钾和氰化钾，并将血红蛋白转换成氰化正铁血红蛋白)、氰亚铁酸盐等。这些血红蛋白试剂可在血红蛋白测量室168中被预先干燥。实际中，血红蛋白被转换成氰化正铁血红蛋白(例如通过使血液与Drabkin试剂发生反应)并进行分光光度测量(经过反应的Drabkin试剂和血红蛋白形成稳定、有色的成品)。简单的LED/光电二极管组合可被用于根据本领域所知的Beer定律使用吸光率对血红蛋白进行定量、比色的确定。

在细胞计数以及血红蛋白测量之后，经过处理的血液样本被收集到废物室170中。

针对WBC和RBC/血小板的两种不同的样本处理方案可同时执行，并且在分离的阻抗传感器上对所感兴趣的细胞进行计数。一种备选实施方式将并行地执行针对WBC和RBC/血小板的处理方案，并从而在单个阻抗芯片上连续地先是对例如WBC进行计数，然后再对RBC/血小板进行计数。在另一备选实施方式中，可连续执行两种不同的样本处理方案，例如在单个阻抗传感器上先对例如WBC进行计数，然后再对RBC/血小板进行计数。

图14示出了用于制备用于对WBC以及RBC和血小板进行计数的血液样本的微流箱的备选实施方式。在这一实施方式中，集成的流箱148包括第一流室44(其作为样本输入室)、第一流导管20、第一旋转阀10中的第一基本为“V”形的内部通道12(其中输入和输出端口分离60度)、连接到包含预先限定体积的细胞溶解试剂132的第二流室46的第二流导管22、连接到包含磁搅拌条128的第三流室48的第三流导管24、连接到包含磁搅拌条128以及预先限定体积的终结试剂134的第四流室50的第四流导管26。第五流导管28与第一集成微流细胞计数器164连通，第一集成微流细胞计数器164与血红蛋白测量室168连通，然后与废物室170连通。第六流导管30用来使第一旋转阀10与第二旋转阀152连通。第一流导管20、第二流导管22、第三流导管24、第四流导管26、第五流导管28和第六流导管30都以第一旋转阀10为中心，其中依次相邻的流导管在角度上分离60度。

第六流导管30与第二旋转阀152连通，第二旋转阀152包含第二基本为“V”形的内部通道72。第二内部通道72的输入和输出端口分离45度。第七流导管32与第五流室52连通，其中第五流室52作为气孔。第八流导管34与第六流室54连通，其中第六流室54包含预先限定体积的稀释试剂150。第九流导管36与第七流室56连通，其中第七流室56包含磁搅拌条128。第十流导管38与第八流室58连通，其中第八流室58作为气孔。第十一流导管40与第九流室60连通，其中第九流室60包含预先限定体积的稀释试剂150。第十二流导管42与第十流室62连通，其中第十流室62包含磁搅拌条128。第十三流导管154与第二微流细胞计数器166连通，第二微流细胞计数器166继而与废物室170连通。

第六流导管30、第七流导管32、第八流导管34、第九流导管36、第十流导管38、第十一流导管40、第十二流导管42以及第十三流导管154都以第二旋转阀152为中心，其中依次相邻的流导管在角度上分离45度。

在这一实施方式中，使用第二旋转阀在两个稀释步骤中执行1∶100的稀释，以为了对RBC和血小板进行计数而制备最终1∶10000稀释的全血样本。

示例4描述了血液计数处理的多种细节。更为一般地，本发明的一个方面是用于执行全血计数的微流箱。微流箱包括外壳，外壳包括多个流导管以及与多个流导管中的各个流导管分别进行流体连接的多个流室。所述多个流室包括至少一个血液样本输入室、多个血液试剂室和多个血液样本混合室。微流箱还包括至少一个血液细胞计数器，血液细胞计数器能够连接到多个流导管中的另一个，以用于对白血细胞、红血细胞和/或血小板进行计数。第一旋转阀具有用于以流连通的方式连接多个流导管中的流导管对的第一内部通道。第一旋转阀可被旋转到第一位置，以用于计量来自血液样本输入室的血液样本的第一部分，第一旋转阀可被旋转到第二位置，以用于将试剂从血液试剂室转移到血液样本的第一计量部分，第一旋转阀可被旋转到第三位置，以将血液样本的第一计量部分和血液试剂转移到血液样本混合室之一，以生成第一制备血液样本，以及第一旋转阀可被旋转到第四位置，以将第一制备血液样本转移到至少一个血液细胞计数器，以用于对白血细胞进行计数。此外，第二旋转阀具有同样用于以流连通的方式连接多个流导管中的流导管对的第二内部通道。第二旋转阀可被旋转到第五位置，以用于计量来自血液样本输入室的血液样本的第二部分，第二旋转阀可被旋转到第六位置，以用于将试剂从血液试剂室转移到血液样本的第二计量部分，第二旋转阀可被旋转到第七位置，以将血液样本的第二计量部分和血液试剂转移到血液样本混合室中的另一个，以生成第二制备血液样本，以及第二旋转阀可被旋转到第八位置，以将第二制备血液样本转移到所述至少一个血液细胞计数器，以用于对红血细胞和血小板进行计数。

示例5-双份(in duplicate)滴定

图15介绍了本发明如何能够被用来执行准确的双份滴定。在本例中，外壳18包括以旋转阀10为中心的八个流导管，其中依次相邻的流导管在角度上分离45度。旋转阀10包含第一基本为“V”形的内部通道12和第二基本为“V”形的内部通道72，它们并不彼此连通。第一内部通道12和第二内部通道72的输入和输出端口都在角度上分离45度。第三流室48和第七流室56均包含预先限定体积的分析物，所述分析物包含具有小量指示剂(优选地，指示剂响应于化学变化而改变颜色)的未知浓度的溶液A1。

通过第一流室44将未知浓度的滴定溶液T0引入到设备，以用于主测量，通过第五流室52将未知浓度的滴定溶液T0引入到设备，以用于副测量。对于主测量，滴定溶液T0被汲取到第一流导管20，通过旋转阀10中的第一内部通道12，并部分地进入第二流导管22(比如借助毛细管力)。类似的处理还针对副测量发生，其中滴定溶液T0被汲取通过第五流导管28，通过旋转阀10中的第二内部通道72，并部分地进入第六流导管30中(优选地借助毛细管力)。在第二流导管22和第六流导管30的至少一部分被填充滴定溶液T0后，沿顺时针方向将旋转阀10旋转90度。这同时对旋转阀10中的第一内部通道12中的主体积的滴定溶液T1和旋转阀10中的第二内部通道72中的第二体积的滴定溶液T1进行计量。使第三流导管24与第四流导管26经由旋转阀10中的第一内部通道12连通，同时使第七流导管32与第八流导管34经由旋转阀10中的第二内部通道72连通。

施加到第三流室48的正气压推动包含溶液A1的分析物，以将主计量滴定溶液T1冲出旋转阀10中的第一内部通道12，并进入到第四流室50中。然后，能够使用磁搅拌条128将两个液体样本A1+T1在第四流室50中混合。同时施加到第七流室56的正气压推动包含溶液A1的分析物，以将副计量滴定溶液T1冲出旋转阀10中的第二内部通道72，并进入到第八流导管34中，从而进入第八流室58。使用磁搅拌条128将两个液体样本A1+T1在第八流室58中混合。

在第一滴定之后，在第四流室50和第八流室58处进行光学测量，以确定指示剂是否已经变色。如果颜色还没改变，则必须执行进一步的滴定。当分析物溶液中的指示剂变色时，到达反应终点。

将旋转阀10沿逆时针方向旋转90度，以使旋转阀回到其最初起始位置，在此处第一内部通道12使第一流导管20和第二流导管22连通，同时第二内部通道72使第五流导管28与第六流导管30连通。如果需要的话，可使用正或负气压来推动滴定溶液T0进入旋转阀10中的第一内部通道12和第二内部通道72。然后沿顺时针方向将旋转阀旋转90度，从而在旋转阀10中的第一内部通道12和第二内部通道72中的每一个中同时计量第二体积的滴定溶液T2。使第三流导管24与第四流导管26经由旋转阀10中的第一内部通道12连通，同时使第七流导管32与第八流导管34经由旋转阀10中的第二内部通道72连通。

施加到第四流室50的正气压推动包含溶液A1+T1的分析物/滴定剂，以将第二主计量滴定溶液T2冲出旋转阀10中的第一内部通道12，并进入到第三流室48中。然后，能够使用磁搅拌条128将三个液体样本A1+T1+T2在第三流室48中混合。同时施加到第八流室58的正气压推动包含溶液A1+T1的分析物，以将第二副计量滴定溶液T2冲出旋转阀10中的第二内部通道72，并进入到第七流导管32中，从而进入第七流室56。使用磁搅拌条128将三个液体样本A1+T1+T2在第七流室56中混合。一旦经过适当地混合，可在第三流室48和第七流室56处进行新的一组光学测量。

可根据需要将所述处理重复多次，并在每次滴定后进行光学测量，直到指示剂已经变色，表示已经达到反应终点为止。

当达到反应终点时，可使用等式1确定分析物的浓度：

Ca＝Ct Vt M/Va 等式1

其中Ca是分析物的浓度(摩尔/升)，Ct是滴定剂的浓度(摩尔/升)，Vt是反应中使用的滴定剂的体积(升)，M是来自反应的平衡化学方程式的分析物和滴定剂的摩尔比，以及Va是在反应中使用的分析物的体积(升)。

对于基于酸的滴定，可使用多种不同的指示剂，其中包括但不限于：甲基紫、甲基橙、甲基红、石蕊、溴百里酚蓝和茜黄。

用来确定指示剂何时变色的光学测量可通过眼睛或使用相机来简单地进行。在更为复杂的设置中，可借助吸收来监测颜色改变。

对于本领域技术人员显然的是，按照期望，本发明可被配置为执行例如三份或四份滴定等。

示例6-胺键合成

图16介绍了本发明如何可被用于胺键合成。外壳18包含具有内部通道12的旋转阀10。七个流导管以旋转阀10为中心，其中依次相邻的流导管在角度上分离50度。第一流导管20与包含限定体积的羧酸溶液172的第一流室44连通。第二流导管22与包含限定体积的活化剂174(例如EDC.HCL)和磁搅拌条128的第二流室46连通。第三流导管24与包含限定体积的n-羟基丁二酰亚胺176和磁搅拌条128的第三流室48连通。第四流导管26与作为气孔的第四流室50连通。第五流导管28与包含限定体积的pH 8缓冲剂的第五流室52连通。第六流导管30与包含磁搅拌条的第六流室54连通。第七流导管32与包含限定体积的胺溶液180的第七流室56连通。

旋转阀10被放置为将第一流导管20经由第一旋转阀10中的内部通道12连接到第二流导管22。将正气压施加到第一流室44，以推动限定体积的羧酸溶液172通过第一流导管20，通过旋转阀10中的内部通道12，通过第二流导管22，并进入第二流室46，在此处使用磁搅拌条128将限定体积的羧酸溶液172与限定体积的活化剂174混合。这产生高化学活性的中间溶液。

将旋转阀10沿顺时针方向旋转50度，以使第二流导管22与第三流导管24经由旋转阀10中的内部通道12连通。将正气压施加到第二流室46，以推动高化学活性中间溶液通过第二流导管22，通过旋转阀10中的内部通道12，通过第三流导管24，并进入到第三流室48，在此处使用磁搅拌条128将高化学活性中间溶液与n-羟基丁二酰亚胺176混合。这产生NHS-活化羧酸。

将旋转阀10沿顺时针方向旋转50度，以使第三流导管24与第四流导管26经由旋转阀10中的内部通道12连通。将正气压施加到第三流室48，以将NHS-活化羧酸推出第三流室，通过第三流导管24，进入旋转阀10中的内部通道12，并至少部分地进入第四流导管26。

将旋转阀沿顺时针方向再旋转100度，以将旋转阀中的内部通道中的计量体积的NHS-活化羧酸与第三流导管和第四流导管隔离，并进一步使第五流导管28与第六流导管30经由旋转阀10中的内部通道12连通，其中旋转阀10中的内部通道12包含所述计量体积的NHS-活化羧酸。

将正气压施加到第五流室52，以将限定体积的pH 8缓冲剂推出第五流室，通过第五流导管28，通过旋转阀10中的内部通道12，通过第六流导管30，并进入第六流室54，在所述处理中，将计量体积的NHS-活化羧酸冲入第六流室中。使用磁搅拌条128将NHS-活化羧酸与限定体积的pH8缓冲剂在第六流室中混合，导致对NHS-活化羧酸的1∶10稀释。

将旋转阀沿顺时针方向旋转50度，使第六流导管30与第七流导管32经由旋转阀10中的内部通道12连通。将正气压施加到第七流室56，以将限定体积的胺溶液180推出第七流室，通过第七流导管32，通过旋转阀10中的内部通道12，通过第六流导管30，并进入到第六流室54，在此处使用磁搅拌条128将限定体积的胺溶液180与1∶10稀释的NHS-活化羧酸混合。发生化学反应，得到胺链接产品，其中NHS-活化羧酸的酸成分与胺溶液中的胺链接。

所公开的发明具有使外壳内的两个流导管经由旋转阀中的成角度的内部通道彼此连通的能力。旋转阀内的所述内部通道然后可被用来使得所述前两个流导管之一与第三流导管连通，然后，可选地，使第三流导管与第四流导管连通，以此类推。因此，除了计量之外，本发明还具有以下能力：在一系列的流操作中，经由旋转阀中的内部通道将一个流室的全部流内容移动到第二相邻流导管和/或室，然后移动到第三流导管和/或室，以及可选地移动到第四流导管和/或室，以此类推。

本发明从而准确地计量了包含在旋转阀内的通道中的小量流体，其中旋转阀位于外壳内。外壳包含以旋转阀为中心的多个流导管。相邻的流导管依次经由旋转阀内的内部通道彼此连通。流操作包括混合、细胞溶解、终结、标定、稀释、以及能够经由旋转阀中的内部通道和流导管对所计量的样本执行的其他操作。

所公开的发明从而经由旋转阀中的成角度的内部通道连接外壳中的两个流导管，然后经由旋转阀中的所述单个内部通道将所述前两个流导管之一连接到第三流导管。所公开的发明能够经由旋转阀中的成角度的内部通道将第一流导管和/或室与外壳中的第二流导管和/或室连接在一起。然后，对所述阀进行旋转经由旋转阀中的所述内部通道将第二流导管和/或室与第三流导管和/或室连通。可进一步旋转所述旋转阀，以使得第三流导管和/或室经由旋转阀中的所述内部通道与第四流导管和/或室连通，以此类推。

本发明的基本构思是一种用于计量流体样本并对所计量的样本执行流操作的流设备，所述流设备包括：

·具有数量“n”个集成微流导管和/或室的外壳，其中n至少是3；

·具有至少一个内部通道的旋转阀，其中入口端口和出口端口在角度上分离大于或等于10度且小于或等于72度；

·由此，旋转阀能够被放置成经由旋转阀中的至少一个内部通道将外壳中的两个依次相邻的流导管连接在一起；

·由此，在旋转所述旋转阀时，能够使外壳中接下来两个依次相邻的流导管经由旋转阀中的内部通道连通；

·其中n可以是5到36之间的数。

通过旋转所述旋转阀，能够使可依次连接的流导管和/或室经由旋转阀中的内部通道彼此连通。例如，旋转阀能被放置成经由旋转阀中的内部通道将第一流导管和/或室与外壳中的第二流导管和/或室连接在一起。然后能够旋转旋转阀，从而能够经由旋转阀中的内部通道将第二流导管和/或室与外壳中的第三流导管和/或室连通，并且针对外壳中的n个流导管以此类推。

能够连续地或并行地对包含在外壳中的分离的(优选为相邻的)流导管和/或室内的流体执行多个流操作。流操作可包括但不限于以下的任意组合：计量、重新计量、混合、标定、培养、细胞溶解、终结、稀释、滴定、分离、以及在可相邻地连接的流导管和/或室之间的转移流体。

根据上文的描述，本发明的一个方面是一种用于执行一系列流操作的集成微流设备，集成微流设备的实施方式包括：数量为n的多个微流导管的外壳，其中n至少为3，以及具有内部通道的旋转阀，其中所述内部通道具有在角度上分离的入口端口和出口端口。所述旋转阀能够位于第一位置，以经由内部通道连接所述n个流导管中的两个流导管，并且在将所述阀旋转到第二位置时，所述n个流导管中的包括不同于在第一位置处连接的流导管的至少一个流导管在内的两个流导管由内部通道连接。在第一位置或第二位置处，经由所述内部通道连接两个依次相邻的流导管。

在集成微流设备的示例性实施方式中，在第二位置处连接的所述n个流导管中的两个流导管包括在第一位置处连接到内部通道的流导管中的至少一个。

在集成微流设备的示例性实施方式中，n为从5至36个流导管。

在集成微流设备的示例性实施方式中，入口端口和出口端口之间的分离角度至少为10度，并且小于或等于72度。

在集成微流设备的示例性实施方式中，内部通道是“V”形、“U”形、“L”形或“三角”形中的至少一种，以使得入口端口和出口端口在角度上分离。

在集成微流设备的示例性实施方式中，所述设备还包括与流导管中的一个流导管流连通的第一流室，其中通过施加正或负的移位压力，能够将第一流室中包含的流体从第一流室通过所述流导管中的所述一个流导管转移，并经由入口端口进入内部通道。

在集成微流设备的示例性实施方式中，通过施加所述正或负移位压力能够将流体从内部通道经由出口端口转移到所述流导管中的另一流导管中，所述另一流导管不同于所述流导管中的所述一个流导管。

在集成微流设备的示例性实施方式中，所述设备还包括：与所述流导管中的所述另一流导管流连通的第二流室，其中流体能够从所述流导管中的所述另一流导管转移到第二流室中。

在集成微流设备的示例性实施方式中，第二流室包括用于执行以下中的至少一个操作的磁搅拌条：对第二流室中包含的流体进行混合或细胞溶解。

在集成微流设备的示例性实施方式中，第一流室包括用于执行以下中的至少一个操作的磁搅拌条：对第二流室中包含的流体进行混合或细胞溶解。

在集成微流设备的示例性实施方式中，第一流室包括第一可移动活塞，所述第一可移动活塞施加所述正或负移位压力，以将所述流体从第一流室转移。

在集成微流设备的示例性实施方式中，第二流室包括用来控制将流体转移到第二流室中的第二可移动活塞。

在集成微流设备的示例性实施方式中，第二流室包括孔，所述孔将通过第一和/或第二可移动活塞的移动而泵送到第二流室中的多余气体排出。

在集成微流设备的示例性实施方式中，根据以下条件中的至少一个来配置所述磁搅拌条：第二流室中的液体的高度与第二流室中的流体的宽度的高宽比在0.1到2.0之间；磁搅拌条的长度与第二流室的直径之比大于0.5；以及磁搅拌条能够以至少300rpm的速度旋转。

在集成微流设备的示例性实施方式中，流导管和/或流室中的至少一个包括至少一个传感器。

在集成微流设备的示例性实施方式中，所述至少一个传感器是阻抗传感器、pH传感器、温度传感器、流传感器、光学传感器、化学传感器、EWOD、AM-EWOD中的至少一个。

在集成微流设备的示例性实施方式中，所述传感器是多个光学传感器，所述多个光学传感器被配置为在至少两个流室中进行一系列光学测量并将光学测量与校准曲线进行比较，以确定旋转阀的内部通道中所计量的流体的体积。

在集成微流设备的示例性实施方式中，所述设备还包括具有内部通道的第二旋转阀，所述内部通道具有在角度上分离的入口端口和出口端口，其中所述旋转阀和第二旋转阀中的至少一个能够被旋转，以使得所述旋转阀和第二旋转阀经由流导管彼此流连通。

本发明的另一方面是一种用于执行完全血细胞计数的微流箱。所述微流箱包括：外壳，包括多个流导管；分别与所述多个流导管中的各个流导管流连通的多个流室，其中所述多个流室包括至少一个血液样本输入室、多个血液试剂室和多个血液样本混合室；能够连接到所述多个流导管中的至少一个的至少一个血液细胞计数器，所述至少一个血液细胞计数器能够对白血细胞、红血细胞或血小板中的至少一个进行计数；以及具有第一内部通道的第一旋转阀，其中所述第一内部通道用于以流连通的方式连接所述多个流导管中的流导管对。第一旋转阀能够旋转到第一位置，以用于计量来自血液样本输入室的血液样本的第一部分，第一旋转阀能够旋转到第二位置，以用于将试剂从血液试剂室转移到血液样本的所计量的第一部分，第一旋转阀能够旋转到第三位置，以将血液样本的所计量的第一部分和血液试剂转移到血液样本混合室之一，以生成第一制备血液样本，以及第一旋转阀能够旋转到第四位置，以将第一制备血液样本转移到所述至少一个血液细胞计数器，以用于对白血细胞进行计数。所述箱还包括：具有第二内部通道的第二旋转阀，其中所述第二内部通道用于以流连通的方式连接所述多个流导管中的流导管对。第二旋转阀能够旋转到第五位置，以用于计量来自血液样本输入室的血液样本的第二部分，第二旋转阀能够旋转到第六位置，以用于将试剂从血液试剂室转移到血液样本的所计量的第二部分，第二旋转阀能够旋转到第七位置，以将血液样本的所计量的第二部分和血液试剂转移到血液样本混合室中的另一个，以生成第二制备血液样本，以及第二旋转阀能够旋转到第八位置，以将第二制备血液样本转移到所述至少一个血液细胞计数器，以用于对红血细胞和血小板进行计数。

本发明的另一方面是一种在集成微流设备中执行一系列流操作的方法。所述方法包括以下步骤：提供包括数量为n的多个微流导管的外壳，其中n至少为3；提供具有内部通道的旋转阀，其中所述内部通道具有在角度上分离的入口端口和出口端口；使所述旋转阀位于第一位置，以经由内部通道连接所述n个流导管中的两个流导管；将来自所述n个流导管中的第一流导管的流体的至少一部分转移到所述n个流导管中经由内部通道连接到第一流导管的第二流导管中；将旋转阀旋转到第二位置，其中在第二位置处，所述n个流导管中的第三流导管经由内部通道连接到第二流导管；经由内部通道将流体的至少一部分在第二流导管和第三流导管之间转移；以及对所述流体执行至少一个流操作。

在执行一系列流操作的方法的示例性实施方式中，所述至少一个流操作包括以下中的至少一个：计量或重新计量流体；混合流体内的成分；标定、培养、细胞溶解、终结、稀释、滴定或分离流体内的成分；以及在与n个流导管中的一个或多个流连通的外部导管和/或室之间转移流体。

虽然已经根据一个或多个特定实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员在阅读和理解说明书和附图时，可在所附的权利要求的主旨和范围内进行等同的修改和改变。此外，虽然只是参照若干实施方式中的一个或多个描述了本发明的具体特征，但按照期望或出于对任何给定的或具体的应用有利的考虑，可将这些特征与不同实施方式中的一个或多个其它特征进行组合

工业实用性

微流设备可形成芯片实验室系统的一部分。这种设备可用于对化学、生物、生理和/或环境流体进行计量、混合、反应、细胞溶解、终结、结合、标定和/或感测。

微流设备还可形成用于细胞计数(例如完全血液计数与分析)的现场护理诊断测试系统的一部分。

Claims

1.一种用于执行一系列流操作的集成微流设备，包括：

外壳，包括数量为n的多个流导管，其中n至少为3；以及

具有单个内部通道的旋转阀，其中所述内部通道具有在角度上分离的入口端口和出口端口，其中所述内部通道与所述壳体中的n个流导管处于同一平面，并且所述入口端口和出口端口与所述n个流导管具有相同的限定的角度分离；

其中所述旋转阀能够位于第一位置，以经由内部通道连接所述n个流导管中的两个流导管，并且在将所述阀旋转到第二位置时，所述n个流导管中的包括不同于在第一位置处连接的流导管的至少一个流导管在内的两个流导管由内部通道连接；以及

其中，在第一位置或第二位置处，经由所述内部通道连接两个依次相邻的流导管。

2.根据权利要求1所述的集成微流设备，还包括：与流导管中的一个流导管流连通的第一流室，其中通过施加正或负的移位压力，能够将第一流室中包含的流体从第一流室通过所述流导管中的所述一个流导管转移，并经由入口端口进入内部通道。

3.根据权利要求2所述的集成微流设备，其中通过施加所述正或负移位压力，能够将流体从内部通道经由出口端口转移到所述流导管中的另一流导管中，所述另一流导管不同于所述流导管中的所述一个流导管。

4.根据权利要求3所述的集成微流设备，还包括与所述流导管中的所述另一流导管流连通的第二流室，其中流体能够从所述流导管中的所述另一流导管转移到第二流室中。

5.根据权利要求4所述的集成微流设备，其中第一或第二流室包括用于执行以下中的至少一个操作的磁搅拌条：对第一或第二流室中包含的流体进行混合或细胞溶解。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的集成微流设备，其中第一流室包括第一可移动活塞，所述第一可移动活塞施加所述正或负移位压力，以将所述流体从第一流室转移。

7.根据权利要求6所述的集成微流设备，其中第二流室包括用来控制将流体转移到第二流室中的第二可移动活塞。

8.根据权利要求2-5中任一项所述的集成微流设备，其中流导管和/或流室中的至少一个包括至少一个传感器。

9.根据权利要求1-5中任一项所述的集成微流设备，还包括：具有内部通道的第二旋转阀，所述内部通道具有在角度上分离的入口端口和出口端口，其中所述旋转阀和第二旋转阀中的至少一个能够被旋转，以使得所述旋转阀和第二旋转阀经由流导管彼此流连通。