CN104337769A - 一种白蛋白纳米球的改良制备工艺及内耳跨膜给药缓释微球载药体 - Google Patents

Abstract

内耳跨圆窗膜给药缓释微球载药体的制备方法，涉及一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物的内耳转运。可提供上述药物的包载和转运，避开血脑屏障和血迷路屏障，直接通过鼓膜穿刺技术跨圆窗膜进入内耳而发挥作用。这大大提高内耳局部的有效药物浓度，同时大大降低传统全身给药方式带来的毒副作用。其提供一种利用血清白蛋白制备的内耳局部给药的缓释微球载体制剂及方法。取血清白蛋白溶于含有氯化钠的水溶液或双蒸去离子水中，在磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，放入高温下水浴热变性固化后离心干燥得到微球载药体。以罗丹明B为模型药物与微球共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释微球载制剂。

Description

一种白蛋白纳米球的改良制备工艺及内耳跨膜给药缓释微球载药体

技术领域

本发明涉及一种经圆窗膜跨膜治疗内耳病的缓释载药微球制剂及其制备工艺，并指出可以携带一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物。 

背景技术

内耳病(包括耳蜗与前庭系统)的临床发病率约占耳科疾病的近1/3，如突发性耳聋、自身免疫性内耳病及梅尼埃病等，可导致不同程度的感音神经性耳聋和平衡机能障碍，严重影响患者的工作能力与生活质量。 

长期以来临床上常采用全身给药治疗内耳病，其中糖皮质激素为有效的治疗药物之一。因高血压、糖尿病等系统性疾病则为全身激素治疗的禁忌，使得此类药物的应用受到限制。同时由于血一迷路屏障的存在，阻抑了药物在内耳的分布与扩散，导致治疗效果并不理想。内耳局部给药的研究一直受到耳科医师的关注。由于内耳与中耳之间存在一种膜性间隔即圆窗膜，其具有生物半透膜的性质，能允许多种药物通过，这使得药物可以不经过体循环而直接进入内耳即避免了血迷路屏障。目前常用的方法是通过鼓膜向鼓室内注射药物溶液的策略最具微创性。但该方法的局限性在于不能调控到达圆窗膜的药物浓度及难以有效控制药物与圆窗膜的接触时间，而后者是决定耳蜗内药物浓度的重要因素。结合近年来药物缓释剂型的发展，向鼓室内注射药物的缓释剂型体现了缓释技术与微创技术的结合，可能成为内耳疾病最优化的治疗方式，成为近年研究热点领域，鼓室跨膜给药缓释剂的研究尤为重要。迄今鼓室内药物治疗尚无标准方案，临床应用亟待规范。因此，研制新型跨圆窗膜缓释制剂在耳内科学中具有十分重要的应用前景。在生物制药和组织工程迅猛发展的今天，控释系统 作为新型的药物载体具有缓释、靶向、生物利用度高等特点，是一种非常有前途的控释系统。血清白蛋白是一种天然的血清中的一种球蛋白，由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。其可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合，主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。但迄今为止临床上还没有一种真正的内耳局部跨膜给药的缓释制剂在应用，而应用血清白蛋白制备载药微球作为新型跨圆窗膜的药物载体在国内外未见报道，故本发明有着广泛的应用前景。 

理想的耳用跨圆窗膜缓释制剂应具备以下特点：①药物迅速在内耳达到理想有效浓度，并维持此浓度适当时间；②在机体其它部位无药物分布或药物浓度仅在最低范围；③一旦治疗目的达到，药物立即从内耳消除；④选择的缓释辅料对机体无毒副作用；⑤可注射性；⑥可实现商品化生产，使用简便，易于推广。 

白蛋白纳米粒是一种相当有前途的药物载体，必须优化制备工艺，才能得到满意的粒径、粒度分布、表面性质，使白蛋白纳米粒达到理想的靶部位。本发明的制备工艺流程克服了以往的不足，即不再应用戊二醛做交联剂，也不再进行旋转蒸发法将乙醇挥发出去，而是改用热变性的固化方法后利用离心和干燥技术制备出空白白蛋白缓释载药微球。这样有利于减少微球的细胞毒性使产物更安全，同时还保留了白蛋白表面大量的有用基团，增强其对细胞的营养作用和对细胞增殖的促进作用。另外，本发明将其引入到跨圆窗膜内耳给药领域，不仅能很好发挥白蛋白自身的营养作用，同时由于起表面结构的特殊性使其更易于吸附携带其他药物而发挥缓释转运作用。因此本发明最大的特点在于制备的白蛋白纳米粒结构完整，制备方法简单、可重复性良好，不引入毒性敷料、有很好的载药、缓释功能，适合药厂规模商品化生产。 

发明内容

基于目前国内外尚无对内耳病(如突发性耳聋、梅尼埃病、噪声性耳聋)局部用药的缓释制剂在临床上应用。本发明的目的旨在针对现有技术的缺点，提供一种可在鼓室腔内注射给药、并能跨圆窗膜实现内耳药物转运的缓释载药微球的制备技术和工艺。这样既减少了给药量，增加了内耳局部的药物浓度，同时也大大降低了传统给药方式给患者带来的全身毒副作用。 

本发明所述的内耳跨圆窗膜给药缓释微球载药体制备方法如下： 

1)取血清白蛋白溶于氯化钠水溶液或双蒸去离子水中，得到含有血清白蛋白的水溶液； 

2)在磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，形成乳白色血清白蛋白混悬液； 

3)放入水浴锅中在高温下进行热变性固化处理，离心、干燥后形成稳定的血清白蛋白空白微球； 

4)以罗丹明B为模型药物与微球共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释微球载制剂。 

可以包载一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物。制备过程中血清白蛋白配制的浓度是5～15mg/ml，所述的氯化钠的浓度为5mmol～20mmol。按体积比氯化钠溶液与无水乙醇的加入比例为1∶3～1∶8。无水乙醇的加入速度控制在1.0～3.0ml/min。热变性温度控制在70～100℃，固化时间控制在10min～2h。离心后处理为真空干燥。加入的模型药物为物理混合吸附方式形成复合缓释制剂。 

总之，本发明采用改良去溶剂方法制备缓释载药微球，制备过程中血清白蛋白配制的浓度是5～15mg/ml，氯化钠水溶液的浓度控制在5mmol～20mmol之间， 氯化钠水溶液与无水乙醇溶液的体积比为1∶3～1∶8。无水乙醇的加入速度控制在1.0～3.0ml/min。本发明确定了改良制备白蛋白纳米粒的优化工艺，制备的白蛋白纳米粒结构完整，粒径大小均一，理化性质稳定，重复性好，具有良好的控释能力，载药率最高可达到15％，包封率可达到40％，制备方法简单、无毒性敷料、可以很好的包载药、体外释放具有良好的缓释功能，且工艺成本低，无毒高效，可望实现更大的经济效益。 

图1BSA纳米球热变性的扫描电镜(a)和粒径分布(b)，其中(a)插图为透射电镜的结果。 

图2载有RB的BSA纳米球的扫描电镜(a)和激光共聚焦显微镜下观察(b)，BSA纳米球的载药和包封率随投药量增加的变化曲线(c)，在PBS体系下进行的药物释放(d)。(a)中插图是其透射电镜的结果。 

图3以L929细胞分别评价热变性固定后BSA纳米球的细胞毒性，用三组数据的平均值计算得出，P＜0.001. 

图4光镜下L929摄取CCK-8的细胞形态，加入CCK-8前对照组(a)，加入CCK-8后4小时对照组(b)，热变性(c)。 

图5载有RB热变性的BSA纳米球注射到豚鼠听泡内的不同时间段的活体成像，即刻成像(a)，三日后成像(b)。 

图6载有RB的BSA纳米球经圆窗膜扩散至内耳骨螺旋板的影象，圆窗膜的荧光显微镜下手术后即刻观察结果(a)，手术三日后内耳骨螺旋板的扫描观察结果(b)。插图是BSA纳米球聚集的放大图示。 

图7经过改良处理后的BSA纳米球的扫描电镜观察，可见纳米球大小均一，分散良好。 

图8豚鼠圆窗膜扫描电镜影象(箭头所指处为纳米球在圆窗膜内跨越通过状态)。 

具体实施方式

实施例1 

取血清白蛋白50mg溶于10mmol氯化钠水溶液或双蒸去离子水中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，氯化钠水溶液与无水乙醇溶液的体积比为1∶3～1∶8，无水乙醇的加入速度控制在1.0～3.0ml/min，形成乳白色血清白蛋白混悬液；放入水浴锅中在70℃下30min进行热变性固化处理，离心、干燥后形成稳定的血清白蛋白空白微球(见图1a)。微球的粒径分布(见图1b)。以罗丹明B为模型药物与微球共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释微球载制剂(见图2a)。微球理化性质稳定，重复性好，具有可注射性，可降解性。适合在局部跨膜注射给药。微球的载药率为2％～15％，包封率为10％～40％(见图2c)。 

实施例2 

取50mg血清白蛋白空白微球溶于5mlPBS缓冲液中充分混合，加入10mg罗丹明B孵育10min，放入专用的体外药物释放的小室内，按照每隔1h、4h、8h、12h、24h等顺序依次取出扩散池中的液体，在紫外分光光度计560nm波长测吸收值，根据标准曲线计算出药物释放的计量，算累计药物释放量，换算成百分比例，即累积释放药物的百分比，微球的体外释放曲线表示一周内药物的累计释放量为12％。(见图2d)。 

实施例3 

取血清白蛋白50mg溶于10mmol氯化钠水溶液或双蒸去离子水中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，氯化钠水溶液与无水乙醇溶液的体积比为1∶3～1∶8，无水乙醇的加入速度控制在1.0～3.0ml/min，形成乳白色血清白蛋白混悬液；放入水浴锅中在70℃下30min进行热变性固化 处理，离心、干燥后形成稳定的血清白蛋白空白微球。然后进行细胞毒性实验(MTT法)，提示通过热变性血清白蛋白的固化，对照组和实验组的细胞生长形态大致相同，甚至可以发现热变性实验组细胞生长状态要优于对照空白组和戊二醛交联组(见图3、4)。 

Claims (9)

1.内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于其步骤如下：

1)取血清白蛋白溶于氯化钠水溶液或双蒸去离子水中，得到含有血清白蛋白的水溶液；

2)在磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，形成乳白色血清白蛋白混悬液；

3)放入水浴锅中在高温下进行热变性固化处理，离心、干燥后形成稳定的血清白蛋白空白微球；

4)以罗丹明B为模型药物与微球共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释微球载制剂。

2.如权利要求1所述的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征为可以包载一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、治疗眩晕类、颅内抗肿瘤类等药物。

3.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于所述的制备过程中血清白蛋白配制的浓度是10～15mg/ml。

4.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于所述的氯化钠的浓度为5mmol～20mmol。

5.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于按体积比氯化钠溶液与无水乙醇的加入比例为1∶3～1∶8。

6.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于无水乙醇的加入的速度控制在2.0～3.0ml/min。

7.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于热变性温度控制在70～100℃，固化时间控制在10min～2h。

8.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于离心后处理为真空干燥。

9.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于加入的模型药物为物理混合吸附方式形成复合缓释制剂。