CN104311426A - 芳香硝基乙烯化合物的新用途 - Google Patents
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Abstract
芳香硝基乙烯化合物的新用途，涉及硝基乙烯化合物。所述芳香硝基乙烯化合物可在制备预防和/或治疗与类视黄醇X受体RXR相关的人类疾病药物中应用，所述人类疾病包括但不限于肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、脂肪性肝炎。所述芳香硝基乙烯化合物可作为类视黄醇X受体RXR的调节剂在制备预防和/或治疗RXR介导的疾病的药物中应用。所述芳香硝基乙烯化合物可作为类视黄醇X受体RXR的配体和调节剂在制备结合或者调节类视黄醇X受体活性剂中的应用。酪氨酸的突变体和色氨酸的突变体具有不需配体的转录自激活作用，酪氨酸的突变体和色氨酸的突变体可以用来研究芳香硝基乙烯化合物在预防和治疗与RXRα相关疾病中的活性和作用。
Description
技术领域
本发明涉及硝基乙烯化合物，尤其是涉及芳香硝基乙烯化合物的新用途。
背景技术
类视黄醇X受体(retinoid X receptor，RXR)，是细胞核受体超家族中的重要成员，属非类固醇类受体。RXR具有三个亚型，分别是RXRα，RXRβ和RXRγ。RXR是配体调控的转录调节因子，参与了人体代谢、生长、发育、分化、死亡、免疫等几乎所有的生理调控。RXR表达或功能异常与人体的许多疾病相关，比如肿瘤、代谢综合症、银屑病等。RXR的功能受到其选择性配体的调控，没有结合配体时，它结合到其靶基因的应答元件上，募集受体辅抑制因子，阻止转录的启动。激活型配体的结合可以诱导其构象发生变化，使其释放受体辅抑制因子并募集受体辅激活因子，从而激活下游基因转录。RXR还具有不依赖于转录调控的生理活性，即RXR通过与其他蛋白相互作用，进行快速调控细胞和机体的生理和病理活性。另外，肿瘤细胞和组织中含有一个缺失蛋白氨基端的RXRα突变体tRXRα。tRXRα可以通过调控TNFα激活的PI3K和NFκB信号活性进而促进肿瘤的生长。
RXR的活性受到其小分子配体的严密调控。RXR蛋白的空间结构含有一个负责结合小分子配体的结合口袋。配体通过与口袋的结合，能够诱导RXR蛋白的分子构象变化，进而调控RXR的生理和病理活性。如果小分子配体通过结合并调节RXR的活性从而产生对疾病的预防和治疗作用，则这些小分子配体就成为靶向RXR的靶点药物。塔革雷汀(Targretin，又名蓓萨罗汀Bexarotene(Duvic,M.；Martin,A.G.；Kim,Y.；Olsen,E.；Wood,G.S.；Crowley,C.A.；Yocum,R.C.；Worldwide Bexarotene Study,G.,Phase 2and 3clinical trial of oral bexarotene(targretin capsules)for the treatment of refractory or persistent early-stage cutaneous T-celllymphoma.Archives of Dermatology 2001,137(5),581-593)是世界上第一个针对RXR开发出来的药物，已被FDA批准应用于皮肤癌治疗，并在临床上广泛使用。近年，Targretin在临床上被证明对肺癌(III期临床)和乳腺癌(II期临床)也有很好的治疗效果。
随着对RXR功能和分子机制的进一步理解，特别是其非转录活性，将为我们提供更多以RXR为靶点的药物开发新策略。同时一些新型的RXR配体的发现，将开发出新的以RXR为靶点的先导药物。
发明内容
本发明的第一目的在于提供芳香硝基乙烯化合物。
本发明的第二目的在于提供芳香硝基乙烯化合物在制备预防和/或治疗与类视黄醇X受体RXR相关的人类疾病药物中的应用。
本发明的第三目的在于提供芳香硝基乙烯化合物作为类视黄醇X受体RXR的调节剂在制备预防和/或治疗RXR介导的疾病的药物中的应用。
本发明的第四目的在于提供芳香硝基乙烯化合物与肿瘤坏死因子联合使用在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的第五目的在于提供芳香硝基乙烯化合物作为类视黄醇X受体RXR的配体和调节剂在制备结合或者调节RXR的活性剂中的应用。
本发明的第六目的在于提供用于鉴别RXR的配体9顺视黄酸(9-cis-RA)和芳香硝基乙烯化合物的两个RXRα的突变体，以及这两个突变体在芳香硝基乙烯化合物的活性研究和药物开发以及靶向RXR的药物开发中的应用。
本发明的第七目的在于提供了模拟芳香硝基乙烯化合物与RXRα结合的两个RXRα突变体，以及这两个突变体在芳香硝基乙烯化合物的活性研究和药物开发以及靶向RXR的药物开发中的应用。
本发明的第八目的在于提供了用芳香硝基乙烯化合物来调节RXR多聚体形成的方法，以及此方法在芳香硝基乙烯化合物的活性研究和药物开发以及靶向RXR的药物开发中的应用。
所述芳香硝基乙烯化合物的化学通式如下：
其中：R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R17，R18，R19，R20，R21，R22，R23，R24，R25,R26,R27,R28为H；或卤素，硝基，氨基，羧基，羟基等中的一种；或具有1～40个碳原子的烷烃基等中的一种；或独立选自具有5～50个碳原子的芳香基团；或独立选自具有5～50个碳原子的含氮杂环。X为氮原子，硫原子以及氧原子；Y为碳原子或者氮原子等。
所述芳香硝基乙烯化合物，可采用以下方法制备：
将芳香醛(以苯甲醛为例)(3mmol，360mg)，CH3NO2(56mmol，3mL)加入到圆底烧瓶内，室温条件下，向上述反应体系加入HOAc(3mL)，NH4OAc(0.3mmol,23.1mg)，70℃加热回流12h，冷却至室温。反应混合物用乙酸乙酯萃取(6mL×3)，合并有机相，减压蒸馏后，硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体为芳香硝基乙烯化合物。
所述芳香硝基乙烯化合物可在制备预防和/或治疗与类视黄醇X受体RXR相关的人类疾病药物中应用，所述人类疾病包括但不限于肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、脂肪性肝炎等。
所述芳香硝基乙烯化合物可作为类视黄醇X受体RXR的调节剂在制备预防和/或治疗RXR介导的疾病的药物中应用。
所述芳香硝基乙烯化合物可作为类视黄醇X受体RXR的配体和调节剂在制备结合或者调节类视黄醇X受体活性剂中的应用。
本发明提供了芳香硝基乙烯化合物能够以独特的方式结合类视黄醇X受体RXR。芳香硝基乙烯化合物的硝基和RXRα的半胱氨酸对它们之间的结合和相互作用是必须的。
所述用于鉴别RXR的配体9顺视黄酸(9-cis-RA)和芳香硝基乙烯化合物的两种突变体为：1)RXRα的432位氨基酸由半胱氨酸突变为丝氨酸的突变体和2)RXRα的316位由精氨酸突变为谷氨酸形成的突变体；所述RXRα的432位氨基酸由半胱氨酸突变为丝氨酸的突变体不能被芳香硝基乙烯化合物结合并激活，但是可被9-cis-RA激活；所述RXRα的316位由精氨酸突变为谷氨酸形成的突变体不能被9-cis-RA激活，但是可被芳香硝基乙烯化合物结合和激活。这两个突变体可以用来鉴定芳香硝基乙烯类的RXR配体，以及靶向RXR的芳香硝基乙烯化合物的药用活性鉴定和分析。
用于模拟芳香硝基乙烯化合物Z-1和Z-10系列化合物与RXRα结合的两个突变体为：1)RXRα的432位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸的突变体和2)RXRα的432位由半胱氨酸突变为色氨酸的突变体；酪氨酸和色氨酸的侧链结构分别同Z-1和Z-10的结构类似，因此这两个突变体能够模拟Z-1和Z-10与RXRα结合。
所述酪氨酸的突变体和色氨酸的突变体具有不需配体的转录自激活作用，酪氨酸的突变体和色氨酸的突变体可以用来研究芳香硝基乙烯化合物在预防和治疗与RXRα相关疾病中的活性和作用。
以下给出一种调节RXRα蛋白多聚化的方法：
芳香硝基乙烯化合物Z-10和Z-12系列化合物与RXRα蛋白在体外和体内孵育，可以诱导RXRα蛋白形成二聚体或三聚体。芳香硝基乙烯化合物Z-11系列化合物与RXRα蛋白在体外和体内孵育，可以诱导RXRα蛋白形成多聚体。这种方法可以用于鉴定芳香硝基乙烯化合物对RXRα的活性调节以及靶向RXRα药物的活性分析和鉴定。
以下给出一种联合用药诱导肿瘤细胞凋亡的方法：
芳香硝基乙烯化合物与肿瘤坏死因子TNFα联合使用，能够有效地在细胞和小鼠体内诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长，由此可见，芳香硝基乙烯化合物与TNFα联合用药，可在制备治疗肿瘤药物中应用。
本发明提供了一系列的芳香硝基乙烯化合物，作为核受体RXR的活性调节剂。由于RXR与多种人类的生理活动和疾病相关，因此本发明提供的芳香硝基乙烯化合物可以作为调节剂用于制备预防和治疗与核受体RXR相关的人类疾病(如：肿瘤，糖尿病，神经退行性疾病，脂肪性肝炎等)的药物。
附图说明
图1为芳香硝基乙烯化合物Z系列化合物Z-1((E)-1-methyl-4-(2-nitrovinyl)benzene),Z-10((E)-1-(2-nitrovinyl)naphthalene),Z-11((E)-2-(2-nitrovinyl)naphthalene)和Z-12((E)-9-(2-nitrovinyl)anthracene)的化学结构式。
图2为芳香硝基乙烯化合物Z-1选择性激活RXRα的转录活性。HEK293T细胞转染图中所示的pBIND-质粒和pG5-luc质粒，并用9-cis-RA(0.1μM),propyl pyrazole triol(PPT,10μM)and Z-1(10μM)刺激细胞12h。收集细胞裂解液并检测firefly和renilla的荧光值，以它们的相对值作图。结果显示Z-1选择性激活RXRα的转录活性，而不激活RARα和ERα的转录活性。
图3为芳香硝基乙烯化合物Z-1的衍生物Z-2至Z-12的化学结构式。
图4为芳香硝基乙烯化合物Z-10和Z-12是优化的选择性激活RXRα转录活性的Z-1衍生物。用与图2同样的方法检测Z-1的衍生物，发现Z-10和Z-12具有优于Z-1的激活RXRα转录活性的能力，而且Z-10和Z-12不激活RARα和RARγ的转录活性。
图5为芳香硝基乙烯化合物Z-10和Z-12选择性的激活RXRα的转录活性。HEK293T细胞转染图中所示的pBIND-质粒和pG5-luc质粒，并分别用9-cis-RA(0.1μM)、ATRA(0.1μM)、PPT(10μM)、Dexametthasone(Dex,1μM)、T0901317(T09,1μM)、Rosiglitazone(Ros,1μM)、Z-10(5μM)和Z-12(5μM)刺激12h,收集细胞裂解液并检测firefly和renilla的荧光值。实验结果显示Z-10和Z-12只显著激活RXRα的转录活性，而不激活其他核受体如RARα,RARγ,ERα,GR,LXRα和PPARγ的转录活性。
图6为芳香硝基乙烯化合物Z-10，Z-11，Z-12以及它们的羧基衍生物Z-10-1，Z-11-1，Z-12-1的化学结构式。
图7为等温滴定量热实验证明芳香硝基乙烯化合物Z-10同RXRα蛋白结合。将RXRα-LBD蛋白和Z-10用缓冲液(20mM Tris-HCL pH7.5,200mM NaCL)稀释，蛋白质浓度为50μM,Z-10的浓度为1mM。在下槽中加入200μl的蛋白溶液，上样针中吸取40μl Z-10样品。设置程序进行滴定，第一滴滴定时间为5s，间隔120s。收集数据并通过Origin软件进行分析和作图。
图8为表面等离子共振实验揭示芳香硝基乙烯化合物Z-10和Z-12同RXRα蛋白结合。将RXRα-LBD蛋白通过氨基偶联到CM5芯片上，不同浓度的Z-10和Z-12流经CM5芯片，并由仪器记录对应的响应单元值，收集数据并作图。
图9为配体竞争实验揭示芳香硝基乙烯化合物Z-10，Z-11和Z-12竞争9-cis-RA与RXRα蛋白结合，而羧基取代亚硝基的衍生物不能竞争9-cis-RA与RXRα蛋白结合。RXRα-LBD蛋白与[3H]9-cis-RA和图示的化合物共同孵育，然后通过液闪计数器检测蛋白结合的[3H]9-cis-RA。此结果显示Z-10、Z-11和Z-12能够竞争9-cis-RA与RXRα-LBD蛋白结合，但是它们的羧基取代亚硝基的衍生物Z-10-1、Z-11-1和Z-12-1不能竞争9-cis-RA与RXRα-LBD蛋白结合。说明Z-10，Z-11和Z-12同RXRα结合，而其羧基取代的衍生物不能同RXRα结合。
图10为亚硝基对芳香硝基乙烯化合物Z-10和Z-12激活RXRα的转录活性是必须的。HEK293T细胞转染图中所示的pBIND-质粒和pG5-luc质粒，并用9-cis-RA(0.1μM),Z化合物(5μM)和Z化合物的羧基衍生物(5μM)刺激细胞12h。收集细胞裂解液并检测firefly和renilla的荧光值。图中显示Z-10和Z-12的羧基衍生物Z-10-1和Z-12-1不能够激活RXRα的转录活性。
图11为其他官能团取代亚硝基所形成的Z-10衍生物的化学结构式。
图12为亚硝基对Z-10激活RXRα的转录活性是必须的。HEK293T细胞转染图中所示的pBIND-质粒和pG5-luc质粒，并用9-cis-RA(0.1μM),Z-10(5μM)和Z-10的衍生物(5μM)刺激细胞12h。收集细胞裂解液并检测firefly和renilla的荧光值。图中显示其他基团取代亚硝基的Z-10衍生物Z-10-1、Z-10-2、Z-10-3、Z-10-4和Z-10-5不能够激活RXRα的转录活性。
图13为亚硝基对Z-10竞争9-cis-RA与RXRα蛋白结合是必须的。RXRα-LBD蛋白与[3H]9-cis-RA和图示的化合物共同孵育，然后通过液闪计数器检测蛋白结合的[3H]9-cis-RA。此结果显示其他基团取代亚硝基的Z-10衍生物Z-10-2、Z-10-3、Z-10-4和Z-10-5不能竞争9-cis-RA与RXRα-LBD蛋白结合。说明其他基团取代亚硝基的Z-10衍生物Z-10-2、Z-10-3、Z-10-4和Z-10-5不能同RXRα结合。
图14为RXRα上316位的精氨酸(R)对Z-10和Z-12激活RXRα的转录活性是非必须的。HEK293T细胞转染图中所示的pBIND-质粒和pG5-luc，并用9-cis-RA(0.1μM),Z-10(5μM)和Z-12(5μM)刺激细胞12h。收集细胞裂解液并检测firefly和renilla的荧光值，以它们的相对值作图。实验结果显示精氨酸突变为谷氨酸的RXRα突变体(R316E)只能被Z-10和Z-12激活，而不能被9-cis-RA激活。揭示了此突变体能够鉴别9-cis-RA和Z系列化合物。
图15为RXRα上432位的半胱氨酸(C)对Z-10和Z-12激活RXRα的转录活性是必须的，并且示出两个自激活的RXRα突变体。HEK293T细胞转染图中所示的pBIND-质粒和pG5-luc，并用9-cis-RA(0.1μM),Z-10(5μM)和Z-12(5μM)刺激细胞12h。收集细胞裂解液并检测firefly和renilla的荧光值，以它们的相对值作图。实验结果显示半胱氨酸突变为丝氨酸的RXRα突变体(C432S)不能被Z-10和Z-12激活，而能被9-cis-RA激活。揭示了此突变体能够鉴别9-cis-RA和Z系列化合物。432位半胱氨酸突变为谷氨酰胺(C432Q)、酪氨酸(C432Y)和色氨酸(C432W)的突变体既不能被9-cis-RA激活，也不能被Z-10和Z-12激活。同时显示半胱氨酸突变为酪氨酸或色氨酸的两个突变体(C432Y和C432W)具有转录自激活活性。
图16为Z-1，Z-10，酪氨酸和色氨酸的化学结构式。图中显示在分子结构上，Z-1和酪氨酸具有一定的相似性，而Z-10和色氨酸具有一定的相似性(图中灰色部分)。
图17为Z-10结合RXRα(R316E)突变体，但是不结合RXRα(C432Q)，RXRα(C432S)和RXRα(C432W)突变体。这与Z-10激活RXRα(R316E)突变体，不激活RXRα(C432Q)，RXRα(C432S)和RXRα(C432W)突变体的转录活性相一致。
图18为Z-10和Z-12抑制9-cis-RA激活的RXRα同源二聚体的转录活性。HEK293T细胞共转染pGL6-TA-RXRE-Luciferase、Renilla-Luciferase以及pCMV-myc-RXRα质粒24h。细胞用9-cis-RA(0.1μM)，Z-10(5μM)和Z-12(5μM)处理12h，收集细胞裂解液并检测firefly和renilla的荧光值，以它们的相对值作图。
图19为Z-10，Z-11和Z-12诱导RXRα-LBD蛋白多聚体的变化。RXRα-LBD蛋白(0.2μg/μl)分别与DMSO,9-cis-RA(0.5μM)或图示的Z衍生物(10μM)孵育3h,蛋白经8％非变性胶电泳分离，并用考马斯亮蓝进行染色。实验结果显示Z-10和Z-12能够诱导RXRα-LBD蛋白二聚体或三聚体的形成，而Z-11能够诱导多聚体的形成。
图20为Z-10和Z-12诱导RXRα-LBD蛋白不同的构象。RXRα-LBD蛋白分别与DMSO,9-cis-RA(0.5μM)或图示的Z化合物(10μM)孵育3h,用糜蛋白酶(50μg/ml)或胰蛋白酶(20μg/ml)在4℃消化9h，蛋白经8％非变性胶电泳分离，并用考马斯亮蓝进行染色。实验显示，在Z-10和Z-12存在的条件下，胰蛋白酶和糜蛋白酶切割RXRα-LBD蛋白形成的切割片段图谱与9-cis-RA和DMSO存在时的切割图谱不同，揭示Z-10和Z-12诱导特异性的RXRα-LBD蛋白构象的变化。
图21为Z-10和Z-12抑制NFκB靶基因c-myc、cycling D1和P62的表达。TNFα(10ng/ml)和10μM Z-10或Z-12刺激MCF-7细胞12h，并用免疫印迹检测相应蛋白的表达。说明Z-10和Z-12抑制TNFα/NFκB的信号活性。
图22为Z-10和Z-12抑制TNFα诱导的NFκB核转移。用Z-10(10μM)或Z-12(10μM)预处理MCF-7细胞1h，然后用TNFα(10ng/ml)刺激细胞30min。细胞经免疫染色检测p65蛋白的定位。P65的核转移表明TNFα/NFκB信号的激活。因此实验结果说明Z-10和Z-12抑制TNFα/NFκB信号活性。
图23为Z-10和Z-12抑制TNFα诱导的NFκB核转移。用Z-10(10μM)或Z-12(10μM)预处理MCF-7细胞1h，然后用TNFα(10ng/ml)刺激细胞30min。细胞经核质分离和免疫印迹检测p65的核转移。P65的核转移表明TNFα/NFκB信号的激活。实验结果说明Z-10和Z-12抑制TNFα/NFκB信号活性。
图24为Z-10和Z-12抑制TNFα诱导的IKK磷酸化和IκBα降解。MCF-7细胞预处理1hZ-10(10μM)或Z-12(10μM)，然后用TNFα(10ng/ml)刺激细胞不同的时间，并通过免疫印迹检测相应蛋白的表达。IKK磷酸化和IκBα降解表明TNFα/NFκB信号的激活。实验结果说明Z-10和Z-12抑制TNFα/NFκB信号活性。
图25为RXRα/tRXRα的表达量与Z衍生物抑制TNFα/NFκB信号呈正相关。MCF-7细胞转染对照小干扰RNA或RXRα的小干扰RNA，然后用Z-10(7.5μM)和Z-12(5μM)预处理细胞1h，用TNFα(10ng/ml)刺激30min，并通过免疫印迹检测相应蛋白的表达。当RXRα/tRXRα的表达量通过干扰RNA降低后，Z-10和Z-12抑制TNFα诱导的IκBα降解的作用也降低。说明Z-10和Z-12可能以RXRα/tRXRα依赖的方式抑制TNFα/NFκB信号活性。
图26为Z-10抑制TNFα信号的效应与RXRα/tRXRα的表达呈正相关。MCF-7和H460细胞经Z-10(7.5μM)预处理1h，然后经TNFα刺激30min，并通过免疫印迹检测蛋白的表达。实验结果说明Z-10和Z-12可能以RXRα/tRXRα依赖的方式抑制TNFα/NFκB信号活性。
图27为一些已知的RXRα的配体能够抑制Z-10和Z-12对TNFα/NFκB信号的作用。Z-10(7.5μM)或Z-12(5μM)与9-cis-RA(0.1μM),CD3254(0.1μM)或UVI3003(1μM)预处理MCF-7细胞1h，再用TNFα(10ng/ml)处理30min，并通过免疫印迹检测相应蛋白的表达。实验结果显示这些已知的RXRα配体能够抑制Z-10和Z-12对TNFα诱导的IκBα降解的抑制作用，说明Z-10和Z-12可能以RXRα/tRXRα依赖的方式抑制TNFα诱导的NFκB激活。
图28为Z-10和Z-12的羧基衍生物Z-10-1和Z-12-1不能抑制TNFα诱导的IκBα降解。MCF-7细胞预处理1h 10μM Z-10、Z-12或者它们的羧基衍生物Z-10-1、Z-12-1，然后用TNFα(10ng/ml)刺激细胞30min，并通过免疫印迹检测相应蛋白的表达。结果表明硝基对于Z-10和Z-12抑制TNFα/NFκB信号是必须的。
图29为Myc-RXRα/Δ80(tRXRα)而不是Myc-RXRα增强TRAF2诱导的NFκB转录激活。MCF-7细胞转染NFκB-Luciferase和Renilla-Luciferase质粒，以及Myc-RXRα/Δ80或Myc-RXRα表达质粒。荧光素值经测量并用相对值作图。Myc-RXRα/Δ80为缺失氨基端80个氨基酸的RXRα突变体，模拟体内的tRXRα。
图30为Myc-RXRα/Δ80(tRXRα)而不是Myc-RXRα增强TRAF2诱导的IκBα降解。MCF-7细胞转染图中所示的质粒24h后，收集细胞并检测相应蛋白的表达。
图31为TRAF2与tRXRα相互作用，但不与RXRα相互作用。HEK293T细胞转染图中所示的质粒24h，然后用TNFα(40ng/ml)处理15min，并用免疫共沉淀检测蛋白之间的相互作用。
图32为Z-10和Z-12抑制TNFα诱导的TRAF2/tRXRα复合体的形成。HEK293T细胞转染图中所示的质粒24h，用Z-10(5μM)和Z-12(5μM)预处理1h，再用TNFα(40ng/ml)刺激15min，用免疫共沉淀检测蛋白之间的相互作用。
图33为TNFα和Z-10或Z-12协同诱导肿瘤细胞PARP蛋白的切割。MCF-7细胞经TNFα(10ng/ml)和Z-10(7.5μM)或Z-12(5μM)共处理9h，经免疫印迹检测PARP切割(c-PARP和c-casp8分别表示切割的PARP和caspase-8)。PARP和caspase-8蛋白的切割是细胞凋亡的标志。实验结果揭示了Z化合物和TNFα联合使用诱导肿瘤细胞凋亡。
图34为Z-10和TNFα能够协同抑制MCF-7细胞的克隆形成。这表明Z-10和TNFα联合使用能够抑制肿瘤细胞的生长。
图35为RXRα/tRXRα的表达量与Z化合物/TNFα协同诱导肿瘤细胞凋亡呈正相关。MCF-7细胞转染对照小干扰RNA或RXRα的小干扰RNA，然后用TNFα(10ng/ml)与Z-10(7.5μM)或Z-12(5μM)处理细胞9h，并通过免疫印迹检测相应蛋白的表达。当RXRα/tRXRα的表达量通过干扰RNA降低后，Z-10或Z-12与TNFα协同诱导的PARP切割也降低。说明TNFα/Z化合物以RXRα/tRXRα依赖的方式诱导肿瘤细胞凋亡。
图36为一些已知的RXRα的配体抑制TNFα和Z-10或Z-12联合使用诱导的凋亡效应。用9-cis-RA(0.1μM),CD3254(0.1μM)或UVI3003(1μM)预处理MCF-7细胞1h，再用TNFα(10ng/ml)和Z-10(7.5μM)或Z-12(5μM)处理细胞9h，通过PARP切割检测细胞的凋亡状况。实验结果显示，这些已知的RXRα配体能够抑制TNFα和Z化合物协同诱导肿瘤细胞凋亡的作用，揭示TNFα和Z-10或Z-12联合使用的凋亡诱导效应依赖于RXRα/tRXRα的表达。
图37为TNFα/Z-10对细胞的凋亡诱导作用同细胞中的RXRα/tRXRα蛋白的表达量呈正相关。图中揭示TNFα/Z-10在RXRα/tRXRα表达较高的MCF-7细胞中诱导很强的凋亡效应，而在RXRα/tRXRα表达较低的SW480和H460细胞中没有或者仅有很弱的凋亡诱导作用。实验揭示TNFα和Z-10联合使用的凋亡诱导效应依赖于RXRα/tRXRα的表达。
图38为与对照细胞相比，在tRXRα而不是RXRα的稳转细胞中，TNFα/Z-10诱导更强的细胞凋亡。用TNFα(10ng/ml)和Z-10(7.5μM)处理细胞9h，通过PARP切割检测细胞的凋亡状况。结果揭示TNFα/Z-10以tRXRα而不是以RXRα依赖的方式诱导肿瘤细胞凋亡。
图39为TRAF2能够挽救TNFα/Z-10诱导的肿瘤细胞凋亡。MCF-7细胞转染Flag-TRAF2或显性抑制TRAF2(Flag-dn-TRAF2)表达质粒，24h后细胞用TNFα(10ng/ml)和Z-10(7.5μM)处理，并用免疫印迹检测相应蛋白的表达。过表达TRAF2能够抑制TNFα/Z-10诱导的肿瘤细胞凋亡，而过表达Flag-dn-TRAF2破坏了TNFα和Z-10诱导肿瘤细胞凋亡的协同作用。
图40为联合使用TNFα和Z-12显著抑制MCF-7细胞在小鼠体内的生长。小鼠经Z-12(30mg/kg)/每两天和TNFα(120×104U/kg)/每天处理接种MCF-7肿瘤细胞的小鼠。肿瘤体积经过测量并记录，以肿瘤体积为纵坐标，药物处理天数为横坐标，做出肿瘤生长曲线图(*P<0.05and**P<0.01)。药物处理14天后，取出肿瘤称量并记录(*P<0.05)。图中显示TNFα和Z-12联合用药可以有效的抑制MCF-7肿瘤细胞在小鼠体内生长。
图41为Z-10显著抑制MCF-7细胞在小鼠体内生长，以及Z-10诱导MCF-7细胞在小鼠体内凋亡。小鼠经Z-10(30mg/kg)/每两天处理接种了MCF-7肿瘤细胞的小鼠。肿瘤体积经过测量并记录，以肿瘤体积为纵坐标，药物处理天数为横坐标，做出肿瘤生长曲线图(*P<0.05)。Z-10处理10天后，取出肿瘤并称量(**P<0.05)。肿瘤组织蛋白提取并通过免疫印迹检测PARP的切割。图中显示，与对照组相比，Z-10能有效的抑制MCF-7肿瘤细胞在小鼠体内生长。同时与对照组相比，Z-10显著诱导肿瘤细胞的凋亡。
具体实施方式
以下通过具体实施例和附图进一步说明本发明的技术方案及效果，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1.芳香硝基乙烯化合物与RXRα的结合
在体外通过配体竞争受体结合实验研究芳香硝基乙烯化合物Z-10，Z-11和Z-12与RXRα蛋白的直接结合。配体竞争受体结合实验显示，同9-cis-RA一样，Z-10，Z-11和Z-12可以浓度梯度的竞争[H3]标记的9-cis-RA与RXRα-LBD结合，IC50分别为0.28μM，0.33μM和0.81μM(图1，图9)。
表面等离子共振实验揭示Z-10和Z-12以浓度依赖的方式结合RXRα-LBD蛋白，其测得的Kd值分别为5.74μM和1.95μM(图8)。
同样经等温滴定量热实验表明Z-10与RXRα的结合常数Kd值为2.98μM(图7)。
体外实验结果显示芳香硝基乙烯化合物Z-10、Z-11和Z-12能够直接结合RXRα蛋白，它们是细胞核受体RXRα的配体和调节剂。
实施例2.芳香硝基乙烯化合物选择性激活RXRα的转录活性
酵母单杂交实验表明Z-1选择性的激活Gal4-DBD-RXRα-LBD的转录活性，但是并不激活Gal4-DBD-RARα-LBD和Gal4-DBD-ERα-LBD的转录活性(图1，图2)。20μM的Z-1对RXRα的激活能力达到0.1μM的9-cis-RA激活能力的一半。
酵母单杂交实验表明Z-10和Z-12选择性的激活Gal4-DBD-RXRα-LBD的转录活性，但是并不激活其他核受体如RARα,RARγ,ERα,GR,LXRα和PPARγ的LBD的Gal4-DBD融合蛋白的转录活性(图4，图5)。Z-10和Z-12比Z-1具有更强的激活RXRα转录活性的能力(图4)。
Z-11与Z-10在结构上的区别在于硝基在萘环上的位置不同(图1)，而且Z-11可以与RXRα结合(图9)，但其并不能激活RXRα转录活性(图4)，这说明激活RXRα的转录活性对Z化合物的结构具有严格的要求。
实施例3.硝基对于芳香硝基乙烯化合物结合RXRα和激活RXRα的转录活性是必须的
羧基和其他基团取代硝基的Z化合物的衍生物不能竞争9-cis-RA与RXRα-LBD蛋白的结合(图6，图9，图11，图13)，表明硝基对于Z化合物结合RXRα蛋白是必须的。
羧基和其他基团取代硝基的Z化合物的衍生物丧失激活Gal4-DBD-RXRα-LBD的能力(图10，图12)，表明硝基对于Z衍生物调节RXRα的转录活性是必须的。
实施例4.RXRα上的316位精氨酸和432位的半胱氨酸能够区别RXRα的配体9-cis-RA和芳香硝基乙烯化合物
酵母单杂交实验揭示，9-cis-RA不能激活Gal4-DBD-RXRα-LBD/R316E(316位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸)突变体的转录活性，但是Z-10和Z-12仍然可以激活此突变体的转录活性(图14)。
酵母单杂交实验揭示，9-cis-RA能激活Gal4-DBD-RXRα-LBD/C432S(432位氨基酸由半胱氨酸突变为丝氨酸)突变体的转录活性，但是Z-10和Z-12不能激活此突变体的转录活性(图15)。
等温滴定量热实验表明Z-10与RXRα-LBD/R316E突变体蛋白结合，而不同RXRα-LBD/C432S突变体蛋白结合(图17)。
实施例5.两个转录自激活的RXRα突变体。
酵母单杂交实验揭示RXRα的432位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸的突变体(C432Y)，在配体不存在的情况下，就具有很高的转录激活活性(图15)。
酵母单杂交实验揭示RXRα的432位氨基酸由半胱氨酸突变为色氨酸的突变体(C432W)，在配体不存在的情况下，就具有很高的转录激活活性(图15)。
上述两个突变体具有转录自激活活性。
由于Z-1与酪氨酸，Z-10与色氨酸在结构上具有相似性(图16)，因此这两个突变体在某种程度上模拟了Z-1和Z-10与RXRα野生型蛋白的结合，解释了这两个突变体自激活的原因。
实施例6.芳香硝基乙烯化合物调节RXRα的多聚体化，诱导特异的RXRα蛋白构象。
非变性胶电泳实验揭示9-cis-RA能够诱导RXRα-LBD蛋白形成二聚体(图19)。
Z-10和Z-12诱导RXRα-LBD蛋白由四聚体转变为二聚体或三聚体(图19)
Z-10和Z-12诱导RXRα-LBD蛋白形成构象不同的二聚体或三聚体(在非变性胶上的迁移速率低于9-cis-RA诱导的二聚体和无配体存在时的二聚体)(图19)。
Z-11能够诱导RXRα-LBD蛋白形成高于四聚体的多聚体(图19)。
因此芳香硝基乙烯化合物可以用来研究RXRα蛋白多聚体的形成和功能。
胰蛋白酶切实验揭示，在Z-10和Z-12存在时，RXRα-LBD蛋白经胰蛋白酶切形成特异的蛋白片段图谱(不同与DMSO和9-cis-RA存在时的蛋白片段图谱)(图20)。
糜蛋白酶切实验揭示，在Z-10和Z-12存在时，RXRα-LBD蛋白经胰蛋白酶切形成特异的蛋白片段图谱(不同与DMSO和9-cis-RA存在时的蛋白片段图谱)(图20)。
蛋白酶切实验表明Z-10和Z-12同RXRα蛋白结合，诱导特异的蛋白构象(不同于9-cis-RA诱导的蛋白构象)。
实施例7.芳香硝基乙烯化合物抑制TNFα/NFκB信号活性
Z-10和Z-12抑制TNFα诱导的NFκB靶基因c-Myc，cyclin D1和P62的表达(图21)。
Z-10和Z-12抑制TNFα诱导的p65由细胞质转移到细胞核(图22，图23)。
Z-10和Z-12抑制TNFα诱导的IKKα/β的磷酸化(图24)。
Z-10和Z-12抑制TNFα诱导的IκBα的降解(图24)。
上述实验表明Z-10和Z-12抑制TNFα/NFκB的信号活性。
实施例8.芳香硝基乙烯化合物通过RXRα/tRXRα抑制TNFα/NFκB信号活性
降低RXRα/tRXRα在细胞中的表达量会减弱Z-10和Z-12对TNFα/NFκB信号的抑制作用(图25)
Z-10和Z-12抑制TNFα诱导的IκBα的降解作用同RXRα/tRXRα在不同细胞中的表达呈正相关(图26)。
RXRα的配体9-cis-RA，UVI3003和CD3254阻碍Z衍生物对TNFα诱导的IκBα降解的抑制作用(图27)。
这些说明RXRα/tRXRα介导了芳香硝基乙烯化合物对TNFα/NFκB信号的调节作用。
实施例9.tRXRα激活NFκB信号通路
Myc-RXRα/Δ80(tRXRα)转染MCF-7细胞，加强TRAF2激活的NFκB转录活性(图29)。
Myc-RXRα/Δ80(tRXRα)转染MCF-7细胞，加强TRAF2诱导的IκBα降解(图29)。
tRXRα激活TNFα/NFκB信号的活性。
实施例10.芳香硝基乙烯化合物抑制tRXRα与TRAF2的相互作用
免疫共沉淀实验表明Myc-RXRα/Δ80与TRAF2有相互作用，而Myc-RXRα与TRAF2没有相互作用(图31)。这说明TRAF2同tRXRα相互作用，而不同全长的RXRα相互作用。
TNFα诱导tRXRα和TRAF2的相互作用(图31)。
Z-10和Z-12抑制TNFα激活的tRXRα和TRAF2的相互作用(图32)。
实施例11.芳香硝基乙烯化合物和TNFα联合使用具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用
TNFα和Z-10或Z-12联合使用，显著诱导体外MCF-7肿瘤细胞PARP蛋白的切割(图33，图35，图36，图37，图38，图39)。
Z-10可能协同肿瘤自身的TNFα，诱导MCF-7细胞在小鼠体内的凋亡(图41)。
实施例12.芳香硝基乙烯化合物通过抑制TNFα的生存信号进而激活其凋亡信号来诱导肿瘤细胞的凋亡
在过表达TRAF2的MCF-7细胞中，Z-10和TNFα联合诱导的PARP切割被抑制(图39)。
在过表达失活型TRAF2的MCF-7细胞中，Z-10和TNFα联合不能增强失活型TRAF2诱导的PARP切割(图39)。
Z-10和TNFα联合使用诱导caspase8的切割和激活(图33)。Z-10诱导TNFα介导的caspase-8的激活。
实施例13.芳香硝基乙烯化合物和TNFα通过tRXRα诱导肿瘤细胞的凋亡
降低RXRα/tRXRα在细胞中的表达量会减弱Z-10或Z-12和TNFα协同诱导肿瘤细胞凋亡的作用(图35)
RXRα的配体9-cis-RA，UVI3003和CD3254阻碍Z-10和TNFα联合使用诱导的PARP切割(图36)。
Z-10和TNFα联合使用诱导的PARP切割同RXRα/tRXRα在不同细胞中的表达量呈正相关(图37)。
与对照细胞相比，在tRXRα稳转的细胞中，Z-10和TNFα联合使用诱导更强的PARP切割(图38)。
与对照细胞相比，在RXRα稳转的细胞中，Z-10和TNFα联合使用没有诱导更强的PARP切割(图38)。
实施例14.芳香硝基乙烯化合物和TNFα联合使用具有抑制肿瘤细胞生长的作用
Z-10和TNFα联合使用抑制MCF-7细胞克隆的形成(图34)。
Z-12和TNFα联合使用抑制MCF-7细胞在小鼠体内的生长(图40)。
Z-10可能协同肿瘤自身的TNFα，抑制MCF-7细胞在小鼠体内的生长(图41)。
以下给出实施例中的主要实验试剂。
DMEM、RPMI1640培养基购自Hyclone公司；脂质体Lipfactamin 2000购自Invitrogen公司；增强化学发光(ECL)试剂、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购自Thermo；RXRα(ΔN197)、NFκB p65(C-20sc-372)、myc(9E10，sc-40)、抗体购自Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz，CA)；IκBα[E130]购自Abcam；Phospho-IKKα(Ser176)/IKKβ(Ser177)(C84E11)；cleavedcaspase-8(p43/p41)、PARP(9542)购自Cell Signaling；Fluorescein isothiocyanate(FITC)-labeled anti-rabbit IgG购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)；anti-rabbit IgGconjugated with Cy3购自Chemicon公司；Flag(F1804)、monoclonal anti-β-actin antibody、9-cis-RA、TNFα、CD3254、UVI3003、PPT、ATRA、Ros、dex、T09购自Sigma公司；protein-Abeads购自GE Healthcare；PVDF membranes购自Millipore；cocktail of proteinase inhibitors(80-6501-23)购自Amersham公司；其他化学纯和分析纯试剂购自Sigma公司。
以下给出实施例中的主要细胞株。
人胚肾细胞HEK293T、人肺癌细胞H460、人结肠癌细胞SW480、人乳腺癌细胞MCF-7购于中国科学院细胞库。
以下给出His-RXRα/LBD蛋白的制备方法：
①将冻存的菌液放入50ml管中，过夜37℃，225rpm培养；
②第二天把50ml管中的菌液取4ml到400ml三角瓶(1:100)中，待OD值长到0.6-0.8的时候，加IPTG至终浓度1mM，25℃诱导过夜；
③用5000rpm，4℃离心15min；
④分别用30ml Lysis Buffer冰上悬浮30min；
⑤超声裂解；
⑥冰上30min；
⑦离心12000rpm，4℃，30min；
⑧上清液倒入15ml离心管中；
⑨洗Beads，用20-30ml PBS洗3次，每次2000rpm，5min；
⑩把第⑧中的上清和第⑨中的Beads 4℃孵育过夜；
离心2000rpm，5min。
以下给出配体受体竞争结合实验。
①药物的稀释：每管100μl体系，每管加药1μl配制成实验所需浓度；
②建立反应体系：(100μl)；
③4℃避光孵育14h；
④每管加入12μl Beads(50％Beads用PBS稀释3倍使用)，室温振摇30min；
⑤在GF/C膜上抽虑，并用PBS洗膜两次，使与受体结合的[3H]-9-cis-RA留在膜上，未结合的同位素抽虑除去。烤干膜，加入1ml闪烁液，测定CPM值；
⑥数据处理：抑制率％＝(CPMcontrol–CPMdrug)/(CPMcontrol–CPM9-cis-RA)×100％
以下给出细胞转染试验。
脂质体法：
(1)在细胞密度达80％左右，于转染前1hr用基本培养基(DMEM或Opti-MEM)为细胞换液；
(2)将适量欲转染的质粒DNA与适量体积的Opti-MEM混匀。同时，将适量的脂质体也和适量的Opti-MEM混合，室温静置5min(具体各种试剂加入量参见下表)；
(3)将(2)所得两溶液转移到同一EP管中，吹打使其混匀，静置20min。
(4)将质粒DNA和脂质体混合液加入到细胞培养皿中，置于CO2培养箱中37℃培养(5％CO2，37℃)。
脂质体法各试剂用量参见表1。
表1
以下给出真核细胞蛋白提取与免疫印迹。
(1)样品的收集：吸取培养基，细胞用4℃的PBS洗三次，加入1ml含1mmol/L的PMSF(临用前加)的PBS，将细胞收集到1.5ml离心管中，4℃，2000rpm离心10min，吸去上清，细胞团可存于-80℃或现用；
(2)细胞裂解：每管中加含1mM PMSF，Cocktail(临用前加，每100μl RIPA加2μl)的RIPA细胞裂解液30-100μl(视细胞量定)，裂解30min，其间，在振荡器上每隔5min震荡10sec，然后4℃，12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白浓度；RAPI裂解液配方：50mMTris-Hcl pH7.4，1％NP-40，0.25％Na-deoxycholate，150mM NaCl(临用时加入1mM EDTA，1mM PMSF，1mM NaF，1mM NaVO3以及蛋白酶抑制剂混合物Cocktail)。
(3)蛋白浓度的测定；
(4)蛋白电泳：取20-100μg(视蛋白在细胞中丰度而定)蛋白样品，加等体积2×Loadingbuffer上样缓冲液(含10％β-巯基乙醇)，于100℃煮10min，稍离心后于Tris-甘氨酸缓冲液中电泳(80V，过了分离胶后改用120V)。每板电泳加入蛋白Marker 5μl。电泳缓冲液配方：称取Tris-HCl 3.03g，Glycine 18.77g，SDS 1g溶于1000ml蒸馏水中即可；
(5)电转移：电转液于4℃预冷，切好胶后将同样大小的PVDF膜(提前用无水甲醇浸泡1min)和滤纸预先浸于电转液中，PVDF膜贴于胶后，赶尽气泡，两面覆盖滤纸，赶尽气泡，按膜朝正极的顺序装于电转槽中，加入电转液和冰袋，于4℃冰箱中电转(100V，60min或300mA，90min)。电转液配方：称取Glycine 11.25g，Tris-HCl 2.425g溶于900ml蒸馏水中然后加入100ml甲醇；
(6)抗原抗体反应：①封闭电转后的PVDF膜于5％脱脂牛奶封闭液中摇1hr或更长；②一抗反应：封闭后的膜封于杂交袋中，按0.1ml/cm2加入一抗(浓度由1：500到1：2000，视不同抗体而定)于4℃摇床上过夜或室温摇3hr；③二抗反应：将膜于TBST中摇洗3次，每次5min，于适当二抗溶液(二抗溶于封闭液中，浓度1:8000到1:20000)中室温摇1hr。TBST配方：称取Tris-HCl 1.21g，Nacl 8.77g，溶于1000ml蒸馏水中，将pH值调至7.6，然后加入Tween-201ml；
(7)ECL检测：倾去二抗，用TBST洗膜，室温摇洗三次，每次5min，蛋白面朝上，置于保鲜膜中，将ECL(Pierce)的A液和B液以1:1(V/V)混和，于暗室中，按0.05-0.1ml/cm2的量滴加于膜表面，孵育1min，滤纸吸去多余液体用保鲜膜将膜包好，立即于暗室中曝光数s或更长(视荧光强度而定)。
以下给出免疫共沉淀实验。
收集、裂解细胞并于4℃高速离心；离心完，吸取5％上清液加入等体积的2×Loading buffer上样缓冲液做总蛋白样品对照(Input)100℃煮沸10min，-80℃存放待用；另外90％的上清液加入10μl protein A/G agarose于4℃摇床上孵育30min以便去除非特异的蛋白结合，离心，将上清移到新的1.5ml离心管中，加入5-10μl一抗，管缠上封口膜，于4℃摇床孵育2hr，然后加入30μl protein A/G agarose，4℃摇床孵育1-2hrh；然后4℃ 2000rpm离心2min，小心的洗去上清，再用冰凉的细胞裂解液1ml在4℃摇床上洗涤至少3次，每次5min，最后在4℃2000rpm离心2min，收集珠子。向离心管中加入适量的2×SDS loading buffer于100℃中变性10min。
以下给出免疫荧光染色。
(1)消化收集细胞，以2-10×103cell/coverslip接种细胞于24孔板中，滴加细胞悬液50-100μl，2hr后补加含10％FBS的培养基500μl；
(2)37℃细胞培养箱中培养一定时间后，显微镜下观察，取细胞状态和细胞数量适应的玻片，加入特定的药物处理；
(3)去掉旧培养液，用冰冷的PBS洗两次，加3.7-4％甲醛0.5ml(在PBS中)室温固定10min；
(4)PBS洗两次，加穿膜液0.5ml(0.1％triton X-100+0.1M Gycine)冰上30min；
(5)PBS洗两次，加5mg/ml BSA 0.3ml室温封闭1hr；
(6)PBS洗两次，取一张封口膜，做好标记，加一抗(用5mg/ml BSA稀释1：100-500)25μl于封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在一抗液滴上，放在湿盒中室温孵育3hr；
(7)将盖玻片从封口膜上小心夹起，细胞面朝上放入原来的24孔板中，PBS洗两次，取另外一张封口膜，做好标记，加二抗(羊抗兔罗丹明，用5mg/ml BSA稀释1：100-500)25μl于封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在一抗液滴上，放在湿盒中室温黑暗中孵育1hr；
(8)同上PBS洗两次，同上操作，将玻片与10μl DAPI(1μg/ml in PBS，贮存液：1mg/ml在dd H2O)室温孵育5min；
(9)PBS洗三次，将玻片背面的水分擦干，封片于载玻片上，做好标记(时间，细胞名称，实验内容，号码)；
(10)待封片胶干后可在荧光显微镜下观察，观察时注意记录每张玻片的内容以免混淆，观察完后将玻片放－20℃保存；
(11)若只观察转染了荧光蛋白细胞，不需要给内源蛋白染色，可直接用DAPI染核后封片；
(12)以BSA(5mg/ml)代替一抗，二抗照加为染色的对照组，做法同上。为了保证实验有重复性，每次做平行2组以上。
以下给出报告基因检测。
(1)将MCF-7或HEK293T以合适密度，250μl每孔接种于48孔培养板，37℃培养24h；
(2)转染前1h将细胞(细胞密度约60-70％)换液成Opti-MEM，用脂质体转染目的质粒于细胞中，转染6h后，换液，加入10％FBS的DMEM(250μl/孔)，继续37℃培养17h；
(3)细胞转染后24h加入不同浓度的药物溶液250μl/孔；
(4)进行Firefly和Luciferase活性检测并用其比值作图。
以下给出克隆形成实验。
(1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10％胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。
(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10ml 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃，5％CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。
(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15min。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10-30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。
以下给出稳定表达tRXRα、全长RXRα的细胞系的建立。
(1)MCF-7细胞用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液，放于含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养，每两至三天胰酶溶液消化传代一次。
(2)转染质粒前24hr以2×105个/孔，每孔500μl铺细胞于24孔板。
(3)转染前1hr用Opti-MEM换液，400μl/孔。取48μl Opti-DMEM加入lipofectamine20002μl混匀，37℃孵育5min。取0.8μgMyc-tRXRα或Myc-RXRα表达质粒用Opti-DMEM稀释至50μl。将两部分混匀，37℃孵育20min。将孵育好的混合物均匀滴入24孔板的一个孔中，摇匀，放入5％CO2培养箱，37℃孵育。
(4)72hr后用含600μg/ml G418的DMEM培养液培养，两周通过Western blotting方法检测tRXRα或RXRα的表达情况。
(5)挑选阳性的克隆到24孔板，继续用600μg/ml G418的DMEM培养液培养，培养4周。
(6)挑取单克隆，Western Blotting检测tRXRα或RXRα蛋白的表达量，建成的稳定表达tRXRα或RXRα的细胞系。
以下给出裸鼠移植瘤模型。
(1)实验材料：MCF-7细胞，BALB/c(nu/nu)裸鼠，体重18-20g，雌性，SPF级动物房中饲养，饲料、饮用水、动物笼具、垫料均经高压火菌处理，每两天更换垫料，严格无菌操作。
(2)人肿瘤细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立：无菌条件下，收集对数生长期的待接种细胞，用无血清培养液洗涤，倒置显微镜下计数活细胞数>95％，调整细胞浓度为1×107/ml，将肿瘤细胞重悬于PBS中制成细胞悬液。每只裸鼠右侧腋下接种0.2m1上述细胞悬液，定期观察测量肿瘤生长情况。
(3)分组及给药：
当裸鼠移植瘤直径达到约0.5cm时，选择无出血、坏死、感染的裸鼠进行实验，给裸鼠称重，测量瘤径，每组6只裸鼠，实验组分别按TNFα(120×104U/kg)、Z-12(30mg/kg)给药，空白对照组给予等量的Tween80，TNFα采用瘤内注射给药，隔天给药,Z-12灌胃给药，每天给药，末次给药6hr后处死裸鼠，称瘤重。
(4)肿瘤生长曲线的绘制：肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：V＝1/2×a×b2其中a、b、c分别表示长宽高根据测量结果计算出肿瘤体积，以时间为横坐标，肿瘤体积为纵坐标绘制肿瘤生长曲线。抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)：其中TRTV，治疗组RTV；CRTV，阴性对照组RTV。疗效评价标准：T/C％>40％为无效，T/C％≤40％，并经统计学处理P<0.05为有效。
以下给出等温量热滴定法(ITG)测定蛋白质与Z-10和Z-12的结合。
将RXRαLBD蛋白和Z-10或Z-12溶液用Buffer(20mM Tris-HCL pH7.5,200mM NaCL)稀释,蛋白质浓度为50μM,Z-10和Z-12的浓度为蛋白质浓度的20倍即1mM。在下槽中加入200μl的蛋白溶液,但为了排除干净下槽中的气泡一般吸取300μl左右样品慢慢注入进去并不断上下移动上样针以赶走气泡,注意在上下移动过程中不要碰到槽体以免损坏仪器,在将所有气泡赶走后吸掉多余的溶液；将上样针中吸取40μl Z-10或Z-12样品,在上样的PCR管中最好含有不少于50μl的样品避免上样针中吸取的样品不足。在准备好下槽液和上样针中的样品后就设置一下程序进行滴定,一般设置环境温度为25℃，第一滴滴定时间为5s,间隔120s,每次实验都要滴定一次对照实验即Z-10或Z-12滴定buffer和一次Z-10或Z-12滴定蛋白实验,最终处理数据时将Z-10或Z-12滴定蛋白的数据减掉对照实验的数据。
Claims (10)
1.芳香硝基乙烯化合物，其特征在于其化学通式如下：
其中：R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R17，R18，R19，R20，R21，R22，R23，R24，R25,R26,R27,R28为H；或卤素，硝基，氨基，羧基，羟基中的一种；或具有1～40个碳原子的烷烃基中的一种；或独立选自具有5～50个碳原子的芳香基团；或独立选自具有5～50个碳原子的含氮杂环；X为氮原子，硫原子以及氧原子；Y为碳原子或者氮原子。
2.如权利要求1所述芳香硝基乙烯化合物在制备预防和/或治疗与类视黄醇X受体RXR相关的人类疾病药物中应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述人类疾病包括但不限于肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、脂肪性肝炎。
4.如权利要求1所述芳香硝基乙烯化合物作为类视黄醇X受体RXR的调节剂在制备预防和/或治疗RXR介导的疾病的药物中应用。
5.如权利要求1所述芳香硝基乙烯化合物作为类视黄醇X受体RXR的配体和调节剂在制备结合或者调节类视黄醇X受体活性剂中的应用。
6.用于鉴别RXR的配体9顺视黄酸(9-cis-RA)和芳香硝基乙烯化合物的两种突变体，其特征在于所述两种突变体为：1)RXRα的432位氨基酸由半胱氨酸突变为丝氨酸的突变体和2)RXRα的316位由精氨酸突变为谷氨酸形成的突变体；所述RXRα的432位氨基酸由半胱氨酸突变为丝氨酸的突变体不能被芳香硝基乙烯化合物结合并激活，但是可被9-cis-RA激活；所述RXRα的316位由精氨酸突变为谷氨酸形成的突变体不能被9-cis-RA激活，但是可被芳香硝基乙烯化合物结合和激活。
7.如权利要求6所述用于鉴别RXR的配体9顺视黄酸(9-cis-RA)和芳香硝基乙烯化合物的两种突变体，其特征在于所述两种突变体在鉴定芳香硝基乙烯类的RXR配体，以及靶向RXR的芳香硝基乙烯化合物的药用活性中应用。
8.用于模拟芳香硝基乙烯化合物Z-1和Z-10系列化合物与RXRα结合的两个突变体，其特征在于所述两个突变体为：1)RXRα的432位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸的突变体和2)RXRα的432位由半胱氨酸突变为色氨酸的突变体；酪氨酸和色氨酸的侧链结构分别同Z-1和Z-10的结构类似，两个突变体能够模拟Z-1和Z-10与RXRα结合；
所述两个突变体具有不需配体的转录自激活作用，两个突变体在研究芳香硝基乙烯化合物在预防和治疗与RXRα相关疾病中的活性和作用中应用。
9.一种调节RXRα蛋白多聚化的方法，其特征在于具体步骤如下：
芳香硝基乙烯化合物Z-10和Z-12系列化合物与RXRα蛋白在体外和体内孵育，诱导RXRα蛋白形成二聚体或三聚体；芳香硝基乙烯化合物Z-11系列化合物与RXRα蛋白在体外和体内孵育，诱导RXRα蛋白形成多聚体；所述调节RXRα蛋白多聚化的方法在鉴定芳香硝基乙烯化合物对RXRα的活性调节以及靶向RXRα药物的活性分析和鉴定中应用。
10.一种联合用药诱导肿瘤细胞凋亡的方法，其特征在于具体步骤如下：
芳香硝基乙烯化合物与肿瘤坏死因子TNFα联合使用，能够有效地在细胞和小鼠体内诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长，芳香硝基乙烯化合物与TNFα联合用药，在制备治疗肿瘤药物中应用。
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