CN104304333A

CN104304333A - 扁蓄乙醇提取物的提取方法及其用途

Info

Publication number: CN104304333A
Application number: CN201410615925.7A
Authority: CN
Inventors: 姬妍茹; 杨庆丽; 董艳; 张正海; 刘淑霞; 马志军; 刘宇峰; 石杰
Original assignee: Heilongjiang Academy of Sciences Daqing Branch
Current assignee: Heilongjiang Academy of Sciences Daqing Branch
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2015-01-28

Abstract

本发明公开了扁蓄乙醇提取物的提取方法及其用途，属于植物病害生物防治领域。本发明提取方法：将扁蓄地上部分干制后粉碎，过筛，然后用80%~90%（体积）乙醇提取2次，蒸发至膏状物。扁蓄乙醇提取物用于黄瓜根结线虫病防治。扁蓄乙醇提取物防治黄瓜根结线虫病是通过下述步骤完成的：扁蓄乙醇提取物按5~40g/m²的用量使用，使用时加丙酮作为助溶剂，然后用200~500倍量的水稀释后对黄瓜进行灌根。本发明在黄瓜上使用后能够增强黄瓜对根结线虫的耐受力，减轻根结线虫对黄瓜的危害，使根系能够更好地吸收营养，植株健壮地生长，有利于提高黄瓜的产量。

Description

扁蓄乙醇提取物的提取方法及其用途

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，主要涉及植物源线虫抑制剂领域。具体涉及一种利用扁蓄（Polygonumaviculare L.）提取物减轻根结线虫对黄瓜危害的方法。

背景技术

植物根结线虫是一类具有土传特性的重要病害，对黄瓜尤其是大棚黄瓜危害较重，防治难度较大。危害黄瓜的根结线虫主要是南方根结线虫（Meloidogyne incongnita），发病主要症状是根部肿大、畸形，影响根系对养分的吸收，阻碍植株的生长发育。同时侵染造成的伤口还会成为其它植物病原真菌和细菌的入侵通道，增大植株染病的几率，导致黄瓜减产甚至绝产，降低菜农的收入。

目前防治黄瓜根结线虫的方法有农业防治、物理防治和药剂防治。农业防治主要是采取作物轮作、深耕土壤和利用对根结线虫具有抗性的黄瓜品种，物理防治主要是采取高温闷棚的方法。这两种方法虽然有一定的防治效果，但也只是作为防治的辅助手段，当今防治根结线虫的主要方法是药剂防治，市面上应用较多的药剂大致有两类，一类是有机磷类化学杀线虫剂，例如：克线磷、益舒宝、米乐尔等，这些药剂的优点是在短期内可以迅速高效地控制线虫的数量，效果显著，缺点是在土壤中和农产品中有残留，造成环境污染，影响食品的安全性，不符合当今推崇的绿色无公害食品理念，在很多国家和地区已被禁用。另一类是以阿维菌素和淡紫拟青霉为代表的生物杀线虫剂，菌类制剂对防治线虫有一定的效果，但是由于土壤抑制作用等因素，使引入的生防菌效果极不稳定，因此需要其他的生防手段加以弥补。植物源杀线剂以其原材料取自天然植物，与环境相容性好，能够较好地降解，无残留、无公害、不易产生抗药性，成为未来防治根结线虫的主要手段。目前已报道的具有抑制线虫功能的植物有300多种，多数处于实验阶段，很少有应用到实际的生产当中。中国的植物资源相当丰富，可挖掘的具有抑制线虫功能的植物很多，扁蓄是一年生草本植物，对于大田作物而言，它属于杂草，是农民需要防除的对象；同时它又是一种中草药，苦，微寒。具有通利膀胱，杀虫除湿止痒的功能，主要用于淋痛及湿疹。目前还没有关于扁蓄具有抑制根结线虫功能方面的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物源黄瓜根结线虫的生物防治药剂提取方法和使用方法，该药剂在黄瓜上使用后能够增强黄瓜对根结线虫的耐受力，减轻根结线虫对黄瓜的危害，使根系能够更好地吸收营养，植株健壮地生长，有利于提高黄瓜的产量。

本发明中扁蓄乙醇提取物的提取方法是按下述步骤进行的：

步骤一、将扁蓄地上部分干制后粉碎，然后过筛，得到扁蓄粉末；

步骤二、向扁蓄粉末加入5~10倍量（以质量计）的80%~90%（体积）乙醇，然后在23℃、120r/min条件下振荡6小时，过滤，再向滤渣中加入5倍量（以质量计）80%~90%（体积）乙醇，在23℃、120r/min条件下振荡6小时，过滤后将滤液合并，蒸发至膏状物。

步骤二中用旋转蒸发仪蒸发，蒸发在40℃，130r/min条件下进行。

扁蓄乙醇提取物用于黄瓜根结线虫病防治。扁蓄乙醇提取物防治黄瓜根结线虫病是通过下述步骤完成的：扁蓄乙醇提取物防治黄瓜根结线虫的用量为5~40g/m²，使用时加丙酮助溶，然后用200~500倍量（以质量计）的水稀释后灌根使用。

丙酮的用量为扁蓄乙醇提取物膏状物的5~10倍量（以质量计）。

扁蓄乙醇提取物可以单独使用，也可以与生物有机肥等肥料混合使用。

本发明利用扁蓄提取物进行室内离体生测，对卵囊的抑制孵化率为79.65%，明显高于马齿苋等其它几种参试植物提取物的抑制作用；1%的扁蓄提取物对根结线虫2龄幼虫的抑杀率可达90.81%；同时在基数为6028头/100克根的病土上进行盆栽试验，当扁蓄提取物施用量为40g/m²时，黄瓜生长40天后与空白对照相比虫口减退率为71.80%，地上部分植株鲜重增长率为33.56%，基本与阿维菌素（与空白对照相比虫口减退率为74.38%，地上部分植株鲜重增长率为35.28%）的作用效果相当。使用扁蓄提取物处理黄瓜后，能够提高黄瓜对根结线虫的抗侵染性，减少根结线虫侵入黄瓜根部的数量，明显减轻根结线虫对黄瓜的危害，促进植株生长。扁蓄属于野生杂草植物，容易获得，价格低廉，而且对环境友好，无残留、无公害、不易产生抗药性，将其提取物施用到黄瓜上，食品安全性好，不会对周边环境造成污染。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式中扁蓄乙醇提取物的提取方法是按下述步骤进行的：

步骤一、将扁蓄地上部分干制后粉碎，然后过40目筛，得到扁蓄粉末；

步骤二、向扁蓄粉末加入10倍量（以质量计）的80%（体积）乙醇，然后在23℃、120r/min条件下振荡6小时，过滤，再向滤渣中加入5倍量（以质量计）的80%（体积）乙醇，在23℃、120r/min条件下振荡6小时，过滤后将滤液合并，在40℃，130r/min条件下用旋转蒸发仪蒸发至膏状物。

扁蓄乙醇提取物用于黄瓜根结线虫病防治，扁蓄乙醇提取物防治黄瓜根结线虫病是通过下述步骤完成的：扁蓄乙醇提取物按5g/m²的用量使用，使用时加入5倍量（以质量计）的丙酮（助溶），然后用200倍量（以质量计）的水稀释后对黄瓜进行灌根。

具体实施方式二：本实施方式中扁蓄乙醇提取物的提取方法是按下述步骤进行的：

步骤二、向扁蓄粉末加入5倍量（以质量计）的90%（体积）乙醇，然后在23℃、120r/min条件下振荡6小时，过滤，再向滤渣中加入5倍量（以质量计）的90%（体积）乙醇，在23℃、120r/min条件下振荡6小时，过滤后将滤液合并，在40℃，130r/min条件下用旋转蒸发仪蒸发至膏状物。

扁蓄乙醇提取物用于黄瓜根结线虫病防治，扁蓄乙醇提取物防治黄瓜根结线虫病是通过下述步骤完成的：扁蓄乙醇提取物按40g/m²的用量使用，使用时加入10倍量（以质量计）的丙酮，然后用500倍量（以质量计）的水稀释后对黄瓜进行灌根。

采用下述试验验证发明效果：

（一）试验1：扁蓄提取物抑杀根结线虫室内离体生测试验

1、将扁蓄地上部分干制后用高速粉碎机粉碎，然后过40目筛。取扁蓄粉末100g，加入500mL的80%乙醇，然后在23℃、120rpm条件下振荡6小时，过滤获得滤液。再次加入5倍量（以质量计）的80%乙醇，同样条件下振荡6小时，过滤后将所得滤液与前次的合并，滤液用旋转蒸发仪，在40℃，130r/min条件下蒸发至膏状物(100g扁蓄可得15.92g提取物)，4℃保存备用。

2、将有根结的黄瓜根冲洗干净，在解剖镜下挑选新鲜、饱满、色泽淡黄、大小较为一致的卵囊，用0.2%次氯酸钠溶液消毒0.5min后，经无菌水冲洗数次后备用。将挑选的卵囊放入直径为3cm的培养皿内，每培养皿放置6个，再加入3ml浓度为1%的扁蓄提取物无菌水溶液，以10%丙酮无菌水溶液作为对照，同时参试的还有马齿苋、藜、反枝苋、苘麻、风花菜等采用相同方法获得的植物提取物，每个处理3次重复。将各处理的培养皿置于25℃恒温箱内，96h后检查孵化出的2龄幼虫数，计算不同植物提取物对根结线虫卵的抑制孵化率。

计算公式如下：

抑制孵化率（%）=（对照孵化数-处理孵化数）/对照孵化数×100

表1 不同植物提取物对黄瓜根结线虫卵孵化抑制率比较

植物名称	孵化线虫数	孵化抑制率（%）	排序
				扁蓄	60.7	79.65	1
马齿苋	120	59.77	2
				藜	284.3	4.69	4
反枝苋	295	1.11	6
				苘麻	258.3	13.41	5
风花菜	167	44.02	3
				丙酮（CK）	298.3	0	7
蒸馏水	300.1	—	8

注：表中数据为3次重复的平均值。

从上表可以看出，参试的6种植物提取物均对黄瓜根结线虫的卵囊具有一定的孵化抑制作用，其中以扁蓄提取物作用最为明显，对根结线虫卵的孵化抑制率达79.65%，明显高于其它几种植物提取物的作用。

3、将2中获得的表面灭菌后的卵囊置于无菌的培养皿内，加入适量的无菌水， 25℃恒温培养48h，观察2龄幼虫孵化情况，悬浮计数备用。在直径3cm的培养皿内，分别加入3ml浓度为1%、0.5%、0.25%、0.125%的扁蓄提取物无菌水溶液，然后加入供度线虫60条左右，以10%丙酮无菌水溶液作为对照，每个处理3次重复。将各处理的培养皿置于25℃恒温箱培养，分别于24h和48h用清水复苏2h，检查线虫死亡情况，计算线虫死亡率和校正死亡率，计算公式如下：

线虫死亡率（%）=死亡线虫数/供试线虫数×100

表2 不同浓度扁蓄提取物对黄瓜根结线虫2龄幼虫抑杀效果比较

处理浓度	24h校正死亡率（%）	48h校正死亡率（%）
			1%	88.63	90.81
0.5%	85.27	89.92
			0.25%	72.42	79.37
0.125%	31.53	47.96
			丙酮（CK）	0	0

注：表中数据为3次重复的平均值。

(二)试验2：扁蓄提取物减轻黄瓜根结线虫危害人工气候箱内盆栽试验

1、将扁蓄地上部分干制后用高速粉碎机粉碎，然后过40目筛。取扁蓄粉末100g，加入500~1000ml的80%乙醇，然后在23℃、120rpm条件下振荡6小时，过滤获得滤液。再次加入5倍量（以质量计）的80~90%乙醇，同样条件下振荡6小时，过滤后将所得滤液与前次的合并，滤液用旋转蒸发仪，在40℃，130r/min条件下蒸发至膏状物(100g扁蓄可得15.92g提取物)，4℃保存备用。

2、将黄瓜种子用0.2%NaClO表面灭菌5分钟，无菌水冲洗三遍，接种于带有无菌滤纸的培养皿中，加入无菌蒸馏水，置于恒温培养箱内25℃催芽。选取芽长度一致的种子播种于塑料盆中，每盆12粒，置于人工气候箱内培养，培养条件为白天14h、25℃，夜晚10h、15℃，光强6000Lux，待黄瓜长出3片真叶时接种。

3、每盆接种根结线虫约1200头，将扁蓄提取物按照5、10、20、40g/m²的量进行灌根处理，每个处理3次重复，设置空白对照和接种对照。按照上述条件继续培养，15天后取根分离线虫，计算虫口减退率。计算公式如下：

虫口减退率（%）= （防治前的活虫数-防治后的活虫数）/防治前的活虫数×100　　　

表3 不同用量扁蓄提取物提高根结线虫抗侵染性结果

注：上表数据为3次重复的平均值。

（三）试验3：扁蓄提取物减轻黄瓜根结线虫危害温室盆栽试验

1、将扁蓄地上部分干制后用高速粉碎机粉碎，然后过40目筛。取扁蓄粉末1000g，加入5000ml的80%乙醇，然后在23℃、120rpm条件下振荡6小时，过滤获得滤液。再次加入5倍量（以质量计）的80%乙醇，同样条件下振荡6小时，过滤后将所得滤液与前次的合并，滤液用旋转蒸发仪，在40℃，130r/min条件下蒸发至膏状物(1000g扁蓄可得159.2g提取物)，4℃保存备用。

2、选用黄瓜品种长春密刺进行试验。将黄瓜种子采用常规育苗方法进行育苗，待幼苗长到4~5片真叶期时，选取长势一致的秧苗，移栽到直径为35cm的大盆内，每盆4株，所用基质为根结线虫发病较重的温室病土。病土中根结线虫基数为6028头/100克根。

3、定植1周后，将扁蓄提取物按照5、10、20、40g/m²的量进行灌根处理，设阿维菌素1.8%乳油 0.15ml/ m²对照和空白对照，每个处理4次重复。药剂处理40天后取根进行线虫分离，计算虫口减退率和植株地上部鲜重增长率。结果见表4。

表4 不同用量扁蓄提取物与阿维菌素抑制根结线虫侵染结果比较

注：上表数据为4次重复的平均值。

Claims

1.扁蓄乙醇提取物的提取方法，其特征在于该方法是按下述步骤进行的：

2.根据权利要求1扁蓄乙醇提取物的提取方法，其特征在于步骤二中用旋转蒸发仪蒸发，蒸发在40℃、130r/min条件下进行。

3. 扁蓄乙醇提取物的用途，其特征在于扁蓄乙醇提取物用于黄瓜根结线虫病防治。

4. 根据权利要求3所述的扁蓄乙醇提取物的用途，其特征在于扁蓄乙醇提取物防治黄瓜根结线虫病是通过下述步骤完成的：扁蓄乙醇提取物按5~40g/m²的用量使用，使用时加丙酮助溶，然后用200~500倍量（以质量计）的水稀释后对黄瓜进行灌根。

5. 根据权利要求4所述的扁蓄乙醇提取物的用途，其特征在于丙酮的用量为扁蓄乙醇提取物膏状物的5~10倍量（以质量计）。