CN104302314B - 减毒博代氏杆菌菌株对抗变应性疾病的效果 - Google Patents

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Abstract

此处所述的是组合物、疫苗、以及方法，其包括使用突变的博代氏杆菌菌株对抗变应性疾病，例如哮喘和皮肤炎症。还描述了试剂盒。也描述了其他组合物、疫苗和方法。

Description

减毒博代氏杆菌菌株对抗变应性疾病的效果
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年11月2日提交的美国临时申请号61/554,798的权益，出于所有目的通过引用将其全部内容结合在此。
领域
此处披露的不同方面涉及微生物学、免疫学、以及病毒学领域。
背景
之前已经报道，百日咳博德特菌的高度减毒菌株(BPZE1)的现有前鼻给予至少通过抑制主要的促炎性介质的产生而针对甲型流感病毒的致命激发提供有效和持续的保护[1和PCT/US2009/047399]。
哮喘是一种慢性炎症性肺部疾病，其特征为间歇性气流阻塞、气道高反应性(AHR)、粘液分泌过多、增强的IgE反应和炎症细胞的浸润-主要是嗜酸性粒细胞进入气道(2)。近年来，哮喘的发病率显著增加，在发达国家观察到最大的流行(3)。尽管已显示伴Th2支配的免疫反应的改变的Th2/Th1平衡在哮喘的发展中是重要的，哮喘的发病潜在机制仍有待完全破译(4)。
由反应性半抗原和金属离子引起的变应性接触性皮炎(ACD)是迟发型过敏症的一种形式，并且是世界范围内最常见的皮肤疾病之一(5)。接触性过敏症(CHS)是用于研究人类ACD的公认小鼠模型，并是表皮T细胞介导的对低分子量的半抗原的炎症反应(6,7)。
根据卫生假说，频繁暴露于病原体会引发一定程度的对抗特应性疾病的保护性免疫(8)。然而，已经报告了有关预暴露于对抗变应性疾病的病毒或细菌微生物(9-13)的保护和有害作用的有冲突的观察，强调致病性的和不致病的细菌对塑造宿主免疫反应的交会影响是复杂的，并且仍然知之甚少。此外，尽管对这些机制和优化医疗管理进行了深入研究，处理这些炎症性疾病的当前治疗方法仍是很大程度上改善而不是治愈，并可能会导致意想不到的副作用(14)。此外，许多哮喘患者产生对治疗的抵抗和/或渐进式肺功能障碍(14))。因此，对治疗变应性疾病的更好的疗法(如此处所述的那些)来说仍然存在一个持续的需要。
概述
此处所述的是一种引起免疫反应的能够降低对其有需要的哺乳动物的变应性疾病的严重度的方法，包括：将一种突变的博代氏杆菌菌株给予至该哺乳动物，其中该菌株包括一种突变的百日咳毒素(ptx)基因、一种缺失的或突变的皮肤坏死(dnt)基因、以及一种异源的ampG基因，并且其中该给予引起了该免疫反应。
在一些方面，该博代氏杆菌菌株是一种百日咳博代氏杆菌菌株。在一些方面，野生型博代氏杆菌菌株的ampG基因被替换为大肠杆菌ampG基因。在一些方面，ptx基因的突变包括对参与底物结合的氨基酸和/或参与催化的氨基酸进行取代。在一些方面，参与底物结合的氨基酸的取代包括R9K，且参与催化的氨基酸的取代包括E129G。在一些方面，该博代氏杆菌菌株是一种三突变的菌株。在一些方面，该博代氏杆菌菌株是一种BPZE1菌株。在一些方面，该博代氏杆菌菌株是减毒的。在一些方面，该博代氏杆菌菌株是一种活菌株。在一些方面，该异源的ampG基因是该菌株中唯一的异源基因。在一些方面，该博代氏杆菌菌株不包括携带异源抗原至哺乳动物呼吸道黏膜的异源表达平台。
在一些方面，该方法进一步包括预防或治疗该变应性疾病。在一些方面，该博代氏杆菌菌株是在该变应性疾病在该哺乳动物中发作之前给予的。在一些方面，该博代氏杆菌菌株是在该变应性疾病在该哺乳动物中发作之前约6周或更长时间而给予的。在一些方面，该博代氏杆菌菌株是在该变应性疾病在该哺乳动物中发作之前约2周或更长时间而给予的。在一些方面，该变应性疾病是哮喘。在一些方面，该变应性疾病是皮肤炎症。在一些方面，该变应性疾病是变应性接触性皮炎(ACD)。在一些方面，该免疫反应包括Th2免疫反应。在一些方面，该免疫反应包括Th1免疫反应。在一些方面，该菌株是通过皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)、口服、或鼻内(i.n.)给予，或通过注射或通过吸入给予至该哺乳动物的。在一些方面，该菌株经鼻内给予。在一些方面，该菌株被给予至需要对抗该变应性疾病的保护性免疫的哺乳动物。
在一些方面，该哺乳动物具有发展该变应性疾病的风险。
在一些方面，该菌株是以单剂给予的。在一些方面，该菌株是以多于一剂给予的。在一些方面，该菌株是以两剂给予的。在一些方面，该两剂是约隔3周给予的。在一些方面，对抗该变应性疾病的保护水平高于约60％。在一些方面，对抗该变应性疾病的保护水平高于约50％。
在一些方面，该哺乳动物是人。在一些方面，该哺乳动物是儿童。
在此还描述了一种引起具有发展变应性疾病的风险的人的对抗该变应性疾病的保护性免疫反应的方法，包括：在该变应性疾病在该人体内发作之前将一种活的和减毒的BPZE1菌株给予至该人，其中该给予引起该免疫反应。
在此还描述了一种引起对其需要的人的对抗一种变应性疾病的免疫反应的方法，包括：将一种活的、突变的博代氏杆菌菌株给予至该人，其中给予引起该免疫反应。
在此还描述了一种保护哺乳动物对抗一种变应性疾病的方法，包括：将一种突变的博代氏杆菌菌株给予至该哺乳动物，其中该菌株包括一种突变的ptx基因、一种缺失的或突变的dnt基因、以及一种异源的ampG基因，其中该哺乳动物被保护对抗该变应性疾病。
在此还描述了一种在对其有需要的哺乳动物中提供对抗一种变应性疾病的一种保护形式的免疫的方法，包括：将一种突变的博代氏杆菌菌株给予至该哺乳动物，其中该菌株包括一种突变的ptx基因、一种缺失的或突变的dnt基因、以及一种异源的ampG基因，其中该哺乳动物被提供该保护形式的免疫。
在此还描述了一种用于治疗或预防对其有需要的哺乳动物的一种变应性疾病的组合物，包括：一种突变的博代氏杆菌菌株，其中该菌株包括一种突变的百日咳毒素(ptx)基因、一种缺失的或突变的皮肤坏死(dnt)基因、以及一种异源的ampG基因。
在一些方面，该博代氏杆菌菌株是一种百日咳博代氏杆菌菌株。在一些方面，野生型博代氏杆菌菌株的ampG基因被替换为大肠杆菌ampG基因。在一些方面，ptx基因的突变包括对参与底物结合的氨基酸和/或参与催化的氨基酸进行取代。在一些方面，参与底物结合的氨基酸的取代包括R9K，且参与催化的氨基酸的取代包括E129G。在一些方面，该博代氏杆菌菌株包括三突变的菌株。在一些方面，该博代氏杆菌菌株是一种BPZE1菌株。在一些方面，该博代氏杆菌菌株是减毒的。在一些方面，该博代氏杆菌菌株是一种活菌株。在一些方面，该博代氏杆菌菌株不包括除异源ampG基因之外的异源基因。在一些方面，该博代氏杆菌菌株不包括携带异源抗原至哺乳动物呼吸道黏膜的异源表达平台。
在一些方面，该组合物进一步包括一种药学上合适的赋形剂、运载体、和/或载体。在一些方面，该组合物进一步包括一种佐剂。在一些方面，该组合物进一步包括一种小分子，该小分子能够影响该变应性疾病。
在此还描述了一种被配制为用于治疗或预防对其有需要的哺乳动物中的一种变应性疾病的组合物，该组合物包括一种博代氏杆菌菌株，其中该菌株由登录号CNCM I-3585确定。
在此还描述了一种被配制用于治疗或预防对其有需要的哺乳动物中的一种变应性疾病的组合物，该组合物包括一种博代氏杆菌菌株，其中该菌株由登录号V09/009169确定。
在此还描述了一种疫苗，该疫苗包括此处所述的一种用于治疗或预防哺乳动物中的变应性疾病的组合物。在一些方面，该疫苗被配制为用于鼻腔给予。
附图简要说明
通过以下描述及附图可以更好地理解这些和其他特征、方面和优点，其中：
图1.BPZE1预处理对OVA诱导的气道病理学的影响。通过苏木素与伊红染色(A)和高碘酸-荧光希夫染色(PAFS)(B)来分析气道炎症。在针对H&E染色100×(A组a-e)和400×(A组f-j)放大率、针对PAFS染色200×(B组a-e)和1000×(B组f-j)放大率下观察来自OVA/盐水(a和f)、OVA/OVA(b和g)、BPZE1(1剂)+OVA/OVA(c和h)、BPZE1(2剂)+OVA/OVA(d和i)和BPSM(1剂)+OVA/OVA(e和j)的固定的肺切片的代表性形态变化。
图2.BPZE1预处理对支气管肺泡灌洗液中的细胞浸润以及OVA激发时的OVA特异性抗体反应的影响。A)在最后的盐水(n＝6)或OVA(n＝8)气雾剂激发之后24小时，从不同的小鼠群组获得BALF中炎症细胞计数。以最低500细胞/片盲地进行差别细胞计数来识别嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、以及淋巴细胞。*P≤0.05，**P≤0.01。(B)在最后的盐水或OVA气雾剂激发之后24小时，收集来自不同组(n＝5-12小鼠每组)的小鼠血清。在个体血清(稀释1/5(A-B)，1/300,000(C)或1/10,000(D))上通过ELISA确定总IgE、OVA特异性IgE、IgG1、以及IgG2a的水平。**P≤0.01，***P≤0.001。
图3.BPZE1预处理对OVA诱导的气道炎症模型中的局部细胞因子的产生的影响。在最后的盐水或OVA气雾剂激发之后24小时，收集来自OVA/盐水、OVA/OVA、BPZE1+OVA/OVA组(n＝6小鼠每组)的BALF。通过多重测定确定细胞因子(如指明的)的水平。显示的值是平均±SEM。*P≤0.05，**P≤0.01。
图4.BPZE1预处理对DNCB诱导的CHS小鼠模型中的耳厚度(A)和组织学(B)的影响。在图1中指明的DNCB致敏和激发(C&D)之前，用BPZE1将小鼠处理一次或两次。(A)使用测径器每天测量耳厚度(n＝5小鼠每组)。通过双向ANOVA分析数据。在DNCB激发之后，在BPZE1(2剂)处理组和BPZE1(1剂)处理组/未处理组之间观察到了显著的差异。显示的值是平均±SEM。(B)耳切片的H&E染色。在100×放大率下进行观察。
图5.BPZE1预处理对DNCB诱导的CHS模型中的局部细胞因子的产生的影响。在DNCB或运载体激发两天之后，收集来自BPZE1预处理的或未处理的小鼠的耳并匀浆化，通过多重测定确定个体匀浆中的细胞因子的产生(n＝5小鼠每组)。显示的值是平均±SEM。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。
图6.BPZE1预处理对致敏阶段的影响。A)将小鼠用BPZE1(1剂)经鼻进行预处理或保持未处理，并进行OVA致敏。致敏之后1周收集来自原始
Figure GDA0001112452180000051
的(n＝3)、未处理的(n＝4)以及BPZE1处理的(n＝4)组中的血清。在个体血清(稀释1/5(A)或1/100(B-C))上通过ELISA确定OVA特异性IgE、IgG1、以及IgG2a的水平。B)将小鼠群组(n＝5)用BPZE1(2剂)经鼻进行预处理或保持未处理，并使其经受DNCB致敏。在致敏3天之后收获它们的耳的LN用于如指明的总细胞计数、用抗CD3/CD28抗体再刺激时的T-细胞增殖、以及培养上清液中的IFNγ的产生。每个个体样品分析三个重复。
详细说明
除非另有说明，否则权利要求书和说明书中的术语按照以下定义。
术语“减毒的”指减弱的、低毒性的博代氏杆菌菌株，其能刺激免疫反应和产生保护性免疫，但一般不会导致生病。
术语“快速保护性免疫”指在给予一种突变博代氏杆菌菌株后短时间内具有针对博代氏杆菌的免疫。
术语“博代氏杆菌菌株”包括来自百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博代氏杆菌(Bordetella parapertussis)和支气管炎博代氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)的菌株。
在此使用的缩写“PTX”指百日咳毒素，其合成并分泌一种ADP-核糖基化毒素。PTX由五个不同亚基(称为S1-S5)构成，各复合物包括两个拷贝的S4。这些亚基按照A-B结构安排。该A组分具有酶活性并形成于Sl亚基，而该B组分是受体结合部分并由S2-S5亚基构成。
在此使用的缩写“DNT”指百日咳皮肤坏死毒素，其是一种不耐热毒素，它能够在皮内注射时诱导小鼠和其他实验室动物发生局部损伤。
在此使用的缩写“TCT”指气管细胞毒素，其是一种博代氏杆菌合成的毒力因子。TCT是一种肽聚糖片段并具有诱导白介素-1产生和一氧化氮的合成的能力。它具有导致纤毛郁积的能力，并对于呼吸道上皮细胞具有致死效果。
在此使用的缩写“ampG”指一种编码用于运送1,6-GlcNac-酐-MurNAc的通透酶的基因。
在此使用的术语“哺乳动物”包括人和非人，并且包括但不限于人、非人灵长类、犬科、猫科、鼠科、牛科、马科以及猪科动物。哺乳动物包括出生前的或出生后的哺乳动物。
术语“儿童”指在0月(出生)和小于或等于18岁的年龄之间的哺乳动物(例如人)。
“治疗”指对疾病、病症或障碍进行成功治疗或改善或预防的任何指标，包括任何客观或主观参数，例如，减轻；缓解；症状消失或使得疾病症状对病人而言更易忍受；减缓退化或衰弱的速度；或使恶化末期没那么衰弱。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括医师的检查的结果。因此，术语“治疗”包括给予这些化合物或试剂以预防或延迟、缓解或阻止或抑制与在此描述的疾病、病症或障碍有关的症状或病症的发展。术语“治疗效果”指在受试者中该疾病、该疾病的症状或该疾病的副作用的减少、消除或预防。使用此处所披露的方法进行“治疗(treating或treatment)”包括预防症状在受试者中发作，该受试者可能具有与在此所述的疾病、病症或障碍有关的疾病或障碍增加的风险、但是还没有经历或表现出症状；抑制疾病或障碍的症状(减缓或阻止其发展)；减轻疾病的症状或副作用(包括镇静剂治疗)；以及减轻疾病(导致退化的)的症状。治疗可以是预防性的(以预防或延迟疾病发作，或预防其临床或亚临床症状表现)或在疾病或病症表现之后治疗性地抑制或缓解症状。
将一种已知药物(或其他化合物)与此处披露的一种组合物进行“联合用药”指在一定时候将该药物(或其他化合物)与该组合物一同给药，从而该已知药物(或其他化合物)二者将具有治疗或诊断效果。这种联合用药可以包括相对于给予一种组合物而言对该药物(或其他化合物)进行并行(即同时)、在前或相继给药。本领域普通技术人员对于确定具体药物(或其他化合物)与一种组合物一起的合适的给药时间、顺序和剂量不会有任何困难。
在此使用的术语“保护”和“预防”可交换使用，并且意为阻碍一种疾病、病症、或障碍。
“预防性疫苗”指该疫苗预防一种疾病、病症、或障碍。
术语“免疫原性组合物”或“组合物”指能够诱导免疫反应并因此具有抗原性的组合物。“免疫反应”指免疫系统的任何反应。这些反应包括有机体的免疫系统响应于抗原的活性变化，并可以包括，例如，抗体产生、诱导细胞介导的免疫、补体激活、或免疫耐受的形成。
在此使用的术语“疾病”具有本领域一般公知的和理解的含义，并且包括宿主个体的功能或健康的任何异常状况。医疗保健人员对特定疾病的诊断可以通过直接检查和/或对一种或多种诊断检测的结果进行分析来得出。
术语“变应性疾病”是指免疫系统的超敏反应障碍，其特征是免疫细胞的激活，该激活导致炎症物质(例如组胺)的释放以及IgE抗体的产生。在一些方面，变应性疾病可以是一个病理状况，其中受试者对一种物质是超高灵敏度的并可以增加针对该物质的异常免疫反应。变应性疾病可以由IgE激活肥大细胞导致炎症反应(例如局部反应，全身反应)来表征，其可以导致温和如流鼻涕的症状至危及生命的过敏性休克和死亡。变应性疾病的实例包括但不限于变应性鼻炎(例如枯草热)、哮喘(例如变应性哮喘)、皮肤炎症、变应性皮炎(例如湿疹)、接触性皮炎、变应性接触性皮炎(ACD)、食物过敏、以及荨麻疹(假膜性喉头炎)。
术语“活疫苗组合物”、“活疫苗”、“活细菌疫苗”，以及相似术语指一种组合物，其包括提供针对一种疾病、病症、或障碍的至少部分的保护性免疫的活的博代氏杆菌细菌的一种菌株。
术语“口服”、“肠内”、“经肠”、“经口”、“非肠道外”、“非不经肠道”等等，指经由沿着消化道的途径或方式将化合物或组合物给予至个体。组合物经“口服”途径给予的实例包括但不限于经口腔吞咽液体或固体形式的疫苗组合物、经鼻空肠或胃造口管的疫苗组合物给药、疫苗组合物的十二指肠给药、和直肠给药(例如使用释放在此描述的活细菌疫苗菌株的栓剂)。
术语“局部给药”指对皮肤或黏膜的外表面(包括鼻、肺和嘴的表面膜)施用药物试剂，从而该试剂穿过皮肤或黏膜的外表面并进入在下的组织。局部给药会导致该试剂在皮肤和周围组织的有限分配，或者，当该试剂随血液流动从治疗区移走后，会导致该试剂的全身性分布。在一种形式中，该试剂通过经皮递送进行递送，例如，使用透皮贴剂。经皮递送指一种试剂穿过皮肤(角质层和表皮层)进行扩散，皮肤表现为一种使得很少试剂能够穿透的障碍。与此相反，真皮是可渗透的以吸收多种溶解物和药物，为此局部给药更容易透过被擦伤或以其他方式剥落表皮露出真皮的皮肤。经完整皮肤的吸收可以通过在皮肤施用(称为涂擦的一个过程)之前将活性试剂和油性运载体(例如，乳膏，润肤剂，渗透促进剂等等，描述于例如，雷明顿的医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，现行版，真纳罗(Gennaro)等人编辑)的组合来获得增强。
术语“经鼻给药”指对受试者的鼻通道推进入或以其他方式引入活性成分，从而使其接触鼻腔呼吸上皮，从该处被吸收至体循环的任何形式的给药。鼻腔给药也可包括接触位于鼻腔顶部在中心鼻中隔和各主要鼻通道侧壁之间的嗅觉上皮。直接围绕嗅觉上皮的鼻腔区域无气流。因此，典型地必须采用特殊方法来达到透过嗅觉上皮的显著吸收。
术语“气雾剂”按其常规含义使用，指非常精细的液体或固体颗粒，在压力下由气体推进剂携带至治疗施用的位点。一种药物气雾剂可包含可溶解、悬浮、或乳化于流体载体和推进剂的一种混合物中的治疗活性化合物。该气雾剂可以处于溶液、悬浮液、乳液、粉末、或半固体制剂的形式。气雾剂旨在作为精细的、固体的颗粒或作为液雾经由患者的呼吸道进行给药。可使用各种类型的推进剂，包括但不限于，烃类或其他合适的气体。气雾剂也可通过喷雾器进行递送，其在气体中产生基本上均勻大小的非常精细的液体颗粒。包含该活性化合物的液体被分散为液滴，其可以被气流携带出喷雾器并进入患者的呼吸道。
术语“改善”指在治疗一种疾病状态(例如变应性疾病状态)中得到的任何治疗上有益的结果，包括预防、减轻其严重度或进程、缓解或治愈。
一般而言，术语“耐受良好的”指不存在由治疗导致的会影响治疗决定的健康状况的负面变化。
“协同作用”指一种相互作用，其中两种或更多种试剂的组合效果大于其各自效果的代数和。
术语“体外”指离开活体有机体生长(例如生长于组织培养物中)的活细胞中发生的过程。
术语“体内”指在活体有机体内发生的过程。
术语“足够的量”指足以产生所希望效果的一个量，例如足以引起细胞中蛋白聚集的一个量。
术语“治疗上有效量”是有效改善疾病症状的一个量。鉴于预防可被认为是治疗，治疗上有效量可以是“预防上有效量”。
应理解，本发明的各方面不限于特定方法、试剂、化合物、组合物、试剂盒、或生物系统，当然其可以变化。还应理解在此使用术语的目的仅在于描述特定方面，并不意味着限制。
如在此说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”以及“该”包括复数的指示物，除非内容中清楚地另外指明。因此，例如，提及“一种疫苗”包括两种或更多种疫苗的组合等等。
组合物
博代氏杆菌菌株
此处提供了一种突变的博代氏杆菌菌株，其可被用作免疫原性组合物或疫苗以在哺乳动物中引起免疫反应。在一个方面，该突变的博代氏杆菌菌株包含突变的ptx基因、缺失或突变的dnt基因、和异源ampG基因。异源ampG基因产物能够大量降低产生的气管细胞毒素的量。在一个方面，该菌株是BPZE1。进行突变的初始菌株可以是任何博代氏杆菌菌株，包括百日咳博代氏杆菌、副百日咳博代氏杆菌和支气管炎博代氏杆菌。在一个方面，用以得到该突变的博代氏杆菌菌株的初始菌株是百日咳博代氏杆菌。在另一方面，该菌株是三突变的博代氏杆菌菌株。在另一方面，该博代氏杆菌菌株由保藏号CNCM I-3585确定。在另一方面，该博代氏杆菌菌株由保藏号为V09/009169确定。
可以使用的菌株不仅限于上述突变体。其他另外的突变也可以进行，例如腺苷酸环化酶(AC)缺陷型突变体、脂多糖(LPS)缺陷型突变体、丝状血凝素(FHA)以及任何bvg调节元件。
一种突变博代氏杆菌菌株的构建可以始于用一种异源ampG基因替换该菌株中的博代氏杆菌ampG基因。可以使用本领域已知的任何异源ampG基因。这些的实例可以包括每代向培养基中释放非常少量的肽聚糖片段的所有革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌的实例包括但不限于：大肠杆菌、沙门菌属、肠杆菌科、假单胞菌属、莫拉氏菌属、螺杆菌属、寡养单胞菌属、军团杆菌属等等。典型地，通过用一种异源ampG基因替换该菌株中的博代氏杆菌ampG基因，得到的菌株中产生气管细胞毒素(TCT)的量表现出少于1％的残留TCT活性。在另一方面，由得到的菌株表达的TCT毒素的量是在约0.6％至1％的残留TCT活性或约0.4％至3％的残留TCT活性或约0.3％至5％的残留TCT活性之间。
PTX是导致全身性百日咳博代氏杆菌感染的主要的致病因子，也是一种主要的保护性抗原。因为这些特性，天然的Ptx基因可以被突变的版本替换，从而酶活性部分Sl编码酶失活的毒素，但是该百日咳毒素的免疫特性不受影响。这可以通过用赖氨酸(Lys)(R9K)替换该序列第9位的精氨酸(Arg)来实现。此外，可以用甘氨酸(Gly)(E129G)替换第129位的谷氨酸(Glu)。一般这些氨基酸位点分别参与底物结合和催化。在其他方面，还可以进行其他突变，例如描述于美国专利号6,713,072中的那些，在此结合作为参考，以及任何已知的或其他能够降低毒素活性的突变。在一个方面，可以首先使用等位基因交换以删除Ptx操纵子，并且然后插入突变的版本。
在另一方面，可以使用等位基因交换以将dnt基因从该博代氏杆菌菌株中移除。除了全部移除外，酶活性也可以通过点突变来进行抑制。由于DNT由N端区域的受体结合域以及C端部分的催化域构成，因此对dnt基因进行点突变，将Cys-1305替换为Ala-1305会抑制DNT的酶活性(樫本(Kashimoto)T.，片平(Katahira)J，科尔内霍(Cornejo)WR，增田(Masuda)M，福王山(Fukuoh)A，松泽(Matsuzawa)T，大西(Ohnishi)T，堀口(Horiguchi)Y.(1999)功能域的博代氏杆菌属表皮坏死毒素的识别(Identification of functionaldomains of Bordetella dermonecrotizing toxin).传染与免疫(Infect.Immun.)67：3727-32.)。
除了等位基因交换以插入突变的ptx基因和受抑制或缺失的dnt基因外，基因的开放阅读框可以通过插入基因序列或质粒来进行打断。这一方法也被考虑到。产生突变体菌株的其他方法一般是本领域公知的。
在一个方面，该突变的菌株被称为BPZEl菌株，并已于2006年3月9日按照布达佩斯条约保藏于法国巴黎的国家微生物菌种保藏中心(CNCM)，并分配编号CNCM I-3585。引入BPZEl的突变一般导致减毒，但是仍然允许细菌拓殖和持续。因此，在另一方面，BPZE1在给药至对其有需要的哺乳动物时可诱导黏膜免疫和全身免疫。在另一方面，构建了表达三拷贝M2e多肽的BPZEl重组菌株。该菌株已于2009年4月27日按照布达佩斯条约保藏于澳大利亚3207维多利亚州墨尔本港的国家测量研究院(National Measurement Institute，之前的AGAL)，并分配以下保藏号V09/009169。M2e是流感病毒M2蛋白的胞外部分。它在所有甲型流感病毒中都高度保守，并已显示它会诱导对甲型流感病毒的抗体介导的保护。重组的产M2e的BPZEl菌株能够引发(例如，在活细菌的经鼻给药时)大量抗-M2e抗体反应(局部和全身)，从而相对于单独的BPZEl细菌而言允许对H1N1和H3N2激发的显著保护。
这些突变的博代氏杆菌菌株可被用在用于治疗或预防变应性疾病的免疫原性组合物中。这类免疫原性组合物有用于在哺乳动物中产生免疫反应，或是抗体反应或是T细胞反应。例如，该T细胞反应可以是保护哺乳动物免受变应性疾病或免受其后果/症状这样的。
这些突变博代氏杆菌菌株可在疫苗或免疫原性组合物中作为活菌株使用。在一个方面，这些活菌株被用于经鼻给药，而化学或热法杀死的菌株可用于全身或黏膜给药。在其他方面这些菌株是减毒的。
在其他方面，这些菌株除了上述的异源ampG基因以外不包括其他任何异源基因。再在其他方面，该菌株不包括异源的表达平台(参见，例如WO2007104451，通过引用而结合)。典型地，异源表达平台携带异源抗原。在一个方面，异源表达平台可用于递送异源抗原至哺乳动物的呼吸道黏膜。
配制品和载体
还考虑到了用于治疗或预防变应性疾病的方法。所述方法可包括给予治疗上有效量的此处所披露的组合物。该组合物可被配制为药物组合物。除了一种或多种的这些菌株外，这些组合物还可以包括药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂，或其他本领域技术人员熟知的材料。这类材料典型地应该是无毒的，并且典型地不应当干扰活性成分的疗效。该载体或其他材料的确切性质可以取决于给药途径，例如，口服、静脉内、皮肤或皮下、经鼻、肌肉内、或腹膜内途径。
组合物可包括一种药学上合适的赋形剂、运载体、和/或载体。组合物可被配制为一种液体悬浮液、一种气雾剂、或一种粉末。
口服给药的药物组合物可以是药片、胶囊、粉末或液体形式。药片可包括固体载体例如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包括液体载体例如水、石油、动物或植物油、矿物油、或合成油。还可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他多糖溶液或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在病痛部位注射，该活性成分将以肠道外可接受的水溶液的形式，其不含热原并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗运载体来制备合适的溶液，例如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's Injection)、或乳酸林格氏注射液(Lactated Ringer's Injection)。根据需要可包括防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。
给药能以“治疗上有效量”或“预防上有效量”(根据可能的情况，尽管预防可以被认为是治疗)，其足以对个体显示出益处。实际给药的量以及给药的速率和时程将会取决于正在治疗的疾病的性质和严重度。治疗处方，例如对于剂量等的决定，是在全科医生和其他医师的责任之内，并且典型地要考虑待治疗的障碍、患者个体的状况、递送位点、给药方法和医生知晓的其他因素。上述技术和方案的实例可以在最新版的雷明顿的医药科学(Remington’s Pharmaceutical Science)，马克出版公司(Mack Publishing Company)，伊斯顿，PA(“雷明顿的(Remington's)”)中找到。
典型地，组合物可单独给药，或者与其他治疗组合给药，根据待治疗的病症可以同时给药也可以相继给药。
佐剂
组合物可连同包括佐剂的其他免疫调节剂给药。在此使用的术语“佐剂”指一种增强免疫反应的化合物或混合物。特别的，组合物可以包括佐剂。佐剂可包括但不限于以下提出的一种或多种：
含矿物佐剂组合物
适合于用作佐剂的含矿物组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。这些佐剂包括矿物盐例如氢氧化物(例如，羟基氧化物基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等等(例如，参见疫苗设计(Vaccine Design).(1995)，鲍威尔&纽曼(Powell&Newman)编辑，ISBN：030644867X.普莱纽姆(Plenum.)的第8&9章)，或不同矿物化合物的混合物(例如，一种磷酸盐和一种氢氧化物佐剂的混合物，可任选地该磷酸盐过量)，这些化合物具有任何合适的形式(例如，凝胶、晶体、无定形等等)，且考虑了被吸附至该一种或多种盐。含矿物组合物也可配制为金属盐的颗粒(WO/0023105)。
组合物中可以包括铝盐，以致Al3 +的剂量在0.2和1.0mg/剂之间。
油-乳液佐剂
适合于用作佐剂的油-乳液组合物可以包括鲨烯-水乳液，例如MF59(5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85，使用微射流机配制成亚微米颗粒)。参见，例如，WO90/14837。还参见，泊哒(Podda)，“新型佐剂辅助的流感疫苗：MF59-辅助的疫苗的体验(Theadjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants:experience with the MF59-adjuvanted vaccine)”，疫苗(Vaccine)19：2673-2680,2001。
在其他相关方面，用于在组合物中使用的佐剂为亚微米水包油乳液。用于在此使用的亚微米水包油乳液的实例包括鲨烯/水乳液，其可任选地包含变化量的MTP-PE，例如包含4-5％w/v鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、和/或0.25-1.0％Span 85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、以及可任选的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-s-n-丙三基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳液，例如，被称为“MF59”的亚微米水包油乳液(国际公开号WO90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325，通过引用以其整体结合在此；和Ott等人，“MF59--设计和评价一种针对人类疫苗的安全和有效的佐剂(MF59--Design andEvaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines)”于疫苗设计：亚单元和辅助方法(Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach)(鲍威尔(Powell)，M.F.和纽曼(Newman)，M.J.编辑)普莱纽姆出版社(Plenum Press)，纽约，1995，第277-296页)。MF59可包含4-5％w/v鲨烯(例如，4.3％)、0.25-0.5％w/v吐温80、和0.5％w/v Span 85以及可任选地包含不同量的MTP-PE，使用例如模式110Y微射流机(微流体，牛顿，MA)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE可以以约0-500μg/剂、或0-250μg/剂、或0-100μg/剂的量存在。
用于在组合物中使用的亚微米水包油乳液、制备该乳液以及免疫刺激剂(例如胞壁肽)的方法详细描述于国际公开号WO90/14837和美国专利号6,299,884和6,451,325，通过引用以其整体结合在此。
完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可用作佐剂。
皂素佐剂配制品
皂素配制品也可用作佐剂。皂素是甾醇糖苷和三萜糖苷的异源组，发现于范围广泛的植物种类的皮、叶、茎、根和甚至花。来自皂树(Quillaia saponaria Molina)皮的皂素被作为佐剂广泛研究。皂素也可以商购自墨西哥菝葜(Smilax ornata)、满天星(Gypsophilla paniculata)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂素佐剂配制品可以包括纯化的配制品，例如QS21，以及脂质配制品，例如免疫刺激复合物(ISCOM；见下文)。
已经使用高效薄层色谱(HPLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对皂素组合物进行了纯化。使用这些技术的特定纯化组分已被鉴别，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。生产QS21的方法公开于美国专利号5,057,540。皂素配制品也可包括甾醇，例如胆固醇(参见WO96/33739)。
皂素和胆固醇的组合可用于形成独特的颗粒，称为ISCOM。ISCOM典型地还包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知皂素均可被用于ISCOM。例如，ISCOM可以包括一种或多种的奎尔(Quil)A、QHA和QHC。ISCOM进一步描述于EP0109942、WO96/11711和WO96/33739。可选地，ISCOM可以缺乏另外的去垢剂。参见WO00/07621。
对于基于皂素的佐剂的研发的描述可以见于巴尔(Barr)等人，“(ISCOM和其他基于皂素的佐剂)ISCOMs and other saponin based adjuvants”，先进药物递送评论(Advanced Drug Delivery Reviews)32：247-27,1998。还参见斯尤兰德(Sjolander)等人，“口服递送的皂素和ISCOM疫苗的吸收和辅助活性(Uptake and adjuvant activity oforally delivered saponin and ISCOM vaccines)”，先进药物递送评论(Advanced DrugDelivery Reviews)32：321-338,1998。
病毒体和病毒样颗粒(VLP)
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作佐剂。这些结构一般包含来自病毒的一种或多种蛋白质，可任选地与磷脂进行组合或配制。它们一般是非病原的、非复制的并且一般不包含任何原生(native)病毒基因组。病毒蛋白质可以重组生产或从整个病毒中分离。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白质包括衍生自流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白质)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、轮状病毒、口蹄疫疾病病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒(Norwalk virus)、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、QB-噬菌体(例如外被蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体、和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白质pl)的蛋白质。
细菌或微生物衍生物
佐剂可包括细菌或微生物衍生物，例如：
(1)肠道菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物
这类衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-去酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是带有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰脂质A的混合物。“小颗粒”形式的3脱-O-酰化单磷酰脂质A的一个实例披露于EP 0 689 454中。这类“小颗粒”的3dMPL足够小以通过0.22微米膜进行无菌过滤(参见EP 0 689 454)。其他无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如RC-529。参见约翰逊(Johnson)等人，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg Med Chem Lett)9:2273-2278,1999。
(2)脂质A衍生物
脂质A衍生物可包括来自大肠杆菌的脂质A的衍生物，例如OM-174。OM-174描述于例如世珂缔(Meraldi)等人，“OM-174，具有潜力用于人类使用的一种新佐剂，以给予来自伯氏疟原虫的环子孢子蛋白的合成C端片段242-310诱导保护性反应(OM-174,a NewAdjuvant with a Potential for Human Use,Induces a Protective Response withAdministered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310from thecircumsporozoite protein of Plasmodium berghei)”，疫苗(Vaccine)21：2485-2491,2003；以及Pajak等人，“佐剂OM-174包括鼠树突细胞的体内迁移与成熟”(The AdjuvantOM-174induces both the migration and maturation of murine dendritic cells invivo)，疫苗(Vaccine)21：836-842,2003。
(3)免疫刺激寡核苷酸
适合用作佐剂的免疫刺激寡核苷酸可包括包括CpG基序的核苷酸序列(包含未甲基化胞嘧啶、随后是鸟嘌呤核苷并经磷酸键连接的序列)。也已显示细菌双链RNA或包含回文或聚(dG)序列的寡核苷酸是免疫刺激的。
该CpG的可包括核苷酸修饰/类似物例如硫代磷酸修饰，并可以是双链或单链的。可选地，该鸟嘌呤核苷可以被替换为一种类似物例如2'-脱氧-7-脱氮杂鸟嘌呤核苷(2'-deoxy-7-deazaguanosine)。参见坎狄马拉(Kandimalla)等人，“分叉的合成核苷酸基序识别模式：有效的具有不同的细胞因子诱导谱的免疫调节寡脱氧核苷酸试剂的设计和开发(Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern:design anddevelopment of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents withdistinct cytokine induction profiles)”，核酸研究(Nucleic Acids Research)31：2393-2400,2003；WO02/26757和WO99/62923中类似物取代的实例。CpG寡核苷酸的佐剂效果进一步在以下中讨论：克里格(Krieg),“CpG基序：细菌提取物中的活性成分(CpG motifs:the active ingredient in bacterial extracts？)”自然医学(Nature Medicine)(2003)9(7):831-835；马克卢萨卡(McCluskie)等人，“小鼠的肠外和粘膜免疫加强免疫策略与乙型肝炎表面抗原和CpG DNA(Parenteral and mucosal prime-boost immunizationstrategies in mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA)”，FEMS免疫学和医学微生物学(FEMS Immunology and Medical Microbiology)(2002)32:179-185；WO98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199。
CpG序列可以针对Toll样受体(TLR9)，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见坎狄马拉(Kandimalla)等人，“toll样受体9：由新型合成CpG DNA进行的识别和细胞因子诱导修饰(Toll-like receptor 9:modulation of recognition and cytokine induction bynovel synthetic CpG DNAs)”，生物化学会汇刊(Biochemical Society Transactions)(2003)31(第3部分):654-658。该CpG序列对于诱导Th1免疫反应可以是特异的，例如CpG-AODN，或者它对于诱导B细胞反应可以是更特异的，例如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN讨论于以下：布莱克威尔(Blackwell)等人，“CpG-A诱导的单核细胞IFN-γ-可诱导蛋白-10生产是由浆细胞样树突状细胞衍生的IFN-α”，免疫学杂志(J.Immunol.)1704061-4068,2003；克里格(Krieg)，“在CpG上从A至Z(From A to Z on CpG)”，免疫学趋势(TRENDS inImmunology)23：64-65,2002和WO01/95935。
在一些方面，该CpG寡核苷酸可被构建为其5'末端可被受体识别。可选地，两种CpG寡核苷酸序列可在其3'末端被连接以形成“免疫体”。参见，例如坎狄马拉(Kandimalla)等人，“CpG寡核苷酸中的二级结构影响免疫刺激活性(Secondary structures in CpGoligonucleotides affect immunostimulatory activity)”，BBRC 306:948-95,2003；坎狄马拉(Kandimalla)等人，“toll样受体9：由新型合成GpG DNA进行的识别和细胞因子诱导修饰(Toll-like receptor 9:modulation of recognition and cytokine induction bynovel synthetic GpG DNAs)”，生物化学会汇刊(Biochemical Society Transactions)31:664-658,2003；巴加特(Bhagat)，“CpG五和六脱氧核糖核甘酸作为有效的免疫刺激剂(CpG penta-and hexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents)”BBRC 300:853-861,2003，以及WO03/035836。
(4)ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可被用作佐剂。例如，毒素可以衍生自大肠杆菌(即大肠杆菌不耐热肠毒素(LT))、霍乱(CT)、或百日咳(PTX)。脱毒ADP-核糖基化毒素作为黏膜佐剂的应用描述于WO95/17211，并且作为肠道外佐剂描述于WO98/42375。在一些方面，佐剂可以是一种脱毒LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72，作为佐剂的应用可以在以下文献中发现，通过引用以其全文将每个文献特别结合在此：贝尼翁(Beignon)等人，“大肠杆菌不耐热肠毒素的LTR72突变体增强了肽抗原在联合施用到裸露的皮肤之后引起CD4+T细胞和分泌γ干扰素的能力(The LTR72Mutant of Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coliEnahnces the Ability of Peptide Antigens to Elicit CD4+T Cells and SecreteGamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin)”，感染与免疫(Infectionand Immunity)70：3012-3019,2002；皮扎(Pizza)等人，“粘膜疫苗：LT和CT的无毒衍生物作为粘膜佐剂(Mucosal vaccines:non toxic derivatives of LT and CT as mucosaladjuvants)”，疫苗(Vaccine)19:2534-2541,2001；皮扎(Pizza)等人，“LTK63和LTR72，进入临床试验的两种粘膜佐剂(LTK63and LTR72,two mucosal adjuvants ready forclinical trials)”国际医学微生物学杂志(Int.J.Med.Microbiol)290:455-461,2003；思卡顿-克斯登(Scharton-Kersten)等人“用细菌ADP-核糖基化外毒素、亚基和不相关的佐剂经皮免疫(Transcutaneous Imrnunization with Bacterial ADP-RibosylatingExotoxins,Subunits and Unrelated Adjuvants)”，感染与免疫(Infection andImmunity)68：5306-5313,2000；赖安(Ryan)等人“大肠杆菌不耐热肠毒素的突变体作为用于百日咳疫苗鼻腔递送的有效的粘膜佐剂：对无毒AB复合体和对Th1和Th2细胞的酶活性的差别效应(Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act as EffectiveMucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Acellular Pertussis Vaccine:Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Th1andTh2Cells)”感染与免疫(Infection and Immunity)67:6270-6280,2003；帕蒂多斯(Partidos)等人“大肠杆菌的不耐热肠毒素和它的位点定向突变体LTK63增强了对鼻内联合免疫的合成肽的扩散的和细胞毒性的T细胞反应(Heat-labile enterotoxin ofEscherichia coli and its site-directed mutant LTK63enhance the proliferativeand cytotoxic T-cell responses to intranasally co-immunized syntheticpeptides)”，免疫学通讯(Immunol.Lett.)67:09-216,1999；Peppoloni等人“大肠杆菌不耐热肠毒素的突变体作为用于疫苗鼻内递送的安全的和强劲佐剂(Mutants of theEscherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strong adjuvants forintranasal delivery of vaccines)”，疫苗(Vaccines)2:285-293,2003；以及派因(Pine)等人(2002)“用流感疫苗和来自大肠杆菌的不耐热肠毒素的去毒突变体(LTK63)鼻内免疫(Intranasal immunization with influenza vaccine and a detoxified mutant ofheat labile enterotoxin from Escherichia coli(LTK63))”控制释放杂志(J.ControlRelease)85:263-270,2002。针对氨基酸取代的数字基准可基于ADP-核糖化毒素的A和B亚基的比对，这提出于道门尼格伊尼(Domenighini)等人，分子微生物学(Mol.Microbiol)15:1165-1167,1995，通过引用以其全文特别结合在此。
生物粘附剂和黏膜粘附剂
生物粘附剂和黏膜粘附剂也可用作佐剂。合适的生物粘附剂可包括酯化的透明质酸微球(辛格(Singh)等人，控制释放杂志(J.Cont.Rele.)70：267-276,2001)或黏膜粘附剂，例如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、聚糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可用作佐剂。参见，例如，WO99/27960。
佐剂微颗粒
微颗粒也可用作佐剂。设想了形成自生物可降解和/或无毒材料(例如，聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等等)、具有聚(丙交酯-共-乙交酯)的微颗粒(即，颗粒直径约100nm至约150μm、或直径200nm至约30μm、或直径约500nm至约10μm)，可选地将其处理为具有负电荷表面(例如，用SDS处理)或正电荷表面(例如，用阳离子去垢剂，例如CTAB处理)。
佐剂脂质体
适合用作佐剂的脂质体配制品的实例参见美国专利号6,090,406、美国专利号5,916,588和EP 0 626 169。
I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯配制品
佐剂还可包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。WO99/52549。这类配制品可进一步包括与辛基酚聚醚的组合的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(WO01/21207)以及与至少一种另外的非离子表面活性剂例如辛基酚聚醚的组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)。
在一些方面，聚氧乙烯醚可包括：聚氧乙烯-9-十二烷基醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-十二烷基醚、聚氧乙烯-35-十二烷基醚、或聚氧乙烯-23-十二烷基醚。
聚磷腈(PCPP)
用作佐剂的PCPP配制品描述于，例如，安德里昂诺夫(Andrianov)等人，“通过水性聚磷腈溶液的团聚制备水凝胶微球(Preparation of hydrogel microspheres bycoacervation of aqueous polyphophazene solutions)”，生物材料(Biomaterials)19：109-115,1998，以及佩恩(Payne)等人，“从聚磷腈矩阵进行的蛋白释放(Protein Releasefrom Polyphosphazene Matrices)”，先进药物递送评论(Adv.Drug.Delivery Review)31：185-196,1998。
胞壁肽
适合用作佐剂的胞壁肽的实例可包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰(normuramyl)-1-丙氨酰-d-异谷酰胺(nor-MDP)、和N-乙酰胞壁酰-1-丙氨酰-d-异谷酰-1-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰-s-n-甘油-3-羟基磷磷酰基氧基)-乙胺MTP-PE)。
咪唑并喹啉酮化合物
适合用作佐剂的咪唑并喹啉酮化合物的实例可包括咪喹莫特及其同系物，进一步描述于斯坦利(Stanley)，“咪喹莫特和咪唑并喹啉酮：作用机制和治疗潜力(Imiquimodand the imidazoquinolones:mechanism of action and therapeutic potential)”，临床实验皮肤病学(Clin Exp Dermatol)27：571-577,2002和琼斯(Jones)，“瑞喹莫德3M(Resiquimod 3M)”，药物调研新见(Curr Opin Investig Drugs)4:214-218,2003。
人免疫调节剂
适合用作佐剂的人免疫调节剂可包括细胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等等)、干扰素(例如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
佐剂组合
佐剂还可包括一种或多种以上确定的佐剂的方面的组合。例如，佐剂组合物可包括：
(1)一种皂素和水包油乳液(WO99/11241)；
(2)一种皂素(例如，QS21)+无毒LPS衍生物(例如，3dMPL)(参见WO94/00153)；
(3)一种皂素(例如，QS21)+无毒LPS衍生物(例如，3dMPL)+一种胆固醇；
(4)一种皂素(例如，QS21)+3dMPL+IL-12(可任选地+一种甾醇)(WO98/57659)；
(5)将3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液进行组合(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；
(6)SAF，包含10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普流尼克(pluronic)嵌段共聚物L121和thr-MDP，将其或者进行微流乳化成亚微米乳液，或者漩涡以产生较大颗粒尺寸的乳液。
(7)Ribi佐剂系统(RAS)(Ribi免疫化学)，包含2％鲨烯，0.2％吐温80，和选自下组的一种或多种细菌细胞壁组分,该组由以下各项组成:单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，例如MPL+CWS(排毒(Detox))；和
(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的一种无毒衍生物(例如3dPML)。
铝盐和MF59是与可注射的疫苗一起使用的佐剂的实例。细菌毒素和生物粘附剂是与黏膜递送疫苗(例如鼻腔疫苗)一起使用的佐剂的实例。所有上述佐剂以及本领域普通技术人员公知的其他佐剂都可以使用本领域熟知的技术进行配制用于鼻内给药。
方法
给药途径
组合物一般直接给药至哺乳动物。直接递送可以通过肠道外注射进行(例如，皮下、腹膜内、皮内，静脉内、肌肉内、或给药至组织间隙)，或黏膜给药，例如通过直肠、口服(例如，药片、喷雾)、阴道、局部、经皮(参见例如，WO99/27961)或透过皮肤(参见例如，WO02/074244和WO02/064162)、吸入、鼻内(参见例如，WO03/028760)、眼睛、耳、肺部或其他黏膜给药。组合物也可以通过直接转移到皮肤表面进行局部用药。局部给药可以不用任何设备进行，或通过使用绷带或类似绷带的设备将该组合物接触裸露的皮肤来进行(参见，例如，美国专利号6,348,450)。在一些方面，组合物可以经由受试者的鼻(例如鼻内地)或经由吸入来给药。
在一些方面，给药的方式是肠道外、黏膜、或黏膜和肠道外免疫的组合。在其他方面，给药的方式是间隔1-3周共1-2次接种疫苗的肠道外、黏膜、或黏膜和肠道外免疫的组合。在相关的方面，给药途径包括但不限于鼻内给药。
给药程序和剂量
给药可包括向哺乳动物给予一种突变的博代氏杆菌菌株以引发能够影响变应性疾病(例如哮喘或皮肤炎症)的免疫反应(例如，THl免疫反应)。突变博代氏杆菌菌株的实例如上所述。典型地，该突变的博代氏杆菌菌株的给药是通过针对过敏反应的保护性免疫而用于治疗或预防哺乳动物(例如人)的变应性疾病。在一些方面，该突变的博代氏杆菌菌株给药是通过在诊断变应性疾病或变应性疾病症状发展或变应性疾病发展之前给药而用以预防变应性疾病。典型地，该突变的博代氏杆菌菌株在变应性疾病发展前约少于1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或更多周被给予至哺乳动物。
在一个方面，用于治疗或预防变应性疾病的方法包括给予对其有需要的受试者单剂的一种组合物，例如，BPZEl。在相关方面，给药步骤是黏膜地(例如，鼻内地)进行的。
在一些方面，组合物是以一剂给予的。在其他方面，组合物是以多于一剂(例如两剂)给予的。在一些方面，组合物是以1、2、3、4、或大于4剂给予的。剂的数目可根据需要进行变化，例如对哺乳动物给药的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多剂。在一个方面，用于治疗或预防变应性疾病的方法包括对有需求的受试者给予一种第一免疫原性组合物(包括例如，BPZE1)，继而给予一种第二免疫原性组合物(包括例如，BPZE1)。典型地，组合物的每剂之间的时间范围可以是约1-6天，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或更多周。在相关方面，每剂之间的时间范围是约3周。在其他方面，可以采用诱发-加强式方法，其中组合物可以以“诱发(priming)”步骤递送，并且随后组合物以“加强”步骤递送。
组合物典型地可被用于引发全身和/或黏膜免疫，例如引发增强的全身和/或黏膜免疫。例如，可以通过血清IgG的诱导和/或肠IgA免疫反应来表征该免疫反应。典型地，对变应性疾病的保护水平可以超过50％，例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多。在一个方面，保护水平可以是100％。在其他方面，保护水平低于50％，例如20％。在其他方面，对每个剂量中的细菌数量进行调节以在哺乳动物中实现有效的免疫反应。每个剂量中的细菌数量或菌落形成单位(cfu)可以是约1、10、100、1000、10000、100000、1000000、5×106、或更多或所述各剂量之间的任何剂量。在一些方面，一个剂量或一系列的剂量中的CFU的数量可以是少于106、106、107、108、109、1010，大于1010，或从约106至约1010的集落形成单位(CFU)。
在其他方面，给予组合物还可包括该组合物与另一种试剂或多种试剂的共同给药。典型地不同组合物/试剂可以按照任何顺序进行递送。因此，在递送多种不同的组合物或试剂的各方面中，该突变的博代氏杆菌菌株不需要都在试剂(例如药物、siRNA、miRNA、免疫原性肽或能够影响变应性疾病的小分子)前进行递送。其他试剂的实例包括神经氨酸苷酶抑制剂和M2抑制剂(金刚烷)。例如，诱发步骤可包括递送一种或多种试剂，加强步骤可包括递送一种或多种突变的博代氏杆菌菌株。在其他方面，突变的博代氏杆菌菌株的多次给药可以在试剂的多次给药后进行。可以按照任何顺序进行给药。因此，此处所述的一种或多种突变的博代氏杆菌菌株和一种或多种试剂可以按照任何顺序以及任何本领域已知的给药途径来进行共同给药，例如以引发免疫反应。
剂量治疗可按照单剂计划或多剂计划。例如，多剂可被用于初次免疫计划和/或加强免疫计划。在多剂计划中，不同各剂可以通过相同或不同的途径进行给药，例如，肠道外诱发和黏膜加强、黏膜诱发和肠道外加强等等。在其他方面，剂量控制可以增强抗体反应的活动性，导致具有中和性质的抗体。体外中和测定可用于检测中和抗体(参见例如浅中(Asanaka)等人，病毒学杂志(J Virology)102:10327,2005；沃步思(Wobus)等人，PLOS生物学(PLOS Biology)2；e432；以及达贝克提(Dubekti)等人，医学病毒学杂志(J MedicalVirology)66：400)。
用于测定免疫反应疗效或存在的测试
评价治疗性治疗的疗效的一种途径涉及在组合物给药后对感染进行监测。评价预防性治疗疗效的一种途径涉及在组合物给药后对针对组合物中的抗原的免疫反应进行监测。另一种评价该组合物的免疫原性的途径是分离蛋白质或蛋白质混合物并通过免疫印迹筛选患者血清或黏膜分泌物。蛋白质和患者血清之间的阳性反应表明患者之前已经对该组合物产生了免疫反应。
检验治疗性治疗的疗效的另一种途径涉及在组合物给药后对感染进行监控。检验预防性治疗的疗效的一种途径涉及在组合物给药后对针对组合物中抗原的全身性(例如监控IgG1和IgG2a的生产水平)和黏膜性(例如监控IgA的生产水平)的免疫反应进行监控。典型地，在免疫后但激发前检测血清特异性抗体反应，而在免疫后和激发后检测黏膜特异性抗体反应。这些免疫原性组合物可以在对宿主(例如人)给药前在体外和体内动物模型中进行评价。
组合物的疗效也可以通过用这些组合物激发例如小鼠的感染动物模型进行体内检测。这些组合物可以衍生自与激发菌株相同的菌株，或可以不衍生自与激发菌株相同的菌株。体内疗效模型可包括但不限于：(i)使用人菌株的鼠类感染模型；(ii)鼠类疾病模型，其为使用小鼠适应性菌株的鼠类模型，例如对小鼠具有特殊毒性的菌株；和(iii)使用人分离物的灵长类模型。
该免疫反应可以是Thl免疫反应和TH2反应的一者或两者。免疫反应可以是改进的或增强的或改变的免疫反应。免疫反应可以是全身性和黏膜性免疫反应的一者或两者。例如，免疫反应可以是增强的全身和/或黏膜反应。增强的全身和/或黏膜免疫反映在增强的TH1和/或TH2免疫反应中。例如，增强的免疫反应可包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA的产生的增加。在另一方面，黏膜免疫反应可以是TH2免疫反应。例如，黏膜免疫反应可包括IgA的产生增加。
典型地，活化的TH2细胞增强抗体的产生，从而在响应胞外感染方面是有价值的。活化的TH2细胞可以典型地分泌IL-4、IL-5、IL-6、和IL-10中的一种或多种。TH2免疫反应也能导致IgGl、IgE、IgA和/或记忆B细胞的产生用于未来的保护。总之，TH2免疫反应可包括以下情况的一种或多种：与TH2免疫反应相关的一种或多种细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的增加，或IgGl、IgE、IgA和记忆B细胞的产生的增加。例如，增强的TH2免疫反应可包括IgGl产生的增加。
THl免疫反应可包括以下情况的一种或多种：CTL的增加、与THl免疫反应相关的一种或多种细胞因子(例如IL-2、IFN-γ和TNF-α)的增加、活化巨噬细胞的增加、NK活性的增加、或IgG2a产生的增加。例如，增强的TH1免疫反应可包括IgG2a产生的增加。
包括此处披露的一种或多种菌株的组合物，特别是免疫原性组合物，可以单独使用或与其他试剂组合使用，可任选的与能够引发Thl和/或Th2反应的免疫调节剂组合使用。
这些组合物能够引发细胞介导的免疫反应连同体液免疫反应以有效地解决变应性疾病。该免疫反应可诱导长期(例如，中和)抗体和在未来能够快速响应的细胞介导的免疫。
受试者和哺乳动物
组合物典型地用于预防或治疗例如人或一种哺乳动物的受试者的变应性疾病。在一些方面，受试者可包括老人(例如，>65岁)、儿童(例如、<5岁)、住院患者、健康工作者、武装服务人员和军人、食品处理人员、孕妇、慢性病患者和出境旅游人群。这些组合物一般适用于这些群组以及一般人群，或以其他方式被医师认为是必要的。
在一些方面，受试者被确定为需要组合物给予。在一些方面,一个受试者被确定为需要经由测定进行组合物给予。在一些方面，该测定可以是一种药理遗传学测试、基于喘息的哮喘预测指数、以及哮喘控制测试(ACT)。在一些方面，有用于鉴定需要组合物给予的受试者的一个测试或测定描述于：吴(Wu)等人，哮喘中的药理遗传学预测测试的发展：概念验证(Development of a Pharmacogenetic Predictive Test in asthma:proof ofconcept.)，药理遗传学基因组学(Pharmacogenet Genomics.)2010年2月，20(2):86-93；卡斯特罗-罗德里格斯(Castro-Rodriguez)JA，哮喘预测指数:预测儿童哮喘的一个非常有用的工具(The Asthma Predictive Index:a very useful tool for predicting asthmain young children)，变态反应与临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol.)2010年8月，126(2):212-6；在2012年10月24日的QualityMetric(质量度量学)的网站上可获得的哮喘控制测试(ACT)；马尔祖利(Marzulli)FN等人，接触性过敏症：对人的预测性测试(Contact allergy:predictive testing in man)，接触性皮炎(Contact Dermatitis.)1976年2月，2(1):1-17；以及图泊克(Tupker)等人，通过无创生物工程方法进行的皮肤过敏的预测(Prediction of Skin Irritation by Noninvasive Bioengineering Methods)，摘要(通过引用以其全文结合于此)。
试剂盒
还提供了包括一种或多种组合物容器的试剂盒。组合物可以是液体形式或冻干的。合适的组合物容器包括，例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料形成，包括玻璃或塑料。容器可以具有无菌的进口端(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有能够被皮下注射针刺破的塞子的小瓶)。
该试剂盒可以进一步包括包含药学上可接受的缓冲液(例如磷酸缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、或右旋糖溶液)的一种第二容器。它也可包含其他对终端用户有用的材料，包括其他药学上可接受的配制溶液例如缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器或其他递送装置。该试剂盒可以进一步包括包含佐剂的一个第三部分。
该试剂盒也可以包括包含用于免疫诱导、预防感染或用于治疗感染的方法的书面指示的包装说明书(package insert)。指示可以是用于进行此处所述的一种或多种方法的指示。该包装说明书可以是未被批准的草拟包装说明书，也可以是被食品与药物管理局(FDA)或其他监察机构批准的包装说明书。
还提供了用这些组合物预填充的递送装置。
这些药物组合物一般配制成无菌和基本等渗的，并完全遵照美国食品与药物管理局的良好操作规范(GMP)规定。
本领域技术人员可以根据之前的描述对这些组合物和方法进行不同的修饰和变化。在此处旨在包括属于附加的权利要求的范围内的所有这类修饰。每个提到的范围都包括该范围的全部的组合和次组合，以及此处包括的特定数字。
虽然为了清晰理解的目的，已通过实例的方式对本发明的前述方面进行了详细描述，但是对于技术人员而言，显然的是某些变化和修饰被本披露所包括，并且可以在附加的权利要求的范围内实施而不必付出过度的实验工作，其是以描述而非限制的方式呈现的。
示例性方面
以下是用于进行本发明的不同方面的具体方面的实例。这些实例仅出于描述性目的提供，而非旨在以任何方式限定本发明的各方面的范围。已经努力保证所使用的数字(例如，数量、温度等等)的精确性，但是无疑应当允许存在一些实验误差和偏差。
本发明的不同方面的实施除非另有说明，否则使用本领域常规的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药学方法。这类技术在文献中得到充分解释。参见，例如，T.E.克赖顿(Creighton)，蛋白质：结构和分子特性(Proteins:Structures and MolecularProperties)(W.H.弗里曼和公司，1993)；A.L.列宁格(Lehninger)，生物化学(Biochemistry)(沃思出版有限公司，现行版)；萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第二版，1989)；酶学方法(MethodsIn Enzymology)(S.克劳威克(Colowick)和N.卡普兰(Kaplan)编辑，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.))；雷明顿的；凯莉(Carey)和桑德博格(Sundberg)先进的有机化学(Advanced Organic Chemistry)第三版(普莱纽姆出版社(Plenum Press))，A和B卷，1992)。
材料与方法
细菌菌株和生长条件
减毒百日咳博代氏杆菌BPZE1是一种链霉素耐受的百日咳博代氏杆菌I衍生物，缺少皮肤坏死毒素，产生灭活百日咳毒素和本底水平的气管细胞毒素(15)。剧毒的百日咳博代氏杆菌BPSM(16)和BPZE1是如上述的进行培养的(1)。
动物实验
雌性BALB/c小鼠(6-8周大)购自保健中心(CARE Centre)(新加坡)。将小鼠维持在独立通风笼具中的无特定病原的条件下。所有动物试验都是被批准的，并是根据新加坡国立大学动物关怀和使用委员会(Animal Care and Use Committee of NationalUniversity of Singapore)设定的机构指南执行的。
减言之，以四周间隔鼻内(in.)给予轻麻醉的小鼠一次或两次5×106集落形成单位(CFU)的如以上所述的活的减毒的BPZE1或BPSM细菌(1)。在一剂BPZE1或BPSM给药六周之后，或在第二剂给药2周之后(第42天)，在完成从肺中清除细菌(数据未显示)之后，如下进行致敏和激发：对于变应性气道炎症模型，卵白蛋白(OVA)致敏由以2周间隔进行的伴随氢氧化铝的0.1ml的200μg/ml OVA的两次腹膜内(ip.)注射组成。OVA气雾剂激发是在如上述持续连续3天的最后的OVA ip.注射液之后一周进行的(17)。阳性对照小鼠鼻内接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)替代细菌，随后OVA致敏和激发。阴性对照小鼠是OVA致敏的但不用PBS激发。
在二硝基氯苯(DNCB)诱导的CHS模型中，将小鼠在它们剃光的背上通过施用50μl的溶解于丙酮和橄榄油(4：1；v/v)的1％w/v DNCB(西格玛公司(Sigma))进行致敏。致敏之后五天(第47天)，在两耳的两侧施用25μl/侧的1％DNCB。将阴性对照小鼠致敏，并用丙酮和橄榄油(4：1；v/v)(无DNCB)进行激发。在激发之后每天使用卡尺监测耳厚度。
支气管肺泡灌洗液体中的细胞浸润
在最后的气雾剂OVA激发(第66天)24小时之后将小鼠安乐死，并如上述地收获支气管肺泡灌洗液(BALF)(17)。将BALF进行离心，并且将上清液储存在-80℃下用于细胞因子检测。将这些细胞颗粒再悬浮，使用细胞离心涂片器设备(热电珊顿(Thermo Shandon))将其印迹至玻片上，并如前所述的使用改进的瑞氏(Wright)染色流程染色(17)。每张片子检测总数为500个细胞。计数是在盲样上进行的。每组单独评估八只小鼠。
抗体和细胞因子检测
如上所述，通过ELISA检测总IgE和OVA特异性IgE、IgG1、以及IgG2a的血清水平(18)。根据制造商的说明书，使用一个定制的多重复细胞因子检测测定(博尔普莱斯(Bioplex)，百奥拉德(Biorad))在BALF上清液(变应性气道炎症模型)或耳匀浆(CHS模型)中进行细胞因子水平测量。在添加具有蛋白酶抑制剂的200μl RIPA缓冲液(西格玛公司)并使用高剪切均化器(欧美妮国际(Omni International))进行机械匀浆化后在冰上制备耳匀浆。在10,000rpm和4℃离心以去除细胞碎片之后，使用Bio-Plex仪器(百奥拉德(Bio-Rad))分析上清液。
体外再刺激试验
制备来自耳淋巴结的单细胞悬浮液，并在96孔圆底板(Nunc)中以2×106细胞/孔接种于100μl RPMI完全培养基(RPMI 640补充以10％FCS，5×10-5Mβ-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，200U/ml青霉素，200μg/ml链霉素)中。用1μg/ml的板结合的抗CD3(cat#553057)和1μg/ml可溶的抗CD28(cat#553294)(BD)再刺激细胞。在24h孵育之后，收获上清液，用于根据制造商的说明书使用小鼠IFN-γELISA
Figure GDA0001112452180000281
检测试剂盒(e生物科学(eBioscience)，圣地亚哥(San Diego)，CA)测量干扰素(IFN)-γ。将这些细胞用20μlRPMI完全培养基中的0.4μCi[3H]胸苷脉冲处理。孵育18小时后，收获细胞，洗涤并在TopCount NXT微板闪烁和萤光计数器(珀金埃尔默(PerkinElmer))中测量并入的放射活性。每个样品分析三个重复。
组织学分析
从安乐死的小鼠收获肺和耳，以在PBS中的4％福尔马林固定，包埋入石蜡，分段，用苏木精和伊红(H&E)染色并以×100和×400放大率在倒置光学显微镜下进行检测。可替代地，用高碘酸-荧光希夫染色(PAFS)对肺切片进行染色并如以上所述针对粘液产生进行检测(19)。
统计分析
除非另有说明，否则误差棒代表平均值±SEM，并且使用双向不成对学生T检验以5％显著性水平在*p≤0.05，**p≤0.01和***p≤0.001处比较平均数。对于DNCB诱导的CHS模型，通过双向ANOVA分析耳厚度数据。显示的值是平均±SEM。
实例1：用BPZE1鼻内预处理提供针对OVA诱导的变应性哮喘的长期保护
向成年BALB/c小鼠鼻内地(in.)给予一次或两次活的BPZE1或PBS。在完成从肺中清除细菌(数据未显示)之后，进行OVA致敏和激发。与致敏但未激发的动物(OVA/盐水)相比之下，在致敏和激发的动物(OVA/OVA)中观察到气道壁炎症，炎性细胞明显浸润进入细支气管周的和血管周的结缔组织中(图1A)。用BPZE1(一或两剂)鼻预处理可见地降低了支气管周的炎症(图1A，c，d，h，i)，而在用剧毒的百日咳博代氏杆菌BPSM预处理的小鼠中观察到增强的病理(图1A，e&f)。PAFS染色显示OVA诱导的粘液分泌过多和杯状细胞增生在BPZE1预处理的小鼠中显著减少，而相对于未处理的激发的动物(OVA/OVA)(图1B)预暴露于剧毒BPSM未导致减少。总之，这些数据表明BPZE1鼻预处理减少了OVA诱导的变应性气道炎症的病理表现，而用它的剧毒的对应物(BPSM)预感染则不会。
实例2：BPZE1预处理抑制OVA诱导的炎性细胞在肺部募集
在对OVA激发24小时后收集的BALF中汇集的炎性细胞进行的检测显示与未激发的(OVA/盐水)组相比，致敏的和受激发的(OVA/OVA)对照动物中总细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数明显增加(图2A)。BPSM预处理的动物显示了与OVA/OVA对照组中测量的那些具有可比性的细胞计数。相比之下，来自BPZE1处理的小鼠的BALF中的总细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数显著减少(图2)，证明BPZE1的经鼻单剂显著抑制OVA诱导的炎性细胞在肺部募集。
实例3：BPZE1预处理降低血清IGE产生
ELISA数据表明与OVA/盐水组相比，在OVA/OVA小鼠中总血清IgE、OVA特异性IgE和OVA特异性IgG1水平明显提高，但OVA特异性IgG2a水平没有(图2B)。用BPSM预处理给出了与OVA/OVA组中测量的那些具有可比性的抗体水平。相比之下，在BPZE1处理的小鼠中总血清和OVA特异性IgE水平被有力地降低，而BPZE1预处理对OVA特异性IgG2a和IgG1的血清水平没有影响(图2B)。因此，用BPZE1鼻内预处理不调节血清OVA特异性IgG反应，但抑制了总的和抗原特异性IgE的产生。
实例4：BPZE1预处理减少了OVA诱导的炎症细胞因子在BALF中的产生
在BALF中测定Th1(IL-1β，IL-2和IFN-γ)以及Th2(IL-4，IL-5，IL-13)细胞因子连同IL-10的水平。如预期的和如前报道的，与盐水气雾剂对照相比，(9,12,20,21)OVA致敏和激发引发了BALF中IL-4，IL-5，IL-13，IL-10，IL-1β，和IL-2水平的显著增加(图3A&B，D-G)，而IFN-γ的水平保持不变(图3C)。BPZE1预处理显著地减少了除了IFN-γ之外的所有测试细胞因子的产生，表明BPZE1预处理影响参与变应性气道炎症的发病机理的主要的Th2和Th1促炎细胞因子的产生。
实例5：BPZE1鼻内预处理抑制DNCB诱导的CHS的进展
在CHS的DNCB诱导的耳肿胀小鼠模型(一种Th1占主导地位的变应性接触性皮炎)中进一步研究BPZE1的抗炎作用。用BPZE1将小鼠鼻内预处理一次或两次，并且在完成从肺中清除细菌之后，将其用DNCB进行致敏和激发。在DNCB激发之后，通过每日测量耳厚度来评估BPZE1预处理对抗耳肿胀的保护性功效。在激发24小时之后，暴露于DNCB导致皮肤厚度的明显增加，该激发持续达4天(图4)。两剂的BPZE1显著地抑制了DNCB激发的小鼠的耳肿胀(图4A)。
对在DNCB激发48小时之后收集的耳皮肤的组织学分析显示在DNCB激发的老鼠中的血管充血和显著肿胀，特征在于组织水肿和明显的炎性浸润(图4B a&b)。对用BPZE1预处理一次的小鼠进行了相似的观察(图4B c)然而，与非BPZE1处理的动物相比，两剂的BPZE1显著地降低了耳肿胀和炎症，其具有减少的水肿和细胞浸润(图4B d)。
实例6：BPZE1预处理下调了由DNCB引起的促炎细胞因子的产生
对来自不同小鼠群组的耳匀浆中的细胞因子谱的检测显示DNCB激发引发了促炎细胞因子IL-1β、IL-2、IL-17、IL-6、TNF-α和IL-4的明显增加(图5)。与通过组织学观察到的炎症和水肿的减少(图4B)相一致，2剂的BPZE1导致测量的所有促炎细胞因子水平的显著降低(图5)。相比之下，所有组的IL-10的水平保持不变(图5)。
实例7：BPZE1预处理不影响致敏阶段
为测试BPZE1预处理是否影响两种炎症模型中的致敏阶段，使BPZE1预处理的和未处理的小鼠经受OVA或DNCB致敏。OVA致敏之后一周，测量OVA特异性抗体反应并且在BPZE1预处理的和未处理的动物两者中都观察到可比的OVA特异性IgE水平和IgG水平(图6)。类似地，DNCB致敏之后3天，收获耳淋巴结，并且在BPZE1预处理的和未处理的动物组两者中都发现在体外再刺激后总细胞计数、T细胞增殖和IFNγ产生是可比的(图6)。因此，这些结果有力地支持了BPZE1预处理不影响致敏阶段，而是影响在激发后被募集的效应细胞。
因此，现有的BPZE1鼻治疗抑制OVA诱导的肺部炎症和炎症细胞募集，并显著降低IgE水平和细胞因子的产生。同样，在DNCB诱导的CHS模型中，BPZE1鼻预治疗明显抑制了耳肿胀、皮肤炎症和促炎细胞因子的产生。对于两种模型，显示BPZE1预处理不影响致敏阶段。激发后，BPZE1预处理选择性地降低了细胞因子(其产生增加)的水平，并不影响到其他细胞因子的基础水平。总之这些观察表明，BPZE1预处理特异性地针对在炎症反应中募集和参与的那些产生细胞因子的效应细胞。
这项研究证明了变应性疾病的背景下减毒百日咳博代氏杆菌BPZE1菌株的广泛的抗炎特性。
所有在此说明书中引用的出版物、专利和专利申请在此均为了所有目的通过引用以其全文结合，就像对每一个这样的出版物或专利文献都具体地并且单独地表明为了所有目的通过引用结合在此一样。
虽然出于清楚理解的目的已经对本发明的上述方面通过说明和实例的方式在一些细节方面进行了描述，但是本领域的普通技术人员在教导的启示下很容易理解可以对其进行某些变化和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。
参考文献
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Claims (27)

1.活的减毒的百日咳博代氏杆菌菌株在制备一种引起免疫反应的能够降低对其有需要的哺乳动物的1型辅助T淋巴细胞(Th1)-占主导地位的变应性皮肤炎症的严重度的药物组合物中的用途，其中该菌株的百日咳毒素(ptx)基因突变、皮肤坏死(dnt)基因缺失或突变、且野生型博代氏杆菌菌株ampG基因被异源的ampG基因替换，并且其中该药物组合物用于给予至哺乳动物的呼吸道，且该给予引起了该免疫反应。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述药物组合物是在该变应性皮肤炎症在该哺乳动物中发作之前鼻内给予的，并且其中该变应性皮肤炎症是变应性接触性皮炎(ACD)。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述药物组合物是在该变应性皮肤炎症在该哺乳动物中发作之前给予的。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述药物组合物是在该变应性皮肤炎症在该哺乳动物中发作之前少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周，或大于12周给予的。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述药物组合物是在该变应性皮肤炎症在该哺乳动物中发作之前6周或更长时间给予的。
6.如权利要求4中所述的用途，其中所述药物组合物是在该变应性皮肤炎症在该哺乳动物中发作之前2周或更长时间给予的。
7.如权利要求1-3和5-6中任一项所述的用途，其中所述药物组合物是在该哺乳动物中检测到该变应性皮肤炎症之前给予的。
8.如权利要求4所述的用途，其中所述药物组合物是在该哺乳动物中检测到该变应性皮肤炎症之前给予的。
9.如权利要求1-3、5-6和8中任一项所述的用途，其中该哺乳动物是通过一种测定被鉴定为对其有需要。
10.如权利要求4所述的用途，其中该哺乳动物是通过一种测定被鉴定为对其有需要。
11.如权利要求7所述的用途，其中该哺乳动物是通过一种测定被鉴定为对其有需要。
12.如权利要求9所述的用途，其中该测定为药理遗传学测试。
13.如权利要求10或11所述的用途，其中该测定为药理遗传学测试。
14.如权利要求1-3、5-6、8和10-12中任一项所述的用途，其中在该活的减毒的百日咳博代氏杆菌菌株中，野生型博代氏杆菌菌株ampG基因被大肠杆菌ampG基因替换。
15.如权利要求4所述的用途，其中在该活的减毒的百日咳博代氏杆菌菌株中，野生型博代氏杆菌菌株ampG基因被大肠杆菌ampG基因替换。
16.如权利要求7所述的用途，其中在该活的减毒的百日咳博代氏杆菌菌株中，野生型博代氏杆菌菌株ampG基因被大肠杆菌ampG基因替换。
17.如权利要求9所述的用途，其中在该活的减毒的百日咳博代氏杆菌菌株中，野生型博代氏杆菌菌株ampG基因被大肠杆菌ampG基因替换。
18.如权利要求13所述的用途，其中在该活的减毒的百日咳博代氏杆菌菌株中，野生型博代氏杆菌菌株ampG基因被大肠杆菌ampG基因替换。
19.如权利要求1-3、5-6、8、10-12和15-18中任一项所述的用途，其中该ptx基因的突变包括对参与底物结合的氨基酸和/或参与催化的氨基酸进行取代。
20.如权利要求4所述的用途，其中该ptx基因的突变包括对参与底物结合的氨基酸和/或参与催化的氨基酸进行取代。
21.如权利要求7所述的用途，其中该ptx基因的突变包括对参与底物结合的氨基酸和/或参与催化的氨基酸进行取代。
22.如权利要求9所述的用途，其中该ptx基因的突变包括对参与底物结合的氨基酸和/或参与催化的氨基酸进行取代。
23.如权利要求13所述的用途，其中该ptx基因的突变包括对参与底物结合的氨基酸和/或参与催化的氨基酸进行取代。
24.如权利要求14所述的用途，其中该ptx基因的突变包括对参与底物结合的氨基酸和/或参与催化的氨基酸进行取代。
25.如权利要求19所述的用途，其中对该参与底物结合的氨基酸的取代包括R9K，并且对该参与催化的氨基酸的取代包括E129G。
26.如权利要求20-24任一项所述的用途，其中对该参与底物结合的氨基酸的取代包括R9K，并且对该参与催化的氨基酸的取代包括E129G。
27.如权利要求1所述的用途，其中该活的减毒的百日咳博代氏杆菌菌株为BPZE1菌株，所述BPZE1菌株以登录号CNCMI-3585保藏于国家微生物菌种保藏中心。
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