CN104292469A - pH敏感的Bola型嵌段物及含该嵌段物的脂质体控释药物载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供式(I)所示pH敏感的Bola型三嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y，该聚合物使脂质体具有较好的结构稳定性及定向释药的特性。本发明还提供含所述聚合物的脂质体控释药物载体，以及所述聚合物和脂质体控释药物载体的制备方法。经Bola型嵌段聚合物修饰的脂质体，随着pH的变化可在病变部位实现靶向性释药，或用于其他领域(化学合成、化妆品等)的定向释药系统。

Description

pH敏感的Bola型嵌段物及含该嵌段物的脂质体控释药物载体

技术领域

本发明属于催化反应工程领域，具体涉及一种合成的含pH敏感的三嵌段聚合物，及其用于pH控释放材料的用途。

背景技术

脂质体是通过磷脂双分子层膜所形成的囊泡，由于生物体细胞膜的基本结构是磷脂双分子层，脂质体具有与生物体细胞相类似的结构，因此有很好的生物相容性而常用作药物载体。

当前，人们对于脂质体作为药物载体应用的研究中，一直致力于如何提高其囊泡的结构稳定性；但是，实际研究中又发现，结构非常稳定的脂质体，又存在着内部药物不释放或释放率低的难题。随着药物制剂的迅速发展，具有无毒、可生物降解、良好的生物相溶性、缓释和控释的药物载体材料逐步引人注目。

基于人体环境的复杂性以及医治癌症疾病的紧迫性，研究出能稳定运载药物、具有靶向作用、且能依据环境释放药物的载体具有重要的意义。人体内环境中，根据其部位或病变部位pH显示出不同的值，例如，在正常组织液体pH为7.4，在肿瘤组织中为6.5～7.2、内涵体或溶酶体为5.0～5.5，因而根据体内中癌细胞病变处和正常体液的不同pH环境，制备出可以根据pH环境响应的材料。

Armes等[G.B.Webber,E.J.Wanless,S.P.Armes and S.Biggs.Tunablediblock copolymer micelles-adapting behaviour via subtle chemical modifica-tions.Faraday Discuss.2005,128,193–209.]合成了PVBA-b-PDMAEMA共聚物，这种共聚物表现出可逆的胶束行为，酸性pH时形成PVBA核-PDMAEMA壳胶束，而在碱性pH时形成PDMAEMA核-PVBA壳胶束。目前已有很多报道这种响应环境自组装形成多重胶束“schizophrenic”嵌段共聚物。Gan等[S.Dai,P.Ravi,K.C.Tam,B.W.Mao and L.H.Gan,NovelpH-Responsive Amphiphilic Diblock Copolymers with Reversible micelliza-tion Properties.Langmuir,2003,19,5175–5177]合成了两性两嵌段共聚物PAA-b-PDMAEMA，该共聚物在pH≈7时形成胶束；由于共聚物中存在弱酸链PAA(pKa＝7.3)及弱碱链PDMAEMA(pKa＝5.4)，聚合物水溶液在低pH(<5.5)时PDMAEMA单元质子化和pH(>9.2)时MAA单元离子化表现出良好的溶解性。但是，在已经开发并获得应用的pH敏感的聚合物中，虽然其相应的pH得到了满足，但其在体内的稳定性、生物靶向性、生物相容性和体内可降解性，依然存在着较大的欠缺，难以满足日益发展的需求。

本课题通过利用pH敏感材料与磷脂通过自组装形成的脂质体，将其作为药物载体，当到达身体特定部位后，利用机体自身pH环境变化来使pH敏感材料发生结构上的变化，使其内包含的药物实现瞬间的靶向释放，从而达到定时、定点、定量的释放药物的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种可用于制备具有pH敏感、稳固脂质体性质的Bola型三嵌段聚合物，使包含该Bola型三嵌段聚合物的脂质体具有较好的结构稳定性和靶向释药性。

本发明还提供了制备上述pH敏感的聚合物的方法。

本发明还提供了含上述pH敏感的嵌段聚合物的脂质体控释药物载体及其制备方法。

本发明选择聚乙二醇单甲醚(mPEG)为生物可降解材料，将聚乙二醇单甲醚(mPEG)与聚N,N-二乙胺基甲基丙烯酸乙酯(PDPA)连接成mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y。

本发明提供的pH敏感的Bola型三嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y，具有如下结构：

其中，n＝15～200  y＝8～226。

在一个优选实施方式中，本发明的三嵌段聚合物中具有pH敏感的聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y中n选自15、20、30、50、100和200，y选自8、12、45、113和226。

在一个优选实施方式中，本发明的三嵌段聚合物中具有pH敏感的聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y包括mPEG₈-PDPA_n-mPEG₈，其中n选自15、20、30、50、100和200。

在一个优选实施方式中，本发明的三嵌段聚合物中具有pH敏感的聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y包括mPEG_y-PDPA₁₅-mPEG_y，其中y选自8、12、45、113和226。

在一个优选实施方式中，本发明的三嵌段聚合物中具有pH敏感的聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y包括mPEG_y-PDPA₃₀-mPEG_y，其中y选自8、12、45、113和226。

在一个优选实施方式中，本发明的三嵌段聚合物中具有pH敏感的聚合物是聚N,N-二乙胺基甲基丙烯酸乙酯(PDPA)，由N,N-二乙胺基甲基丙烯酸乙酯(DPA)在催化剂溴化亚铜(CuBr)、引发剂2,5-二溴己二酸二乙酯的作用下，通过ATRP聚合机理进行反应而制成。

本发明提供的pH敏感的Bola型三嵌段聚合物的制备方法包括如下步骤：

1)在干燥的有机溶剂中，在引发剂和催化剂存在下，将单体DPA和配体PMDETA或bpy进行原子自由基聚合，合成聚合物PDPA_n；

2)在干燥的有机溶剂中，在活化物质氢化钠存在下，干燥的mPEG_y与PDPA_n反应，产物经柱层析分离后，在冷冻甲醇中沉降、干燥，得到三嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y。

较优选地，有机溶剂为四氢呋喃；较优选地，引发剂为2,5-二溴己二酸二乙酯；较优选地，催化剂为CuBr。

较优选地，柱层析分离为中性氧化铝柱层析、四氢呋喃洗脱。

更具体地，本发明的一个优选实施方案提供pH敏感的Bola型三嵌段聚合物的制备方法，包括如下步骤：

1)合成聚合物PDPA_n

聚合物ATRP聚合(原子自由基聚合)：取N,N-二乙胺基甲基丙烯酸乙酯(DPA)为单体，五甲基二乙三胺(PMDETA)为配体，2,5-二溴己二酸二乙酯为引发剂，干燥的四氢呋喃(THF)作为溶剂。将上述物质混溶于斯莱克瓶中，在液氮的环境下进行冷冻除氧30min、解冻，3次循环。在氩气的保护下加入催化剂溴化亚铜(CuBr)，密封，在50℃的环境下反应，8h后终止反应。反应产物通过中性三氧化二铝柱，四氢呋喃作为洗脱剂除金属盐。洗脱液进行旋蒸后，在冷冻的甲醇中进行沉降，得到粘稠的白色产物，干燥后得到白色的固体PDPA_n。

2)三嵌段聚合物的合成mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y

取干燥的mPEG_y溶解在干燥的四氢呋喃中，加入活化物质氢化钠，20℃的环境下反应3h，加入PDPA_n，同样环境下反应3h。将产物过中性氧化铝柱子，四氢呋喃作为洗脱剂，洗脱液进行旋蒸后，在冷冻甲醇中进行沉降、干燥，得到白色固体，即为三嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y。

本发明还提供含pH敏感的Bola型三嵌段聚合物的脂质体控释药物载体，所述脂质体控释药物载体由磷脂和所述pH敏感的Bola型三嵌段聚合物自组装而成；所述磷脂为磷脂类生物表面活性剂。

优选地，所述磷脂类生物表面活性剂选自HSPC、DOPC、DPPE、DPPC和DSPG。

所述pH敏感的Bola型三嵌段聚合物为mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y，具有如下结构：

其中，n＝15～200，y＝8～226。

优选地，其中n选自15、20、30、50、100和200，y选自8、12、45、113和226。

本发明所述控释药物载体的制备方法，包括以下步骤：

1)将生物表面活性剂及pH敏感的三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，真空下旋转容器蒸发溶剂至干，脂质膜均匀沉积在瓶壁上，真空干燥，于30～60℃水浴超声预热10～30min后加入硫酸铵缓冲溶液水化脂质体；

2)将步骤1)制备的脂质体溶于生理盐水中，透析5～10h，每小时更换生理盐水一次；

3)将步骤2)所得透析过的脂质体按磷脂(HSPC)与药(盐酸性阿霉素)10：1进行载药。

本发明的控释药物载体制备方法中，有机溶剂选自无水氯仿、无水甲醇和无水乙醇。

本发明的控释药物载体制备方法中，步骤1)可将pH敏感的三嵌段聚合物与生物表面活性剂同时溶于有机溶剂中，通过薄膜超声水化法(权利要求9)得到修饰后的脂质体。

本发明方法还可包括步骤4)：将步骤3)的产物于20～40℃保持20-40min后，静置于4℃的环境下半天，得到包封药物的载体。

根据需要，本发明的药物载体可在脂质体囊泡中包裹药物，未包封的药物通过葡聚糖微型凝胶柱分离除去；这种包裹药物的脂质体可以在酸性环境下进行可控释药。

经过Bola型嵌段聚合物对脂质体的修饰，在正常体液环境下修饰后的脂质体结构稳定且药物泄漏量低，而当脂质体达到病变部位后，随着体液环境中pH的变化，嵌段聚合物会发生质子化，使得药物进行有效的释放。本发明设计、合成了具有pH响应性的Bola型嵌段聚合物，制备了具有快速pH响应性的脂质体，可以用于实现靶向性释药，或其他领域(化学合成、化妆品等)的定向释药系统。

附图说明

图1嵌段聚合物mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈的¹H-NMR(400MHz，CCl₃D)，其中m＝15,n＝9；

图2A为嵌段聚合物mPEG₈PDPA₁₅-mPEG₈溶液在400nm紫外光下随pH变化的透过率变化图；图2B为嵌段聚合物mPEG₈PDPA₁₅-mPEG₈、mPEG₈PDPA₃₀-mPEG₈和mPEG₈PDPA₁₀₀-mPEG₈的透过率变化图；

图3是嵌段聚合物mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈插入脂质体前(A)和后(B)的透射电子显微粒径结果；

图4嵌段聚合物修饰脂质体后，其稳定性随pH和时间的变化；

图5显示pH改变后含嵌段聚合物mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈脂质体的阿霉素的释放曲线。

具体实施方式

以下用实施例对本发明作更详细的描述。这些实施例仅仅是对本发明最佳实施方式的描述，并不对本发明的范围有任何限制。

实施例1嵌段聚合物mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈的合成

(1)聚合物的ATRP反应：聚合物PDPA₁₅的合成

聚合物ATRP聚合(原子自由基聚合)：按照各物质的：n(单体)：n(配体)：n(引发剂)：n(催化剂)＝15:1.1:1:1，取N,N-二乙胺基甲基丙烯酸乙酯(DPA)为单体(1.185ml)，五甲基二乙三胺(PMDETA)为配体(0.12g)，2,5-二溴己二酸二乙酯为引发剂(76μl)、干燥的四氢呋喃(2ml)作为溶剂混溶于斯莱克瓶中，在液氮的环境下进行冷冻除氧30min、通高纯氮解冻，经3次循环，在高纯氮的保护下加入催化剂溴化亚铜(0.0478g)，密封，在50℃的环境下反应，8h后终止反应，通过中性氧化铝柱，四氢呋喃作为洗脱剂除金属盐，洗脱液进行旋蒸，通过在冷冻的甲醇中进行沉降，可得到粘稠的白色产物，通过干燥最终得到白色的固体PDPA₁₅，通过核磁计算，单体的转化率为98.9％；

(2)聚乙二醇单甲醚mPEG₈的活化

取mPEG₈1ml与甲苯30ml混合，旋蒸1.5h，使水与甲苯共沸除水。在氩气保护下停止旋蒸，溶解在干燥的20ml四氢呋喃(干燥的方法为钠块与THF回流，二苯甲酮作为指示剂，变蓝显示无水)中，加入活化物质氢化钠0.05g，20℃的环境下反应3h，得到活化后的聚乙二醇单甲醚mPEG₈。

(3)三嵌段聚合物的合成mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈

取步骤(1)中得到的聚合物PDPA₁₅1g，加入步骤(2)得到的活化的聚乙二醇单甲醚mPEG₈中，在20℃下反应3h，将产物过中性氧化铝柱，用四氢呋喃洗脱，旋蒸，冷冻甲醇中进行沉降，多余的聚乙二醇单甲醚mPEG₈可以溶解在甲醇中、最后干燥得到白色固体mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈。

实施例2嵌段聚合物mPEG₄₅-PDPA₃₀-mPEG₄₅的合成

(1)聚合物的ATRP反应：聚合物PDPA₃₀的合成

聚合物ATRP聚合(原子自由基聚合)：按照各物质的量比为：n(单体)：n(配体)：n(引发剂)：n(催化剂)＝30:2:1:1，取N,N-二乙胺基甲基丙烯酸乙酯(DPA)为单体(1.185ml)，bpy(2,2-联吡啶)为配体(0.052g)，2,5-二溴己二酸二乙酯为引发剂(38μl)、干燥的四氢呋喃(2ml)作为溶剂混溶于斯莱克瓶中，在液氮的环境下进行冷冻除氧30min、通高纯氮解冻，经3次循环，在高纯氮的保护下加入催化剂溴化亚铜(0.0239g)，密封，在50℃的环境下反应，8h后终止反应，通过中性三氧化二铝柱，四氢呋喃作为洗脱剂除金属盐，洗脱液进行旋蒸，通过在冷冻的甲醇中进行沉降，可得到粘稠的白色产物，通过干燥最终得到白色的固体PDPA₃₀，通过核磁计算，单体的转化率为98.1％；

(2)聚乙二醇单甲醚mPEG₄₅的活化

取mPEG₄₅1ml与甲苯30ml混合，旋蒸1.5h，使水与甲苯共沸除水。在氩气保护下停止旋蒸，溶解在干燥的20ml四氢呋喃(干燥的方法为钠块与THF回流，二苯甲酮作为指示剂，变蓝显示无水)中，加入活化物质氢化钠0.05g，20℃的环境下反应3h，得到活化后的聚乙二醇单甲醚mPEG₄₅。

(3)三嵌段聚合物的合成mPEG₄₅-PDPA₃₀-mPEG₄₅合成

取步骤(1)中得到的聚合物PDPA₃₀1g，加入步骤(2)得到的活化的聚乙二醇单甲醚mPEG₄₅中，按照n(PDPA):n(mPEG)＝1:1(此时聚乙二醇单甲醚远远过量),在20℃下反应3h，将产物过中性氧化铝柱，四氢呋喃作为洗脱剂，旋蒸，冷冻甲醇中进行沉降，多余的聚乙二醇单甲醚可以溶解在甲醇中、最后干燥得到白色固体mPEG₄₅-PDPA₃₀-mPEG₄₅。

按实施例1和2的方法，在聚合物的ATRP反应中采用相应的配体并改变各物质的比例，得到不同链长的嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y(见表1)。

表1：不同链长的嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y

实施例3含嵌段聚合物mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈脂质体的制备

配制3.8mM的脂质体膜材料(HSPC/Chol＝5:1，mol/mol)(其中m(HSPC)＝15mg,m(chol,胆固醇)＝1.5mg)的氯仿溶液。取5％磷脂HSPC量的嵌段聚合物mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈，其质量为m＝3.6mg，以氯仿作为溶剂，用5ml容量瓶进行定容。将以上两种氯仿溶液放入圆底烧瓶中混合均匀，在45℃的环境下旋转45min蒸发除去氯仿制得均匀混合脂质薄膜，油泵抽取1h。加入5mL的0.1mol/l的硫酸铵溶液水化脂质薄膜，得到磷脂浓度为3.8mMol/L的脂质体，在60℃以上水浴中超声10min(输出功率100W)，得到脂质体混悬液。将脂质体混悬液在60℃以上的水浴中放置，用小型挤出器将60℃左右的胶体溶液通过200nm的聚碳酸酯滤膜过滤11次，得到粒径约200nm的浓度约为3.8mM的脂质体溶液。

实施例4含mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈脂质体的稳定性研究

实施例3得到的插入嵌段聚合物mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈的脂质体(总脂质/聚合物＝20:1，mol/mol)中磷脂的浓度为3.8mMol/L，取1.2mlpH7.4的PBS缓冲液稀释，得到浓度为0.19mMol/L的脂质体，通过加入荧光探针DPH(1,6-联苯-1,3,5-己三烯)(磷脂与DPH的质量比m(脂质)：m(DPH)＝800：1)，可以获得脂质体膜流动性的信息，在图4中显示，空白脂质体的偏振强度最弱，证明稳定性差，而当磷脂中插入嵌段聚合物后，其偏振强度得到明显的提高，从而可以说明,Bola型嵌段聚合物对脂质体的稳定性有增强作用。

通过荧光偏振仪考察嵌段聚合物对脂质体稳定性的影响，图4中显示，加入嵌段聚合物的脂质体其稳定性远高于空白脂质体的稳定性，同时在改变pH环境后，加入嵌段聚合物的偏振值改变较大，因而对脂质体的稳定性影响也较大，进而说明，Bola型嵌段聚合物起到稳定脂质体的作用，该作用受环境pH的影响。

制备的脂质体溶液2ml放入透析袋(截留量为14000)，以至少脂质体100倍体积的生理盐水透析更换外水相8次后，按Dox/mol：总脂质/mol＝1:10加入0.180mL盐酸阿霉素水溶液(2.5mg/mL)，60℃孵育30min，冰水浴停止载药，通过sephadex G-50凝胶微柱离心法除去游离阿霉素，即得到阿霉素脂质体。

嵌段聚合物mPEG₈-PDPA₁₅-mPEG₈插入到脂质体(脂质/聚合物＝20:1，mol/mol)后脂质体的透射电子显微镜图(图3)显示了其粒径的变化。从图中可以看到在pH7.4的环境下，脂质体的粒径约为130～200nm，同时DLS的检测为140nm左右，而插入嵌段聚合物的脂质体其DLS检测到的粒径为150.3左右。在pH6.0时，空白脂质体的粒径基本没变化，为130nm左右，而插入嵌段聚合物的脂质体为131.3nm，脂质体无破裂现象。

表2  pH敏感脂质体(0.38mM)在改变pH前后粒径变化

脂质体组成	pH	粒径(nm)	分散系数
				HSPC:Chol＝5:1	7.4	130	0.236
HSPC:Chol＝5:1	6.0	124.5	0.217
				HSPC:Chol:聚合物＝20:4:1	7.4	150.3	0.258
HSPC:Chol:聚合物＝20:4:1	6.0	131.3	0.185

将阿霉素脂质体放入透析袋(截留量为14000)，再将透析袋放入37℃恒温的适量的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)和37℃恒温的适量的磷酸盐缓冲液(pH＝6.0)中，每隔1h取3mL溶液，通过紫外可见吸收光度计(UV)进行检测，在UV(485nm)测得药物释放曲线(图5)。

不同pH对的释药行为影响，通过硫酸铵梯度法制得的阿霉素脂质体(约1.9mM，mol DOX/mol lipid)，利用透析法在紫外可见分光光度计上测得37℃下其随时间的药物释放曲线。在pH7.4时，空白脂质体进行药物释放时，25h后释放27％左右，而加入嵌段聚合物后的脂质体25h仅释放16％左右。在pH6.0时，25h后空白脂质体释放18％左右，但其释放速率较空白的慢，而加入嵌段聚合物的脂质体释放45％，很明显，在可控释药方面，嵌段聚合物起到一个很好的可控作用。

同时针对不同链长的嵌段聚合物进行稳定性及释药实验：

如表3  不同嵌段聚合物对脂质体稳定性及释药的影响

其中表3中，磷脂(HSPC)中的含量为嵌段聚合物的量与总磷脂的物质量比，其中磷脂浓度为3mg/ml；

稳定性为统一条件下在pH7.4的条件下检测磷脂中DPH的偏振值；

释药率为嵌段聚合物修饰后的脂质体在37℃，pH7.4和pH6.0在48h时释放出的总百分比。

Claims (10)

1.一种pH敏感的Bola型三嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y，具有如下结构：

其中，n＝15～200，y＝8～226。

2.如权利要求1所述的pH敏感的Bola型三嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y，其中n选自15、20、30、50、100和200，y选自8、12、45、113和226。

3.如权利要求1所述的pH敏感的Bola型三嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y，包括：

mPEG₈-PDPA_n-mPEG₈，其中n选自15、20、30、50、100和200。

4.如权利要求1所述的pH敏感的Bola型三嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y，包括：

mPEG_y-PDPA₁₅-mPEG_y和mPEG_y-PDPA₃₀-mPEG_y，其中y选自8、12、45、113和226。

5.如权利要求1所述的pH敏感的Bola型三嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y，其中，-PDPA_n-是pH敏感的高分子嵌段，由DPA在催化剂CuBr、引发剂2,5-二溴己二酸二乙酯的作用下，通过ATRP聚合机理进行反应而制成。

6.权利要求1所述pH敏感的Bola型三嵌段聚合物的制备方法，包括如下步骤：

1)在干燥的有机溶剂中，在引发剂和催化剂存在下，将单体DPA和配体PMDETA或bpy进行原子自由基聚合，合成聚合物PDPA_n；

2)在干燥的有机溶剂中，在活化物质氢化钠存在下，干燥的mPEG_y与PDPA_n反应，产物经柱层析分离后，在冷冻甲醇中沉降、干燥，得到三嵌段聚合物mPEG_y-PDPA_n-mPEG_y。

7.如权利要求6所述的制备方法，其中所述引发剂为2,5-二溴己二酸二乙酯；所述催化剂选自CuCl和CuBr，更优选CuBr。

8.含权利要求1所述pH敏感的Bola型三嵌段聚合物的脂质体控释药物载体，所述脂质体控释药物载体由磷脂和权利要求1所述pH敏感的Bola型三嵌段聚合物自组装而成；所述磷脂为磷脂类生物表面活性剂，更优选地，所述磷脂类生物表面活性剂选自HSPC、DOPC、DPPE、DPPC和DSPG。

9.权利要求8所述脂质体控释药物载体的制备方法，包括以下步骤：

1)通过薄膜超声水化法将生物表面活性剂及pH敏感的三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，真空下旋转容器蒸发溶剂至干，脂质膜均匀沉积在瓶壁上，真空干燥，于30～60℃水浴超声预热10～30min后加入硫酸铵缓冲溶液水化脂质体；

2)将步骤1)制备的脂质体溶于生理盐水中，透析5～10h，每小时更换生理盐水一次；

3)将步骤2)所得透析过的脂质体按磷脂(HSPC)与药(盐酸型阿霉素)的量比为10：1进行载药；可将步骤3)的产物于20～40℃保持20～40min后，静置4℃的环境下半天，得到包封药物的脂质体控释药物载体。

10.如权利要求9所述的制备方法，其中所述的有机溶剂选自无水氯仿，无水甲醇和无水乙醇。