CN104280327A - 一种流式荧光收集光学系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流式荧光收集光学系统，包括：荧光收集镜头，用于将多种不同的激光束激发样本产生的荧光放大为多个相互之间存在间距的荧光像点；微分束镜，荧光收集镜头放大形成的荧光像点照射于微分束镜，微分束镜对多个荧光像点进行分光和去除杂散光；多个消色差准直镜头，由微分束镜分出的各束荧光像点均通过至少一个消色差准直镜头进行消色差处理；多个多色镜滤光片组，各束经过消色差处理的荧光像点经过多色镜滤光片组进行滤光；多个聚焦镜和多个探测器，各束经过多色镜滤光片组进行滤光后的荧光像点经过聚焦镜进行聚焦至探测器。本发明提供的流式荧光收集光学系统，其成本较低、结构紧凑易装调、测量准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分析技术领域，尤其涉及一种流式荧光收集光学系统。
背景技术
流式细胞分析及流式细胞术，是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以高速分析成千上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。其检测原理为：激光束经过整形后照射到单细胞样本流上，依次通过检测区的细胞在激光束的照射下产生微弱的荧光，然后通过荧光收集镜头尽可能多的收集荧光信号，数值孔径越大收集到的荧光信号越强，仪器的荧光探测性能就越高，然后经过准直透镜、二色镜、带通滤光片对荧光进行按波长区域划分，再会聚到光电探测器收集各波段的荧光信号，不同的荧光信号和强度反应出细胞抗原与抗体的特异性结合程度，从而实现对样本的分类定量分析和分选。
流式光学系统中通常都有两、三个激光光源，激发特定荧光染料产生不同波长的荧光，荧光染料的种类是有一定数量的，因而不同波长激光激发的荧光光谱是可能有重叠的，比如488nm激光激发的PerCP(多甲藻黄素-叶绿素-蛋白，peridinin chlorophyll protein)和638nm激光激发的APC(别藻兰蛋白，allophycocyanin)产生的荧光即都在670nm左右，还有很多这里不再累述，因而在目前流式细胞仪中基本都是采用空间分光方式把不同激光激发的荧光先在空间上分开来，再通过不同二色镜、滤光片的组合把多色的荧光分离开来，收集荧光的空间分光目前通常有两种方案：一种是反射镜方案，一种是光纤方案。
方案1反射镜方案虽结构简单，但反射镜边缘分界尺寸精度很不好，同时也容易引入不同激光激发的荧光串扰或过多杂散光进入荧光接收通道，这样对荧光接收带通滤光片的镀膜参数要求很高，比如一般要求通带外OD(Optical Density，光学密度)6以上以阻止杂散光，所以滤光片的镀膜难度和成本就会提高很多，同时串扰问题仍然存在，从而造成测量的不准确及流式重要指标荧光探测灵敏度的降低。
方案2光纤接收方案目前很多流式采用，它能有效解决杂散光和荧光串扰问题，但其缺点也不少，1是光纤耦合效率较低，要提高耦合效率就必须采用复杂的非球面多片耦合透镜设计，这必然造成成本大幅增加，2是光纤有一定的尺寸包络，光纤间距不可能做得很小，这就要求荧光收集镜头倍率提高同时还要像差足够小，这也为镜头的设计增加了困难。同时光纤对准装调也相对非常困难。
因此，如何解决现有技术中收集荧光光学系统存在的成本高、对准装调难度高及测量的不准确的问题，成为本领域技术人员所要解决的重要技术问题。
发明内容
本发明提供了一种流式荧光收集光学系统，其成本较低、结构紧凑易装调、测量准确性高。
本发明提供的流式荧光收集光学系统，包括：
荧光收集镜头，包括多个凸透镜，且用于将多种不同的激光束激发样本产生的荧光放大为多个相互之间存在间距的荧光像点；
微分束镜，所述荧光收集镜头放大形成的所述荧光像点照射于所述微分束镜，所述微分束镜对多个所述荧光像点进行分光和去除杂散光；
多个消色差准直镜头，由所述微分束镜分出的各束荧光像点均通过至少一个所述消色差准直镜头进行消色差处理；
多个多色镜滤光片组，各束经过消色差处理的荧光像点经过所述多色镜滤光片组进行滤光；
多个聚焦镜和多个探测器，各束经过多色镜滤光片组进行滤光后的荧光像点经过所述聚焦镜进行聚焦至所述探测器。
优选地，所述微分束镜包括石英玻璃本体和镀于所述石英玻璃本体表面的铝膜。
优选地，消色差准直镜头包括第一凸镜、第二凸镜和第三凸镜，所述第二凸镜位于所述第一凸镜和所述第三凸镜之间；
所述第一凸镜远离所述第二凸镜的面为平面，靠近所述第二凸镜的面为曲率半径为-2.756mm的球面；
所述第二凸镜靠近所述第一凸镜的面为曲率半径为17.563mm的球面，靠近所述第三凸镜的面为曲率半径为-8.204mm的球面；
所述第三凸镜靠近所述第二凸镜的面为曲率半径9.475mm的第一球面，远离所述第二凸镜的面为曲率半径为-23.972mm的第二球面，且所述第一球面与所述第二球面之间还设有曲率半径为3.988mm的第三球面。
优选地，所述第一凸镜的厚度为1.5mm，所述第二凸镜的厚度为1.5mm，所述第三凸镜的厚度为3.35mm。
本发明提供的流式荧光收集光学系统，包括：荧光收集镜头，用于将多种不同的激光束激发样本产生的荧光放大为多个相互之间存在间距的荧光像点；微分束镜，所述荧光收集镜头放大形成的所述荧光像点照射于所述微分束镜，所述微分束镜对多个所述荧光像点进行分光和去除杂散光；多个消色差准直镜头，由所述微分束镜分出的各束荧光像点均通过至少一个所述消色差准直镜头进行消色差处理；多个多色镜滤光片组，各束经过消色差处理的荧光像点经过所述多色镜滤光片组进行滤光；多个聚焦镜和多个探测器，各束经过多色镜滤光片组进行滤光后的荧光像点经过所述聚焦镜进行聚焦至所述探测器。如此设置，在细胞分析系统的流动室中的样本受不同激光激后发出荧光，由荧光收集镜头将不同激光激发样本产生的荧光放大为一定间距的荧光像点，通过微分束镜把荧光像点空间精确分光并去杂散光，分离的荧光像点然后分别通过消色差准直镜头对宽波段激发荧光准直时需要进行消色差处理，消色差准直镜头采用了镜组的设计方式达到消色差的效果，而后荧光像点以平行光的方式入射到多色镜滤光片组，分波段在不同位置分出两种或多种荧光，最后通过聚焦镜聚焦到相应的探测器接收。由于本发明提供的流式荧光收集光学系统，其对照射样本的激光光斑间距要求不高，可尽量小些，因此可提高同等流速下细胞分析速度；另外，不需要放大倍率以增大不同激光激发荧光的间距，即荧光收集镜头设计难度不大，仍能把不同激光激发的荧光空间分开，并且不产生荧光串扰和去掉多余杂散光的影响；而且消色差准直镜头设计使宽波段激发荧光准直，即准直镜采用了镜组的设计方式达到消色差的效果，使各个波长在一定范围的像点严格以平行光的方式入射到后面多色镜滤光片组内，保证接收荧光的无损收集。整体结构相比光纤接收方案更简洁紧凑易装调，并有较高成本优势，相比反射镜方案又具有更好的分光性能，从而达到更好的流式性能指标。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明具体实施方式提供的流式荧光收集光学系统示意图；
图2为本发明具体实施方式中消色差准直镜头示意图；
图中：
荧光收集镜头—11、微分束镜—12、消色差准直镜头—13、多色镜滤光片组—14、聚焦镜—15、探测器—16、样本—21、第一凸镜—31、第二凸镜—32、第三凸镜—33。
具体实施方式
本具体实施方式提供了一种流式荧光收集光学系统，其成本较低、结构紧凑易装调、测量准确性高。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参考图1和图2，本具体实施方式提供的流式荧光收集光学系统，包括：
荧光收集镜头11，用于将多种不同的激光束激发样本21产生的荧光放大为多个相互之间存在间距的荧光像点；
微分束镜12，荧光收集镜头11放大形成的荧光像点照射于微分束镜12，微分束镜12对多个荧光像点进行分光和去除杂散光；
多个消色差准直镜头13，由微分束镜12分出的各束荧光像点均通过至少一个消色差准直镜头13进行消色差处理；
多个多色镜滤光片组14，各束经过消色差处理的荧光像点经过多色镜滤光片组14进行滤光；
多个聚焦镜15和多个探测器16，各束经过多色镜滤光片组14进行滤光后的荧光像点经过聚焦镜15进行聚焦至探测器16。
如此设置，在细胞分析系统的流动室中的样本21受不同激光激后发出荧光，由荧光收集镜头11将不同激光激发样本21产生的荧光放大为一定间距的荧光像点，通过微分束镜12把荧光像点空间精确分光并去杂散光，分离的荧光像点然后分别通过消色差准直镜头13对宽波段激发荧光准直时需要进行消色差处理，消色差准直镜头13采用了镜组的设计方式达到消色差的效果，而后荧光像点以平行光的方式入射到多色镜滤光片组14，分波段在不同位置分出两种或多种荧光，最后通过聚焦镜15聚焦到相应的探测器16接收。由于本发明提供的流式荧光收集光学系统，其对照射样本21的激光光斑间距要求不高，可尽量小些，因此可提高同等流速下细胞分析速度；另外，不需要放大倍率以增大不同激光激发荧光的间距，即荧光收集镜头11设计难度不大，仍能把不同激光激发的荧光空间分开，并且不产生荧光串扰和去掉多余杂散光的影响；而且消色差准直镜头13设计使宽波段激发荧光准直，即准直镜采用了镜组的设计方式达到消色差的效果，使各个波长在一定范围的像点严格以平行光的方式入射到后面多色镜滤光片组14内，保证接收荧光的无损收集。整体结构相比光纤接收方案更简洁紧凑易装调，并有较高成本优势，相比反射镜方案又具有更好的分光性能，从而达到更好的流式性能指标。
本具体实施方式中，流式光学系统可以采用488nm和638nm双路激光源，两激光打到流动室中心样本21上的光斑竖直方向间距可以为120um，光斑尺寸为80×15um，荧光收集镜头11可以为NA1.2，垂轴放大倍率可以为12倍，则两激光激发的荧光像点上下间距为1.44mm，同时考虑到去杂散光要求，假设样本21最大直径40u，则在像点处大于0.5mm以外区域需设置光阑消去背景杂散光。
需要说明的是，本具体实施方式提供的微分束镜12需要进行特殊设计，其可以包括石英玻璃本体和镀于石英玻璃本体表面的铝膜。如此设置，微分束镜12的界面边缘尺寸精度能达到0.01mm，可有效分离1.44mm间距的不大于60um荧光像点。
本具体实施方式中，消色差准直镜头13可以包括第一凸镜31、第二凸镜32和第三凸镜33，第二凸镜32位于第一凸镜31和第三凸镜33之间；
第一凸镜31远离第二凸镜32的面为平面，靠近第二凸镜32的面为曲率半径为-2.756mm的球面；
第二凸镜32靠近第一凸镜31的面为曲率半径为17.563mm的球面，靠近第三凸镜33的面为曲率半径为-8.204mm的球面；
第三凸镜33靠近第二凸镜32的面为曲率半径9.475mm的第一球面，远离第二凸镜32的面为曲率半径为-23.972mm的第二球面，且第一球面与第二球面之间还设有曲率半径为3.988mm的第三球面。
第一凸镜31的厚度优选为1.5mm，第二凸镜32的厚度为1.5mm，第三凸镜33的厚度为3.35mm。
本具体实施方式中，消色差准直镜头的具体参数可以如下表1中设置：
| 镜片 | 曲率半径(mm) | 厚度(mm) | 口径(mm) | 材料 |
| 第一凸镜31 | R1＝∞,R2＝-2.756 | 1.5 | 4.5 | ZK4 |
| 第二凸镜32 | R1＝17.563,R2＝-8.204 | 1.5 | 7 | ZK9 |
| 第三凸镜33 | R1＝9.475,R2＝3.988,R3＝-23.972 | 3.35 | 7 | K9,ZF13 |
表1
其中：ZK4，ZK9,K9，ZF13均为玻璃编号，具体请参考文献：GB903-87无色光学玻璃。
如此设置，消色差准直镜头13采用的镜组的设计方式能够有效达到消色差的效果，使0.5～0.9μm范围各个波长的严格以平行光的方式入射到后面多色镜滤光片组14内。
另外，需要说明的是，荧光收集镜头11、多色镜滤光片组14及聚焦镜15的参数比较灵活，本领域人员可以根据实际选定，非本发明的关键参数。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.一种流式荧光收集光学系统，其特征在于，包括：
荧光收集镜头，包括多个凸透镜，且用于将多种不同的激光束激发样本产生的荧光放大为多个相互之间存在间距的荧光像点；
微分束镜，所述荧光收集镜头放大形成的所述荧光像点照射于所述微分束镜，所述微分束镜对多个所述荧光像点进行分光和去除杂散光；
多个消色差准直镜头，由所述微分束镜分出的各束荧光像点均通过至少一个所述消色差准直镜头进行消色差处理；
多个多色镜滤光片组，各束经过消色差处理的荧光像点经过所述多色镜滤光片组进行滤光；
多个聚焦镜和多个探测器，各束经过多色镜滤光片组进行滤光后的荧光像点经过所述聚焦镜进行聚焦至所述探测器。
2.如权利要求1所述的流式荧光收集光学系统，其特征在于，所述微分束镜包括石英玻璃本体和镀于所述石英玻璃本体表面的铝膜。
3.如权利要求1所述的流式荧光收集光学系统，其特征在于，消色差准直镜头包括第一凸镜、第二凸镜和第三凸镜，所述第二凸镜位于所述第一凸镜和所述第三凸镜之间；
所述第一凸镜远离所述第二凸镜的面为平面，靠近所述第二凸镜的面为曲率半径为-2.756mm的球面；
所述第二凸镜靠近所述第一凸镜的面为曲率半径为17.563mm的球面，靠近所述第三凸镜的面为曲率半径为-8.204mm的球面；
所述第三凸镜靠近所述第二凸镜的面为曲率半径9.475mm的第一球面，远离所述第二凸镜的面为曲率半径为-23.972mm的第二球面，且所述第一球面与所述第二球面之间还设有曲率半径为3.988mm的第三球面。
4.如权利要求3所述的流式荧光收集光学系统，其特征在于，所述第一凸镜的厚度为1.5mm，所述第二凸镜的厚度为1.5mm，所述第三凸镜的厚度为3.35mm。
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