CN104274838A - 一种地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物作为治疗哮喘药物的应用及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物在哮喘治疗方面的应用及其制备方法。本发明针对传统糖皮质药物地塞米松磷酸钠毒性大，靶向性差的缺点，利用层状双氢氧化物对地塞米松磷酸钠进行搭载，用于提高地塞米松磷酸钠的治疗效果，降低地塞米松磷酸钠的毒副作用。本发明制备的地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物载药量较高，具有一定的缓释作用，能抑制卵蛋白诱发的哮喘大鼠气道炎症，有望应用于哮喘疾病的治疗。

Description

一种地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物作为治疗哮喘药物的应用及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，涉及一种地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物作为哮喘药物的应用及其制备方法。 

背景技术

支气管哮喘是一种呼吸系统严重危害人类健康的常见疾病，在过去的40年中，随着全球范围内空气污染的日益加剧、工业化的发展，其发病率和病死率在世界范围内呈上升趋势。目前全球罹患该病的人数不少于3亿，预计到2025年，全球哮喘患者将增加至4亿，目前我国至少有3000万哮喘患者，其中儿童的发病率大约有1.5%，成人的发病率大约有1%。哮喘的反复发作及恶化对患者的生活质量造成严重影响，给社会带来了沉重的经济负担，因而寻找安全有效的哮喘新制剂成为全世界科学家面临的巨大挑战。 

糖皮质激素是目前临床上治疗哮喘的首选药物，它可以减轻气道炎症反应，降低气道高反应性，降低哮喘患者住院率及死亡率，减少哮喘严重发作入住ICU和气管插管的风险，但长期使用易引起下丘脑-垂体-肾上腺轴功能抑制、代谢紊乱、骨质疏松、声嘶和咽喉部不适，以及诱发和加重感染等副作用， 严重时可致残或危及生命，正是由于这种双刃剑效应严重影响了糖皮质激素类药物的临床疗效以及治疗的依从性，因此，如何扬长避短，，最大限度的发挥此类药物的治疗效应，同时尽可能地减少其不良反应，已成为临床及基础研究中亟待解决的重要课题。 

纳米载药系统作为药物、基因传递和控释的载体，是一种新型的药物输送和控释体系。层状双氢氧化物是由二价金属离子和三价金属离子组成的具有层状结构的氢氧化物。LDHs具有独特的结构特点：第一，层片结构带正电荷，第二，层间存在可交换的阴离子，药物可插入LDHs层间得到药物/LDHs纳米杂化物，由于药物与层板间存在的静电作用、氢键作用以及空间位阻效应，因而可实现对药物的有效控释。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有一定缓释效应的地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物的制备方法以及地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物作为治疗哮喘药物的应用。 

本发明提供的技术方案为： 

本发明提出的一种地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物作为治疗哮喘药物的应用，所述地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物含有二价金属离子（M^Ⅱ）和三价金属离子（M^Ⅲ），层间含有阴离子，其中：M^Ⅱ为Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺或Zn²⁺中任一种，M^Ⅲ为Al³⁺、Cr³⁺、Mn³⁺、Fe³⁺、Co³⁺或Ni³⁺中任一种，层间阴离子为OH^-、CO3^2-、SO4^2-、Cl^-、NO3^-中的一种或两种。

本发明中，所述的地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物中地塞米松磷酸钠的质量百分含量为10%-55%。 

本发明中，所述地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物的制备方法，具体步骤如下： 

(1). 配制浓度为0.1-0.5mol/L的可溶性二价金属离子和可溶性三价金属离子的混合盐水溶液，可溶性二价金属离子和可溶性三价金属离子的摩尔比为(1~3)：1；其中：M^Ⅱ为Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺或Zn²⁺中任一种，M^Ⅲ为Al³⁺、Cr³⁺、Mn³⁺、Fe³⁺、Co³⁺或Ni³⁺中任一种；

(2). 配制浓度为0.002~0.03mol/L的碱性溶液，所述的碱性溶液为NH₄OH、NaOH或Na₂CO₃中的一种或两种，配制浓度为0.001mol/L地塞米松磷酸钠溶液；

(3). 将步骤(1)所得溶液加入到步骤(2)所得溶液中，反应温度为20~80℃，反应时间为2~5小时，离心，蒸馏水洗涤3~4次，得到地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物胶体；

(4). 将步骤(3)制备的地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物放到水热反应釜中，水热反应时间为80℃~140℃，水热反应时间为10~20小时，得到地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物胶溶产物，真空干燥后得到地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物纳米材料。

本发明中，所述的地塞米松磷酸钠层状双氢氧化物的给药方式为口服、注射或雾化给药中任一种。 

本发明中，所述的地塞米松磷酸钠-层状双氢氧化物对大鼠的有效用量范围是每次0.2-0.3mg/kg，每日一次。 

本发明中，地塞米松磷酸钠-层状双氢氧化物对大鼠的给药周期为两周，每周五天。 

本发明中，所述步骤(1)混合盐溶液浓度优选为0.3mol/L或0.1mol/L，可溶性盐的阴离子优选为Cl^-、NO3^-。 

本发明中，所述步骤(2)碱溶液优选为NaOH，浓度为0.0025mol/L。 

本发明中，所述步骤(3)反应温度优选为60℃，反应时间优选为3小时。 

本发明中，所述步骤(4)水热反应温度优选为100℃，水热反应时间优选为18小时。 

本发明具有如下优点： 

1.      本发明实验条件温和，操作简单，不需要使用大量的毒性溶剂和添加剂，不需要复杂的合成和制备过程，产物易于处理，便于大规模生产。

2.      本发明制备的地塞米松磷酸钠-层状双氢氧化物具有载药量高，载药稳定，具有一定的缓释效应。 

3.      本发明制备的地塞米松磷酸钠层状双氢氧化物能够有效的治疗哮喘，恢复大鼠气道阻力到正常水平，且安全无毒副作用，具有很大的市场开发潜力。 

附图说明

图1为地塞米松磷酸钠/LDHs的X 射线粉末衍射图（XRD）； 

图2为地塞米松磷酸钠/LDHs的FTIR谱图；

图3为地塞米松磷酸钠/LDHs 在Ph=7.2的磷酸缓冲液中释放地塞米松磷酸钠的速率曲线，同时另有LDHs和地塞米松磷酸钠物理混合物的释放速率曲线作对比；

图4为哮喘大鼠的建模流程图和治疗干预流程图；

图5治疗哮喘大鼠模型中各组大鼠的气道阻力；

图6治疗哮喘大鼠模型中各组大鼠支气管肺泡灌洗液的IL-4水平；

图7治疗哮喘大鼠模型中各组大鼠支气管肺泡灌洗液的IL-13水平。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。 

实施例1：地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物纳米材料的制备 

步骤a：配制MgCl₂6H₂O (0.6099g，0.003 mol)和AlCl₃9H₂O (0.2414 g，0.001 mol) 的金属混合盐溶液共10 mL；

步骤b：将0.516g（0.001mol) 的地塞米松磷酸钠溶于40mL 浓度为0.0006mol 的NaOH溶液，使其在N₂气氛下60℃下搅拌10分钟；

步骤c：将步骤a溶液滴加到步骤b溶液中，N₂气氛下60度搅拌3小时。

步骤d：反应后将样品取出，离心，使用ddH₂O水反复清洗、离心三遍，转入水热釜，置于烘箱，100℃反应16小时。 

步骤e：将样品离心、倒去上清液，置于真空干燥箱中50℃完全干燥48小时后将其取出，置于研钵中研磨成粉末，即得样品。 

实施例2：地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物的表征 

2.1、X-射线粉末衍射测定在Rigaku D/max-rA X-射线粉末衍射仪上进行，加速电压和电流分别为40 kV和40 mA，扫描速率6°/min。Cu靶 (λ=0.154060nm)，石墨单色器。

由XRD谱图可知，地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物纳米复合材料具有层状晶形结构，其003晶面的衍射峰位置与 MgAl-Cl-LDHs相比向低2θ发生偏移，因此可以推断地塞米松磷酸钠已插入LDHs 层间。 

2.2、取少量干燥的样品粉末，用KBr压片法进行FTIR测定，采用波长范围为4000~500 cm^-1 Nicolet傅立叶变换红外光谱，将固体样品在玛瑙研钵中粉碎磨细，加入溴化钾粉料，样品量与溴化钾的混合比例为1：100，继续研磨，直到磨细混合均匀，将已磨好的物料加到压片专用的模具上，合上模具在油压机上加压到90t/cm²以上，并且维持2~3分钟。取出压成片状的物料，压片厚度在0.5~1 mm，装入样品架放入仪器进行检测。 

由FTIR谱图可知，地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物纳米复合材料的红外谱图同时具有LDHs载体和地塞米松磷酸钠分子的特征峰，说明地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物纳米复合材料中地塞米松磷酸钠和LDHs的结构并未发生改变，复合材料中药物分子与LDHs并没有发生化学作用，只是插入到了疏水层间抑或吸附在其表面。 

2.3、载药量的测定: 

地塞米松磷酸钠工作曲线的绘制：分别配制1、2、3、4、5、6、8、10 μg/mL地塞米松磷酸钠标准溶液，在240 nm处测定其吸光度，拟合标准曲线。标准曲线拟合方程为：A=0.00973+0.02678C，线性相关系数R=0.99946。其中A为吸光度，C为地塞米松磷酸钠浓度。

   地塞米松磷酸钠/LDHs复合纳米材料载药量的测定：将0.003 g的DSP/LDHs干燥粉末置于10 mL容量瓶中，滴加6 M盐酸溶液100 μL，用0.02 M、pH=7.45的磷酸缓冲液进行定容至10 mL，超声30min后，再置于37℃水浴锅过夜。次日测其紫外吸光度值，对照地塞米松磷酸钠工作曲线，即可得出样品中地塞米松磷酸钠的浓度。 

载药量的计算公式为：LDHs载药量= LDHs中药物质量/LDHs质量×100% 

地塞米松磷酸钠的含量为51.2%； 

2.4、选取pH7.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液作为缓释介质。称取0.01g的地塞米松磷酸钠/LDHs，加入300 mL的pH=7.4的缓冲液，恒温37℃100 rpm磁力搅拌。按一定时间间隔取2 mL的悬浮液，立即经0.45 μm微孔滤膜过滤。CARY 50紫外可见分光光度计检测吸光度值，对照地塞米松磷酸钠标准工作曲线和载药量，计算地塞米松磷酸钠的释放率。

以释放率对时间作图得到缓释曲线，作为对比，同样条件下测定了地塞米松磷酸钠和MgAl-Cl-LDHs载体物理混合物的释放率。LDHs和地塞米松磷酸钠的物理混合物，是将两者按相应杂化物中两者比例混合加入研钵研磨而成药物释放实验结果可见地塞米松磷酸钠/LDHs纳米杂化物的释放速率明显低于地塞米松磷酸钠原药与LDHs的物理混合物，表明地塞米松磷酸钠/LDHs纳米杂化物具有良好的药物控释效果。 

实施例3：哮喘大鼠模型的建立及给药方法 

3.1、实验分组: 清洁级雄性SD大鼠共20只，体重在110g-130g，随机分为正常组（saline），阳性对照组（Asthma组），地塞米松磷酸钠给药组（Dexa组）、地塞米松磷酸钠-层状双氢氧化物给药组（Dexa-LDHs组），层状双氢氧化物组（LDHs组），每组10只，哮喘大鼠模型的构建流程和治疗干预流程如图4所示。

哮喘大鼠模型的构建 

3.2、哮喘模型组：适应性饲养一周后，采用卵蛋白致敏和激发建立哮喘大鼠模型。

致敏阶段：在第0天和第8天在胸部皮下每只注射OVA 致敏液1mL1 mg OVA和10 mg Al(OH)₃凝胶溶于l mL生理盐水 

激发阶段：第14天起将大鼠置于雾化箱内(50cm×40cm×30cm)，通过PARIBOY射流雾化器，以1%OVA溶液(10 mg OVA溶于l0 mL生理盐水)进行30分钟雾化激发，每天1次，连续激发7天。

正常对照组：第0天和第8天在胸部皮下每只注射l mL生理盐水，第14天起雾化吸入生理盐水，每天1次，每次30 min，连续激发7天。 

3.3、给药方法 

正常对照组(Saline组)：第0天和第7天分别分三点皮下注射 1 mL生理盐水，第14天起雾化吸入生理盐水，每天1次，每次30 min，连续7天；

哮喘组 (Asthma组)：第0天和第7天分别分三点皮下注射1 mL致敏液、第14天起雾化吸入含 1 % OVA的生理盐水进行激发，每天1次，每次 30 min，连续7天；

地塞米松磷酸钠给药(Dexa组)：每次激发前 30 min腹腔注射地塞米松磷酸钠 (0.25 mg/kg)，其余同哮喘组；

层状双氢氧化物-地塞米松磷酸钠给药组(Dexa-LDHs组)，每次激发前30 min腹腔注射层状双氢氧化物-地塞米松磷酸钠(按含地塞米松磷酸钠量0.25mg/kg进行给药)，其余同哮喘组。

层状双氢氧化物（LDHs组）：每次激发前30 min腹腔注射LDHs，其余同哮喘组 

实施例4：地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物对哮喘大鼠气道阻力的影响

气道阻力的检测：末次激发后，腹腔注射麻醉大鼠，切开气管，插管，将含有适量乙酰胆碱的1mL注射器的针头插入颈外静脉内1cm，平衡系统，观测各组大鼠的气道阻力和肺顺应性。

随着乙酰胆碱浓度的增加，各组大鼠气道阻力均呈现不同的程度的升高。当乙酰胆碱激发浓度较低为10μg/kg和33μg/kg时，各组大鼠的气道阻力并没有明显区别。当乙酰胆碱浓度增加到100μg/kg时，哮喘组大鼠的气道阻力与对照组大鼠的气道阻力相比差异较为显著 (P<0.05)，地塞米松磷酸钠给药组和地塞米松磷酸钠-层状双氢氧化物均能降低哮喘大鼠的气道阻力，两者之间无显著性差异。而当乙酰胆碱浓度激发剂量较高达到330μg/kg时，单独药物处理组与纳米载药体系处理组气道阻力相比存在显著性差异 (P<0.05)，提示，地塞米松磷酸钠-层状双氢氧化物能够有效的降低哮喘大鼠的气道阻力。 

实施例5：地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物对哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13的影响 

取BALF上清液，采用ELISA（酶联免疫吸附法）检测BALF中IL-4和IL-13水平，ELISA试剂盒购自R&D公司，按说明书操作。

Th2细胞因子水平增高是哮喘的重要特征之一。如图6所示，哮喘组大鼠肺泡灌洗液中IL-4含量(84.43±12.41 pg/mL)明显高于对照组(23.18±7.61 pg/mL)，两者相比具有显著性差异(P<0.01)，LDHs给药组并不能抑制IL-4的生成。当地塞米松磷酸钠给药剂量为0.25mg/kg时，IL-4的生成明显受到抑制，与哮喘组相比差异较为显著 (P<0.05)，当给予哮喘大鼠含相同剂量药物的地塞米松磷酸钠-层状双氢氧化物时，IL-4的抑制程度更明显，与哮喘组相比，差异极为显著(P<0.01)，而与单独的地塞米松磷酸钠处理组相比，也存在一定的差异显著性 (P<0.05)。 

如图7所示，哮喘组大鼠肺泡灌洗液中IL-13的含量(155.39±15.36 pg/mL)显著高于对照组(34.58±34.72 pg/mL)(P<0.01)，地塞米松磷酸钠-层状双氢氧化物给药组虽然相对于地塞米松磷酸钠给药组更能抑制IL-13的产生，但两者之间并无显著性差异(P>0.05)。 

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不经过创造性的劳动，因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所作出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。 

Claims (6)

1.一种地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物作为治疗哮喘药物的应用，其特征在于所述地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物含有二价金属离子（M^Ⅱ）和三价金属离子（M^Ⅲ），层间含有阴离子，其中：M^Ⅱ为Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺或Zn²⁺中一种或两种，M^Ⅲ为Al³⁺、Cr³⁺、Mn³⁺、Fe³⁺、Co³⁺或Ni³⁺中一种或两种，层间阴离子为OH^-、CO3^2-、SO4^2-、Cl^-、NO3^-中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物中地塞米松磷酸钠的质量百分含量为10%-55%。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物的制备方法，具体步骤如下：

(1)配制浓度为0.1-0.5mol/L的可溶性二价金属离子和可溶性三价金属离子的混合盐水溶液，可溶性二价金属离子和可溶性三价金属离子的摩尔比为(1~3)：1；其中：M^Ⅱ为Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺或Zn²⁺中任一种，M^Ⅲ为Al³⁺、Cr³⁺、Mn³⁺、Fe³⁺、Co³⁺或Ni³⁺中任一种；层间阴离子为OH^-、CO3^2-、SO4^2-、Cl^-、NO3^-中的一种或两种；

(2)配制浓度为0.002~0.03mol/L的碱性溶液，所述的碱性溶液为NH₄OH、NaOH或Na₂CO₃中的一种或两种，配制浓度为0.001mol/L地塞米松磷酸钠溶液；

(3)将步骤(1)所得溶液加入到步骤(2)所得溶液中，反应温度为20~80℃，反应时间为2~5小时，离心，蒸馏水洗涤3~4次，得到地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物胶体；

(4)将步骤(3)制备的地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物放到水热反应釜中，水热反应时间为80℃~140℃，水热反应时间为10~20小时，得到地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物胶溶产物，真空干燥后得到地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物纳米材料。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的地塞米松磷酸钠层状双氢氧化物的给药方式为口服、注射或雾化给药中任一种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的地塞米松磷酸钠-层状双氢氧化物对大鼠的有效用量范围是每次0.2-0.3mg/kg，每日一次。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：地塞米松磷酸钠-层状双氢氧化物对大鼠的给药周期为两周，每周五天。