CN104274438A - 藤黄酸在制备预防或治疗脏器纤维化的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了藤黄酸的药物新用途，具体涉及藤黄酸通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)的表达从而抑制肺纤维化和肝纤维化的发生发展，以致于预防或治疗肺纤维化和肝纤维化。在上述应用中，其注射使用剂量范围是2mg～100mg；优选5～50mg。其口服使用剂量范围是5mg～500mg；优选10～200mg。

Description

藤黄酸在制备预防或治疗脏器纤维化的药物中的应用

技术领域

本发明涉及藤黄酸抑制脏器纤维化的发生发展从而预防或治疗脏器纤维化；具体涉及藤黄酸通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)的表达从而抑制肺纤维化和肝纤维化的发生发展，以致于预防或治疗肺纤维化和肝纤维化。

背景技术

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)又称为隐源性致纤维化性肺泡炎(cryptogenicfibrosing alveolitis，CFA)，是一种慢性炎症性间质性疾病，以普通型间质性肺炎(usual interstitialpneumonia，UIP)为特征性病理改变且病因不明。主要表现为成纤维细胞灶(fibroblastic foci)的出现致大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉，胶原积聚，肺泡结构破坏，最终导致正常肺组织结构的破坏，是一种慢性、进行性、不可逆转也是最常见的一种致命性肺疾病【King TJ，Pardo A，Selman M.Idiopathic pulmonary fibrosis[J].Lancet，2011，378(9807)：1949-1961.】。临床表现为进行性呼吸困难并伴有刺激性干咳，肺功能为限制性通气障碍，病情一般持续恶化，最终因呼吸衰竭而死亡。流行病学研究显示，IPF发病率呈不断上升趋势，目前约为16.3/100,000，且3年内急性恶化发生率为20.7％【Navaratnam V，Fleming KM，West J et al.The rising incidence of idiopathic pulmonary fibrosisin the UK[J].Thorax，2011，66(6)：462-467.；Song JW，Hong SB，Lim CM et al.Acuteexacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis：incidence，risk factors and outcome[J].Eur RespirJ，2011，37(2)：356-363.】。已知肺纤维化主要是肺组织受损后修复调节失控、重建异常所引起的病变，在这过程中，一系列细胞因子和生长因子等表达异常、炎症反应参与肺纤维化的发病过程。由此造成上皮细胞缺损、成纤维细胞增生和ECM积聚等主要病变，最终结果是成纤维细胞替代了行使正常功能的肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells，AECs)，导致了纤维化的发生。

肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，其降解活性相对或绝对不足，因此大量细胞外基质沉积下来形成肝纤维化。肝纤维化不是一个独立的疾病，而是许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化。如果肝纤维化同时伴有肝小叶结构的破坏(肝再生结节)，则称为肝硬化。肝硬化则是不可逆的。因此，在慢性肝病的治疗过程中，肝纤维化的防治占有重要地位。肝纤维化是由许多在肝星状细胞和肌异常激活的纤维母细胞中的纤维化介质，产生ECM的沉积和其他生长因子，形成肝纤维化【Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis.Gastroenterology.2008；134：1655-1669.】。

VEGF、PDGF和FGF在IPF扮演重要作用，抑制VEGF、PDGF和FGF可以明显抑制IPF的发生和进展(Fehrenbach H，Haase M，Kasper M，Koslowski R，Schuh D，Muller M.Alterations inthe immunohistochemical distribution patterns of vascular endothelial growth factor receptors Flk1and Flt1 in bleomycin-induced rat lung fibrosis.Virchows Arch1999；435：20-31.；Hetzel M，Bachem M，Anders D，Trischler G，Faehling M.Different effects of growth factors on proliferationand matrix production of normal and fibrotic human lung fibroblasts.Lung2005；183：225-237.；Lappi-Blanco E，Soini Y，Kinnula V，Paakko P.VEGF and bFGF are highly expressed inintraluminal fibromyxoid lesions in bronchiolitis obliterans organizing pneumonia.J Pathol2002；196：220-227.；Chaudhary NI，Roth GJ，Hilberg F，Müller-Quernheim J，Prasse A，Zissel G，Schnapp A，Park JE.Inhibition of PDGF，VEGF and FGF signalling attenuates fibrosis.Eur Respir J.2007；29(5)：976-985.；Gurujeyalakshmi G，Hollinger MA，Giri SN.Pirfenidone inhibits PDGFisoforms in bleomycin hamster model of lung fibrosis at the translational level.Am J Physiol.1999；276(2Pt1)：L311-318.)。吡非尼酮抑制通过抑制VEGF、PDGF和FGF表达抑制肝纤维化【Salazar-Montes A，Ruiz-Corro L，Lopez-Reyes Al.Potent antioxidant role of pirfenidone inexperimental cirrhosis.Eur J Pharmacol.2008；595：69-77.】

藤黄(gamboge)为藤黄科植物藤黄树Garcinia hanbaryi Hook.f.分泌的干燥树脂。其主产于柬埔寨、印度、泰国和越南，我国广东省和海南省均有栽培。传统医学对其早有记载，藤黄性寒，味酸、辛、涩，有毒，具破血散结、解毒、止血、杀虫之功效，被用于治疗瘰疬、痈疸、疖肿等顽疾【杨企铮，贾淑杰，李德华.中药藤黄的近代研究[J].中国肿瘤临床，1994，21(6)：464-466.】。藤黄在国外常被用作利尿剂，治疗水肿和脑出血时的血压升高，现已收载于《美国药典》第10版【王鸣，冯煦，赵友谊.中药藤黄的研究和应用[J].中国野生植物资源，2003，22(1)：1-3.】。藤黄酸为藤黄的主要活性成分。藤黄酸分子式为C₃₈H₄₄O₉，相对分子质量为628.34，为橙黄色无定型粉末。文献报道藤黄酸对于多数肿瘤细胞都具有抑制作用【郭青龙，赵丽，尤启东，等.藤黄诱导人胃癌SGC-7901细胞的凋亡作用[J].中国天然药物，2004，2(2)：106-108.；刘静冰，秦叔逵，李进.藤黄酸抗胰腺癌作用的实验研究[J].临床肿瘤学杂志，2005，10(3)：472.】，但藤黄酸在预防或治疗肝纤维化和肺纤维化的药理作用未见报道。本发明人通过大量的研究发现藤黄酸可以通过抑制VEGF、PDGF和FGF的表达从而在预防或治疗肝纤维化和肺纤维化方面有明显的作用。基于此，本发明人发明了藤黄酸通过抑制VEGF、PDGF和FGF的表达从而抑制肺纤维化的发生发展，以致于预防或治疗肝纤维化和肺纤维化。

发明内容

本发明提供了藤黄酸在抑制VEGF、PDGF和FGF表达的药物中的应用。

本发明提供了藤黄酸在制备预防或治疗脏器纤维化的药物中的应用。

本发明提供了藤黄酸在制备预防或治疗肺纤维化的药物中的应用。

本发明提供了藤黄酸在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。

发明提供的药物在用于肝纤维化和肺纤维化时，其注射使用剂量范围是2mg～100mg；优选5～50mg。其口服使用剂量范围是5mg～500mg；优选10～200mg。

本发明还提供了由藤黄酸和药学上可接受的载体或辅料组成的药物，该药物可以以药学常规方法制备成片剂、胶囊剂、滴丸剂、注射液、冻干粉针，优选以片剂或冻干粉针形式存在。

具体实施方式

实施例1  藤黄酸冻干粉针制备

取藤黄酸5.0g，加注射用水2000ml使其溶解，以NaOH调pH＝5.5～7.5，加甘露醇8g，搅拌溶解，超滤，得到无热源的澄清液，灌入10ml西林瓶中，2ml/只，按冻干粉针工艺冻干，制成每支含藤黄酸5.0mg的冻干粉针。

实施例2  藤黄酸片剂制备

称取10.0g藤黄酸、65.0g糖粉、70.0g乳糖和53.0g羧甲基淀粉钠充分混合均匀后过100目筛，加入适量的3％PVP_K30水溶液适量制软材，20目筛制粒，60℃干燥3小时，18目筛整粒，加入2.0g硬脂酸镁，混合均匀后浅凹冲压，调节片重约200mg，即得。

具体实施方式

试验例1藤黄酸对A549细胞株VEGF、PDGF和FGF表达的影响

1.1实验材料

DMEM培养基为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品，TGF-β1购自PeproTech公司，A549细胞购自中国典型培养物保藏中心，用含10％胎牛血清(Hyclone公司)的低糖DMEM培养基(GIBCO公司)，常规培养于5％的CO₂，37℃人工培养箱中，细胞呈贴壁生长。VEGF、PDGF和FGF一抗购买于sigma公司。

藤黄酸(纯度98.9％，购买于广州牌牌生物科技有限公司)

1.2试验方法

当细胞生长融合至70％-80％，用无血清培养基饥饿24h，换新鲜培养液，将传代的A549细胞分为：(1)阴性对照组；(2)TGF-β1处理组(5μg/L作用时间48h)；(3)TGF-β1处理组(5μg/L作用时间48h)+藤黄酸0.1μM；(4)TGF-β1处理组(5μg/L作用时间48h)+藤黄酸0.3μM；(5)TGF-β1处理组(5μg/L作用时间48h)+藤黄酸1μM。BCA蛋白测定试剂盒(Pierce公司)测定蛋白浓度后，取50μg样品蛋白进行10％的十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶变性电泳、然后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入VEGF、PDGF和FGF一抗，β-actin作内参，Western blot检测细胞VEGF、PDGF和FGF蛋白的表达。以TGF-β1未刺激组作为对照，计为相应蛋白的100％，分析各药物浓度对VEGF、PDGF和FGF蛋白的表达差异。组间进行T检验。

表1藤黄酸对TGF-β1刺激A549细胞的VEGF、PDGF和FGF表达影响(n＝5)

^*，P＜0.05，^**，P＜0.01，与单纯TGF-β1刺激组比较

表1结果可以看出，TGF-β1刺激A549细胞48小时，VEGF、PDGF和FGF表达明显增加，而加藤黄酸0.3-30μM后48小时，VEGF、PDGF和FGF表达明显下降，说明藤黄酸抑制TGF-β1刺激的肺泡上皮细胞分泌VEGF、PDGF和FGF。

试验例2藤黄酸对博莱霉素(BLM)诱导的肺纤维化模型大鼠的影响

2.1实验材料

博莱霉素购于上海拜力生物科技有限公司

羟脯氨酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所

实验动物：SPF级Sprague Dawley大鼠，雄性，体重150g-200g，山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为：SYXK(鲁)20030020。

藤黄酸(纯度98.9％，购买于广州牌牌生物科技有限公司)

2.2试验方法

100只大鼠，10％水合氯醛麻醉(350mg/kg，ip)，采用支气管内注射博莱霉素(5mg/kg)诱导肺纤维化模型。造模型2天后分组，分为模型组、藤黄酸灌胃给药组1、藤黄酸灌胃给药组2、藤黄酸灌胃给药组3、藤黄酸灌胃给药组4，藤黄酸静脉给药组1、藤黄酸静脉给药组2、藤黄酸静脉给药组3、藤黄酸静脉给药组4，连续给药4周。处死动物，取肺，称重，计算肺指数，形态学改变分级肺泡炎和肺纤维化分级按文献[Szapiel S V，Elson N A，Fulmur JD，et al.Bleomycin induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse[J].AmRev Respir Dis，1979，120：893-899]，将肺泡炎和肺纤维化的程度分为4级：0级无明显改变；1级轻度改变，病变范围小于全肺的20％；2级中度改变，病变范围占全肺的20％～50％；3级重度改变，病变范围占全肺的50％以上。测定肺组织羟脯氨酸含量，western blot分析HMGBl表达。

表2藤黄酸对博莱霉素(BLM)诱导的肺纤维化模型大鼠的影响

^*，P＜0.05，^**，P＜0.01，与模型组比较

表2结果显示藤黄酸灌胃给药组1、藤黄酸灌胃给药组2、藤黄酸灌胃给药组3、藤黄酸灌胃给药组4，藤黄酸静脉给药组1、藤黄酸静脉给药组2、藤黄酸静脉给药组3、藤黄酸静脉给药组4，连续给药4周可以明显降低肺指数，降低纤维化分级，降低肺组织羟脯氨酸含量，说明藤黄酸灌胃给药或静脉给药给药均可抑制肺纤维化的发生发展。其中藤黄酸灌胃给药组3(20mg/kg)与藤黄酸灌胃给药组4(50mg/kg)比较，无明显差异；藤黄酸静脉给药组3(5mg/kg)与藤黄酸静脉给药组4(10mg/kg)比较，无明显差异。

试验例3藤黄酸对慢性肝炎肝纤维化的影响

3.1药品与试剂

藤黄酸(纯度98.9％，购买于广州牌牌生物科技有限公司)

HA(透明质酸)、LN(层粘连蛋白)及PcIII(III型胶原)放免试剂盒购买于上海海研医学中心；羟脯氨酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

实验动物：SPF级Sprague Dawley大鼠，雄性，体重150g-200g，山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为：SYXK(鲁)20030020。

3.2实验方法：

大鼠130只，随机分为10组，即正常对照组、模型组、藤黄酸静脉注射0.2mg/kg、0.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg组；藤黄酸灌胃0.5mg/kg、1mg/kg、20mg/kg、50mg/kg组，每组10只。除正常对照组外，大鼠每3d每100g体重皮下注射40％四氯化碳油溶液0.3ml，首剂量加倍，正常对照组大鼠每3d皮下注射油溶液0.3ml/100g体重，6周后各组开始给药，连续给药6周，给药结束后用20％乌拉坦溶液腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，取肝小叶组织，部分于-80℃保持，其余用10％中性福尔马林溶液固定，24-48h内制石蜡块。肝组织病理学检查采用HE染色，纤维增生程度分为0-4级【栗坤，赵玉珍，朱秋霜等.川芎嗪对老龄小鼠心、肝超氧化物歧化酶活力的影响.黑龙江医药科学，1998；21：4-5】，对血清中HA(透明质酸)、LN(层粘连蛋白)及PcIII(III型胶原)、及肝中HYP(羟脯氨酸)进行测定，HA、LN、PcIII、HYP按检测试剂盒测定方法测定。肝组织匀浆，裂解细胞提取细胞总蛋白。BCA蛋白测定试剂盒(Pierce公司)测定蛋白浓度后，取50μg样品蛋白进行10％的十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶变性电泳、然后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入HMGB1、E-cad一抗，β-actin作内参，Western blot检测细胞HMGB1和E-cad(上皮细胞标记物)蛋白的表达。以TGF-β1未刺激组作为对照，计为相应蛋白的100％，分析各药物浓度对VEGF、PDGF和FGF蛋白的表达差异。组间进行T检验。

3.3实验结果

病理学检查：正常对照组大鼠肝脏结构正常；模型组大鼠肝脏12周均出现明显的纤维化；藤黄酸各组中纤维化程度均较模型组轻。

光镜观察：HE常规染色和VG胶原染色肝组织切片显示，肝纤维化模型对照组大鼠肝组织中可见肝细胞脂肪变性，坏死，炎细胞浸润；汇管区内胶原纤维沉积，Henny管增生；纤维结缔组织增生明显，纤维间隔增粗，并有典型假小叶形成。藤黄酸治疗组大鼠肝组织纤维结缔组织增生程度减轻，纤维间隔变细，假小叶形成不明显。对各组纤维增生程度分值进行秩和检验。结果见表3，藤黄酸静脉注射0.2mg/kg、0.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg组与藤黄酸灌胃0.5mg/kg、1mg/kg、20mg/kg、50mg/kg组均能够明显降低纤维增生程度，结果见表3。

电镜观察：正常对照组大鼠肝细胞间紧密相连，细胞内各种细胞器分布规整，结构典型。血窦排列整齐，Disse腔内可见肝贮脂细胞，细胞质内有脂滴。模型对照组大鼠肝组织中则出现典型的肝细胞损伤结构，相邻肝细胞间隙增宽，肝细胞变性坏死，核固缩，细胞质内出现大小不等、分布不规则的脂滴。肝组织中存在轻重不等的纤维化病变。肝窦毛细血管化，Disse间隙内可见较多成纤维细胞(活化的肝贮脂细胞)，且周围有大量胶原纤维沉积。汇管区内可出现大量的胶原纤维。藤黄酸治疗组中，肝细胞损伤有不同程度的减轻，肝细胞间隙较紧密，细胞质内脂肪小滴减少，细胞内结构趋向正常。肝纤维化病变不明显，肝血窦和Disse间隙内胶原纤维沉积及成纤维样细胞数量减少。

表3藤黄酸对大鼠肝纤维化病理形态的影响(n＝10)

^*，P＜0.05，^**，P＜0.01，与模型组比较

血清HA、LN、PcIII、HYP检测结果见表4，藤黄酸静脉注射0.2mg/kg、0.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg组与藤黄酸灌胃0.5mg/kg、1mg/kg、20mg/kg、50mg/kg组均能明显降低HA、LN、PcIII、HYP水平(与模型对照组比较，p＜0.05或0.01)。

表5结果可以看出，模型组动物肝组织VEGF、PDGF和FGF表达明显增加，而各藤黄酸给药组VEGF、PDGF和FGF表达明显下降，说明藤黄酸抑制肝纤维化动物苷组织分泌VEGF、PDGF和FGF。

表4藤黄酸对肝纤维化大鼠HYP、HA、LN及PCIII含量的影响((n＝10))

^*，P＜0.05，^**，P＜0.01，与模型组比较

表5藤黄酸对肝纤维化大鼠肝组织VEGF、PDGF和FGF表达影响(n＝10)

^*，P＜0.05，^**，P＜0.01，与模型组比较

Claims (6)

1.本发明提供了藤黄酸在制备预防或治疗脏器纤维化的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，藤黄酸是通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)表达达到预防或治疗脏器纤维化的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，预防或治疗脏器纤维化具体包括预防或治疗肝纤维化和肺纤维化的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，藤黄酸在用于预防或治疗肝纤维化和肺纤维化时，其注射使用剂量范围是2mg～100mg；优选5～50mg。其口服使用剂量范围是5mg～500mg；优选10～200mg。

5.根据权利要求4所述的应用，藤黄酸是由药学上可接受的载体或辅料组成的药物，以药学常规方法制备成片剂、胶囊剂、注射液、冻干粉针。

6.根据权利要求5所述的应用，由藤黄酸组成的药物优选以片剂或冻干粉针存在。