CN104271772A - 点击核酸 - Google Patents

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C·J·克罗新
席伟贤
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Abstract

本发明披露点击核酸单体和含有这些单体的聚合物。所述点击核酸单体包括任选保护的硫醇部分、任选保护的硫醇-点击受体部分及任选保护的核碱基(NB)，在一些实例中，所述核碱基为A、G、T、U或C核碱基。在一些实例中，所述点击核酸单体包括N-乙烯基硫醇乙酰胺(VTA)主链。在其它实例中，所述点击核酸单体包括N-乙烯基硫醇乙胺(VTE)主链。本发明还披露了使用这些聚合物例如代替如DNA或RNA等天然存在的核酸聚合物应用，及如PNA或吗啉基核酸等合成核酸聚合物应用的方法。

Description

点击核酸
技术领域
本发明涉及核酸模拟物，并且具体地说，涉及具有硫醚主链的核酸模拟物，制备这些核酸模拟物的方法及其用途。
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年3月29日申请的美国临时申请第61/617,145号的优先权益，所述申请是以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
核酸类分子，如DNA、RNA和PNA，在生物学和生物医学系统(不管是用于基因敲除、作为适体、用于药物递送和靶向)、生物检测和许多其它领域中的实施和激励人心的应用的水平持续不断增加。
DNA是最有能力并且最强大的分子之一：充当遗传材料或作为适体；与互补链杂交；在转录/翻译中起作用并且能够诱导纳米结构的组织和形成。不幸的是，DNA的技术利用任然惊人地昂贵和/或难以广泛实施，只能用于最有价值的应用中，特别是作为材料。作为合成替代物，开发出了肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)并且发现PNA能与互补PNA或DNA分子杂交。
首个PNA是使用氨基乙基甘氨酸(aminoethylglycin，AEG)主链合成的，所述主链是基于基本分子模型选择，其指示了与DNA的磷酸核糖主链类似的重复单元距离和最佳的键角。自发现PNA起，已经合成并评价了若干PNA变体，揭露了杂交所需的基本结构限制。最关键的限制看来是沿所述链的主链的侧接核碱基之间的距离，这一距离最佳为六个碳原子。尽管已观察到在核碱基之间具有5或7个原子的间隔子的PNA与ssDNA杂交，但如通过较高的熔融温度所指示，具有6个原子的间隔子的PNA主链变体展现出较高的稳定性。PNA已经被广泛用于自组装和靶向性药物递送中。尽管PNA具有优于DNA的益处，但它们受到形成反应的特征以及肽主链的限制。这些问题中有需要反应物大量过量、相对较慢的反应动力学和对于副反应的诸多关注。因此，需要另外的核酸模拟物。本发明满足了这一需求。
发明内容
本文披露了可以用于产生聚硫醚核酸的单体CNA分子、结构或结构单元。在一些实施例中，硫醚核酸单体包括任选保护的硫醇部分、任选保护的硫醇-点击受体(click acceptor)、任选保护的核碱基以及包括如碳(C)、氮(N)或硼(B)等3价或更高价态的原子的主链。所述硫醇、所述硫醇-点击受体和所述核碱基是通过共价键独立地连接到所述主链。在一些实例中，所述主链包括3价或更高价态的另外的原子。在一些实施例中，所述硫醚核酸单体另外包括连接子，其中所述连接子将所述核碱基共价连接到所述3价或更高价态的原子。在一些实例中，所述连接子包括-C(O)C-。在一些实施例中，所述连接子和所述核碱基为核碱基侧链(nucleobase sidechain，NS)。
在一些实施例中，点击核酸单体具有以下结构：
其中Z为具有3价或更高价态的主链原子，例如C、N或B硼；NS是核碱基侧基，其包括任选保护的核碱基(NB)和任选存在的连接子，用于连接所述NB与Z；T为任选保护的硫醇；并且TCA是任选保护的硫醇-点击受体。
在一些实施例中，点击核酸主链包括一个或多个3价或更高价态的另外的原子，例如C、N或B。
在一些实施例中，点击核酸单体具有以下结构：
其中Y和Z为具有3价或更高价态的原子(例如碳、氮和硼)；n为0到4的整数；NS是核碱基侧基，其包括任选保护的核碱基；T为任选保护的硫醇；并且TCA是任选保护的硫醇-点击受体。
在一些实施例中，点击核酸单体具有以下结构：
其中Y和Z为具有3价或更高价态的原子；n和m独立地为0到4的整数；NS是核碱基侧基，其包括任选保护的核碱基；T为任选保护的硫醇；并且TCA是任选保护的硫醇-点击受体。
在一些实施例中，点击核酸单体具有以下结构：
其中Y和Z为具有3价或更高价态的原子；n和m独立地为0到4的整数；NS是核碱基侧基，其包括任选保护的核碱基；T为任选保护的硫醇；并且TCA是任选保护的硫醇-点击受体。
在一些实施例中，点击核酸单体具有以下结构：
其中n+m介于1与7之间，n>0并且m>0；NS为核碱基侧基，包括任选保护的核碱基；T为任选保护的硫醇并且TCA为任选保护的硫醇-点击受体；Z为3价或更高价态的原子；并且R1和R2独立地为氢、羟基、芳香族基团、胺、羧基和羰基的组合，这些基团任选被取代。
在一些实施例中，所述点击核酸单体另外包括连接子，其中所述连接子将所述核碱基共价连接到所述3价或更高价态的原子。在一些实例中，所述连接子包括-C(O)C-。在一些实施例中，所披露的点击核酸单体包括N-乙烯基硫醇乙酰胺(N-vinyl thiol acetamide，VTA)主链。在其它实施例中，所披露的点击核酸单体包括N-乙烯基硫醇乙胺(N-vinyl thiol ethylamine，VTE)主链。
还披露了点击核酸聚合物，所述聚合物包括所披露的硫醚核酸单体，如所披露的硫醚单体中的一种或多种。这些聚合物是在硫醇部分与硫醇-点击受体部分的末端之间端接的。在一些实例中，CNA分子与一个或多个另外的分子(如效应分子)偶联。在一些实施例中，例如作为治疗剂，所述硫醚核酸聚合物是以组合物(如包括药学上可接受的载剂的组合物)形式提供。还涵盖使用这些聚合物例如代替DNA、RNA、吗啉基核酸(morpholino nucleic acid，MNA)和/或合成核酸模拟物(如PNA)的方法。
本发明的前述和其它特征和益处将从以下具体实施方式而变得更清楚，所述具体实施方式是参照附图进行的。
附图说明
图1示出了寡核苷酸种类DNA、PNA和CNA的可能结构。描绘了主链聚合物从天然生物聚合物DNA到由PNA和一种可能的CNA结构(如本文所披露)形成的人工生物聚合物的结构演变。在这一实例中，CNA主链被设计成具有与PNA和DNA类似的分子间距，具有由本文所披露的硫醇-烯点击反应形成的硫醚主链，并且具有与包括DNA在内的其它寡核苷酸杂交以诱导控制性组装和生物功能性的能力。
图2是示范性普遍化自由基介导的硫醇-烯‘点击’反应机制的示意图。硫醇-烯反应经历了快速的连续增长和链转移机制，实现了硫醇与乙烯基(‘烯’)官能团之间的高选择性加成。极高的反应效率使得低浓度光引发剂能实现反应的时空控制。对于CNA聚合物形成，R1和R2分别表示CNA聚合反应中的第一和第二CNA单体。尽管描绘了硫醇-烯反应机制，但如本文所披露，所述反应可以在硫醇部分与任何硫醇-点击受体(如炔、卤化物、异氰酸酯或环氧部分等)之间发生。
图3示出了两个硫醇-烯光聚合反应的官能团转化，展现了完全转化。示出了三乙烯基醚与二硫醇单体(左)及三烯丙基醚与二硫醇单体(右)的化学计量混合物的聚合反应中的‘烯’转化。尽管未示出，但硫醇转化遵循相同的转化特征，指示烯与硫醇之间的一对一反应动力学。这一结果展现了硫醇-烯的化学计量混合物反应实现反应物的完全转化的容易性和快速是本文所述的许多所提出的实施方案的关键。这些反应是在10mW/cm2的365nm光下以0.1wt％羟基-环己基-苯基-酮光引发的。
图4示出了基于N-乙烯基硫醇乙胺(VTE)的CNA单体结构。所述基本单体含有被保护的硫醇、乙烯基和核碱基(NB)并且具有6个原子的重复单元。
图5是显示胞嘧啶-CNA单体(C-CNA)的合成的示意图。CNA单体合成是以用甲氧基三苯甲基保护硫醇(步骤i)开始，并且经由溴乙酸的酰胺偶合(步骤ii)随后乙烯基添加到仲胺(步骤iii)来进行。胞嘧啶是Boc保护的并且与侧接的溴代乙酰胺偶合(步骤iv)以形成被保护的产物。所有产物都是由NMR确定并且百分含量是每个步骤的初步(即，非优化的)产率。
图6示出了在25℃(顶图)和经由温度扫描确定的熔融温度(底图)下，在存在和不存在互补G-DNA(分别为蓝色方形和绿色圆形)情况下C-CNA寡聚物的CD光谱图。CNA-DNA杂交物的熔融温度(Tm)大于DNA-DNA杂交物的熔融温度，并且所述熔融温度受单碱基错配(即，单核苷酸多态性或SNP)影响较大，分别指示较高程度的稳定性和选择性。*应注意：DNA-DNA的熔融温度是使用BioMath计算器计算。
图7示出了侧接的溴代乙酰胺易于与四种核碱基中的任一种偶合以形成1)腺嘌呤(A)-CNA单体、2)胸腺嘧啶(T)-CNA单体、3)鸟嘌呤(G)-CNA单体和4)胞嘧啶(C)-CNA单体(Boc保护的)。
图8示出了基于N-乙烯基硫醇乙酰胺(VTA)的CNA单体的合成方案。使用甲氧基三苯甲基保护巯基乙酸酯的硫醇基(步骤iv)，同时将乙烯基添加到溴代乙酰胺中(步骤v)。两种产物通过碳化二亚胺偶合(步骤vi)以形成具有侧接溴代乙酰胺的CNA，将核碱基添加于其中。
图9示出了利用固体基质进行的CNA的合成。核碱基(NB)基团不受硫醇-烯偶合影响，所述偶合是使用可见光和光引发剂进行，随后去除Mmt保护基。重复这一过程以制备具有多个核碱基(NBx)的CNA，并且然后使其从基质裂解，得到CNA产物。
图10示出了基本CNA单体结构，其中R1对于VTE和VTA分别为氢(H)或羰基(＝O)。
图11示出了并入了与核碱基侧链发生硫醇-点击反应的能力的示范性CNA单体的一般结构，其中n+m介于1与7之间，并且n≥0并且m>0，NS是核碱基侧基，PG是硫醇保护基(可以被去除)，并且R1可以为硫醇-点击受体，如乙烯基、炔、卤化物、异氰酸酯或环氧基等。R2侧基可以为氢、羟基、芳香族基团、胺、羧基和羰基官能团的组合。R3为3价或更高价态的原子，如碳或氮。
图12示出了如图11中所描述的示范性单体的结构，其中n+m介于1与7之间，并且n≥0并且m>0，NS是核碱基侧基，PG是硫醇保护基，EWG是拉电子基团，其可以为任选包括的。R1侧基可以为氢、羟基、芳香族基团、胺、羧基和羰基官能团的组合。
图13示出了基于乙烯基醚和基于丙烯酸酯的CNA单体的结构，其中n+m介于1与7之间，并且n≥0并且m>0，NS是核碱基侧基，PG是硫醇保护基(可以被去除)。R1侧基可以为氢、羟基、芳香族基团、胺、羧基和羰基官能团的组合。
图14示出了并入与核碱基侧链发生硫醇-点击反应的能力的单体的一般结构，其中n+m介于1与7之间，并且n≥0并且m>0，NS是核碱基侧基，PG是硫醇保护基(可以被去除)。R1侧基可以为氢、羟基、芳香族基团、胺、羧基和羰基官能团的组合。R3为3价或更高价态的原子，如碳或氮。
图15示出了示范性单体和其聚合物产物的结构。
图16是经由光学直写式光刻技术制造可定址CNA阵列的说明。最初，使用聚焦激光使CNA与硫醇化表面发生空间选择性反应。随后使用封端来防止错误增长，使用添加、偶合、冲洗及脱除保护基的单体合成循环迅速制造这些序列。
图17是在生物学、化学、工程科学和材料科学中合成、开发和实施CNA的可能的总体方法的说明。通过硫醇-烯点击化学组装的CNA有可能具有DNA的益处及其在自组装、纳米技术、医学和生物技术中进行大规模开发的独特能力。
图18A和18B示出了示范性未保护的CNA单体，其中NB是核碱基。
图19是说明使用CNA-DNA(荧光)杂交分子修饰表面的方法的示意图。
图20是显示使用荧光检测表面上的CNA-DNA(F)杂交物的结果的直方图。
序列表的简要说明
本文显示的核酸和氨基酸序列是使用如37C.F.R.1.822中所定义的核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写显示。仅显示出每个核酸序列的一条链，而互补链应理解为通过任何参考所展示的链而包括在内的。序列表是作为ASCII文本文件以文件名为COL_0110WP_ST25.txt的形式提交，所述文件是于2013年3月11日创建，1千字节并且通过引用并入本文中。
SEQ ID NO:1和2是KRAS的示范性核酸序列。
具体实施方式
I.术语概述
以下提供术语和缩写的解释以更好地描述本发明并且指导本领域技术人员实践本发明。除非上下文另作清楚规定，否则如本文所使用，“包含”意思指“包括”并且单数形式“一个(种)(a/an)”或“所述”包括复数形式参考物。除非上下文另作清楚规定，否则术语“或”是指所陈述的替代性要素中的单一要素或者两种或更多种要素的组合。
除非另作指示，否则如本说明书或权利要求书中所使用的表示组分的数量、分子量、百分含量、温度、时间等的所有数字都应理解为以术语“约”修饰。因此，除非另作含蓄地或明确地指示，否则所陈述的数字参数是近似值，其可以取决于在标准测试条件/方法下所寻求的所希望的特性和/或检测限。当直接并且明确地将实施例与所论述的现有技术相区分时，除非叙述“约”一词，否则实施例的数量并非近似值。
除非另作规定，否则技术性术语是根据常规用法使用。分子生物学中常见术语的定义可以见于本杰明雷文(Benjamin Lewin),《基因IX》(Genes IX),琼斯与巴利特出版社(Jones and Bartlet)出版,2008(ISBN 0763752223)；肯德鲁(Kendrew)等人(编),《分子生物学百科全书》(The Encyclopedia of Molecular Biology),布莱克威尔科技有限公司(Blackwell Science Ltd.)出版,1994(ISBN0632021829)；及罗伯特A.米尔斯(Robert A.Meyers)(编),《分子生物学与生物技术综合参考书》(Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference),VCH出版公司(VCH Publishers,Inc.)出版,1995(ISBN 9780471185710)。化学中常用术语的定义可以见于雷查德J.李维斯Sr.(Richard J.Lewis,Sr.)(编),《霍利简明化学词典》(Hawley’s Condensed ChemicalDictionary),约翰威立出版公司(John Wiley&Sons,Inc.)出版,1997(ISBN 0-471-29205-2)。
为了便于本发明各种实施例的评述，提供以下特定术语的解释：
投药：通过任何有效途径提供或给予受检者药剂，如本文所述的点击核酸(CNA)。示范性投药途径包括(但不限于)局部、注射(如皮下、肌肉内、真皮内、腹膜内、肿瘤内和静脉内)、口服、舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。
动物：活的多细胞脊椎动物生物体，此类别包括例如哺乳动物。“哺乳动物”包括人类和非人类哺乳动物，如小鼠。术语“受检者”包括人类和动物受检者，如小鼠。在一些实例中，受检者是患者。
反义化合物：是指这样一种寡聚化合物，所述化合物与靶核酸分子中其所杂交的区域至少部分互补(例如具有至少部分互补的核碱基的CNA)。如本文所使用，对靶核酸分子具有“特异性”的反义化合物是与所述靶核酸分子特异性杂交并且调节其表达的化合物。如本文所使用，“靶”核酸是反义化合物被设计成与其特异性杂交并且调节其表达的核酸分子。
反义化合物的非限制性实例包括引物、探针、反义寡核苷酸和包含这些的CNA。
烷氧基：-OZ1基团，其中Z1选自由以下各基团组成的群组：烷基、被取代的烷基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基、被取代的杂环烷基、硅烷基及其组合，如本文所述。适合的烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、苯甲氧基、叔丁氧基等。相关术语有“芳氧基”，其中Z1选自由以下基团组成的群组：芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基及其组合。适合的芳氧基的实例包括苯氧基、被取代的苯氧基、2-吡啶氧基、8-喹啉氧基等。
炔部分：在两个碳原子之间具有三键的烃，具有式–CCR1，其中R1可以独立地为氢、烃基、被取代的烃基、被取代的杂环基、烷基、被取代的烷基、酰基、-C(O)R、-C(O)OR或-C(O)NRaRb，芳基或被取代的芳基或杂环。
烷基：直链、分支链或环状烃链，包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基及联烯基(allenyl)。
烷基可以任选被一个或多个可以相同或不同的烷基取代基取代，其中“烷基取代基”包括烷基、卤代基、芳基氨基、酰基、羟基、芳氧基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳烷氧基、芳烷硫基、羧基、烷氧羰基、氧代基及环烷基。沿烷基链可以任选地插入一个或多个氧、硫或者被取代或未被取代的氮原子，其中氮取代基是氢、烷基(本文又称为“烷基氨基烷基”)或芳基。“分支链”是指这样一种烷基，其中烷基(如甲基、乙基或丙基)连接到直链烷基链。
氨基：基团-NZ1Z2，其中Z1和Z2各自独立地选自由以下各基团组成的群组：氢；烷基、被取代的烷基、环烷基、被取代的环烷基、杂环烷基、被取代的杂环烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、硅烷基及其组合。
适体：结合特定靶分子(如靶生物分子，例如分析物，如靶分析物)的小核酸和分子。在一些实例中，适体为CNA分子。
芳基：芳香族取代基，其可以为单一芳香族环，或稠合在一起、共价连接或与如亚甲基或亚乙基部分等共同基团连接的多个芳香族环。所述共同连接基团还可以是羰基(如在苯甲酮中)或氧(如在二苯基醚中)或氮(如在二苯基胺中)。芳香族环可以包括苯基、萘基、联苯、二苯基醚、二苯基胺及苯甲酮等。在特定实施例中，术语“芳基”意思指包含约5到约10个碳原子的环状芳香族基团，包括5元和6元烃和杂环芳香族环。
芳基可以任选地被一个或多个可以相同或不同的芳基取代基取代，其中“芳基取代基”包括烷基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基、酰基、卤代基、硝基、烷氧羰基、芳氧羰基、芳烷氧基羰基、酰氧基、酰基氨基、芳酰基氨基、氨甲酰基、烷基氨甲酰基、二烷基氨甲酰基、芳硫基、烷硫基、亚烷基和--NR'R”，其中R'和R”可以各自独立地为氢、烷基、芳基及芳烷基。
芳基的具体实例包括(但不限于)环戊二烯基、戊基、呋喃、噻吩、吡咯、吡喃、吡啶、咪唑、异噻唑、异噁唑、吡唑、吡嗪、嘧啶等。
(CNA与寡核苷酸)结合或稳定结合：如果足量的CNA与其靶核酸形成碱基对或杂交，那么所述CNA结合或稳定结合到靶，如靶核酸。
结合可以通过物理特性或功能特性进行检测。靶与寡核苷酸或CNA之间的结合可以通过本领域技术人员已知的任何程序检测，包括功能(例如表达和/或活性的降低)和物理结合检验。
接触：以直接物理缔合的方式放置，包括呈固体或液体形式，例如使样品与CNA接触。接触可以在体外发生，例如在诊断检验中；或在体内发生，例如通过向受检者投予药剂实现。
共价键：两个原子之间的原子间键，以这些原子共用一个或多个电子对为特征。术语“共价结合”或“共价连接”是指使两个单独的分子成为一个连续的分子，例如核碱基和CNA主链，或CNA分子与第二分子(如效应分子)。
可检测标记：与第二分子(例如CNA分子)直接或间接偶联以便利第二分子的检测的可检测分子(又称为标记)。举例来说，可检测标记物能够通过诊断成像技术(如CT扫描、MRI、超声波、光纤检查和腹腔镜检查)进行检测。可检测标记物的具体的非限制性实例包括荧光团、化学发光试剂、酶连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如通过MRI检测的超顺磁氧化铁纳米晶体)。标记多肽的各种方法是本领域中已知的并且都可以使用。
检测：用以确定一种试剂(如信号或特定CNA探针，或结合此类CNA探针的分子)存在或不存在。在一些实例中，这可以另外包括定量。
效应分子：预期具有或产生所希望的作用，如治疗作用、检测或其它物理作用，如(但不限于)效应分子的定位的一种分子。效应分子包括如多肽、放射性同位素和小分子(例如药物)及标记等分子。
拉电子基团：将电子从乙烯基键拉走的任何取代基。示范性拉电子基团包括羟基、烷氧基、巯基、卤素、羰基、磺酰基、腈、季胺、硝基、三卤代甲基、亚胺、脒、肟、硫酮、硫酯或硫酰胺。
环氧化物：具有三个环原子的环状醚，其中两个原子为碳并且剩余原子为与两个碳键接的氧。
卤化物或卤代基：来自Br、Cl、I和F的群组的原子。
杂原子：除碳以外的原子。在一些实施例中，杂原子选自由以下各原子组成的群组：N、O、P、S、Si、B、Ge、Sn及Se。
杂环基或杂环的：在至少一个环中具有至少一个杂原子并且在每个环中优选具有5或6个原子的任选取代的、完全饱和或不饱和、单环或双环的芳香族或非芳香族基团。杂环基团优选在环中具有1或2个氧原子、1或2个硫原子和/或1到4个氮原子，并且可以通过碳或杂原子键接到分子的其余部分。示范性杂环基包括杂芳族基团，如呋喃基、噻吩基、吡啶基、噁唑基、吡咯基、吲哚基、喹啉基或异喹啉基等。示范性取代基包括以下一个或多个基团：烃基、被取代的烃基、酮基、羟基、被保护的羟基、酰基、酰氧基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、卤素、酰胺基、氨基、硝基、氰基、硫醇、缩酮、缩醛、酯及醚。
杂交：寡核苷酸和其类似物(如CNA)在互补碱基之间通过氢键杂交，所述氢键包括沃特森-克里克(Watson-Crick)氢键、胡格斯丁(Hoogsteen)或反向胡格斯丁氢键。一般来说，核酸由嘧啶类(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤类(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))含氮碱基组成。这些含氮碱基在嘧啶与嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤键接称为“碱基配对”。更具体地说，A将与T或U形成氢键，并且G将与C键接。“互补”是指在两个截然不同的核酸序列或同一核酸序列的两个截然不同的区域之间发生的碱基配对。
术语“可特异性杂交”和“特异性互补”指示互补的程度足以使得在寡核苷酸(或其类似物，如CNA)与DNA或RNA靶之间发生稳定并且特异性结合。寡核苷酸或寡核苷酸类似物无需与其有待可特异性杂交的靶序列100％互补。当寡核苷酸或类似物与靶DNA或RNA分子的结合干扰了靶DNA或RNA的正常功能，并且互补程度足以避免寡核苷酸或类似物在希望特异性结合的条件下与非靶序列非特异性结合时，所述寡核苷酸或类似物为可特异性杂交的。此类结合称为特异性杂交。
引起特定严格度的杂交条件将取决于所选杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。一般来说，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+浓度)将决定杂交的严格度，不过损失时间也影响严格度。
烃或烃基：仅仅由元素碳和氢组成的有机化合物或基团。这些部分包括烷基、烯基、炔基及芳基部分。这些部分还包括被其它脂肪烃基或环状烃基取代的烷基、烯基、炔基和芳基部分，如烷芳基、烯芳基及炔芳基。
“被取代的烃基”是被至少一个除碳外的原子取代的烃基部分，包括碳链原子被如氮、氧、硅、磷、硼、硫或卤素原子等杂原子取代的部分。这些取代基包括卤素、杂环基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、羟基、被保护的羟基、酮基、酰基、酰氧基、硝基、氨基、酰胺基、硝基、氰基、硫醇、缩酮、缩醛、酯及醚。
标记：可以与另一分子(如CNA)直接或间接偶联以便利所述分子或CNA所结合的分子的检测的可检测化合物或组合物。标记的具体的非限制性实例包括荧光标签、酶和放射性同位素。标记的实例包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(如35S或131I)、荧光标记(如荧光素异硫氰酸酯(fluoroscein istothiocyanate，FITC)、罗丹明(rhodamine)、镧系磷光体、花青染料、荧光蛋白如GFP)、酶标记(如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记物、生物素基团、被第二报告子识别的预定多肽表位(如亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)或磁性试剂，如钆螯合剂。在一些实施例中，标记是通过各种长度的间隔子臂(如连接子)连接，例如以降低潜在的空间位阻。
连接子：充当分子桥以可操作地连接两个不同分子的化合物或部分，其中所述连接子的一个部分可操作地连接到第一分子并且其中所述连接子的另一部分可操作地连接到第二分子。对于连接子没有特定的大小或含量限制，只要它能够履行其作为分子桥的目的即可。连接子是本领域技术人员已知的，包括(但不限于)化学链、化合物、碳水化合物链、肽、半抗原等。在一个实施例中，连接子将核碱基连接到CNA单体的其余部分。在另一个实施例中，连接子将异源分子(如效应分子)连接到CNA分子。
模拟物：模拟一种试剂的活性和/或结构，如核酸(如RNA和DNA)的活性的一种分子(如有机化合物)。在一个实施例中，一种核酸模拟物为所披露的CNA。
核碱基：核苷酸包括含氮碱基，它可以连接到聚合物主链，如脱氧核糖核酸、核糖核酸或硫醚主链等。
主要的核碱基为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)。
核碱基还包括经修饰的碱基，例如，如美国专利第5,866,336号中所描述。经修饰碱基部分的实例包括(但不限于)：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N～6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-S-氧基乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶及2,6-二氨基嘌呤等。
探针：探针包含能够与靶核酸杂交的分离的核酸或所披露的CNA，并且可检测标记或报告分子可以连接到核酸分子。典型的标记包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。
探针一般为至少6个碱基长，如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个、至少48个、至少49个、至少50、至少51个、至少52个、至少53个、至少54个、至少55个、至少56个、至少57个、至少58个、至少59个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少140个、至少160个、至少180个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个或更多个与靶核酸分子互补的连续碱基，如6-500个核苷酸、20-400个核苷酸、100-250个核苷酸、20-40个核苷酸或20-30个核苷酸。
药学上可接受的载剂：可用于本发明中的药学上可接受的载剂(媒剂)是常用的。E.W.马丁(E.W.Martin)所著的《雷氏药学大全》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(宾夕法尼亚州伊斯顿的默克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA)，第19版(1995))描述了适于本文所披露的纳米粒子的药物递送的组合物和制剂。
一般说来，载剂的性质将取决于所采用的特定投药模式。举例来说，不经肠制剂通常包含可注射流体，这些流体包括药学上并且生理学上可接受的流体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为媒剂。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载剂可以包括例如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除呈生物中性的载剂外，打算投予的药物组合物可以含有极少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
样品：样品(如生物样品)是从动物受检者(如人类受检者)获得的。如本文所使用，生物样品包括所有临床样品，包括(但不限于)细胞、组织及体液，如：血液；血液衍生物和部分；包括例如未固定、冷冻、固定于福尔马林(formalin)中和/或包埋于石蜡中的组织在内的组织活检(包括非典型或可疑的痣的刮削、钻取或切除活检)样品。在一些实例中，样品是从患有、怀疑患有或曾经患有，例如被诊断患有黑素瘤(如转移性黑素瘤)的受检者获得的样品。
聚合物是经由化学反应(例如聚合反应)形成的具有重复的一般结构单元(例如单体，如一个或多个所披露的CNA单体)的分子。
序列一致性/相似性：两个或更多个核酸(nucleic acid)序列、核酸(nuclic acid)序列和CNA序列或者两个或更多个CNA序列之间的一致性/相似性是关于这些序列之间的一致性或相似性来表示。序列一致性可以关于一致性百分比来测量；百分比越高，则序列的一致性越高。
比对序列以进行比较的方法是本领域中众所周知的。各种程序和比对算法描述于以下文献中：史密斯-沃特曼(Smith&Waterman),《应用数学进展》(Adv.Appl.Math.)2:482,1981；尼德尔曼-伍奇(Needleman&Wunsch),《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48:443,1970；皮尔森-利普曼(Pearson&Lipman),《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:2444,1988；霍金斯-夏普(Higgins&Sharp),《基因》(Gene),73:237-44,1988；霍金斯-夏普,CABIOS5:151-3,1989；卡佩特(Corpet)等人,《核酸研究》(Nuc.Acids Res.)16:10881-90,1988；黄(Huang)等人,《计算机在生物科学中的应用》(Computer Appls.in the Biosciences)8,155-65,1992；及皮尔森(Pearson)等人,《分子生物学方法》(Meth.Mol.Bio.)24:307-31,1994。奥兹楚尔(Altschul)等人于《分子生物学杂志》(215:403-10,1990)中呈现了有关序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项。
NCBI的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool，BLAST)(奥兹楚尔等人,《分子生物学杂志》,215:403-10,1990)可从若干来源获得，包括国家生物信息中心(National Center forBiological Information，NCBI；国家医学图书馆(National Library ofMedicine)，第38A栋，8N805室，马里兰州贝塞斯达(Bethesda,MD)20894)和互联网上，适于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。Blastn被用于比较核酸序列，而blastp被用于比较氨基酸序列。其它信息可以见于NCBI网站。
一旦对准，就通过对两个序列中存在一致核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行计数来确定匹配的数量。序列一致性百分比是通过用匹配的数量除以所鉴别的序列中所陈述的序列长度或明确表示的长度(如所鉴别的序列中陈述的序列中的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，随后将所得值乘以100来确定。举例来说，当与具有1554个核苷酸的测试序列比对时，具有1166个匹配的核酸序列与所述测试序列达75.0％一致(1166÷1554×100＝75.0)。序列一致性百分比值四舍五入到最接近的十分之一值。举例来说，75.11、75.12、75.13和75.14四舍五入到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19则四舍五入到75.2。长度值将始终为整数。两个核酸分子和/或CNA密切相关的一个指示为这两个分子在严格条件下彼此杂交。
合成核酸：包括通过接合含核酸的分子所构造的聚合物分子，例如以化学方式或通过其它手段合成或扩增的核酸分子，包括以化学方式或以其它方式修饰但可以与天然存在的核酸分子或与其它合成核酸碱基配对的分子。在一个实例中，合成核酸为CNA。
点击核酸或CNA(分子或序列)：具有硫醚主链代替DNA或RNA中通常所见的磷酸酯主链的DNA和/或RNA模拟聚合物。CNA可以为双链(ds)或单链(ss)的或甚至更高级的，如三螺旋。在单链的情况下，核酸可以为有义链或反义链。CNA可以包括天然核碱基(如A、T/U、C和G)并且可以包括天然核碱基的类似物，如标记的核苷酸。
硫醇或硫醇部分或基团：碳键接的硫氢基(–C–SH或R–SH)。在一些实例中，硫醇部分为被保护的硫醇。硫醇保护基的实例是本领域中已知的。
硫醇点击化学：通过众多反应机制之一实现的硫醇部分与硫醇-点击接受基团(如乙烯基、炔、卤化物、异氰酸酯或环氧部分)之间的反应。硫醇点击化学反应的实例可以见于霍勒(Hoyle)等人,"硫醇-点击化学：小分子和聚合物合成的多面工具箱(Thiol-click chemistry:a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis)",《化学协会评论》(Chemical Society Reviews)39(4)1355-1387(2010)，所述文献以全文引用的方式特定地并入本文中。
硫醇-点击受体：硫醇-点击受体是易于与硫醇(其可以含有或可以不含保护基)反应以产生硫醚的任何化学部分。此类部分的实例有乙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、降冰片烯、乙烯基砜、环氧基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、顺丁烯二酰亚胺、卤化物和其烷基延长。示范性硫醇-点击受体也可以见于图18中。
乙烯基部分或乙烯基：具有碳-碳双键的基团，例如具有式–CR1＝CR2R3，其中R1、R2和R3可以独立地为氢、烃基、被取代的烃基、被取代的杂环基、烷基、被取代的烷基、酰基、-C(O)R、-C(O)OR或-C(O)NRaRb，芳基或被取代的芳基或杂环。在一些实例中，乙烯基是烯丙基醚、乙烯基醚、甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、顺丁烯二酰亚胺、降冰片烯、α-羟基甲基丙烯酸酯、乙烯基砜等的一部分。在一些实例中，乙烯基是被保护的。乙烯基保护基的实例是本领域中已知的。
用于实践或测试本发明的适合方法和材料描述于下。这些方法和材料只是说明性的并且不打算作为限制。与本文所述这些类似或相当的其它方法和材料都可以使用。
II.示范性实施例的说明
A.引言
披露了点击核酸(CNA)分子、制备这些分子的方法及其用途。如本文所披露，硫醇点击化学与产生新颖CNA分子的寡核苷酸合成的协同组合具有诸多益处并且是一项重大革新。尽管PNA已经展现了非生物寡核苷酸的巨大效用，但其合成方法、可用的有限主链化学及固相反应的必要性严重地限制其广泛实施。相比之下，使用本文所披露的点击化学方法能够实施化学计量比率的反应物并且定量转化的同时实现具有重要的新颖性和价值。具体地说，硫醇-点击化学反应的简易性、稳固性、速度及化学计量特征使其理想地用于开发新颖类别的功能性寡核苷酸模拟物。事实上，基于这些益处和化学方法，最初已经以每批10mg的规模容易地制备聚CNA分子，估计现时成本介于每克$10-100之间，而一致的DNA序列将花费每克约$100,000。这一成本差异使得CNA成为仅仅由于高昂的费用而无法考虑DNA的众多应用中的功能分子。
当与DNA或PNA相比较时，硫醇点击化学方法实现了若干特定的革新。重要的是，由化学计量反应物得到的定量产率有利于使用基于溶液的方法以最低的成本得到大体积控制性序列。尽管这一方法可能产生极少量的错误，但经由杂交进行的简单纯化可以使得分离出纯产物。
如本文所披露，反应性硫醇-点击受体，如乙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、降冰片烯、乙烯基砜、环氧基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、顺丁烯二酰亚胺、卤化物及亚烷基、炔、卤化物、异氰酸酯、环氧基和硫醇末端基团，易于适合用如PEG(用于改善溶解性)、肽、造影剂和染料，和/或其它寡核苷酸(如DNA或RNA)等化合物进一步官能化。另外，进一步反应的能力还是当纯化时制造出高分子量CNA序列的途径，5、10或20个单体的中等大小的控制性序列可以在单一步骤中偶合以迅速增加序列中碱基的数量并且获得高分子量。另外，CNA方法的稳固性允许利用多个基本单体结构来产生CNA。本文所披露的点击硫醚核酸单体和聚合物CNA与2012年3月29日申请的美国临时申请第61/617,145号(本发明主张其优先权益)中所披露的硫醚核酸单体和聚合物TNA实质上相同。仅改变了名称。
B.点击核酸(CNA)
本文披露了一种新颖类别的生物功能性寡核苷酸、硫醚核酸或CNA，其利用了硫醇-烯‘点击’反应来形成所希望的碱基序列。这一方法(其实例与DNA和PNA结构一起说明)呈现于图1中，具有增强其重要性的若干截然不同的益处，特别是，(i)使用了点击化学；(ii)能够光引发反应；及(iii)由具有硫醚主链的聚合物形成，此将增强CNA分子的稳定性。
本文披露了可以用于产生聚点击核酸的单体CNA分子、结构或结构单元。在一些实施例中，硫醚核酸单体包括任选保护的硫醇部分、任选保护的硫醇-点击受体、任选保护的核碱基以及包括如碳(C)、氮(N)或硼(B)等3价或更高价态的原子的主链，和任选地3价或更高价态的另外的原子。硫醇部分、硫醇反应性部分和核碱基独立地共价连接到主链。在一些实施例中，所述点击核酸单体另外包括连接子，其中所述连接子将所述核碱基共价连接到所述3价或更高价态的原子。在一些实例中，所述连接子包括-C(O)C-。在一些实施例中，所述连接子和所述核碱基为核碱基侧链(NS)。在一些实例中，所述3价或更高价态的原子是氮(N)或碳(C)。在一些实例中，核碱基的胺被保护基保护。胺保护基是本领域中众所周知的。在一些实例中，硫醇基是被保护的。硫醇保护基是本领域中众所周知的。在一些实例中，硫醇通过糖部分连接到主链原子。
在一些实施例中，点击核酸单体具有以下结构：
并且Z为具有3价或更高价态的原子，如C、N或B(硼)；NS是核碱基侧基，其包括任选保护的核碱基(NB)和任选存在的连接子，用于连接NB与Z；T为任选保护的硫醇；并且TCA是任选保护的硫醇-点击受体。
在一些实施例中，点击核酸主链包括一个或多个3价或更高价态的另外的原子，例如C、N或B。
在一些实施例中，点击核酸单体具有以下结构：
其中Y和Z是具有3价或更高价态的原子(例如碳、氮和硼)；n为0到4的整数，如0、1、2、3，或对于例如1-1、0-2、0-3、0-4、1-2、1-3、1-4、2-3、2-4或3-4，其可以包括杂原子并且独立地被例如芳基、羟基、羰基、羧酸和其它酸、氨基、烷基酰胺、硫醚、环、杂环及其烷基延长取代；NS为核碱基侧基，其包括任选保护的核碱基；T为任选保护的硫醇；并且TCA为任选保护的硫醇-点击受体，如任选保护的乙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、降冰片烯、乙烯基砜、环氧基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、顺丁烯二酰亚胺、卤化物及其烷基延长。
在一些实施例中，点击核酸单体具有以下结构：
其中Y和Z是具有3价或更高价态的原子(例如碳、氮和硼)，n为0到4的整数，如0、1、2、3，或对于例如1-1、0-2、0-3、0-4、1-2、1-3、1-4、2-3、2-4或3-4，其可以包括杂原子并且独立地被例如芳基、羟基、羰基、羧酸和其它酸、氨基、烷基酰胺、硫醚、环、杂环及其烷基延长取代；m为0到4的整数，如0、1、2、3，或对于例如1-1、0-2、0-3、0-4、1-2、1-3、1-4、2-3、2-4或3-4，其可以包括杂原子并且独立地被例如芳基、羟基、羰基、羧酸和其它酸、氨基、烷基酰胺、硫醚、环、杂环及其烷基延长取代；NS为核碱基侧基，其包括任选保护的核碱基；T为任选保护的硫醇；并且TCA为任选保护的硫醇-点击受体，如任选保护的乙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、降冰片烯、乙烯基砜、环氧基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、顺丁烯二酰亚胺、卤化物及其烷基延长。
在一些实施例中，点击核酸单体具有以下结构：
其中Y和Z是具有3价或更高价态的原子(例如碳、氮和硼)，n为0到4的整数，如0、1、2、3，或对于例如1-1、0-2、0-3、0-4、1-2、1-3、1-4、2-3、2-4或3-4，其可以包括杂原子并且独立地被例如芳基、羟基、羰基、羧酸和其它酸、氨基、烷基酰胺、硫醚、环、杂环及其烷基延长取代；m为0到4的整数，如0、1、2、3，或对于例如1-1、0-2、0-3、0-4、1-2、1-3、1-4、2-3、2-4或3-4，其可以包括杂原子并且独立地被例如芳基、羟基、羰基、羧酸和其它酸、氨基、烷基酰胺、硫醚、环、杂环及其烷基延长取代；NS为核碱基侧基，其包括任选保护的核碱基；T为任选保护的硫醇；并且TCA为任选保护的硫醇-点击受体，如任选保护的乙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、降冰片烯、乙烯基砜、环氧基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、顺丁烯二酰亚胺、卤化物及其烷基延长。
在一些实施例中，点击核酸单体具有以下结构：
其中n+m介于1与7之间，如1、2、3、4、5、6或7，n≥0，如0、1、2、3、4、5或6，并且m>0，如1、2、3、4、5、6或7；NS为核碱基侧基，包括任选保护的核碱基；T为任选保护的硫醇；并且TCA为任选保护的硫醇-点击受体，如任选保护的乙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、降冰片烯、乙烯基砜、环氧基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、顺丁烯二酰亚胺、卤化物及其烷基延长；Z为3价或更高价态的原子；并且R1和R2独立地为氢、羟基、芳香族基团、胺、羧基及羰基的组合，这些基团任选被取代。在一些实例中，n+m介于1与7之间，如1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-7、2-6、2-5、2-4、3-7、3-6、3-5、3-4、4-7、4-6、4-5、5-6、5-7，例如为1、2、3、4、5、6或7。在一些实例中，n≥0，如大于或等于0、1、2、3、4、5或6，例如为0-6、0-5、0-4、0-3、0-2、0-1、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-7、2-6、2-5、2-4、3-6、3-5、3-4、4-6、4-5或5-6，并且m>0，如大于1、2、3、4、5、6或7，例如为1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-7、2-6、2-5、2-4、3-7、3-6、3-5、3-4、4-7、4-6、4-5、5-6、5-7。
在一些实施例中，所述点击核酸单体另外包括连接子，其中所述连接子将所述核碱基共价连接到所述3价或更高价态的原子。在一些实例中，所述连接子包括-C(O)C-。
在一些实施例中，NS基团具有以下结构：
其中NB为任何核碱基(例如A、T、G、C或U)，其上的氨基可以被保护。
在一些实施例中，任选保护的硫醇具有以下结构：
其中p为0到4的整数，并且其中甲基任选并且独立地被例如芳基、羟基、羰基、羧酸和其它酸、氨基、烷基酰胺、硫醚、环、杂环及其烷基延长取代。在一个具体实例中，任选保护的硫醇具有以下结构：
在一些实施例中，硫醇-点击受体为任选取代的乙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、降冰片烯、异氰酸酯、乙烯基砜、环氧基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、顺丁烯二酰亚胺、卤化物和其烷基延长。在具体实例中，硫醇-点击受体具有如下之一所陈述的结构：
其中X为卤化物并且R为氢或烷基链。在一些实例中，硫醇-点击受体为如图18A和18B中所示的单体所显示的受体部分。
在一些实例中，点击核酸单体包括炔部分。在一些实例中，点击核酸单体包括卤化物部分。在一些实例中，点击核酸单体包括异氰酸酯部分。在一些实例中，点击核酸单体包括环氧基部分。在一些实例中，点击核酸单体包括丙烯酸酯部分。在一些实例中，点击核酸单体包括乙烯基醚部分。在一些实例中，乙烯基部分(包括丙烯酸酯或乙烯基醚中的乙烯基部分)具有结构-CR5＝CR6R7，其中R5、R6和R7可以独立地为氢、芳基、羟基、羰基、羧酸和其它酸、氨基、烷基酰胺、硫醚、环、杂环、烃基、被取代的烃基、被取代的杂环基、烷基、被取代的烷基、酰基、-C(O)R、-C(O)OR或-C(O)NRaRb、芳基或被取代的芳基或杂环。
在一些实例中，CNA单体包括例如紧跟着乙烯基的拉电子基团。尽管不受理论束缚，相信接近乙烯基的这些基团使得乙烯基的反应性增强。拉电子基团的实例包括羟基、烷氧基、巯基、卤素、羰基、磺酰基、腈、季胺、硝基或三卤代甲基。在一些实例中，在拉电子基团为烷氧基的情况下，其一般对应于式-OR，其中R为烃基、被取代的烃基或杂环基。在一些实例中，在拉电子基团为巯基的情况下，其一般对应于式-SR，其中R为氢、烃基、被取代的烃基或杂环基。在一些实例中，在拉电子基团为卤素原子的情况下，拉电子基团可以为氟、氯、溴或碘；通常，它将为氟或氯。在一些实例中，在拉电子基团为羰基的情况下，其可以为醛(-C(O)H)、酮(-C(O)R)、酯(-C(O)OR)、酸(-C(O)OH)、酰卤化物(-C(O)X)、酰胺(-C(O)NRaRb)或酐(-C(O)OC(O)R)，其中R为烃基、被取代的烃基或杂环基，Ra和Rb独立地为氢、烃基、被取代的烃基或杂环基，并且X为卤素原子。在一些实例中，在拉电子基团为磺酰基的情况下，其可以为酸(-SO3H)或其衍生物(-SO2R)，其中R为烃基、被取代的烃基或杂环基。在一些实例中，在拉电子基团为季胺的情况下，其一般对应于式N+RaRbRc，其中Ra、Rb和Rc独立地为氢、烃基、被取代的烃基或杂环基。在一些实例中，在拉电子基团为三卤代甲基的情况下，其优选为三氟甲基或三氯甲基。
在具体实例中，CNA单体具有包括硫部分及乙烯基部分的末端碳在内的5到7个原子的重复单元。在一个具体实例中，所述单体具有包括硫醇部分和乙烯基部分的末端碳在内的6个原子的重复单元。在一些实施例中，CNA单体具有N-乙烯基硫醇乙酰胺(VTA)主链。在一些实施例中，所述单体具有N-乙烯基硫醇乙胺(VTE)主链。在一些实施例中，所述单体包含N-乙烯基醚硫醇主链，其中乙烯基部分通过醚键连接到主链的其余部分(参看例如图13)。在一些实施例中，所述单体包含N-丙烯酸酯基硫醇主链，其中反应性乙烯基部分通过C(O)O基团连接到主链的其余部分(参看例如图13)。在具体实例中，CNA具有图4、5和/或7-14或18中任一个中所示CNA单体中的任一种的结构，其可以为被保护的。在一些实例中，CNA单体是图18A或18B中所示单体之一。
在一些实例中，CNA单体包括A、G、T、U或C核碱基，不过也涵盖其它核碱基，如(但不限于)以上术语清单中所述的那些。如图4中所示，示范性单体含有六个原子的重复单元。在一些实施例中，CNA单体具有3-10个原子的重复单元间距，如3、4、5、6、7、8、9、10或甚至更长的重复单元间距，如5-9、5-7个原子的重复单元间距，例如包括硫醇的硫原子及TCA基团的末端碳在内(参看例如图15)。
预期所披露的单体可以另外经过修饰以例如解决任何不稳定、毒性、主链柔顺性、电荷或溶解性问题，例如基础单体结构可以被改变成有利于例如阴离子部分加成以更好地模拟DNA结构，或通过改变主链重复单元原子的数目以优化杂交选择性。此外，硫醇和硫醇-点击受体部分可以易于官能化以添加另外的取代基，如效应分子，如用于改善溶解性的PEG、肽、造影剂和染料，和/或其它寡核苷酸，如DNA或RNA。
披露了CNA聚合物及制造CNA聚合物的方法。CNA聚合物包括至少两个所披露的CNA单体。所述聚合物可以为任何长度。CNA聚合物可以为同质或异质的，例如聚合物可以由单一类型的所披露的单体或本文所披露的单体的任何组合构成。
效应分子，如治疗部分、诊断部分或检测部分，或其它分子，可以使用本领域技术人员已知的任何手段连接CNA分子。共价和非共价连接手段都可以使用。用于将效应分子连接到CNA分子的程序是根据效应子的化学结构和CNA分子的哪一端发生连接进行。举例来说，多肽通常包含多种官能团；例如，羧酸(COOH)、游离胺(-NH2)或硫氢基(-SH)，其可用于与CNA分子上的适合官能团(例如存在于CNA分子的任一端上的硫醇或TCA部分)反应，引起效应分子的结合。这一连接可以是直接进行或通过连接子进行的并且可能涉及多个连接分子中的任何分子的连接，如可从伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Company,Rockford,IL)得到的那些分子。连接子可以是用于将CNA分子接合到效应分子的任何分子。连接子能够与CNA分子和效应分子形成共价键。适合连接子是本领域技术人员众所周知的并且包括(但不限于)直链或分支链碳连接子、杂环碳连接子或肽连接子。
在一些情况下，希望的是使效应分子独立于CNA分子。因此，在一些情况下，这些偶联物将包含可裂解的键联。
鉴于已报导用于连接多种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、标记(例如酶或荧光分子)药物、毒素和其它试剂的多种方法，故本领域技术人员将能够确定用于将指定试剂连接到CNA分子的适合方法。
本文披露了制造CNA单体的方法。制造基于N-乙烯基硫醇乙胺(VTE)的CNA单体的方法的一个实例示于图5中。制造基于N-乙烯基硫醇乙酰胺(VTA)的CNA单体的方法的一个实例示于图8中。在两个实例中，CNA单体是由若干简单的分子成分合成，从而允许精确、原子水平的单体设计。这一针对单体结构的合成控制进一步使得简单的结构变化作为不良溶解性或杂交效率的可能偶发事件或作为对杂交稳定性的进一步优化。如图5中所示，CNA单体是使用三个偶合反应合成的：使用甲氧基三苯甲基(Mmt)进行硫醇保护、酰胺偶合及碘乙烯与酰胺的反应。如图5中所示，最后一个步骤的胞嘧啶与溴乙酸的偶合反应易于扩展到其余三个核碱基(腺嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤)，从而制备DNA的全部CNA类似物。
披露了CNA聚合物及制造CNA聚合物的方法。CNA聚合物包括至少两个所披露的CNA单体。所述聚合物可以为任何长度。CNA聚合物可以为同质或异质的，例如聚合物可以由单一类型的所披露的单体或本文所披露的单体的任何组合构成。
本文披露了制造CNA聚合物的方法。为了产生CNA聚合物，使CNA单体通过包括固相法、在溶液中、在微阵列形式的格式中及本体聚合法等多种方法聚合，以产生均聚物。图2中显示了CNA聚合的一个实例。如图2中所示，使单体CNA的硫醇脱除保护基以暴露硫醇部分。通过例如在365nm光下使用羟基-环己基-苯基-酮进行的光引发的自由基反应，在硫醇上形成自由基，然后所述自由基可以攻击正在增长的链中下一单体的乙烯基醚或烯丙基醚。通过这一机制，形成CNA聚合物。CNA聚合物的固相形成的一个实例显示于图9中。与固相肽合成类似，通过用单体进行数轮连续反应并且将脱除保护基的单体添加到正在生长的聚合物链中，可以将任何核碱基添加到正在生长的链中。
在一些实例中，聚合反应是光引发的。这些反应可以用可光诱导的光活化剂，例如用羟基-环己基-苯基-酮进行光引发。在一些实例中，所述反应是用介于约0.001wt％与约1.0％之间的羟基-环己基-苯基-酮，如约0.01wt％的羟基-环己基-苯基-酮、0.01wt％的羟基-环己基-苯基-酮或1.0wt％的羟基-环己基-苯基-酮进行光引发的。在一些实例中，光引发剂是在波长介于约350与410nm之间的约1到约100mW/cm2的光下活化的。在一个具体实例中，光引发剂是用波长为约365nm的约10mW/cm2的光活化的。
光引发反应的能力是巨大的革新。利用这一能力，易于以一种容易做到的方式在单一芯片上制造出序列阵列(类似于昂飞(Affymetrix)的DNA芯片)用于生物监测、折纸(origami)或其它应用。
C.示范性使用方法
i.示范性体内CNA应用
CNA应用包括生物监测、类SELEX方法的开发及互补DNA或CNA序列的复制。靶向与PCR类似的扩增和成果，这是一种指数扩增方法，通过这种方法，由互补DNA或CNA链通过寡聚CNA的原位杂交和选择性连接而复制得到CNA链。这一方法将用作一种制造大量高分子量序列的手段并且适合于在生物检测中实施，其中底物扩增对于检测是很重要的。
a.探针和引物
所披露的CNA分子可以用作能够结合并且检测靶核酸分子的探针和/或引物。通常，这些探针和引物具有介于6与40个核苷酸之间的长度，如长度为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、2829、30、31、32、32、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸，并且能够杂交靶核酸，不过也涵盖更长和/或更短的序列，例如用于DNA印迹法和其它应用。因此，在一些实例中，探针或引物的长度大于40个核苷酸，如长度为至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少500个核苷酸，或甚至是至少1000个核苷酸。
在一些实施例中，CNA探针和/或引物标记有可检测物，即用同位素或非同位素标记进行标记，或者，靶核酸(如流感核酸)被标记。非同位素标记可以例如包含荧光分子或发光分子、生物素、酶或酶底物，或化学品。这些标记的选择优选使得探针与靶分子的杂交可以被检测到。在一些实例中，探针用荧光团标记。在一些实例中，CNA分子(如探针)连接到固体底物，如珠粒和/或阵列。
b.靶核酸的检测和鉴别
本文所披露的CNA分子引物和探针的主要应用是检测样品(如生物样品)中的靶分子。本文所描述的方法可以用于希望检测靶核酸的任何目的，包括诊断和预后应用，如在实验室和临床环境中。适当的样品包括任何常规的环境或生物样品，包括从人类或兽类受检者获得的临床样品，包括(但不限于)细胞、组织(例如肺、肝和肾)、骨髓抽取液、体液(例如血液、血清、尿液、脑脊髓液、支气管肺泡灌洗液、气管抽取液、痰、鼻咽抽取液、口咽抽取液、唾液)、眼拭子、子宫颈拭子、阴道拭子、直肠拭子、粪便及粪便悬浮液。
c.CNA阵列
还披露了用于检测靶核酸的含有多个同质或异质CNA探针的阵列。阵列是可定址位置在基质上的布置，其中每个地址含有一个CNA，如探针。在一些实施例中，每个地址对应于单一类型或类别的CNA，如单一探针，不过在多个地址处可以多余地含有特定CNA。“微阵列”是需要显微镜检查来检测杂交的小型化阵列。较大的“宏阵列”使得能通过人裸眼识别每个地址，并且在一些实施例中，无需另外放大即可检测杂交信号。这些地址可以被标记、固定到单独的指导(guide)或通过位置以其它方式鉴别。
可能含有或甚至怀疑含有靶核酸(包括核酸提取物，如扩增或未扩增的DNA或RNA制剂)的任何样品都可以被靶向并进行分析。来自阵列上个别地址的杂交信号指示探针与样品内的核苷酸杂交。这一系统允许通过多个探针同时分析样品并且得到鉴别样品内所含流感核酸的信息。
这些核酸可以呈干燥或液体形式添加到阵列基质。也可以将其它化合物或物质添加到阵列，如缓冲液、稳定剂、用于检测杂交信号的试剂、乳化剂或防腐剂。
在阵列内，每个排列的CNA都是可定址的，这样使得其位置可以可靠地并且一贯地在阵列表面的至少两个维度内确定。因此，在将每个核酸放入阵列内时，有序的阵列允许对其位置进行分配。通常，提供了阵列图谱或图例来将每个地址与适当核酸相关联。有序阵列通常是以对称网格模式布置，但核酸也可以按其它模式布置(例如，在径向分配的线中，“轮辐与轮”模式，或有序簇)。可定址的阵列可以是计算机可读的；计算机可以拟定程序以将阵列上的特定地址与有关所述位置处的样品的信息相关联，如杂交或结合数据，包括信号强度。在一些示范性计算机可读格式中，阵列中的个别样品或分子是有规律地布置的(例如，在笛卡尔网格(Cartesian grid)模式中)，其可以通过计算机与地址信息相关联。
d.核酸“折纸”和定向组装
所披露的CNA分子可以用于核酸折纸和定向组装应用中，例如作为核酸订书钉(nucleic acid staple)。核酸折纸是核酸的纳米级折叠，用以建立纳米级的任意二维和三维形状。通过碱基对的设计，互补碱基对之间相互作用的特异性使得DNA成为有用的构造材料。核酸折纸涉及较长的单链病毒DNA在多个较小“订书钉”链的帮助下折叠。在一些实例中，用相当完整的单一长DNA分子绘制图像。然后将这一设计输入计算机程序中，以计算个别订书钉链的放置。每个订书钉结合到DNA模板的特定区域，并且因此，由于沃特森-克里克碱基配对，已知并展示所有订书钉链的必要序列。混合DNA，然后加热并冷却。当DNA冷却时，各种订书钉将长链拉成希望的形状。设计可经由若干方法直接观察，包括原子力显微镜检术，或当DNA与荧光材料偶合时的荧光显微镜检术。
核酸的这种自组装可以用于在相对温和的条件下合成纳米结构，用于如酶固定、药物载运胶囊以及表面上和本体溶液或悬浮液中材料(例如具有希望的特征的纳米粒子)的纳米技术自组装和定向图案化。
ii.体内CNA应用.
根据CNA的独特化学和物理特性，其具有相当大的潜力用于体内应用中。值得关注的是CNA横跨外部细胞膜的潜力。已知CNA具有疏水性和中性主链，故CNA将穿透细胞的脂质膜并且具有固有地高细胞渗透性。重要的是，CNA进入细胞的能力可以通过化学定制CNA单体的亲脂性来优化。这一能力与CNA的体内稳定性以及其对互补RNA和DNA的高亲和力和特异性组合被探索用于RNA和/或DNA干扰。具体地说，CNA将被用于使靶基因和整个路径沉默。这一应用对于治疗学并且对于涉及基因调控的机制研究具有广泛意义。此外，这一细胞穿透能力可用于递送外源染料或治疗性分子，包括蛋白质。
a.治疗性组合物
所披露的CNA聚合物可以在体内投予细胞或受检者。一般来说，希望将组合物制备为适于预定应用的药物组合物。因此，包括了用于制备含有如上文所描述的CNA的药剂或药物组合物的方法。通常，药物组合物(药剂)的制备需要制备基本上不含热原质以及会对人类或动物有害的任何其它杂质的药物组合物。通常，所述药物组合物含有适当的盐和缓冲液以使组合物中各组分稳定并且允许被靶细胞(如肿瘤细胞)摄取。
提供的治疗性组合物可以作为不经肠组合物，如注射或输注用组合物。这些组合物一般是通过将呈单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液或乳液)的所希望的纯度的所披露的治疗剂与药学上可接受的载剂(例如在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒并且与制剂的其它成分可相容的载剂)混合来配制。此外，所披露的治疗剂可以悬浮于水性载剂中，例如pH值为约3.0到约8.0，优选pH值为约3.5到约7.4、3.5到6.0或3.5到约5.0的等渗缓冲溶液中。有用的缓冲液包括柠檬酸钠-柠檬酸和磷酸钠-磷酸，及乙酸钠/乙酸缓冲液。活性成分任选地连同赋形剂一起也可以呈冻干粉的形式并且可以在不经肠投予之前通过添加适合溶剂制成溶液。所用溶液(如用于例如不经肠投药的那些)也可以为输注溶液的形式。
药物组合物可以包括分散于(例如溶解于或悬浮于)药学上可接受的载剂或赋形剂中的有效量的CNA。药学上可接受的载剂和/或药学上可接受的赋形剂为本领域中已知的并且描述于例如E.W.马丁所著的《雷氏药学大全》(宾夕法尼亚州伊斯顿的默克出版公司)第19版(1995)中。
载剂的性质将取决于所采用的特定投药模式。举例来说，不经肠制剂通常含有可注射流体，这些流体包括药学上并且生理学上可接受的流体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为媒剂。对于固体组合物(如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载剂可以包括例如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。此外，打算投予的药物组合物可以含有极少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
如本文所使用，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂等。用于药物活性物质的这些介质和试剂的使用为本领域中众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则涵盖其在所述药物组合物中的应用。还可以在这些组合物中并入补充性活性成分。举例来说，某些药物组合物可以包括在混有适合表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中的CNA。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及于油中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
治疗性组合物可以通过任何常用途径投予，只要靶组织可经由所述途径利用即可。这包括口服、经鼻、眼、颊或其它粘膜(如直肠或引导)或局部投药。或者，投药将通过常位、真皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射途径进行。这些药物组合物通常是作为包括生理学上可接受的载剂、缓冲剂或其它赋形剂的药学上可接受的组合物投予。
药物组合物还可以呈液体溶液或悬浮液形式；适于在注射前还可以制备于液体中的溶液或悬浮液的固体形式作为可注射组合物投予。这些制剂还可以被乳化。用于这种目的的典型组合物包含药学上可接受的载剂。举例来说，所述组合物可以含有每毫升磷酸盐缓冲的生理盐水约100mg人血清白蛋白。其它药学上可接受的载剂包括水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇/水溶液、生理盐水溶液、不经肠媒剂(如氯化钠、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)等)。静脉内媒剂包括流体和营养补充物。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂及惰性气体。药物组合物的各种组分的pH值和确切浓度可根据众所周知的参数进行调整。
另外的制剂适于经口投予。口服制剂可以包括赋形剂，如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物(药物)通常呈溶液、悬浮液、气雾剂或粉末形式。
当途径是局部途径时，所述形式可以为乳膏、油膏、药膏或喷雾剂。药物组合物的有效量是基于预定目标(例如人类或非人类受检者的疫苗接种)确定。适当剂量将取决于受检者的特征，例如受检者为人类还是非人类；受检者的年龄、体重及有关受检者的状况或状态的其它健康考虑；投药模式、途径；及剂量次数，和药物组合物是否包括CNA而变化。
当投予核酸时，还可以包括核酸摄取和/或表达的促进剂，如丁哌卡因(bupivacaine)、心脏毒素和蔗糖，以及促进转染的媒剂，如常用于递送核酸分子的脂质体或脂质制剂。阴离子性和中性脂质体是众所周知可广泛用于递送核酸分子的(参看例如，《脂质体：一种实用的方法》(Liposomes:A Practical Approach),RPC New Ed.,IRL出版社(IRL Press),1990)。阳离子性脂质制剂也是众所周知的用于递送核酸分子的媒剂。适合的脂质制剂包括可以商品名得到的DOTMA(N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵)，及DOTAP(1,2-双(油烯基氧基-3-(三甲基胺基)丙烷)。参看例如，菲戈纳(Felgner)等人,《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)84:7413-7416,1987；马龙(Malone)等人,《美国国家科学院院刊》86:6077-6081,1989；美国专利第5,283,185号和第5,527,928号，及国际公开第WO 90/11092号、第WO 91/15501号和第WO 95/26356号。这些阳离子性脂质可以优选地与中性脂质，例如DOPE(二油烯酰基磷脂酰乙醇胺)结合使用。可以添加到上述脂质或脂质体制剂中的又其它促进转染的组合物包括精胺衍生物(参看例如，国际公开第WO 93/18759号)和膜渗透性化合物，如GALA、短杆菌肽S(Gramicidine S)和阳离子性胆汁盐(参看例如国际公开第WO 93/19768号)。
适当有效量可以易于由本领域技术人员决定。此类量将在一个相对较宽的范围内，所述范围可以通过常规试验确定，例如在约10μg到约1mg范围内。然而，已发现高于和低于这一范围的剂量也可能是有效的。
包括所披露的治疗剂的治疗性组合物可以借助于泵递送(参看朗格(Langer),同上文；赛弗顿(Sefton),《生物医学工程评论综述》(CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.)14:201,1987；布奇沃德(Buchwald)等人,《外科学》(Surgery)88:507,1980；索德克(Saudek)等人,《新英格兰医学杂志》(N.Engl.J.Med.)321:574,1989)或通过连续皮下输注(使用微型泵)递送。还可以采用静脉内袋溶液。选择适当剂量的一个因素是如通过在此所披露的方法测量的所获得的被从业人员认为适当的结果。其它控制性释放系统论述于朗格(《科学》(Science)249:1527-33,1990)中。
在一个实例中，植入泵(例如参看美国专利第6,436,091号；第5,939,380号；及第5,993,414号)。可植入的药物输注装置被用于向患者提供治疗剂的恒定并且长期剂量或输注。此类装置可以归类为主动型或被动型的。
活性药物或可程式化的输注装置特征为用以将药剂递送到患者的系统中的泵或计量系统。目前可用的此类主动型输注装置的一个实例为美敦力(Medtronic)的SYNCHROMEDTM可程序化泵。相比之下，被动型输注装置不以泵为特征，而是依赖于加压药物储集器来递送所关注的药剂。此类装置的一个实例包括美敦力的ISOMEDTM。
在特定实例中，包括所披露的治疗剂的治疗性组合物是通过持续释放系统投予的。持续释放系统的适合实例包括适合的聚合材料(如呈例如膜或微胶囊等成形物品形式的半渗透性聚合物基质)、适合的疏水性材料(例如呈于可接受的油中的乳液的形式)或离子交换树脂，及难溶性衍生物(如例如难溶性盐)。持续释放组合物可以经口、不经肠、池内、腹膜内、局部(如通过粉末、油膏、凝胶、滴液或透皮贴片)或作为口服或鼻喷雾剂形式投予。持续释放基质包括聚丙交酯(美国专利第3,773,919号、EP 58,481)、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(希德曼(Sidman)等人,《生物聚合物》(Biopolymers)22:547-556,1983，聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯))；(朗格等人,《生物医学材料研究杂志》(J.Biomed.Mater.Res.)15:167-277,1981；朗格,《化学技术》(Chem.Tech.)12:98-105,1982)；乙烯乙酸乙烯酯(朗格等人,同上文)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
聚合物可以用于离子控制性释放。适用于控制性药物递送的各种可降解和不可降解的聚合物基质是本领域已知的(朗格,《化学研究报告》(Accounts Chem.Res.)26:537,1993)。举例来说，嵌段共聚物泊洛沙姆407(polaxamer 407)以在低温下具有粘性但仍可移动的液体形式存在，但在体温下形成半固体凝胶。经显示，其为重组白细胞介素-2和尿素酶配制和持续递送的有效媒剂(乔斯顿(Johnston)等人,《药物研究》(Pharm.Res.)9:425,1992；和派克(Pec),《不经肠药品科学与技术杂志》(J.Parent.Sci.Tech.)44(2):58,1990)。或者，已使用羟磷灰石作为微载体用于蛋白质的控制性释放(艾杰特马(Ijntema)等人,《国际药物杂志》(Int.J.Pharm.)112:215,1994)。在又一方面，脂质体被用于控制性释放以及脂质囊封的药物的药物靶向(贝塔格里(Betageri)等人,《脂质体药物递送系统》(LiposomeDrug Delivery Systems),泰克诺米克出版有限公司(TechnomicPublishing Co.,Inc.),宾夕法尼亚州兰开斯特(Lancaster,PA),1993)。已知众多用于控制性递送治疗性蛋白质的另外的系统(例如，美国专利第5,055,303号；美国专利第5,188,837号；美国专利第4,235,871号；美国专利第4,501,728号；美国专利第4,837,028号；美国专利第4,957,735号；及美国专利第5,019,369号；美国专利第5,055,303号；美国专利第5,514,670号；美国专利第5,413,797号；美国专利第5,268,164号；美国专利第5,004,697号；美国专利第4,902,505号；美国专利第5,506,206号；美国专利第5,271,961号；美国专利第5,254,342号；及美国专利第5,534,496号)。
所披露的CNA还可以与可检测标记物偶联。举例来说，可检测标记物能够通过诊断成像技术(如CT扫描、MRI、超声波、光纤检查和腹腔镜检查)进行检测。可检测标记物的具体的非限制性实例包括放射性同位素和重金属或化合物(例如通过MRI检测的超顺磁氧化铁纳米晶体)。检测此类可检测标记物的手段是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，可使用照相软片或闪烁计数器来检测放射性标记。
药物组合物可以通过单次推注递送、经由连续递送(例如连续透皮、粘膜或静脉内递送)经一段较长的时间或以重复投药方案(例如依据每小时、每天或每周重复投药方案)投予受检者。化合物的治疗有效剂量可以在较长的预防或治疗方案中以重复剂量提供，所述方案将得到临床上显著的结果，例如改善与本文所陈述的靶向性疾病或病况相关的一种或多种症状或可检测状况；或以足以显现肿瘤的量提供。
适当剂量将取决于受检者的特征，例如受检者是人类还是非人类；受检者的年龄、体重和有关其状况或状态的其它健康考虑；投药模式、途径；及投药剂量次数、时间和途经；同时投予的其它药物或治疗；以及用于在受检者中引起所希望的活性或生物反应的治疗性组合物的具体药理学。剂量方案可进行调整以提供最佳的预防或治疗反应。
治疗有效量也是在临床意义上化合物和/或其它生物活性剂的治疗有益作用超过其任何无毒或有害副作用的量。在本发明的方法和制剂范围内的治疗有效量的非限制性范围为每剂约0.0001μg/kg体重到约10mg/kg体重，如每剂约0.0001μg/kg体重到约0.001μg/kg体重、每剂约0.001μg/kg体重到约0.01μg/kg体重、每剂约0.01μg/kg体重到约0.1μg/kg体重、每剂约0.1μg/kg体重到约10μg/kg体重、每剂约1μg/kg体重到约100μg/kg体重、每剂约100μg/kg体重到约500μg/kg体重、每剂约500μg/kg体重到每剂约1000μg/kg体重，或每剂约1.0mg/kg体重到每剂约10mg/kg体重。
D.试剂盒
本发明还提供了在一个或多个容器中包括一个或多个本发明的CNA分子的试剂盒。在一些实例中，CNA分子是冻干的，并且在投予受检者或用于任何其它应用之前复水。试剂盒可以任选包括其它药剂，如药学上可接受的载剂、说明书等。
前述各方面将通过以下非限制性实例说明。
实例
实例1
CNA设计：CNA单体设计受到了利用肽核酸(PNA)作为DNA模拟物取得的成功的启发。首个PNA是使用氨基乙基甘氨酸(AEG)主链合成的，所述主链是基于基本分子模型选择，其指示了与DNA的磷酸核糖主链类似的重复单元距离和最佳的键角。自发现PNA起，已经合成并评价了若干PNA变体，揭露了杂交所需的基本结构限制。最关键的限制看来是沿所述链的主链的侧接核碱基之间的距离；所述距离最佳为六个原子。尽管已观察到在核碱基之间具有5或7个原子的间隔子的PNA与ssDNA杂交，但如通过较高的熔融温度所指示，具有6个原子的间隔子的PNA主链变体展现出较高的稳定性。
初始CNA单体的结构在重复单元之间具有6个原子的间隔子，并且含有三种组分：硫醇、乙烯基和核碱基(参看图1)。最初提出的两种不同的单体含有这些基本组分，同时还在重复单元之间具有6个原子的间隔子。模拟(SYMBYL-x1.2)指示，N-乙烯基硫醇乙胺(VTE；参看图4)的重复单元长度比DNA重复单元长度少(为比较，DNA与PNA之间的差异为)。
合成：CNA单体是由若干简单的分子成分合成，从而允许精确、原子水平的单体设计。这一针对单体结构的合成控制进一步使得简单的结构变化作为不良溶解性或杂交效率的可能偶发事件或作为对杂交稳定性的进一步优化。VTE单体是使用三个偶合反应成功合成的：使用甲氧基三苯甲基(Mmt)进行的硫醇保护、酰胺偶合及碘乙烯与酰胺的反应。最后一个步骤的胞嘧啶与溴乙酸的偶合反应易于扩展到其余三个核碱基(腺嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤)，从而制备DNA的全部CNA类似物。如所示，C-CNA是以数百毫克量合成，说明合成方案易于扩展到其它核碱基。A、T和G(图7)。合成其余A-CNA、T-CNA和G-CNA单体。对所述合成进行精制以优化产率并将产物按比例放大到克或更大量，这对于在如SNP检测以及反义基因治疗或纳米级药物递送系统等应用中利用这些材料的广泛前景至关重要。
Mmt基团使硫醇官能团的脱除快速并且高效；作为一个可能的应急计划，将考虑其它正交去除的硫醇保护基，如乙酰胺基甲基和硝基苯甲基官能团。如图5中所示，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)将被保护的硫醇官能团经由酰胺偶合途径添加到中心分子，这在本文中被证实是高效的并且产生一种易于纯化的产物。一般的被保护硫醇-烯单体是遵照江(Jiang)等人(江等人,“铜催化的酰胺和氨基甲酸酯与卤乙烯的偶合(Copper-catalyzed coupling ofamides and carbamates with vinyl halides.)”《有机化学通讯》(OrganicLetters)5,3667-3669(2003)，以全文引用的方式并入本文中)所开发的程序，经由碘乙烯的催化偶合制备。这一基本单体然后通过四个核碱基中的任一个进行修饰，如图7中所示。
也考虑CNA主链的修饰。不同单体结构的探索提供了对影响如CNA溶解性、硫醇-烯偶合和CNA杂交等基本特性的分子参数的了解。初步分子模拟(SYMBYL-x1.2)揭露，N-乙烯基硫醇乙酰胺(VTA)主链与DNA重复单元长度具有的差异(如早前所述，PNA与DNA之间的差异为)。因此，作为替代性候选物，提出了使用与用于制备基于VTE的单体相同的偶合反应来合成基于VTA的CNA。
聚合和杂交：使单体C-CNA的硫醇脱除保护基(图5)并且经由在寡聚鸟嘌呤-DNA(10个单体的G-DNA)存在下进行光聚合反应来制造CNA寡聚物。通过乙醇沉淀来纯化产物并且使用MALDI-TOF质谱法进行确定。通过这一实验，已经确定了两个主要发现：i)CNA单体能够在DNA存在下光引发；和ii)硫醇-烯反应是经由交替的链增长-转移机制进行(参看图2)。这些发现支持了以下预想：这些特定的硫醇和‘烯’官能团特别适合于硫醇-烯化学并且在化学上与基于核酸的材料中存在的官能团正交。预期硫醇-烯的自由基性质和其在整个反应中的低浓度使任何碱基损害减到最少，不过，作为应急措施，可以使用众多其它硫醇-X偶合反应(例如迈克尔加成(Michaeladdition))。
在一些实例中，在固体基质(即，官能化树脂)上进行CNA分子的连续制备，从而提供连续控制并且帮助纯化，与固相肽合成(solidphase peptide synthesis，SPPS)类似。简单地说，经由硫醇保护的巯基丙酸酯的酰胺偶合将胺官能化的可裂解基质(通常用于SPPS中，例如瑞克酰胺树脂(Rink amide resin))转化成硫醇。所述基质允许高效并且简单的反应和纯化循环。对于给定循环，将硫醇脱除保护基，并且冲洗掉副产物，随后进行CNA单体硫醇-烯偶合反应以产生新的硫醇保护的表面(参看图9)。然后重复这一程序，直到完成希望的CNA序列。最后，使CNA寡聚物从表面裂解并且通过柱色谱法(HPLC)纯化。然后将使用质谱法(MALDI TOF MS)验证并进一步评价产物。
单体偶合的优化：对每个硫醇-烯反应步骤的偶合效率进行评价；这是通过在整个CNA制造工艺中去除等分试样的树脂并且经由HPLC和质谱法(以及适当时，红外和NMR光谱法)分析产物来实现。反应参数可变换，如光引发剂、树脂和CNA单体的浓度；化学计量；照射强度；及用以进一步优化硫醇-烯偶合效率的反应时间。由于非定量转化引起连续的错误增长，故反应参数的优化是很重要的。为了使这一影响减到最低，将考虑在SPPS中常采用的另外的反应策略，如使用中间物封端反应来减少错误的增长(例如用中间物丙烯酸甲酯/膦溶液冲洗)。
圆二色性：圆二色性(Circular dichroism，CD)光谱法被用于评价CNA光学活性。寡聚C-CNA和G-DNA的CD光谱法展现螺旋形二级结构所特有的光学活性(参看图6)。这一意外的结果是自大致前二十年发现PNA以来合成DNA杂交的首个实例。此外，对样品温度扫描达到90℃(以2℃/min)揭露了解离或‘熔融’温度，所述温度比DNA-DNA结合等效物高20℃(图6)；也就是说，互补CNA-DNA结合比DNA-DNA更稳定。最后，重复杂交实验，不过改用在序列中含有单一变化(即，SNP)的DNA链。单碱基错配的影响是使DNA-CNA缔合明显不稳定，指示CNA材料将对DNA SNP异常敏感。
DNA分别经由其核酸序列和杂交储存信息并选择性缔合的能力使得DNA成为最有能力并且最强大的生物分子结构之一。在所提出的工作中，旨在产生较佳地模拟DNA的能力，同时利用了硫醇-烯点击化学的高效并且容易得到的性质的CNA寡聚物。
杂交评价：使用购买的DNA寡核苷酸(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies,Inc.))和制造的CNA补体评价CNA与DNA的杂交。具体地说，评价21个核碱基的DNA寡核苷酸(KRAS密码子12：5'-CAG CTC CAA CTA CCA CAA GTT TAT-3'(SEQ IDNO:1))和合成的CNA补体的熔融温度。另外考虑在5'端和3'端处以及中点处的单位点和双位点突变。这一信息对于评估SNP检测中CNA的效率很重要。如以上所提到的，CD光谱法特别适合通过测量在260nm下的吸光度来测量CNA-DNA复合物的杂交稳定性(或‘熔融’温度)。在典型实验中，在70℃下培育单链CNA和DNA达10分钟并缓慢地冷却到室温。为了优化CNA-DNA杂交以及为了探索新颖的缔合特征，将考虑方案修改，如热循环。
实例2
展现DNA SNP的CNA寡聚物检测
DNA寡核苷酸阵列由固定于固体基质上，从而允许用遗传材料样品评价互补杂交事件的不同DNA序列的斑点组成。这一技术被用于许多遗传筛选应用，如基因组测序、病理基因学及基因表达分析。CNA将提供一种制造诊断性DNA阵列用于SNP检测的简单方法。除提供一条合成较大核碱基聚合物的途径外，硫醇-烯化学是易于光诱导的，从而得到对反应的精确时空控制。芯片上CNA阵列的制造是通过使用激光或掩蔽光引导序列特异性生长来实现。作为概念验证，将购买荧光标记的DNA，并且对CNA微阵列捕捉特定序列的能力进行评价。在一个具体实例中，评价CNA微阵列检测KRAS癌基因(在密码子12处C->G；常常与癌症诊断相关联的遗传生物标记物)中的SNP的效率。
CNA寡核苷酸阵列的制造：直接在硫醇化比例载片上制造CNA寡核苷酸序列。所述载片是通过经由食人鱼溶液(piranha solution)氧化载片的表面，随后蒸汽沉积硫醇-硅烷试剂(即，3-巯基丙基三甲氧基硅烷)来制备。将载片放到装备有405nm激光的共聚焦显微镜台上。使CNA单体溶液漂浮在在载片的表面上，所述溶液可以包括光引发剂(I819–一种可见光光引发剂)。显微镜被拟定程序以使用405nm激光照射载片上的较小区域，这将确定第一个CNA碱基的放置(参看图16)。冲洗掉CNA溶液，但保留起来用于将来的偶合。对于其余三个CNA碱基重复这一过程，由此完成CNA寡核苷酸的第一个区段。然后将阻断溶液施加于载片，所述溶液是由丙烯酸己酯/二甲基苯基膦溶液，其将不可逆地结合到所有未反应的硫醇并且减少序列错误增长。然后去除硫醇保护基并将开始下一个CNA添加/冲洗循环。使用这一方案，大小为N的CNA寡聚物将需要最多4N的CNA添加/冲洗循环，其中每种CNA核苷酸溶液都是可重复使用的。应理解，这一程序易于扩展到建立高密度寡聚物微阵列，并且，其意义将完全超过简单地制造用于SNP检测的诊断基因阵列。
在一些实例中，产生20个斑点的CNA寡核苷酸阵列，其具有四种不同的序列(即，每个序列五个重复序列)。这些不同序列中的两个可以为野生型或突变型KRAS密码子12的21个核苷酸的互补CNA序列(即，靶序列将为5'-XAG CTC CAA CTA CCA CAA GTT TAT-3'(SEQ ID NO:2)，其中分别对于野生型和G→R突变体，X＝‘C’和X＝‘G’)。其余两个不同序列为具有两个点突变的野生型序列和非特异性(随机)对照物。具有含不同荧光标记的端基(Cy3和Cy5)的野生型和突变序列的DNA寡聚物将是购买的。使用安捷伦技术公司(Agilent Technologies)的荧光微阵列扫描仪(FluorescentMicroarray SCNAner)观测荧光标记的DNA。在每个试验中，给定斑点的平均荧光将相对于背景报导并针对含有互补序列的斑点进行正规化。因此，对于同时含有野生型和突变型DNA靶序列的试验，使用每个颜色通道(对应于Cy3和Cy5荧光团)来确定阳性结合。此外，对杂交方案进行优化以发现适于检测突变型KRAS癌基因的条件。
实例3
用硫醚核酸修饰表面
将CNA序列并入表面修饰中以简单证实所披露的CNA分子对互补DNA具有优良的亲和力。这一增加的敏感性使CNA分子敏感性探针能用于表面上DNA链的检测。在这一试验中，第一步骤是连接玻璃载片上相同载量(1μM)的CNA(多聚T)和DNA(多聚A)链(参看图18)。使用过量的荧光互补DNA链作为荧光探针以检测玻璃载片上的DNA和CNA。如图19中所示，这一试验的结果指示，CNA的荧光强度高于DNA。这一数据证实，CNA分子对互补DNA链的敏感性高于DNA本身。
实例4
将点击核酸并入水凝胶中
在水凝胶形成中引入CNA-DNA杂交物作为交联剂。在初始试验中，使用与PEG-丙烯酸酯的硫醇-迈克尔加成反应合成4臂的PEG-多聚A(DNA)和2臂的PEG多聚T(CNA)。在缓冲液(5-8wt％)中将这两个底物混合在一起并观察水凝胶的形成。这些结果证明了所披露的CNA分子作为分子结构单元(例如在生物相容性水凝胶中)的弹性性质。

Claims (38)

1.一种点击核酸单体，其包含：
任选保护的硫醇；
任选保护的硫醇-点击受体；
任选保护的核碱基(NB)；及
主链，其包含3价或更高价态的原子，
其中所述任选保护的硫醇、所述任选保护的硫醇-点击受体部分及所述任选保护的核碱基独立地与所述主链共价连接。
2.如权利要求1所述的点击核酸单体，其中所述点击核酸单体具有以下结构：
其中Z为具有3价或更高价态的原子；NS为核碱基侧基，包含所述任选保护的核碱基(NB)；T为所述任选保护的硫醇；并且TCA是所述任选保护的硫醇-点击受体。
3.如权利要求1或2所述的点击核酸单体，其中所述点击核酸主链包括一个或多个3价的另外的原子。
4.如权利要求1到3中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述点击核酸单体具有以下结构：
其中Y和Z为具有3价或更高价态的原子；n为0到4的整数；NS是所述核碱基侧基，包含所述任选保护的核碱基；T为所述任选保护的硫醇；并且TCA是所述任选保护的硫醇-点击受体。
5.如权利要求1到3中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述点击核酸单体具有以下结构：
其中Y和Z为具有3价或更高价态的原子；n为0到4的整数；m为0到4的整数；NS是核碱基侧基，其包括任选保护的核碱基；T为任选保护的硫醇；并且TCA是任选保护的硫醇-点击受体。
6.如权利要求1到3中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述点击核酸单体具有以下结构：
其中Y和Z为具有3价或更高价态的原子；n为0到4的整数；NS是所述核碱基侧基，包含所述任选保护的核碱基；T为所述任选保护的硫醇；并且TCA是所述任选保护的硫醇-点击受体。
7.如权利要求1到3中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述点击核酸单体具有以下结构：
其中n为≥0的整数并且m为>0的整数，n+m介于1与7之间；NS为所述核碱基侧基，包含所述任选保护的核碱基；T为所述任选保护的硫醇部分；TCA为任选取代的硫醇反应性部分；Z为3价或更高价态的原子；并且R1和R2独立地为氢、羟基、芳香族基团、胺、羧基和羰基的组合，这些基团任选被取代。
8.如权利要求1到7中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述核碱基侧基包含连接子，其中所述连接子将所述核碱基共价连接到所述3价或更高价态的原子。
9.如权利要求8所述的点击核酸单体，其中所述连接子包含-C(O)C-。
10.如权利要求1到9中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述任选保护的硫醇-点击受体包含乙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、降冰片烯、乙烯基砜、环氧基、丙烯酸酯、异氰酸酯、炔、甲基丙烯酸酯、顺丁烯二酰亚胺、卤化物或其烷基延长。
11.如权利要求10所述的点击核酸单体，其中所述乙烯基部分具有以下结构：
-CR5＝CR6R7，
其中R5、R6和R7独立地为氢、烃基、被取代的烃基、被取代的杂环基、烷基、被取代的烷基、酰基、-C(O)R、-C(O)OR或-C(O)NRaRb、芳基或被取代的芳基或杂环。
12.如权利要求1到11中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述3价或更高价态的原子为氮(N)或碳(C)。
13.如权利要求1到12中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述单体具有包括所述硫代部分和所述任选保护的硫醇-点击受体的末端碳在内的5到9个原子的重复单元。
14.如权利要求1到13中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述单体具有包括所述硫醇部分和所述任选保护的硫醇-点击受体的末端碳在内的6个原子的重复单元。
15.如权利要求1到14中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述硫醇部分被保护。
16.如权利要求1到15中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述硫醇-点击受体被保护。
17.如权利要求1到16中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述核碱基被保护。
18.如权利要求1到17中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中NS基团具有以下结构：
其中NB为任选保护的核碱基。
19.如权利要求1到18中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述任选保护的硫醇具有以下结构：
其中p为0到4的整数，并且其中亚甲基任选并且独立地被芳基、羟基、羰基、羧酸和其它酸、氨基、烷基酰胺、硫醚、环、杂环及其烷基延长取代。
20.如权利要求1到19中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述任选保护的硫醇具有以下结构：
21.如权利要求1到20中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述任选保护的硫醇-点击受体为任选取代的乙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、降冰片烯、异氰酸酯、乙烯基砜、环氧基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、顺丁烯二酰亚胺、卤化物及其烷基延长。
22.如权利要求1到21中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述任选保护的硫醇-点击受体包含以下之一：
其中X为卤化物并且R为氢或烷基链。
23.如权利要求1到22中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述单体包含N-乙烯基硫醇乙酰胺(VTA)主链。
24.如权利要求1到22中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述单体包含N-乙烯基硫醇乙胺(VTE)主链。
25.如权利要求1到24中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述单体包含A、G、T、U或C核碱基。
26.如权利要求1到25中任一权利要求所述的点击核酸单体，其中所述单体包含图4、5、7-14或18中的任一个中所示的点击核酸。
27.一种点击核酸聚合物，其包含通过硫醇硫醇-点击受体反应与另一如权利要求1到26中任一权利要求所述的点击核酸单体共价连接的如权利要求1到26中任一权利要求所述的点击核酸单体。
28.如权利要求27所述的点击核酸聚合物，其中所述点击核酸聚合物与效应分子共价连接。
29.如权利要求28所述的点击核酸聚合物，其中所述效应分子为可检测标记物。
30.如权利要求28所述的点击核酸聚合物，其中所述效应分子为生物活性化合物。
31.如权利要求27到30中任一权利要求所述的点击核酸聚合物，其中所述硫醚聚合物与表面结合。
32.一种阵列，其包含如权利要求27到31中任一权利要求所述的点击核酸聚合物。
33.一种组合物，其包含如权利要求27到30中任一权利要求所述的可点击核酸聚合物。
34.如权利要求32所述的组合物，另外包含生理学上可接受的载剂。
35.一种制备点击核酸单体的方法，其包含图5、8和/或15中所示的方案。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述点击核酸单体包含如权利要求1到27中任一权利要求所述的点击核酸单体。
37.一种制备点击核酸聚合物的方法，其包含图2、9或15中所示的方案。
38.一种如权利要求27到31中任一权利要求所述的点击核酸聚合物的用途。
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