CN104271744B - 分枝杆菌感染的预防和治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预防和治疗分枝杆菌感染(尤其但不仅是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染)之抗原(包括分枝杆菌硫酸盐同化途径组分，例如CysD)的鉴定；涉及表达系统，其包含用于表达所述用于预防和治疗所述感染之抗原的活分枝杆菌；并且涉及所述抗原和表达系统用于预防和治疗所述感染的用途。

Description

分枝杆菌感染的预防和治疗

技术领域

本发明涉及用于预防和治疗分枝杆菌感染(尤其但不仅是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染)之抗原的鉴定；涉及表达系统，其包含用于表达所述用于预防和治疗所述感染之抗原的活分枝杆菌(Mycobacterium)；并且涉及所述抗原和表达系统用于预防和治疗所述感染的用途。

背景技术

本说明书中参考的任何现有技术不是也不应当被视为承认或任何形式的建议该现有技术构成了澳大利亚或任何其他司法管辖区的公知常识，或者该现有技术可以由本领域技术人员合理地预期为确定、理解和视为相关。

结核病(tuberculosis，TB)的病原体结核分枝杆菌每年夺去将近2百万生命(Dye，2010)，且是全球由于单细菌病原体而死亡的首要原因。该情况在过去十年中已经由于与HIV的共感染以及目前的疫苗卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)为成年人提供针对TB的保护时的低效率而变得更危急(Dye，2010)。

通过被感染个体识别新的和保护性抗原的鉴定将代表TB控制中的主要进步，且可形成限制疾病传播之新疗法的基础。

目前临床试验中的TB疫苗包括病毒载体的或基于佐剂的亚单位疫苗，以及全分枝杆菌疫苗，其表达一个或更多个免疫原性结核分枝杆菌抗原(Kaufmann，2011)。这些策略中的多数基于结合分枝杆菌的分泌抗原，假定其被宿主免疫应答更容易地“看到”(在(Kaufmann，2011)中综述)。还没有确定这些新候选疫苗在人中的保护性效力。

存在对用于预防和/或治疗分枝杆菌感染(尤其是结核分枝杆菌感染)之其他候选抗原和疫苗的需要。

为进一步鉴定抗原，通过重组疫苗载体(例如卡介苗(BCG))在抗原呈递细胞中抗原表达的靶向调节将显著地辅助开发有效的免疫治疗策略。

存在对候选表达系统的需要，尤其是能够立即并持续表达保护性抗原的那些，从而使得能够提高对分枝杆菌(尤其是结核分枝杆菌)的抗原特异性免疫应答。

发明内容

本发明寻求解决一个或更多个上面提到的需要和/或提供预防和/或治疗分枝杆菌感染的改进，并且在一个实施方案中提供了最小化在个体中发生分枝杆菌感染之可能性的方法，其包括：

-在个体中形成对分枝杆菌硫酸盐同化途径(sulphate assimilation pathway，SAP)之组分(component)的免疫应答；

从而最小化所述个体中发生分枝杆菌感染的可能性。

在另一个实施方案中，提供了用于向个体提供对分枝杆菌感染之免疫的方法，其包括：

-在个体中形成对分枝杆菌SAP之组分的免疫应答；

从而向所述个体提供对分枝杆菌感染的免疫。

在另一个实施方案中，提供了预防个体中发生分枝杆菌感染的方法，其包括：

-在处于病症中的需要所述预防的个体中提供分枝杆菌SAP的组分以使所述个体中能够形成对所述组分的免疫应答；

从而预防所述个体中发生感染。

在另一个实施方案中，提供了用于治疗具有分枝杆菌感染的个体以至少最小化所述感染或与所述感染相关病症之进展的方法，其包括：

-在处于病症中的需要所述治疗的个体中提供分枝杆菌SAP的组分以使所述个体中能够形成对所述组分的免疫应答；

从而治疗所述个体。

在另一个实施方案中，提供了分枝杆菌SAP的组分在制造用于最小化个体中发生分枝杆菌感染可能性的药物中的用途。

在另一个实施方案中，提供了分枝杆菌SAP之组分用于最小化个体中发生分枝杆菌感染可能性的用途。

在另一个实施方案中，提供了用于确定个体是否对分枝杆菌免疫的方法，其包括：

-在处于病症中的个体中提供分枝杆菌SAP的组分以使所述个体中能够形成对所述组分的免疫应答；

-确定所述个体是否发生了对所述组分的保护性免疫应答；

其中保护性免疫应答的发生确定了所述个体对分枝杆菌免疫；

从而确定所述个体是否对分枝杆菌免疫。

分枝杆菌CsyD基因或基因产物是用于上述方法中的优选组分。

在另一个实施方案中，提供了用于在个体中提供对分枝杆菌之免疫应答的疫苗或免疫刺激组合物，其包含：

-分枝杆菌SAP的组分；

-化合物，其用于增强对分枝杆菌SAP之组分的免疫应答。

在另一个实施方案中，提供了用于在个体中提供对分枝杆菌之免疫应答的疫苗或免疫刺激组合物，其包含：

-包含重组CysD基因或蛋白质的分枝杆菌细胞。

在另一个实施方案中，提供了适合于用在上述组合物中的重组蛋白，所述蛋白包含具有由分枝杆菌CysD基因编码之序列的第一区以及一个或更多个具有分枝杆菌抗原序列的另外的区。还提供了编码所述重组蛋白的核酸以及包含所述核酸的表达载体。

在另一个实施方案中，提供了适合于用在上述组合物中的蛋白质，所述蛋白质包含具有由分枝杆菌CysD基因编码之序列的第一区以及具有由分枝杆菌Agb85基因编码之序列的另外的区。还提供了编码所述蛋白质的核酸以及包含所述核酸的表达载体。

在另一个实施方案中，提供了包含编码分枝杆菌CysD蛋白的核酸和启动子的表达载体，其中当将包含所述载体的分枝杆菌菌株引入APC时所述启动子与核酸可操作地相连接用于表达所述核酸，所述启动子具有引起分枝杆菌ATP非依赖性分子伴侣之表达的分枝杆菌启动子的序列。

在另一个实施方案中，提供了包含上述重组蛋白、核酸或表达载体的分枝杆菌。细胞可来自结核分枝杆菌或可为结核分枝杆菌的减毒菌株。

在一些相关的实施方案中，提供了用于提供对分枝杆菌感染之抗原特异性免疫应答的方法，其包括：

-将分枝杆菌菌株引入抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)；

其中所述菌株包含：

-编码用于提供对分枝杆菌感染的抗原特异性免疫应答之分枝杆菌抗原的重组核酸；

-当将所述菌株引入APC时用于表达所述重组核酸的与所述重组核酸可操作地相连接的启动子，所述启动子具有引起分枝杆菌ATP非依赖性分子伴侣之表达的分枝杆菌启动子的序列。

在另一个实施方案中，提供了表达载体，其包含：

-编码用于提供对分枝杆菌感染的抗原特异性免疫应答之分枝杆菌抗原的核酸；

-当将菌株引入APC时用于表达所述核酸的与所述核酸可操作地连接的启动子，所述启动子具有引起分枝杆菌ATP非依赖性分子伴侣之表达的分枝杆菌启动子的序列。

在上述的一些实施方案中，分枝杆菌HspX启动子是用作具有引起分枝杆菌ATP非依赖性分子伴侣之表达的分枝杆菌启动子序列之启动子的优选的启动子。

在另一个实施方案中，提供了包含上述表达载体的分枝杆菌菌株。

在另一个实施方案中，提供了表达载体，其包含：

-编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含具有由分枝杆菌CysD基因编码之序列的第一区以及具有由分枝杆菌Agb85基因编码之序列的另外的区；

-当将所述载体引入APC时，引起所述核酸表达的分枝杆菌HspX启动子。

在另一个实施方案中，提供了细胞，通常为结核分枝杆菌细胞或减毒分枝杆菌细胞(例如减毒牛分枝杆菌(M.bovis)细胞如BCG)，或减毒结核分枝杆菌细胞，所述细胞包含上述表达载体。

在一个相关的实施方案中，提供了用于最小化个体中发生结核分枝杆菌感染可能性的方法，其包括：

-在个体中提供减毒结核分枝杆菌细胞，在其中发生所述感染的可能性将被最小化；

其中所述细胞包含：

表达载体，其包含：

-编码蛋白质的重组核酸，所述蛋白质包含具有由分枝杆菌Agb85基因编码之序列的第一区以及具有由分枝杆菌CysD基因编码之序列的另外的区；

-当将所述载体引入APC时，引起所述重组核酸表达的分枝杆菌HspX启动子；

其中在所述处于病症中的个体中提供所述细胞用于形成所述个体中对所述蛋白质的免疫应答；

从而最小化个体中发生分枝杆菌感染的可能性。

附图说明

图1.在宿主细胞内和非复制持续期间结核分枝杆菌硫酸盐活化复合物的上调。(A)编码所述硫酸盐活化复合物之cysDNC基因座的基因组构(genetic organisation)。在结核分枝杆菌中，cysN(GTP酶)和cysC(激酶)活性在一条多肽中融合在一起，且cysDNC构成操纵子。(B)通过定量实时PCR测量之杆菌(bacilli)cysDNC的相对表达水平，所述杆菌在培养物中生长48小时(空柱)或在RAW细胞感染后生长48小时(黑柱)。数据为以一式三份测量的平均相对表达±S.E.M，且代表两个独立的实验。(C)DETA-NO(Det)对经培养的结核分枝杆菌生长的作用。每24小时将50μM DETA-NO添加至结核分枝杆菌培养物(实心正方形)，持续7天，或者未处理(实心圆圈)。在第0、1、3和7天，取等分试样以确定CFU/mL。(D)在DETA-NO处理后第7天cysDNC的相对表达水平(黑柱)与未处理之结核分枝杆菌培养物(空柱)的比较。

图2.结核分枝杆菌硫酸盐活化复合物的宿主免疫识别。在鼻内结核分枝杆菌攻击(challenge)后3周(A)和8周(B)测量小鼠之MLN中的抗原特异性T细胞应答。在对CysDNC或85B蛋白(10μg/ml)回忆(recall)后通过ELIspot计数IFN-γ分泌性细胞。数据为4只小鼠的平均值±S.E.M，且代表两次实验。通过ANOVA确定蛋白质刺激的和未刺激的细胞间差异的显著性；＊p＜0.0001。(C)在结核分枝杆菌感染的患者的外周血中(空圆圈)(n＝15)以及TST-ve个体的外周血中(实心圆圈)(n＝11)测量抗原特异性T细胞应答。经由³H-胸苷和计算的刺激指数的整合测量10μg/ml下响应于结核分枝杆菌CFP、CysDNC和Ag85B蛋白的T细胞增殖。水平线表示每组的中值。通过Mann-Whitney U检验确定结核分枝杆菌感染的患者和TST-ve个体间差异的显著性；＊p＜0.001。

图3.在结核分枝杆菌攻击后，通过编码硫酸盐活化复合物成员的DNA疫苗来提供保护。以2周间隔以100μg的pCDNA3、DNA-cysD、DNA-cysNC或DNA-cysD与DNA-cysNC之组合的每一种通过肌内注射(i.m injection)免疫接种C57BL/6(n＝5)小鼠三次。在第一次注射DNA疫苗时，通过皮下注射(s.c injection)5×10⁵CFU的BCG免疫接种小鼠一次。在第三次免疫接种后四周，用气溶胶结核分枝杆菌攻击小鼠。在攻击后四周，在肺(A)和脾(B)中确定细菌负荷。这些数据以每个器官的平均CFU(±SEM)示出，且代表所有组之3个单独实验之一。通过ANOVA确定未接种疫苗和免疫接种组间在肺和脾中之差异的显著性；＊p＜0.001。

图4.在结核分枝杆菌硫酸盐活化途径中的下游酶的上调和宿主免疫识别。(A)RAW细胞内结核分枝杆菌SAP基因与体外培养之杆菌相比的相对上调。从体外培养的杆菌或结核分枝杆菌感染的RAW细胞感染后48小时提取总RNA。反转录1μg的总RNA并进行实时PCR以评估结核分枝杆菌cysH、sirA、cysK1和cysE的表达。数据为一式三份测量的平均相对表达±S.E.M并代表两个独立的实验。(B)在结核分枝杆菌攻击8周后测量小鼠MLN中抗原特异性T细胞应答。在对CysH、SirA、CysK1和CysE(10μg/ml)回忆后，通过ELIspot计数IFN-γ分泌细胞。数据为四只小鼠的平均±S.E.M，且代表两次实验。通过ANOVA确定蛋白质刺激的和未刺激的细胞间之差异的显著性；＊p＜0.0001。(C)TB感染之个体中SAP蛋白的识别。在结核分枝杆菌感染的患者(空圆圈)(n＝15)和TST-ve个体(实心圆圈)(n＝11)的外周血中测量抗原特异性T细胞应答。如图2C所述测量响应于10μg/ml的结核分枝杆菌CFP(按照图2C)、CysH、SirA、CysK1和CysE蛋白的T细胞增殖。通过Mann-Whitney U检验确定结核分枝杆菌感染的患者和TST-ve个体间差异的显著性；＊p＜0.001。

图5.编码下游SAP酶之DNA疫苗的保护性效力。以2周间隔以100μg的pCDNA3、DNA-cysD与DNA-cysNC的组合或者表达cysH、sirA、cysK1或cysE之DNA疫苗的混合物的每一种通过肌内注射免疫接种C57BL/6小鼠(n＝5)三次。在第一次注射DNA疫苗时，通过皮下注射5×10⁵CFU的BCG免疫接种小鼠一次。在第三次免疫接种后四周，用气溶胶结核分枝杆菌攻击小鼠。四周后，在肺(A)和脾(B)中确定细菌负荷。这些数据以每个器官的平均CFU(±SEM)示出，且代表所有组之3个单独实验之一。通过ANOVA确定未接种疫苗和免疫接种组间在肺和脾中之差异的显著性(＊p＜0.0001)以及BCG免疫接种的动物和其他免疫接种组间之差异的显著性(+p＜0.0001)。

图6.在用CysDN蛋白加强(boost)后BCG的保护性效力。用5×10⁵CFU的BCG通过皮下注射免疫接种小鼠的组，且在24周后小鼠皮下接受MPL-DDA中之100μg的CysDNC蛋白(以两周间隔进行3次)。在6周后，用气溶胶结核分枝杆菌攻击小鼠。没有免疫对照小鼠，没有免疫接种或者用BCG免疫接种，并仅用MPL-DDA佐剂加强。在攻击后4周，确定肺(A)和脾(B)中的细菌负荷。这些数据以对于每组6至10个小鼠之每个器官的平均细菌数量±SEM示出。数据代表两个独立的实验。通过ANOVA确定未免疫小鼠和其他组间之差异的显著性(＊p＜0.0001)以及BCG/MPL-DDA免疫的动物和其他组间之差异的显著性(＊＊p＜0.0001；NS-无显著差异)。

图7.在树突细胞内hspX启动子的迅速诱导。通过流式细胞术测量由BCG Pasteur、充气的BCG：P_hspX-GFP培养物(滚动)或在低氧张力下培养7天的BCG：P_hspXGFP(静止)表达GFP的水平(A)。用BCG：P_hspX-GFP以1∶1的MOI感染来自C57BL/6小鼠的BMDC培养物，且通过流式细胞术在感染后0、6和24小时确定GFP荧光(B)。数据示出平均值±SEM(n＝3)并代表两个独立的实验。通过ANOVA确定相对0时间点之差异的显著性(＊＊＊p＜0.0001)。通过共聚焦显微术在BMDC感染后0、6和24小时可视化BCG：P_hspX-GFP的GFP表达(C)。示出的图像是使用GFP滤光器和相差图像的合成以可视化细胞形态。

图8.在宿主内hspX启动子的体内诱导。用1×10₇CFU的对照BCG或BCG：P_hspX-GFP向小鼠皮下接种疫苗，且在感染后0、1、3和7天确定来自感染部位CD45₊细胞中GFP表达的水平(A)。将BCG：P_hspX-GFP小鼠小鼠(黑点)的散点图(scatter plot)叠加在用对照BCG感染小鼠(灰点)的GFP表达水平上。来自经注射的GFP₊总数在(B)中示出。数据示出平均值±SEM，且代表两个独立的实验。通过ANOVA确定第0天与其他时间点间之差异的显著性(＊＊p＜0.01；＊＊＊p＜0.0001)。

图9.在募集至疫苗接种部位的树突细胞中hspX启动子的表达。如图2所述向小鼠接种疫苗，且通过流式细胞术确定显示DC表型(CD11c_hiCD11b_hi)之细胞的数目(A)。在CD45₊群内的GFP表达细胞以散点图(B)与GFP₊CD11b_hiCD11c_hi细胞在疫苗接种部位的总数随时间进程一起示出(C)。数据示出平均值±SEM，且代表两个独立的实验。通过ANOVA确定第0天与其他时间点间之差异的显著性(＊p＜0.05；＊＊p＜0.001；＊＊＊p＜0.0001)。

图10.hspX启动子可促进APC内重组抗原的改善的T细胞识别。经培养的BMDC被留下不感染(uni)或在用由p25小鼠纯化之Ag85B特异性T细胞共孵育之前用对照BCG、BCG：P_hsp60-85B或BCG：P_hspX-85B感染4小时。分别通过[₃H]-胸苷吸收(uptake)或IFN-_ELISA在第3天确定p25T细胞的增殖(A)和IFN-_释放(B)。数据示出平均值±SEM(n＝3)，且代表至少两个独立的实验。通过ANOVA确定未感染的细胞与其他组间之差异的显著性(＊＊＊p＜0.0001；ns，不显著)。

图11.在用BCG：P_hspX-85B接种疫苗的小鼠的DLN中Ag85B-反应性T细胞的做好准备(prime)。用5×10₅CFSE标记的p25转基因淋巴结细胞静脉内注射C57BL/6小鼠，且一天后留下作为未感染的对照(unv)或用5×10₅CFU的BCG、BCG：P_hsp60-85B或BCG：P_hspX-85B皮下接种疫苗。在感染后3或7天，确定DLN中转移的p25CD4T细胞的CFSE和CD62L谱(A)。分裂状态呈现为CFSE_hi(高)、CFSE_int(分裂1-5，中)或CFSE_lo(分裂＞6，低)。确定处于基于CFSE水平的分裂状态之p25CD4T细胞的比例(B)。

图12.在hspX启动子控制下通过用表达Ag85B的BCG接种疫苗诱导的特异性T细胞免疫的提高。将小鼠留下不接种疫苗(unv)或用5×10₅CFU的对照BCG、BCG：P_hsp60-85B或BCG：P_hspX-85B皮下接种疫苗。在接种疫苗后3周(A)或12周(B)确定对应于来自Ag85B之p25肽的IFN-_分泌性脾细胞的数目。在接种疫苗后12周，还用结核分枝杆菌H37Rv雾化(aerosolize)小鼠的组，且在攻击后4周确定肺(C)和脾(D)中的结核分枝杆菌负荷。示出的数据为每组3只小鼠的平均值±SEM，且代表两个独立的实验。通过ANOVA确定未接种疫苗的小鼠与BCG接种组间之差异的显著性(＊p＜0.05；＊＊p＜0.001；＊＊＊p＜0.0001)。

图13.用BCG：Ag85BCysD的疫苗接种显示出改善的免疫原性。用5×10⁵CFU的BCG或表达Ag85BCysD融合蛋白的BCG免疫接种C57BL/6小鼠(n＝5)。用Ag85BCysD蛋白再刺激的脾细胞表现出与仅用BCG免疫接种之小鼠的脾细胞相比提高的IFN-g-分泌性细胞的数目。

图14.通过Ag85B-CysD融合蛋白诱导的保护。用佐剂(MPL/DDA)、Ag85B-CysD融合蛋白(10mg)或Ag85B(10mg)通过皮下注射免疫接种C57BL/6小鼠(n＝5)3次。在第一次注射蛋白质疫苗时，通过皮下注射5×10⁵CFU的BCG免疫接种小鼠一次。在第三次免疫接种后四周，用具有每肺～100个有活力的杆菌之感染剂量的气溶胶结核分枝杆菌攻击小鼠，且4周后在肺(A)和脾(B)中确定细菌负荷。数据以每器官的平均CFU(±SEM)示出。用单因素ANOVA以及使用Bonferroni事后检验完成的多组数据集的成对比较来评价组间之差异的显著性。

图15.分枝杆菌中的硫酸盐同化。一旦输入细胞，通过由cysDNC编码的ATP硫酸化酶活化硫酸盐以产生腺苷-5’-磷酰硫酸(APS)。在分枝杆菌中，APS位于代谢分支点。其可通过由cysC编码的APS激酶磷酸化以产生磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)，其作为生物分子硫酸化(sulfation)的普遍硫酸盐供体，所述生物分子的硫酸化为分枝杆菌细胞壁的结构单元(building block)。在APS中的硫酸盐部分还可通过cysH编码的APS还原酶催化还原为亚硫酸盐。亚硫酸盐通过亚硫酸盐还原酶(由sirA编码)进一步还原为硫化物，且以硫的形式在该还原途径的最后步骤中整合入半胱氨酸，所述步骤涉及两种酶，分别为由cysK1和cysE编码的O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(O-Acetylserine sulfhydralase，OASS)和丝氨酸乙酰转移酶。半胱氨酸为分枝杆菌中许多重要分子的结构单元。

具体实施方式

现将详细涉及本发明的某些实施方案。虽然本发明将与这些实施方案相结合来描述，但是应理解目的不在于将本发明限制于那些实施方案。相反地，本发明旨在覆盖所有替代方案、修改和等价方案，其可包括在通过权利要求书所定义的本发明的范围内。

本领域技术人员将认识到许多类似或等价于本文所描述的那些的方法和材料，其可用于本发明的实践中。本发明不以任何方式限制所描述的方法和材料。

应理解，在本说明书中所公开的和所定义的本发明延伸至两个或更多个提到的或者从文字或图明显的单个特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成本发明的多个替代方面。

本文提到的所有专利和出版物通过引用以其整体并入。

为了说明本说明书，没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。

如本文所述，本发明人示出硫酸盐同化途径(SAP)基因和相关基因产物是高度免疫反应性的，在这个意义上，刺激来自从结核分枝杆菌感染的具有SAP蛋白之小鼠淋巴结的淋巴细胞提供强Th1应答，在感染后持续长达8周。此外，在感染结核分枝杆菌的人中，观察到外周血淋巴细胞响应于SAP蛋白的增殖在程度上大于来自结核分枝杆菌阴性个体的细胞。

进一步说，本发明人示出可利用SAP基因和蛋白来诱导抗原特异性保护性免疫应答。更特别地，本发明人示出用SAP基因和蛋白的免疫接种对随后感染结核分枝杆菌之小鼠中的肺和脾提供了保护，且保护性效力接近在用BCG免疫接种中观察到的。

此外，本发明人示出可使用SAP基因和基因产物来改善通过BCG免疫接种提供的保护免疫，如本说明书所示，所述SAP组分改善了BCG针对结核分枝杆菌感染的保护作用，这在肺组织中最明显。

如本文所讨论的，这些发现是出乎意料的，因为认为SAP蛋白为细胞内或膜相关蛋白(鉴于其定位)与分泌性蛋白质相比应当不太可能进行免疫监视。在这点上，令人吃惊地在这些研究中观察到免疫活化的量等效于针对细胞表面抗原或分泌性抗原Ag85B所观察到的量。

A定义

如本文使用的，除了当上下文另有要求外，术语“包括/包含(comprise)”及该术语的变体(比如“comprising”、“comprises”和“comprised”)不旨在排除另外的添加剂、组分、整数或步骤。

磷酸盐同化途径或SAP一般指通过其分枝杆菌还原硫的途径，从而获得用于生物合成半胱氨酸和下游产物(包括分支硫醇(mycothiol))的底物。更详细地说，所述途径包括从硫酸盐形成腺苷-5’-磷酰硫酸(APS)，APS还原酶(由CysH编码)可由其产生亚硫酸盐，且亚硫酸盐还原酶(由SirA编码)可由其产生硫化物，且用O-乙酰基-L-丝氨酸、O-乙酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶(由CysK1编码)可由其产生半胱氨酸。SAP的关键酶包括ATP硫酸化酶(腺苷酰转移酶)(由CysD编码)、GTP酶(由CysN编码)和APS激酶。这些酶使得能够从硫酸盐形成PAS，且从APS形成3’磷酸腺苷5’-磷酰硫酸(PAPS)。

SAP组分一般指根据SAP涉及分枝杆菌中硫还原的蛋白质或酶，其的实例包括由CysD、CysNC、CysH、SirA、CysE、CysK1基因编码的那些。

硫酸盐活化复合物或SAC一般指从CysD基因产物与CysNC基因产物的组合形成的异源二聚复合物。所述CysD和CysNC基因作为操纵子一起存在于分枝杆菌中。

CysD基因一般指编码ATP硫酸化酶的核酸。所述核酸可具有实质上如本文SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列，或以其他方式具有如本文所定义的限定的同源性和/或同一性。

CysD蛋白一般指ATP硫酸化酶。所述蛋白质可具有实质上如本文SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或以其他方式具有如本文所定义的限定的同源性和/或同一性。

CysNC基因一般指编码GTP酶和APS激酶的核酸。所述核酸可具有实质上如本文SEQID NO：3所示的核苷酸序列，或以其他方式具有如本文所定义的限定的同源性和/或同一性。

CysNC蛋白一般指GTP酶和APS激酶。所述蛋白质可具有实质上如本文SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或以其他方式具有如本文所定义的限定的同源性和/或同一性。

Ag85B基因一般指这样的核酸，所述核酸具有实质上如本文SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，或以其他方式具有如本文所定义的限定的同源性和/或同一性。

Ag85B蛋白一般指这样的蛋白质，所述蛋白质具有实质上如本文SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，或以其他方式具有如本文所定义的限定的同源性和/或同一性。

HspX启动子一般指这样的核酸，所述核酸具有实质上如本文SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，或以其他方式具有如本文所定义的限定的同源性和/或同一性。

85BCysD一般指具有实质上如本文SEQ ID NO：8所示之氨基酸序列的蛋白质。

pHspX85BCysD一般指具有实质上如本文SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列的核酸。

B.抗原特异性免疫的诱导

如本文所讨论以及在实例中所示例的，本发明人已经示出SAP组分引起抗原特异性保护性免疫应答。特别地，用SAP组分免疫接种且特别是SAC组分防止稍后感染结核分枝杆菌的小鼠中分枝杆菌感染的进展。此外，本发明人示出所述SAP组分可用来加强来自BCG免疫接种的免疫，且所述SAP组分在结核分枝杆菌感染的个体中是高度免疫反应性的，表明这些组分对最小化由感染造成之疾病或病症的发生是有用的。因此，本发明提供了用于对分枝杆菌感染进行(i)预防、(ii)治疗、和(iii)加强免疫的方法。在这些情形下，本发明的方法通过防止所述感染发展成相关疾病或病理状况或者一旦感染已经建立通过防止进一步发生疾病或病理状况使发生感染的可能性最小化。

因此，在一个实施方案中提供了用于在个体中使发生分枝杆菌感染之可能性最小化的方法，所述方法包括：

-对个体中之分枝杆菌硫酸盐同化途径(SAP)的组分形成免疫应答；

从而使个体中发生分枝杆菌感染的可能性最小化。

在一个实施方案中，个体可不具有可检测的分枝杆菌感染和/或之前可没有针对分枝杆菌进行免疫。这样的个体一般可通过在本领域中广泛地使用的Mantoux测试来鉴定。

在另一个实施方案中，个体可以是无症状的或者具有感染的亚临床症状。更通常地，无症状对象具有一种或更多种症状(例如，发烧、咳嗽、体重减轻)。杆菌可存在且可培养，即可生长在来自以上体液的培养物中，且个体可具有放射显影上的明显的肺部损害，其可包括浸润但无成腔(cavitation)。

在另一个实施方案中，个体可具有感染的明显症状，例如肺的腔损害。杆菌可从痰和/或其他上述体液的涂片培养，而且以足够的数量存在以作为耐酸杆菌在这些流体的涂片中可检测。

通常免疫应答主要为Th1应答。通过在疫苗施用后检测细胞增殖来确定该应答，如通过³H胸苷整合或使用其中评估IFN-γ之产生的细胞测定(例如流式细胞术和/或ELISA)测量。还可通过检测特异性抗体测量所述免疫应答(以1至1×10⁶的范围、优选1×10³、更优选地以约1×10³至约1×10⁶的范围以及最优选地大于1×10⁶的效价(titer))。

通过从现在或先前感染强致病性分枝杆菌的动物或人中取出的淋巴细胞之相关细胞因子(例如IFN-γ)的释放，或者通过检测这些T细胞的增殖来确定体外细胞应答。通过添加多肽或免疫原性部分至包含每孔1×10⁵个细胞至3×10⁵个细胞的悬液来进行诱导。所述细胞从血液、脾、肝或肺分离，且添加所述多肽或所述多肽的免疫原性部分产生不大于每ml悬液20μg的浓度，且2至5天进行所述刺激。为了监测细胞增殖，所述细胞用放射性标记的胸苷脉冲作用，且孵育16-22小时后通过液体闪烁计数检测所述增殖。阳性应答为大于背景加两个标准差的应答。可通过ELISA方法确定IFN-γ的释放，其是本领域技术人员公知的。阳性应答为大于背景加两个标准差的应答。当监测对所述多肽的免疫应答时，另一些不为IFN-γ的细胞因子可相关，例如IL-12、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、TGF-β。用于确定细胞因子(例如IFN-γ)存在的另一种且更灵敏的方法为ELISPOT法，其中将所述从血液、脾、肝或肺分离的细胞稀释至优选1至4×10⁶个细胞/ml的浓度并在所述多肽或所述多肽的免疫原性部分存在下孵育18至22小时，产生不大于每ml 20μg的浓度。此后，将所述细胞悬液稀释至1至2×10⁶/ml并转移至用抗IFN-γ包被的Maxisorp板，并优选地孵育4至16小时。通过使用经标记的二级抗IFN抗体和产生斑点的相关底物来确定IFN-γ产生细胞，其可使用解剖显微镜计数。还可能使用PCR技术来确定编码相关细胞因子之mRNA的存在。经常利用例如PCR、ELISPOT或ELISA测量一种或更多种细胞因子。本领域技术人员应了解由特定多肽诱导的任何这些细胞因子量的显著提高或降低可用于评价所述多肽的免疫活性。

为了能够在个体中对组分形成免疫应答，可通过在所述个体中提供分枝杆菌SAP的所述组分形成所述免疫应答。这些组分可以以如下相关的副标题所讨论的多种形式提供。

可皮下递送或通过吸入递送重组BCG和其他活分枝杆菌。还可由技术人员使用其专业知识确定给药方案(例如单次施用、重复施用(以规律或不规律间隔两次或更多次)等)。这还将通常取决于待治疗的疾病以及正接受治疗的个体(例如，在有膀胱癌的人中，低剂量BCG方案已经描述为75mg，而标准剂量为150mg)。然而，已经记载了低至1mg的BCG剂量有效地支持免疫应答很长时间(5年)。在肺结核中，典型剂量的实例低得多：0.075mg，对应于30-120万活分枝杆菌)。大致地说，典型剂量可落至0.01μg/kg体重至10mg/kg体重。在肺结核的治疗中，一次治疗通常保护许多年。然而，也考虑给予重复剂量(如例如通常在治疗膀胱癌中的情况)。

当疫苗或免疫刺激组合物基于肽时，施加的方式可广泛地变化。任何施用疫苗的常规方法都是适用的。这包括以含有活性成分的固体形式(例如丸剂、栓剂或胶囊剂)或者以生理可接受的分散体(例如喷雾剂、散剂或液体)经口、经鼻或经粘膜施加，或者通过注射胃肠外(例如皮下、皮内或肌内)施加或者经皮施加。疫苗的剂量将取决于施用的途径且将根据待疫苗接种之人的年龄而变化，且较小的程度上，根据待疫苗接种之人身材大小而变化。目前，多数疫苗通过针注射肌内施用，且这可能继续作为标准途径。然而，已经开发了诱导粘膜免疫的疫苗制剂，其通常通过经口或经鼻递送。最广泛研究的用于粘膜免疫诱导的递送系统之一包含霍乱毒素(CT)或其B亚单位。但在疫苗制剂中施用时，该蛋白质增强粘膜免疫应答并诱导IgA产生。优点是经口或经鼻递送疫苗的简便。来自另一些微生物物种的经修饰的毒素(其已经降低了毒性但保留了免疫刺激能力，例如经修饰的来自革兰氏阴性细菌的不耐热毒素或葡萄球菌肠毒素)也可用来产生类似的作用。这些分子特别适合经粘膜施用。

常规地，疫苗通过注射胃肠外施用，例如皮下或肌内施用。适于施用的其他模式的另外的制剂包括栓剂，和在一些情况下的经口制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载剂可包括例如聚亚烷基乙二醇类(polyalkalene glycols)或甘油三酯类；这样的栓剂可由含有0.5％至10％，优选1-2％范围之活性成分的混合物形成。经口制剂包括通常使用的赋形剂，例如药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或散剂的形式，且有利地含有10％-95％(优选25％-70％)的活性成分。

当疫苗或免疫刺激组合物为病毒载体时，载剂可以是任何自身不诱导产生对接受所述组合物的患者有害之抗体的物质，且其可以以无过度毒性地施用。合适的载剂可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。这样的载剂是本领域技术人员公知的。可药用载剂可包括液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质(例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等)也可存在于这样的载剂中。稳定剂(例如海藻糖或允许在环境温度下水溶性糖玻璃形成的物质)也可存在。后者包括在悬浮于全氟化碳液体的小球体形式中使用混合可溶玻璃稳定技术。脂质体也是合适的载剂。药用载剂的彻底讨论见Gennaro(2000)，Remington：The Science and Practiceof Pharmacy.20th ed.，ISBN：0683306472。药物组合物优选为灭菌的。其优选无热原的。优选缓冲在例如pH 6至pH 8，通常大约pH 7。优选地，所述组合物与人等张。本发明的组合物可经通过多种不同途径施用。对于某些组合物，某些途径可能是有利的，因为产生更有效的应答，或更低的可能诱导副作用，或更容易地施用。例如，本发明中利用的组合物可通过许多途径施用，所述途径包括但不限于经口、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮或经皮肤施加、皮下、腹膜内、鼻内、经肠、表面、舌下、阴道内或直肠方式。所述组合物可制备成用于鼻内施用，如鼻喷雾剂、滴鼻剂、凝胶剂或粉末，如可注射的液体溶液或混悬液；也可制备在注射之前适于溶解于或混悬于液体载剂的固体形式。所述组合物的直接递送将一般通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内、鼻内注射完成，或者递送至组织的胞间隙。剂量处理可以是单次剂量方案或多次剂量方案。

C.确定对分枝杆菌感染的免疫

在另一个实施方案中提供了用于确定个体是否对分枝杆菌免疫的方法，所述方法包括：

-在处于病症中的个体中提供分枝杆菌SAP的组分以使得在所述个体中能够形成对所述组分的免疫应答；

-确定所述个体是否发生对所述组分的保护性免疫应答；

其中保护性免疫应答的发生确定所述个体对分枝杆菌免疫；

从而确定所述个体是否对分枝杆菌免疫。

所述方法特别地可用来确认Mantoux测试或其他常规分枝杆菌测试的结果，或者以其他方式用于进一步描绘Mantoux测试的结果，例如来鉴定特定免疫应答中的关键特异性或鉴定应答所基于之相关免疫原的性质。在之前副标题提到的用于检测免疫应答之形成的多种测定可在此执行。

D.疫苗和免疫刺激组合物

本发明提供了疫苗和免疫刺激组合物。在某些实施方案中，所述疫苗和免疫刺激组合物可用于提供对分枝杆菌感染(尤其是结核分枝杆菌感染)的保护性免疫应答。

通常，描述了如下的4种不同形式的疫苗或组合物：

(i)为非细胞的且作为用于免疫刺激之活性成分含有的那些，重组或合成的SAP组分。

(ii)作为用于免疫刺激的活性成分含有的那些，可对于SAP组分富集的细胞提取物。

(iii)作为用于免疫刺激的活性成分含有的那些，表达重组SAP组分的细胞。

(iv)含有编码施用至个体之SAP组分的核酸的那些，所述核酸表达以形成用于免疫刺激的活性成分。

(v)含有编码形成用于免疫接种的活性成分之SAP组分的病毒载体的那些。

在这些形式的每种中优选的免疫原为CysD基因或基因产物，或者其同系物的片段。

这些形式在下面更详细地描述。

D.1含有重组或合成SAP组分的非细胞组合物

在一个实施方案中，通过在个体中提供非细胞组合物形式的SAP组分形成免疫应答，所述组合物包含分离或重组的SAP蛋白。

一般来说，这些组合物包含两个关键的组分，第一个为重组或合成SAP组分形式的免疫原，且第二个为用于增强对免疫原免疫应答的佐剂。

对于免疫原，其可包含本文中所述的任何一种或更多种SAP组分。优选地，所述免疫原包含CysD或者免疫原性或抗原性片段或其同系物。片段和同系物在下面更详细地描述。

应理解，所述免疫原还可包含其他重组或合成的分枝杆菌抗原或免疫原。这些可以以通过共价键与CysD融合的形式提供，其中他们与CysD非共价结合，或其中他们完全不与CysD结合。这些抗原和免疫原的特别实例包括Ag85B。另一些在WO2009/070700中讨论。

在一个实施方案中，给定的SAP组分(例如CysD、CysNC、CysH、SirA、CysE、CysK1蛋白及其编码基因)可具有在硫酸盐同化途径活性方面保守的功能，但具有趋异序列(diverged sequence)。将这些蛋白或核酸称为同系物。

在某些实施方案中，给定的SAP组分为与给定的SAP组分具有至少75％、优选80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％、更优选98％或99％同一性的组分。例如，CysD免疫原可以是与SEQ ID No：2中所示CysD蛋白具有至少75％、优选80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％，更优选98％或99％同一性的免疫原。编码CysD免疫原的核酸序列可以是与SEQID No：1中所示CysD基因具有至少75％、优选80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％，更优选98％或99％同一性的序列。

通过常规方法，通过本领域已知的计算机程序的手段确定序列同一性百分比，例如在Needleman，S.B.和Wunsch，CD.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453中公开的GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin package，Version 8，1994年8月，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)中提供的GAP，其通过引用以其整体并入此处。对于多肽序列比较在以下设定下使用GAP：3.0的空位生成罚分(GAP creation penalty)和0.1的空位延伸罚分(GAP extension penalty)。通过类似的方法使用对于DNA序列比较之以下设定的GAP确定多核苷酸分子的序列一致性：5.0的空位生成罚分和0.3的空位延伸罚分。

在另一个实施方案中，给定的SAP组分以能够形成保护性免疫应答之片段的形式提供。这些片段通常有足够的长度和能够由I类或II类APC呈递的构象(conformation)。它们通常可以是以下长度范围：对于I类呈递约8至15和约8至11，且对于II类呈递11至15。

为了鉴定在免疫应答期间被识别的相关T细胞表位，常用方法是使用用于检测II类MHC表位的重叠肽，其优选为合成的，具有例如来自多肽之20个氨基酸残基的长度。这些肽可在生物测定中测试(例如本文中所述的IFN-γ测定)且给出阳性应答的那些将被分类为免疫原性T细胞表位。可通过预测将与I类结合的那些肽来鉴定I类MHC表位(Stryhn，A.，等1996Eur.J.Immunol.26：1911-1918)，且此后合成地产生这些肽并在相关生物测定(例如本文中所述的IFN-γ测定)中测试它们。

所述肽优选地具有例如来自所述多肽之8至11个氨基酸残基的长度。可通过例如Harboe，M.，等1998Infect.Immun.66：2；717-723中所述的分析B细胞对覆盖目的多肽之重叠肽的识别来确定B细胞表位。

可通过固相合成或重组DNA技术来制造任何CysD、CysNC、CysH、SirA、CysE、CysK1或相关核酸的序列。

对于佐剂，有许多本领域已知的佐剂的实例。还参见Allison(1998，Dev.Biol.Stand.，92：3-11；通过引用并入本文)，Unkeless等(1998，Annu.Rev.Immunol.，6：251-281)和Phillips等(1992，Vaccine，10：151-158)。根据本发明可利用的示例性佐剂包括但不限于细胞因子、铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝等；Baylor等，Vaccine，20：S18，2002)、凝胶型佐剂(例如磷酸钙等)；微生物佐剂(包含CpG基序的免疫调节DNA序列；内毒素，例如单磷脂酰脂质A(Ribi等，1986，Immunology and Immunopharmacology ofbacterial endotoxins，Plenum Publ.Corp.，NY，p407，1986)；内毒素，例如霍乱毒素、大肠杆菌(E.coli)不耐热毒素和百日咳毒素；胞壁酰二肽等)；基于油乳胶和乳化剂的佐剂(例如弗氏佐剂、MF59[Novartis]、SAF等)；颗粒佐剂(例如脂质体、生物可降解的小球体等)；合成佐剂(例如非离子型嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物、聚膦腈、合成的多核苷酸等)；和/或其组合。另一些示例性的佐剂包括一些聚合物(例如聚膦腈类；在美国专利5,500,161中描述)、Q57、皂苷类(例如QS21，Ghochikyan等，Vaccine，24：2275，2006)、角鲨烯、四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)、CPG7909(Cooper等，Vaccine，22：3136，2004)、聚[二(羧基苯氧基)磷腈](PCCP；Payne等，Vaccine，16：92，1998)、干扰素-γ(Cao等，Vaccine，10：238，1992)、嵌段共聚物P1205(CRL1005；Katz等，Vaccine，.18：2177，2000)、白细胞介素-2(IL-2；Mbwuike等，Vaccine，8：347，1990)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA；Kreuter等，J.Pharm.ScL，70：367，1981)、二甲基十八烷基溴化铵(DDA)、(Vann Dissel，Vaccine，29：2100，2011)等。

这些化合物还可包含使得能够施用所述组合物的稀释剂、赋形剂和载剂，如本领域已知的。

D.2细胞提取物

在另一个实施方案中，通过在个体中以细胞提取物的形式提供SAP组分来形成免疫应答，所述细胞提取物包含分离或重组的SAP蛋白。

可通过已知技术获得细胞提取物，包括例如分枝杆菌菌株的超声、通过离心的沉淀和收回裂解物用于免疫接种。所述裂解物还可通过例如免疫亲和层析对SAP组分进一步富集。这最可用于当菌株不为SAP组分重组体时，即当所述菌株不为SAP组分的过表达子或SAP组分富集时。当所述菌株为具有高水平表达的SAP组分的重组菌株时，则层析富集步骤可不是必须的。

所述细胞提取物可特别地用作用于测试免疫接种方案之效力的体外试剂。

D.3重组或转化的细胞

在本发明的一个实施方案中，通过在个体中以细胞的形式提供SAP组分来形成免疫应答，所述细胞包含分离或重组的SAP蛋白。

特别优选细胞为分枝杆菌，且特别为结核分枝杆菌菌株，尤其是能够形成活减毒疫苗的减毒结核分枝杆菌菌株。本文中使用的“活减毒疫苗”为含有活的或有活力的具有降低的致病性(减毒)之微生物的疫苗；与失活疫苗相反。

另一些类型的分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合物的成员(在UniProt或NCBI分类学数据库中的分类标识符77643)、其包括物种结核分枝杆菌(人结核病的主要原因)、牛分枝杆菌、年分枝杆菌BCG(最经常用于疫苗接种目的的菌株)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、卡内蒂分枝杆菌(M.canetti)和海豹分枝杆菌(M.pinnipedii)。

优选地，所述细胞为BCG菌株。本领域技术人员将认识到存在数种合适的BCG菌株，其适合用在本发明的实践中，包括但不限于以下指定号的那些：

27289牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG，Chicago 1[B；BCGT；tice]

27291牛分枝杆菌

35731牛分枝杆菌TMC 1002[BCG Birkhaug]

35732牛分枝杆菌TMC 1009[BCG Swedish]

35735牛分枝杆菌TMC 1012[BCG Montreal；CIP 105920]

35736牛分枝杆菌TMC 1013[BCG Brazilian]

35737牛分枝杆菌TMC 1019[BCG Japanese]

35738牛分枝杆菌TMC 1020[BCG Mexican]

35739牛分枝杆菌TMC 1021[BCG Australian]

35741牛分枝杆菌[BCG Glaxo]

35742牛分枝杆菌TMC 1025[BCG Prague]

35744TMC 1029[BCG Phipps]

35745牛分枝杆菌TMC 1030[BCG Connaught]

35746牛分枝杆菌TMC 1101[BCG Montreal，SM-R]

35747牛分枝杆菌TMC 1103[BCG Montreal，INH-R；CIP 105919]

35748牛分枝杆菌TMC 1108[BCG Pasteur SM-R]

27290牛分枝杆菌[BCG Copenhagen H]

19274牛分枝杆菌，其以zrculosis亚种牛50[BCG]保藏

19015分枝杆菌属d＜i的牛分枝杆菌Karlson和Lessel BCG

35733牛分枝杆菌TMC 1010[BCG Danish，SSI 1331]和

35734牛分枝杆菌TMC 1011[BCG Pasteur]等。

应理解本发明的重组分枝杆菌不一定限于BCG菌株。本领域技术人员将认识到也可使用其他分枝杆菌菌株，其实例包括但不限于：结核分枝杆菌CDC1551菌株(参见，例如Griffith等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.8月；152(2)：808；1995)、结核分枝杆菌北京菌株(van Soolingen等，J CHn Microbiol.12月：33(12)：3234-8，1995)、H37Rv菌株(ATCC#：25618)、结核分枝杆菌泛酸盐营养缺陷型菌株(Sambandamurthy等，见上文)；结核分枝杆菌rpo v突变体菌株(Collins等，Proc Natl Acad Sci USA.92(17)：8036；1995)、结核分枝杆菌亮氨酸营养缺陷型菌株(Hondalus等，Infect.Immun.68(5)：2888；2000)等，或者其他来自结核分枝杆菌的减毒和/或重组菌株。其他候选细菌包括结核分枝杆菌复合物的其他成员、其他分枝杆菌(例如非洲分枝杆菌或鸟分枝杆菌(M.avium)复合细菌)、或者其他分枝杆菌物种。

在本发明的这种形式中，SAP组分可过表达，即蛋白质可以以超过合适对照生物体(例如同样的没有进行遗传改造的分枝杆菌)之水平的水平表达以过表达所述SAP组分。本领域技术人员非常熟悉蛋白质活性的比较测量，以及对这种测量使用的合适标准物和对照。

可通过本领域已知的任何合适方法进行SAP组分的过表达。通常，所述方法将包括将编码SAP组分的核酸序列与特定启动子或其他调控元件相连，当将菌株引入细胞(尤其是APC)时所述调控元件被激活。本领域技术人员将认识到许多这样的表达控制序列是已知的，且将适合用于本发明。例如，如果希望SAP组分的组成型表达，则表达控制序列(例如启动子和相关序列)包括但不限于：分枝杆菌最佳启动子(mop，George等，1995)；blaF启动子(Timm等，1994)；hsp60、ace或mspl2启动子；等，具有或没有优化的核糖体结合位点。

作为替代地，SAP的过表达可以不是组成型的，但可替代地是可响应于环境信号而诱导的。例如，所述蛋白质的表达可通过在特定位置诱导的或响应于环境刺激的启动子来驱动，其实例包括但不限于：巨噬细胞诱导的启动子(其驱动在巨噬细胞吞噬体内特异性上调之基因的表达，参见Schannapinger等JEM 2003)；乙酰胺酶启动子(Mahenthiralingam等，J.Gen.Microbiol.1993)和四环素可诱导的(Blokpoel等，Nucl.Acids Res.33(2)：e22，2005)等。

此外，可利用来自其他物种的启动子，其实例包括但不限于：多种病毒启动子，由此在“基因治疗样”策略(例如分枝杆菌和经改造病毒的共接种)后，Mtb抗原在由共施用病毒感染的经选择的组织中表达；等。

作为另一个替代方案，天然或自然存在的SAP启动子可通过突变改变以引起SAP组分的过表达。

本领域技术人员将认识到许多途径可用来将与一个或更多个表达控制序列可操作地相连接的编码SAP组分的核酸序列引入其中将发生过表达的分枝杆菌宿主中。例如，可将序列包含在载体中，接下来将所述载体引入分枝杆菌。许多适用于包含并表达基因的载体是已知的，且包括但不限于多种染色体外元件，例如质粒，例如包含pAL500复制初始点的那些，进行修饰以提高其拷贝数量；或其他具有会或将会开发之复制起始点的质粒；或者不复制或不整合入分枝杆菌基因组但为发生同源重组提供自杀源(suicidal source)的染色体外元件；等。将这样的载体引入分枝杆菌可通过任何许多适用于所述特定载体的已知方法进行，包括但不限于电穿孔和用于同源重组的分枝杆菌噬菌体介导的转导。在一个优选的实施方案中，载体为质粒且所使用的方法为电穿孔。

在本发明的另一些实施方案中，SAP组分从结核分枝杆菌染色体过表达。本领域技术人员将认识到存在多种分子生物学策略来产生具有此性质的分枝杆菌。例如，可将多种突变引入染色体(随机或以定向的方式)从而导致细菌大量产生SAP组分。作为替代地，可将包含一个或更多个与编码所述SAP组分的核酸序列可操作地相连接之表达控制序列的核酸序列引入细菌染色体，例如通过用有或无反向选择手段之自杀质粒转导以提供用于同源重组的序列。

在本发明一个特别优选的实施方案中，提供了表达载体，所述载体包含：

-编码分枝杆菌抗原以提供对于分枝杆菌感染之抗原特异性免疫应答的核酸；

-当将菌株引入APC后与所述核酸可操作地连接来表达所述核酸的启动子，所述启动子具有当将所述启动子引入APC后引起立即和持续分枝杆菌抗原表达之分枝杆菌启动子的序列。

在上述实施方案中，分枝杆菌HspX启动子是用作具有引起分枝杆菌ATP非依赖性分子伴侣的表达之分枝杆菌启动子序列的启动子的优选启动子。特别地，如本文实施例2所示例，该启动子能够在BCG菌株中诱导高且持续的SAP组分表达。可用于本发明的启动子的另一些实例包括如Fontan等2008Infect.&Immun.76：pp 717中描述的Rv0962c、Rv0971c、Rv0983、Rv0986、Rv2428、Rv1130、Rv2626c。

在此副标题下的疫苗制剂涉及研究以确定最大细菌生存力和在整个制造过程中的稳定性。这包括在利用多种通常使用的培养基培养分枝杆菌的培养期间确定最大生物体生存力(活的至死的)，所述培养包括添加甘油、糖类、氨基酸和去污剂或盐。在通过离心或切向流过滤收获培养物细胞之后，将所述细胞重悬在允许在冷冻或冷冻干燥过程期间保护细胞的稳定化介质中。通常使用的稳定剂包括谷氨酸钠、氨基酸或氨基酸衍生物、甘油、糖类或通常使用的盐。最终的制剂将提供具有足以维持稳定性的足够有活力的将通过皮内、经皮注射、灌注或经口递送的生物体以及用于分发和使用足够的保质期(shelf life)。

在作为疫苗向人施用之前，根据本领域技术人员公知的方法测试在本副标题下的BCG菌株。例如，在合适的动物模型中(例如小鼠、豚鼠等中，其中一些是免疫受损的)进行毒性、致病性、安全性等的测试。同样通常在合适的动物模型(例如小鼠、豚鼠等)中测试疫苗制剂引起免疫应答的能力。此外，可使用合适的动物模型(例如小鼠、豚鼠和非人灵长类)进行涉及疫苗接种、加强和接着用活Mtb攻击的保护研究。最后，本领域技术人员熟悉为了测试所述疫苗制剂的效力而在同意的人中进行临床试验的安排。细节参见例如2006年6月8日公开的美国专利申请20060121054(Sun等)，以及本文中引用的参考文献。

D.4核酸疫苗

在另一个实施方案中，通过在个体中以编码SAP蛋白的核酸的形式提供SAP组分来形成免疫应答。

特别地，如实施例1所示例，本发明人已经示出可通过在用结核分枝杆菌攻击的小鼠中施用含有编码CysD之基因的DNA疫苗提供保护性免疫。

可以以线性或环状形式提供核酸用于注射。一般来说，所述核酸将具有能够使得SAP组分在相关细胞中表达的启动子。例如，当向肌肉组织施用时，载体将含有能够由肌肉转录因子和增强子活化的启动子。在这些实施方案中，一般理解肌肉细胞将产生相应的SAP组分，其然后将被APC(例如树突细胞)吞噬来呈递至T细胞，在其上建立免疫。

D.5病毒载体

在另一个实施方案中，通过以病毒载体的形式提供SAP的组分来形成免疫应答，所述病毒载体含有编码所述组分或表达所述SAP的组分的核酸。

合适载体的实例包括基于牛痘基因组的那些和基于腺病毒基因组的那些。

在以上副标题下描述的一些组合物可配制为液体溶液或混悬液，然而也考虑固体形式，例如片剂、丸剂、散剂等。在施用前也可制备适用于溶解于液体或悬浮于液体的固体形式。还可乳化制剂。活性成分可与可药用的并与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，或其组合。此外，所述组合物可含有少量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等。如果期望施用所述组合物的经口形式，则可添加多种增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂等。本发明的组合物可含有任何这些另外的成分以提供适于施用之形式的所述组合物。

应理解，在本说明书中所公开的和所定义的本发明延伸至两个或更多个提到的或者从文字或图明显的单个特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成本发明的多个替代方面。

实施例

实施例1

结核分枝杆菌可在广谱环境中存活，包括高水平的氧化应激、低pH和营养剥夺((Nathan，2000#29)。在感染期间结核分枝杆菌对这些条件的暴露和适应需要基因表达的协同调节((Timm，2003#93)。涉及硫代谢的基因已经一致地鉴定为在模拟巨噬细胞环境的条件中((Pinto，2004#14；，#35；Muttucumaru，2004#34；Manganelli，2002#75；Hampshire，2004#33；Betts，2002#49)和巨噬细胞感染期间((Schnappinger，2003#31)上调。这些基因编码结核分枝杆菌之硫酸盐同化途径(SAP)的酶，所述酶是硫的还原所需的。实际上，含有硫的化合物是广泛生物活性的基础。在其还原的形式中，硫用在氨基酸半胱氨酸的生物合成，半胱氨酸是在细胞内环境中由结核分枝杆菌遇到(encounter)的反应性氮中间体的主要靶标之一((Rhee，2005#92)。半胱氨酸接下来可整合入分支硫醇，其与谷胱甘肽起类似的作用((Fan，2009#197)且在遇到由宿主细胞释放的自由基时对肉芽肿内结核分枝杆菌调节氧化还原平衡是至关重要的。其中已经去掉了分支硫醇生物合成的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的突变体展示出对异烟肼的高水平抗性且相比野生型菌株对氧化应激和抗生素更易感((Rawat，2002#82；Buchmeier，2003#85)。因此，该结核分枝杆菌的第一道防线与半胱氨酸的利用率相联系，且因此已经示出为生物体存活所需的((Sareen，2003#84；Buchmeier，2006#83；Newton，2002#81)。增强这样对于在巨噬细胞环境中半胱氨酸提高的需要是ATP硫酸化酶的上调，ATP硫酸化酶是当暴露于氧化应激时在SAP中的第一个酶((Pinto，2004#14；，#35；Schnappinger，2003#31)。半胱氨酸生物合成能力的失去减弱了小鼠中感染的慢性阶段期间细菌的致病性和持久性((Senaratne，2006#3)。

虽然SAP的成员似乎在推定于宿主内遇到的条件下高度表达，但是如果这些蛋白质构成结核分枝杆菌的免疫原性组分，则所述表达是不知道的。多数焦点已经在分枝杆菌的分泌性蛋白质上了，因为预测这些将被早期宿主免疫应答所识别((Andersen，1992#202；Roberts，1995#203)。硫还原发生在细胞内且由于这个原因SAP酶为胞内或膜结合组分((deSouza，2011#206；Bhave，2007#205；Schelle，2006#204)且将在筛选结核分枝杆菌的免疫原性分泌抗原中不被检测((Andersen，1992#202)。在本报道中，我们证明了SAP的成员是结核分枝杆菌的高度免疫原性组分，通过结核分枝杆菌感染的个体识别且赋予TB的鼠类模型保护性免疫。我们的结果表明SAP成员是包含入新TB疫苗的潜在候选。

材料和方法

细菌菌株和生长条件

大肠杆菌(Escherichia coli)K-12和BL21(DE3)培养于Luria-Bertani(LB)培养液或琼脂(Sigma-Aldrich)中。结核分枝杆菌H37Rv或菌株MT103((Jackson，1999#208)培养于补充有0.5％甘油、0.05％Tween 80和10％白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(albumin-dextrose-catalase，ADC)的Middlebrook 7H9培养基(Difco实验室)或补充有油酸-ADC的Middlebrook 7H11培养基(Difco实验室)中。在37℃下，所有培养物在有或没有振荡下培养。当需要时，以25μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素向培养基添加抗生素。使用((Bryk，2008#36)的方法通过每日添加50μM的一氧化氮供体化合物2，2’-(羟基亚硝基亚肼基)双-乙亚胺(2，2′-(Hydroxynitrosohydrazono)bis-ethanimine)(DETA-NO)(Sigma)达到体外生长结核分枝杆菌的非复制持久性。在第0、1、3和7天确定这些培养物的细菌计数，且在第7天，从两种培养基中提取RNA进行实时(RT)PCR分析。

蛋白质抗原和DNA疫苗

从NIH生物防御和新兴传染病研究资源库(Biodefense and EmergingInfections Research Resources Repository)获得培养物滤液蛋白质(CultureFiltrate protein，CFP)(NR-14825)。从Sigma-Aldrich购买Concavalin A(ConA)。在附表1中描述了SAP蛋白抗原的纯化和编码SAP基因之DNA载体的构建。

巨噬细胞感染和实时PCR

RAW264.7小鼠巨噬细胞系于37℃下在5％CO₂中于补充有10％胎牛血清(FCS；Gibco-BRL)和2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)的RPMI(Gibco-BRL)(完全RPMI)中培养。用结核分枝杆菌以1∶1的感染复数感染贴壁RAW264.7细胞。感染后4小时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤巨噬细胞单层，将细胞在新鲜培养基中另外孵育48小时且提取总RNA用于RT PCR分析。

将来自培养液培养物或结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的结核分枝杆菌沉淀重悬在TRI试剂(Invitrogen)中，并用BioSpec Products Bead Beater中的0.1-mm氧化锆/二氧化硅珠中断。提取RNA，用TURBO DNA酶(Ambion)处理并将其如先前描述的重悬于DPEC处理的水(Invitrogen)((Muttucumaru，2004#34)中。通过使用Superscript III反转录酶(Invitrogen)由1μg的总RNA合成cDNA。使用4μL的cDNA、SYBR green I PCR Master Mix(Qiagen)和5μM的基因特异性引物对(附表1)在25μL的反应体积中进行定量RT-PCR。PCR反应在Rotogene6000系列序列检测器(Corbett research)上以每引物对一式三份地运行。使用Livak和Schmittgen((Livak，2001#99)的比较阈值循环方法(comparative thresholdcycle method)，并使用非诱导的结核分枝杆菌16S rRNA(由rrs编码)作为对照((Banaiee，2006#101)确定相对表达水平。

人研究

对象：从Royal Prince Alfred Hospital，Missenden Rd，NSW，Australia的TB门诊部招募15个结核分枝杆菌感染的HIV阴性患者。从活组织检查或培养证实的不同年龄和性别已经开始或还未开始抗TN治疗的患者获得外周血单个核细胞(peripheral bloodmonocuclear cell，PBMC)。悉尼西南地区健康服务部门(Sydney South West AreaHealth.Service)给予了本研究的伦理许可(协议号：X06-0248)。患者与11个健康结核菌素皮肤测试阴性(TST-ve)个体比较。

T细胞增殖测定：来自全血的PBMC在Ficoll梯度(Histopaque-1077，SigmaAldrich)上分离。在37℃下5％CO₂中在有10μg/mL的SAP蛋白、10μg/mL的CFP、Ag-85B或3μg/mL的ConA存在下孵育每孔2.5×10⁵个细胞的PBMC 5天。通过³H胸苷并入(MP Biomedicals，1μCi/孔)在第5天使用液体闪烁光谱(Microbeta Luminescence Counter，Wallace)测定T细胞增殖。使用以下的方程计算淋巴细胞刺激指数(stimulation index，SI)：抗原存在下的平均每分钟计数(counts per minute，cpm)/抗原不存在下的平均cpm。认为大于或等于3的SI为对抗原的阳性应答。

鼠类研究

从动物资源中心(Perth，Australia)获得6至8周大的雌性C57BL/6小鼠并将其维持在无特定病原体条件下。为确定免疫原性，通过鼻内(i.n)途径用5×10⁴菌落形成单位(CFU)的结核分枝杆菌Mt103感染小鼠(4只/组)。在感染后3和8周，从完全RPMI培养基中经免疫小鼠的纵膈淋巴结(mediastinal lymph node，MLN)制备单细胞悬液，且通过先前描述的ELISpot((Palendira，2002#210)使用SAP酶、CFP和浓度为10μg/ml的Ag85B以及以3μg/ml使用的ConA确定干扰素(IFN)-γ产生细胞的数量。为了分析保护性效力，用5×10⁵CFU的牛分枝杆菌BCG皮下(s.c)免疫小鼠(5/组)一次，或以2周间隔用10μg与二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)(1.25mg/ml)和单磷脂酰脂质A(MPL)(125μg/ml)共施用的CysDNC蛋白皮下免疫三次，或用每次注射100μg的DNA疫苗肌内(i.m)免疫。在最后的疫苗接种后8周，使用吸入暴露装置(Glas-Col)以每肺□100个有活力的杆菌之感染剂量的气溶胶结核分枝杆菌Mt103攻击小鼠。在攻击后4周通过平板接种(plate)肺和脾的匀浆确定细菌负荷。

统计分析

为评估保护性效力，通过单因素ANOVA以及使用Bonferroni事后检验完成的多组数据集的成对比较来评价差异的显著性。为评估由经感染小鼠之SAP酶诱导的宿主免疫应答或者为将结核分枝杆菌感染的个体与未感染的小鼠或TST-ve个体分别比较，使用Mann-Whitney U检验(＊P＜0.05)。

结果

在与有效抗原特异免疫相关之细胞内环境中结核分枝杆菌ATP硫酸化酶mRNA的诱导。

由CysDNC操纵子编码的结核分枝杆菌的硫酸盐活化复合物(SAC)是SAP的第一步(图15)并构成3种催化活性，ATP硫酸化酶、GTP酶和APS激酶活性(图1A)。结核分枝杆菌SAC上调其在模拟细胞内应激之培养条件下的表达((Pinto，2004#14)表明其表达也可在细胞内环境中诱导。为对其测试，我们检查了结核分枝杆菌感染期间在RAW264.7细胞内CysDNCmRNA水平的变化。我们发现CysDNC的表达被显著增强了，显示出在首个48小时期间于培养液培养的杆菌中发现的水平上4.4倍的提高(图1B)。为了模拟潜伏感染期间遇到的条件，我们还确定了CysDNC的表达是否在非复制细菌中被诱导。使用一氧化氮供体DETA-NO((Bryk，2008#156)，相比未处理的细菌我们能够抑制结核分枝杆菌体外复制(图1C)。在非复制持续性的条件下，结核分枝杆菌CysDNC被高度上调，且证明了相比活跃生长的分枝杆菌基因表达35倍的提高(图1D)。这意味着CysDNC可参与结核分枝杆菌适应在细胞内环境中遇到的多种应激并发展为潜伏状态的能力。

由于在细胞内环境和非复制细菌中CysDNC以高水平诱导，因此我们推测在结核分枝杆菌感染期间所述酶可由免疫应答识别。为对其测试，我们用结核分枝杆菌鼻内感染小鼠并在纵膈淋巴结(MLN)中检查IFN-γ分泌性细胞的频率。在感染后三周时，用CysDNC离体刺激MLN细胞导致IFN-γ分泌性细胞的强诱导，其类似于通过结核分枝杆菌之免疫显性分析Ag85B蛋白所诱导的水平(图2A)。感染后该强T细胞应答维持长达8周(图2B)。在肺中观察到响应于CysDNC和Ag85B之抗原特异性IFN-γ分泌性细胞应答的类似模式(数据未示出)。此外，人PBMC的淋巴细胞增殖测定揭示在人结核分枝杆菌感染期间识别了CysDNC(图2C)。CysDNC应答类似于当对Ag85B回忆后的应答但低于由CFP诱导的应答。然而，相比TST-ve个体，CysDNC显著诱导了来自TB患者之PBMC的增殖(图2C)。这些结果表明编码ATP硫酸化酶的结核分枝杆菌CysDNC是有效的结核分枝杆菌免疫刺激抗原。

在用编码ATP硫酸化酶的DNA疫苗接种后针对致病性结核分枝杆菌攻击的保护免疫。

在细胞内环境(图1B)、在我们的非复制持续性模型(图1C)中编码ATP硫酸化酶之基因的增强表达以及该蛋白复合物诱导离体稳健(robust)抗原特异性Th1型细胞因子应答的能力(图2)可使得编码的产物对于抗分枝杆菌保护变异性有效靶向。为对其确定，用表达cysD和/或cysNC的DNA载体免疫小鼠，并用结核分枝杆菌气溶胶攻击小鼠。用表达cysD或cysNC的所有载体免疫接种导致在肺(图3A)和脾(图3B)二者中相比用对照载体疫苗接种小鼠显著降低的细菌负荷(p＜0.01)。在所有实验中，在肺中DNA-cysD比DNA-cysNC提供更好之保护性效力的提高趋势，而使用DNA-cysD和DNA-cysNC的组合等于仅用DNA-cysD可见的保护。当用这两种质粒的组合免疫小鼠时，在脾中的保护性效力显著更大，且该保护接近用BCG达到的水平(图3B)。因此，ATP硫酸化酶是结核分枝杆菌的高度保护性组分。

结核分枝杆菌硫酸盐同化途径(SAP)的下游酶是结核分枝杆菌的免疫原组分。

用结核分枝杆菌ATP硫酸化酶(CysDNC)获得的满意效果引导我们怀疑SAP的其他成员是否为宿主免疫应答的靶标。我们发现测试的所有SAP蛋白都在细胞内环境中被显著上调，且CysK1mRNA显示出大约6.7倍的最高诱导(图4A)。SirA和CysH的诱导水平类似，而CysK1和CysE还显示出细胞内上调的类似水平。这与SirA和CysH位于结核分枝杆菌基因组的相同操纵子内((Cole，1998#225)而CysK1和CysE在基因组中临近((Cole，1998#225；Schnell，2007#87)的事实相一致。我们还确定了在结核分枝杆菌感染的小鼠中这些蛋白质被识别，因为在感染后8周所有蛋白质都诱导了IFN-γ分泌性T细胞(图4B)。如CysDNC(图2C)，在人PBMC的淋巴细胞增殖测定揭示了在人结核分枝杆菌感染期间所有研究的SAP酶都被识别(图4C)。

由于体内上调了所有SAP酶的表达且在小鼠和人中识别了蛋白质，因此我们评估它们是否可以改善由DNA-CysDNC提供的保护性效力。当用DNA-CysDNC与编码cysH、sirA、cysK1和cysE的DNA一起疫苗接种小鼠时，我们没有观察到在肺(图5A)或脾(图5B)二者中相比仅用DNA-CysDNC保护性效力的提高。因此，虽然在结核分枝杆菌感染的人和小鼠中通过免疫应答识别了所有SAP成员，但是在本文中使用的小鼠模型中仅用CysDNC可提供最大的保护性效力。

用ATP硫酸化酶加强BCG疫苗接种的小鼠改善由肺中BCG提供的针对结核分枝杆菌之攻击的保护。

考虑到由TB患者C ATP硫酸化酶的强识别以及其在小鼠中的保护性作用，我们确定了当结核分枝杆菌攻击时该蛋白质复合物是否可以是用来加强BCG保护性作用的合适候选物。在低剂量下，结核分枝杆菌的气溶胶递送之后，首次用于实验的小鼠(naive mice)示出了检测到在肺中大量的细菌生长以及向脾的传播(图6A和6B)。相反地，仅用BCG的免疫接种导致针对结核分枝杆菌攻击的显著保护，具有在肺和脾中结核分枝杆菌负荷大约1.5-log₁₀的降低(图6A，6B)。用CysDNC蛋白的加强导致相比仅用BCG的疫苗接种之0.5-log_1oM的进一步显著降低(图6A)。虽然在加强的脾中降低了细菌负荷(bacterial burden)，然而该差异没有达到显著性(图6B)。因此，CysDNC能够改善针对结核分枝杆菌感染之BCG的保护性作用，其在肺中最明显。

讨论

宿主免疫新靶标的鉴定将明显地帮助开发更有效TB疫苗的努力。在本报道中，我们鉴定了作为杆菌主要抗原性组分之结核分枝杆菌的硫酸盐活化复合物(SAC)。所述SAC是具有3种催化活性的酶复合物((Pinto，2004#14；Sun，2005#13)。预计该复合物在结核分枝杆菌对宿主细胞环境的适应中起作用，由于在巨噬细胞内CysDNC的上调(图1B)((Schnappinger，2003#31)，并响应于许多体外应激条件，包括营养饥饿(nutrientstarvation)和氧化应激((Hatzios，2011#167；Pinto，2004#14)。因此，可能TB患者(图2C)和结核分枝杆菌感染的小鼠(图2A&B)对CysDNC的强识别可归因于在宿主内CysDNC增强的表达。有趣地，CysDNC还在结核分枝杆菌的非复制生长模型中显示出显著的上调(图1D)。此结果表明CysDNC表达可能是在慢性感染期间结核分枝杆菌对潜伏状态适应所需的。这被在慢性结核分枝杆菌感染((Senaratne，2006#3)的发作中降低的硫化合物的作用支持，且响应于小鼠中结核分枝杆菌感染晚期由T细胞的CysDNC的持续识别(图2B)。这还表明结核分枝杆菌CysDNC可有助于在通过使用半胱氨酸的持续代谢途径的非复制持续性的状态中之生物体的存活。半胱氨酸整合入乙酰基CoA，其是生物体细胞壁中脂质的结构单元和乙醛酸旁路的底物，乙醛酸旁路是结核分枝杆菌在巨噬细胞和小鼠中持久所需的途径((McKinney，2000#211)。而且，CysDNC在低氧休眠期间被上调((Voskuil，2004#35)且在由巨噬细胞造成的凋亡抑制中起作用((Danelishvili，2010#116)，表明CysDNC在宿主免疫应答逃避中的作用。有趣地，发现在暴露于杀非复制细菌的抗TB药物后，cysD将被上调((Fu，2009#1 17；Heifets，2005#120；Tasheen，2008#121)。

由宿主细胞应答的分枝杆菌抗原增强识别不总是将针对攻击的保护与动物模型中的致病性结核分枝杆菌相关联((Gartner，2007#215；Kamath，1999#143；Skinner，2003#115)。因此，我们评估了CysDNC是否在我们的气溶胶结核分枝杆菌感染的低剂量鼠类模型中是保护性的。当作为DNA疫苗递送时，CysD和CysNC在肺和脾二者中作为单独组分是保护性的，且所述两个构建体的组合达到了与由BCG诱导的类似的保护水平(图3)。因此，编码CysDNC基因的强表达与在本文所用的模型中抗原性复合物的保护性作用相关。然而，虽然存在蛋白质通过来自TB患者的PBMC识别，在巨噬细胞内被上调且诱导来自结核分枝杆菌感染小鼠之T细胞的强IFN-□应答的事实，但是添加编码SAP其他组分的DNA疫苗没有改善CysDNC的保护性效果(图4)。不清楚为什么CysDNC在保护性效力方面是SAP的显性成员，但是可涉及基于该研究中使用的小鼠菌株的MHC限制性应答。还有兴趣注意到由于SAP抗原在硫代谢中的功能，提出所述SAP抗原为细胞内或膜联蛋白((de Souza，2011#206)，且我们已经通过蛋白质印迹对于所述成员中的一些确认了这点(未示出)。然而，临床试验中的所有结核分枝杆菌抗原为分泌性蛋白质，因为预计这些为宿主免疫的早期靶标((Kaufmann，2011#196)。该研究表明非分泌性蛋白质也可以是新TB疫苗构成的合适组分。此外，应激诱导的潜伏期相关的在结核分枝杆菌感染后晚期改善保护之抗原的最近鉴定((Aagaard，2011#213)保证了在类似模型中CysDNC的进一步测试，考虑到在非复制细菌中并响应于体外应激之所述蛋白质复合物的明显诱导。

潜在亚单位疫苗的重要性质是用现有的BCG免疫接种“加强”保护的能力，因为这是在新TB疫苗计划中提出的这些疫苗的作用((Kaufmann，2011#196)。少数蛋白质在实验性结核分枝杆菌感染中已经证明了加强BCG诱导之保护的能力((Lu，2011#144；Dey，2011#145；Rouanet，2009#214)。现可将CysDNC添加到这个列表上，因为所述抗原复合物能够在肺中显著地提高仅用BCG的保护性作用，肺为所用模型中感染的主要部位(图6)。

除了定义所述SAP蛋白的抗原性作用之外，该研究还已经扩展了我们SAP基因表达在感染期间调节的知识。所测试的SAP的所有组分显示出在本文中使用的巨噬细胞细胞系内上调。这种对吞噬体环境的适应是细菌及时向细胞供应半胱氨酸能力的指示，其已经由Hatzios和Bertozzi广泛地综述((Hatzios，2011#167)。有可能SAP中的酶调节彼此的表达。例如已经显示丝氨酸乙酰转移酶与途径中上一个酶O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(OASS)缔合并形成复合物((Droux，1998#218)。虽然此相互作用负调节OASS((Mino，2000#222；Schnell，2007#87)，类似于ATP-硫酸化酶，其表达和活性可取决于半胱氨酸的需求((Kredich，1966#219；Mino，1999#220；Mino，2000#221；Pinto，2004#14)。而且，大肠杆菌ATP硫酸化酶与OASS形成紧密的复合物((Wei，2002#96)且其是可活化硫酸盐产生APS的复合物(图15)。已经建议考虑到大肠杆菌与结核分枝杆菌ATP硫酸化酶的相似性，分枝杆菌系统也与SAP中的其他酶催化功能连接形成更高阶的复合物((Sun，2005#13)。虽然还没有正式测试，然而这可能是为什么SAP的所有酶诱导稳健的宿主免疫应答的原因(图2、图4B&C)。还强调当暴露于多种抗生素时硫代谢基因的调节为其增强的转录，其可影响结核分枝杆菌如何响应于这些药物((Hatzios，2011#167)。假设药物响应基因编码与药物作用模式相关的蛋白质，且许多硫代谢酶为有希望的药物靶标((Bhave，2007#1)。

总的来说，我们已经鉴定了作为宿主细胞诱导之蛋白质的SAP组分，其为结核分枝杆菌的主要抗原性组分。

实施例2

在致病性分枝杆菌的宿主和减毒BCG疫苗株内优选的小生境(niche)为巨噬细胞的细胞内环境。已经观察到分枝杆菌还具有在DC内感染和持久以及刺激体内T细胞应答的能力[8，9]。

我们推测在DC内通过重组(r)BCG的抗原靶标表达可影响接下来抗原特异免疫的产生。我们认为结核分枝杆菌hspX基因的启动子控制表达可以是在用BCG疫苗接种后引导抗原至APC表达的合适候选物。

HspX或α-晶体蛋白是小分子量热休克蛋白的成员，其充当ATP非依赖性分子伴侣[10，11]。当结核分枝杆菌进入经培养的巨噬细胞时，迅速诱导hspX启动子[12]。所述基因还通过低氧体外上调[12]，在通气的结核分枝杆菌培养物生长的静止期期间[11]并通过NO供体的添加[13]，其可全部呈现宿主细胞内结核分枝杆菌遇到的条件。重要地，在用致病性结核分枝杆菌感染小鼠后hspX基因被上调[14]。

在本报道中，我们证明了hspX启动子可用来调节由rBCG表达之抗原的表达，且在DC内当rBCG进入时迅速诱导抗原表达。使用hspX启动子来控制抗原表达导致抗原特异性T细胞的加速起始以及在疫苗接种后抗原反应性T细胞的持续体内产生。

材料和方法

细菌菌株，培养基和抗原

结核分枝杆菌H37Rv(ATC27294)和牛分枝杆菌BCG(Pasteur菌株)在补充有0.5％甘油、0.05％Tween-80和10％ADC的Middlebrook7H9培养基(Difco，BD)或补充有OADC的Middlebrook 7H11培养基(Difco，BD)上培养。当需要时，以20μg/ml的浓度添加抗生素卡那霉素(Km)。

小鼠

从动物资源中心(Perth，WA，Australia)获得6至8周大的C57BL/6小鼠并将其维持在无特定病原体条件下。从K.Takatsu教授(University of Tokyo，Japan)和J.Ernst教授(New York University School of Medicine，NY)[15]获得p25CD4⁺TCR转基因(特别对于Ag85B的残基240-254)且回交至B6.SJL/Ptprca以获得p25⁺CD45.1⁺系。在悉尼大学动物保健和伦理委员会(University of Sydney Animal Care and Ethics Committee)的许可下进行动物实验。

重组(r)BCG菌株的构建

通过将质粒pMV306：GFP转化至BCG构建在结核分枝杆菌hspX启动子控制下的表达GFP的BCG(BCG：P_hspX-GFP)，其由Cliff Barry教授(Tuberculosis Research Section，NIAID，National Institutes of Health，Rockville，MD)惠赠。为开发其中hspX启动子驱动Ag85B蛋白表达的BCG，从结核分枝杆菌基因组DNA扩增编码Ag85B蛋白的fbpB基因并用来替换pMV306：GFP中的gfp基因，产生中间体载体pJEX88。通过用XbaI和HpaI消化切除P_hspX-fbpB片段并将其连接至用相同酶消化的穿梭载体pMV261[16]。将产生的质粒转化入BCG以产生BCG：P_hspX-85B。在该研究中使用的对照BCG为BCG Pasteur菌株或用pMV261[16]转化的BCG Pasteur。先前已经描述了在hsp60启动子控制下过表达结核分枝杆菌Ag85B蛋白之rBCG(BCG：P_hsp60-85B)的构建[17]。

树突细胞感染

如先前所述从小鼠的骨髓制备DC[18]。对于DC感染，4天大的DC培养物与以5∶1或1∶1感染复数的rBCG菌株孵育。4小时后，通过彻底洗涤除去细胞外细菌，且在感染后6小时和24小时，裂解DC并收集细菌进行流式细胞术(LSR-II，Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)。通过用起始值(第0天)除在6和24小时下的细菌群荧光确定荧光提高的倍数。为通过共聚焦显微术可视化，使用类似的感染条件，除了在rBCG感染之前允许DC粘附在约25mm的盖玻片上(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)，然后在LP5共聚焦显微镜(Leica)下观察。

体外免疫原性测定

用Rbcg菌株以5∶1的MOI感染四天的DC培养物(1×10⁵个细胞)通过autoMACs分选仪(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)从p25⁺CD45.1⁺小鼠纯化CD4T细胞，且与感染的DC培养5×10⁵个经纯化的T细胞。在共孵育后3天后，如先前所述通过ELISA测定上清液的IFN-γ[19]，且通过[3H]-胸苷摄取测量T细胞增殖。

体内免疫应答

为检测体内GFP表达，用1×10⁷CFU的荧光rBCG菌株在足垫中皮下接种C57BL/6小鼠。在感染后或感染后第1、3或7天立即获得局部炎性部位的组织。用胶原酶和DNA酶消化组织至少1小时，然后拉紧以覆盖细胞。用CD45-APCCy7、CD11b-APC和CD11c-PE-Cy7(BDPharmingen)对细胞进行染色。使用LSR-II流式细胞仪(BD)分析经染色的细胞。

在rBCG递送后为确定T细胞起始，制备来自p25⁺CD45.1⁺小鼠的淋巴结细胞并用羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE；MolecularProbes，Invitrogen，USA)标记。C57BL/6小鼠静脉注射(i.v.)接受5×10⁵个CFSE标记的p25淋巴结细胞且第二天用5×10⁵CFU的rBCG菌株皮下免疫小鼠。在疫苗接种后3或7天，处理器官并分析分裂细胞的CFSE谱。

为确定rBCG免疫原性，用5×10⁵CFU的rBCG菌株皮下疫苗接种小鼠。在疫苗接种后3和12周，将脾细胞移出且2×10⁵个脾细胞在37℃5％CO₂中与p25肽(3μg/ml)培养。共孵育后18小时，通过先前所述的ELIspot确定IFN-γ分泌性细胞的数量[19]，且在抗原攻击后72小时时，通过[3H]-胸苷摄取评估T细胞增殖。

保护性效力

为评估保护性效力，用5×10⁵CFU的BCG菌株免疫C57BL/6小鼠(每组5只)且在疫苗接种后12周时使用Middlebrook空气传播感染装置(Glas-Col，Terre Haute，IN，USA)以大约每肺100个有活力的杆菌之感染剂量的气溶胶结核分枝杆菌H37Rv攻击小鼠。在所述攻击后4周，在Middlebrook 7H11Bacto琼脂上计数肺和脾内细菌的数量。

统计分析

用使用Bonferroni多重比较检验的方差(ANOVA)分析来确定线性和log转换测定之差异的显著性，所述Bonferroni多重比较检验用于多组数据集的成对比较。认为具有p＜0.05的差异是显著的。

结果

在树突细胞内结核分枝杆菌hspX启动子的诱导

我们推测在分枝杆菌感染期间靶向DC抗原表达将对引导向所述抗原产生的免疫应答有积极作用。为了诱导DC内之外来基因的表达，我们构建了BCG菌株，其中结核分枝杆菌hspX启动子(P_hspX)控制了基因表达。当在未通气的培养物中生长时，其中使用P_hspX表达gfp的BCG：P_hspX-GFP仅显示出明显的GFP荧光上调，确认了在低氧压下hspX启动子的上调(图7A)。在用BCG：P_hspX-GFP感染DC 24小时后，当与初始接种物(第0天)或感染后6小时分离的细菌相比时分离的细菌展示出荧光明显的提高(图7B)。在rBCG感染的DC内通过共聚焦显微术可视化GFP荧光确认hspX控制之表达的诱导(图7C)。这些结果证明hspX启动子可用来驱动DC内迅速和显著的由重组BCG引起之基因表达的诱导。

在疫苗接种后hspX诱导表达的早期体内诱导

为了确定hspX启动子是否可用来驱动抗原体内表达，用BCG：P_hspXGFP疫苗接种小鼠并确定GFP⁺宿主细胞的存在。疫苗接种后1天尽早检测GFP⁺细胞，且其在疫苗接种后3和7天明显(图8A)。在疫苗接种后3天GFP⁺细胞的比例达到峰值，然而在检查的3个时间点间无显著差异(图8B)。我们还检测了CD11c^hiCD11b^hi DC内流至rBCG疫苗接种部位，在疫苗接种后第7天达到数量峰(图9A)。在感染的较晚期GFP⁺DC明显，在第3天和第7天分别具有诱导状态的锚定于BCG：P_hspXGFP之显著数量的DC(图9B和C)。这些数据表明用BCG：P_hspX-GFP的疫苗接种导致DC的感染和hspX启动子的迅速细胞内诱导。

在BCG中hspX启动子驱动外来抗原表达的用途

为确定hspX启动子是否可用来调节对定义抗原的免疫，在该启动子的控制下我们表达了编码免疫显性结核分枝杆菌Ag85B抗原的基因。虽然通过BCG表达该蛋白质的同系物，通过所述抗原的组成型过表达赋予BCG改善的抗Ag85B免疫[17]。BCG：P_hspX-85B菌株显示出在有效通气条件下培养的培养物中Ag85B表达的上调(数据未示出)。为确定hspX介导的表达是否影响Ag85B被DC呈递，用BCG：P_hspX-85B、仅BCG或BCG：P_hsp60-85B感染来自小鼠骨髓的体外培养DC，其中在强hsp60启动子的控制下Ag85B组成地表达[17]。感染的细胞与转基因Ag85B特异性CD4⁺T细胞(p25T细胞[15])培养，且检测增殖和细胞因子释放。用全部3种菌株感染的DC诱导了p25T细胞增殖(图10A)和IFN-γ分泌(图10B)，其在未感染的细胞中未观察到。在用BCG：P_hspX-85B感染的DC中应答更明显，且该差异达到了T细胞增殖测定中的显著性(图10A)。因此，hspX启动子可用来驱动BCG中外来抗原的表达，且在DC内的诱导产生提高的T细胞体外增殖。

通过用BCG：P_hspX-85B疫苗接种诱导体内T细胞免疫增强

体外免疫原性实验表明hspX启动子的使用可能能够体内修饰BCG诱导的免疫。考虑到疫苗接种后由hspX启动子驱动之表达的迅速诱导(图8)，我们首先确定用BCG：P_hspX-85B的疫苗接种是否导致相比仅用BCG或BCG：P_hsp60-85B改善的Ag85B反应性T细胞的早期起始。为此，将CFSE标记的p25T细胞转移至野生型接受体，其在用BCG菌株疫苗接种后检查所述经转移细胞的活化和增殖。在感染后第三天时，BCG：P_hspX-85B疫苗接种已经诱导了p25T细胞增殖，具有多数显示CFSE中等或低谱之分裂的细胞，而仅用BCG或BCG：P_hsp60-85B的疫苗接种没有造成可察觉的增殖(图11A和B)。在感染后第7天时，所有BCG菌株诱导了大多数经转移之p25T细胞的增殖，如通过p25CD4⁺T细胞的CSFE谱(图11A)确定的大约90％的p25CD4T细胞显示出用BCG、BCG：P_hsp60-85B或BCG：P_hspX-85B疫苗接种后的CSFE低谱(图11B)。一并考虑，这些结果表明BCG：P_hspX-85B中Ag85B的诱导加速了p25T细胞的初始起始，然而在稍后的时间点BCG和BCG：P_hsp60-85B二者产生足够的抗原以引起p25T细胞的增殖。

我们接下来评估了用所述3种BCG菌株疫苗接种的小鼠的长期T细胞应答，并检查了在疫苗接种后3周或12周时Ag85B特异性T细胞的产生。在疫苗接种后3周时，BCG：P_hsp60-85B和BCG：P_hspX-85B二者导致相比仅用BCG Ag85B特异性IFN-γ分泌性细胞产生的提高，特别是BCG：P_hspX-85B相比对照BCG提高了相应细胞数量大约5倍(图12A)。在疫苗接种后12周时，BCG和BCG：P_hsp60-85B二者显示出响应Ag85B之IFN-γ分泌性细胞的相等同水平，其显著高于在未疫苗接种之小鼠中观察到的水平(图12B)。然而，在用BCG：P_hspX-85B疫苗接种的小鼠中，抗原特异性IFN-γ分泌性细胞的数量为仅用BCG诱导数量的大约6倍，且为在用BCG：P_hsp60-85B疫苗接种后观察到之应答的3倍以上(图12B)。这些结果表明在宿主细胞内诱导Ag85B表达的能力导致体内T细胞免疫提高的模式，其在疫苗接种后延长的时间点最明显。

因为Ag85B为结核分枝杆菌的免疫显性抗原，所以我们确定了在hspX启动子控制下表达Ag85B的rBCG是否可改善针对结核分枝杆菌感染的BCG保护性作用。疫苗接种后12周，经由气溶胶途径用低剂量的结核分枝杆菌菌株H37Rv攻击小鼠。在结核分枝杆菌感染后4周时，肺(图12C)和脾(图12D)二者中的细菌负荷相比未疫苗接种的小鼠在所有用BCG菌株疫苗接种的小鼠中都显著降低。然而，仅用BCG、用BCG：P_hspX-85B、用BCG：P_hsp60-85B疫苗接种之小鼠中的保护性作用是类似的，表明在此模型中Ag85B过表达没有改善保护性效力。

讨论

BCG疫苗显示出针对肺结核可变的保护性效力，然而可改造所述疫苗来以功能形式表达外来分子，且这已经驱动了开发BCG作为重组载体来针对感染性疾病和恶性疾病(例如癌症)提供保护[20]。对这些方法的成功至关重要的是调节BCG诱导的免疫以产生期望之免疫应答的能力。在本报道中，我们示出结核分枝杆菌hspX启动子可用来调节在BCG中产生之重组抗原的表达。我们示出了在DC内hspX启动子被体外迅速诱导(图6)，其补充了在巨噬细胞内hspX表达[21]和在小鼠感染后DC的BCG摄取[8]的已有文献。这种在DC内hspX启动子迅速和明确的体内诱导对于抗原载体系统的使用是重要的，这是由于DC在分枝杆菌免疫应答初始中的关键作用[8，22，23]。我们还示出了hspX启动子活性在rBCG疫苗接种的小鼠的DC内于感染后早在24小时明显(图8)。该迅速的启动子诱导似乎同低剂量气溶胶结核分枝杆菌感染小鼠后的hspX转录水平相矛盾，仅在感染后大约15天且更普遍的在较晚阶段检测到hspX mRNA[14]。这表明在结核分枝杆菌中的体内hspX积聚可以是缓慢的过程，或者还可涉及在目前研究中使用的高rBCG剂量的递送，且敏感性GFP报道系统促进了hspX启动子活性的检测。

为了确定P_hspX驱动表达的抗原特异性作用，我们利用hspX启动子来调节结核分枝杆菌Ag85B的表达，Ag85B为分泌性分枝杆菌蛋白质，其为许多候选肺结核疫苗的组分[24]。我们观察到在用BCG：P_hspX-85B疫苗接种后与Ag85B反应性T细胞起始和活化增强(图10和11)相关的DC早期募集至感染部位和BCG的迅速吞噬细胞裂解(图9)。而且，改善的T细胞起始导致持续产生的IFN-γ分泌性细胞识别Ag85B长达疫苗接种后3个月。有趣地，编码Ag85B之基因的表达在小鼠中的慢性结核分枝杆菌感染期间被下调[14]，且将有兴趣确认在BCG中使用天然Ag85B启动子来驱动抗原表达的疫苗是否可以在人中保持长期的保护性免疫[25]。我们还使用气溶胶结核分枝杆菌感染的鼠类模型来确定Ag85B的体内诱导是否可改善BCG疫苗的保护性作用。然而，相比仅用BCG我们没有观察到改善的保护性作用(图12)。在先前的研究中，类似地我们观察到在BCG中Ag85B的过表达没有改善BCG的保护性作用，尽管在经疫苗接种的小鼠中提高了抗Ag85B免疫[17]。这表明可需要评估在该系统中的其他抗原来确定BCG中P_hspX驱动表达针对结核分枝杆菌感染提供保护的作用，或作为替代地，应当在肺结核的其他临床前模型中评估BCG：P_hspX-85B，其中当在rBCG中表达时确实给予保护性效力一些水平的改善[25]。

由于经hspX启动子上调的抗原而改善和持续之免疫的机理是不清楚的。使用分枝杆菌hsp60启动子的Ag85B组成型过表达导致在rBCG中非常强的表达水平，如通过蛋白质印迹所检测的[17]且在疫苗接种后早期在刺激抗原特异性T细胞免疫上比仅用BCG更好，然而，该作用不能长期保持(图12A和12B)。可能P_hsp60转录在BCG感染的较晚期被下调，因此导致在延长的时间点降低的抗原水平或者启动子的体内不稳定性降低免疫原性[26]。相反地，P_hspX活性看来在感染后较长的时间点最大[14]，表明该方法可导致由BCG：P_hspX-85B表达的抗原之升高和持续的水平。先前已经报道了BCG中Ag85B的过表达导致提高的自体吞噬和rBCG菌株刺激抗原特异性T细胞应答之能力的改善[27]。当我们使用3-甲基腺嘌呤抑制rBCG感染之DC中的自体吞噬并确定Ag85B特异性T细胞活化的程度时，我们观察到在用BCG：P_hspX-85B感染的经处理DC中T细胞活化降低的趋势，然而该作用在所有实验中都未达到统计显著性(数据未示出)。

在目前研究中呈现的结果证明使用rBCG作为载体诱导抗原表达的能力导致显著和持续之细胞免疫应答的产生，这对于需要“Th1”样应答对其进行控制的疾病(例如肺结核)具有清楚的意义。

实施例3

方法

通过皮下注射佐剂(MPL/DDA)、Ag85B-CysD融合蛋白(10mg)或Ag85B(10mg)免疫C57BL/6小鼠(n＝5)3次。在蛋白质疫苗第一次注射时，通过皮下注射5×10⁵CFU的BCG免疫小鼠一次。在第三次免疫接种后四周，用具有每肺～100个有活力的杆菌之感染剂量的气溶胶结核分枝杆菌攻击小鼠。

结果

在用气溶胶结核分枝杆菌攻击经免疫的小鼠后4周，在肺(图14A)和脾(图14B)中确定细菌负荷。数据以每器官的平均CFU(±SEM)示出。用单因素ANOVA以及使用Bonferroni事后检验完成的多组数据集的成对比较来评价组间之差异的显著性。

用Ag85B-CysD的疫苗接种导致的保护等同于存在的BCG疫苗。考虑到BCG表达大量的抗原性靶标，这是引人注目的结果，而我们两个抗原的融合为同等保护性的(图14)。

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附表1：在本研究中使用的用于蛋白质纯化的引物和克隆

SEQ ID No：1(CysD核序列)

ATGGCAATAACCATAAATATGGTCAATCCTACCGGATTTATCAGGTATGAGGACGTGGAACAGGAAGCCATGACCAGCGATGTGACGGTGGGCCCCGCACCCGGCCAGTACCAACTGAGCCATCTGCGCTTGCTGGAGGCCGAAGCCATCCACGTCATCCGGGAGGTGGCCGCCGAGTTCGAGCGGCCAGTGCTGTTGTTCTCGGGGGGCAAGGACTCCATCGTCATGCTGCACCTGGCGCTGAAGGCGTTTCGGCCCGGGCGACTGCCGTTCCCGGTCATGCACGTCGACACCGGTCACAACTTCGACGAAGTTATCGCTACCCGAGACGAGTTGGTCGCCGCGGCCGGGGTGCGGCTGGTGGTGGCGTCGGTGCAGGACGATATCGATGCCGGTCGGGTCGTCGAGACCATCCCGTCGCGAAATCCGATACAGACCGTGACGCTGCTGCGGGCCATCCGGGAGAACCAATTCGACGCGGCATTCGGGGGAGCCCGGCGCGACGAGGAGAAGGCCCGCGCCAAGGAGCGGGTGTTCAGCTTCCGCGACGAGTTCGGCCAGTGGGACCCGAAGGCTCAGCGGCCGGAACTGTGGAACCTCTACAACGGACGGCACCACAAGGGCGAGCACATCCGGGTCTTCCCGCTGTCCAACTGGACCGAATTCGACATCTGGTCCTACATCGGCGCCGAGCAGGTCAGGCTGCCGTCCATCTATTTCGCCCACCGGCGCAAGGTGTTTCAGCGCGACGGCATGTTGCTGGCCGTGCACCGGCACATGCAACCGCGAGCCGACGAGCCGGTGTTCGAGGCCACGGTGCGATTCCGCACCGTCGGGGATGTTACCTGCACCGGGTGCGTCGAGTCGTCGGCATCGACGGTCGCGGAAGTCATCGCCGAAACTGCGGTGGCCCGCTTGACGGAGCGCGGGGCGACCAGGGCTGACGACCGGATCTCGGAGGCTGGAATGGAAGACCGCAAGCGGCAGGGATACTTCTGA

SEQ ID No：2(CysD氨基酸序列)

MAITINMVNPTGFIRYEDVEQEAMTSDVTVGPAPGQYQLSHLRLLEAEAIHVIREVAAEFERPVLLFSGGKDSIVMLHLALKAFRPGRLPFPVMHVDTGHNFDEVIATRDELVAAAGVRLVVASVQDDIDAGRVVETIPSRNPIQTVTLLRAIRENQFDAAFGGARRDEEKARAKERVFSFRDEFGQWDPKAQRPELWNLYNGRHHKGEHIRVFPLSNWTEFDIWSYIGAEQVRLPSIYFAHRRKVFQRDGMLLAVHRHMQPRADEPVFEATVRFRTVGDVTCTGCVESSASTVAEVIAETAVARLTERGATRADDRISEAGMEDRKRQGYF

SEQ ID No：3(CysNC DNA序列)

ATGACGACGCTATTGCGGCTGGCGACAGCGGGTTCCGTCGACGATGGCAAGTCCACGCTGATTGGGCGGCTACTCTACGACTCCAAGGCTGTGATGGAAGACCAGTGGGCGTCGGTGGAGCAAACGTCCAAGGACCGGGGCCACGACTACACCGACCTGGCTCTGGTCACCGACGGCCTGCGGGCCGAGCGGGAACAGGGCATCACCATCGACGTTGCCTACCGCTACTTCGCCACTCCCAAGCGGAAATTCATCATTGCCGACACCCCGGGACACATCCAATACACCCGCAACATGGTGACCGGTGCGTCCACCGCCCAACTGGTGATCGTACTGGTGGATGCCCGGCACGGCTTGCTGGAGCAATCCCGCCGGCACGCCTTCCTGGCGTCGCTGCTGGGCATCCGCCACCTGGTGCTCGCGGTCAACAAGATGGACTTGCTTGGCTGGGACCAAGAGAAATTCGACGCGATTCGAGACGAATTCCACGCCTTCGCGGCCCGCCTCGACGTGCAGGACGTCACCTCCATCCCAATCTCCGCGCTGCACGGCGACAACGTGGTGACCAAATCCGACCAGACGCCCTGGTACGAGGGACCGTCGCTGCTGTCGCATCTCGAAGACGTCTACATCGCCGGTGACCGCAACATGGTCGACGTGCGATTCCCGGTCCAGTACGTCATCCGGCCGCACACCCTCGAGCATCAAGACCACCGCAGCTACGCGGGCACCGTGGCCAGTGGGGTAATGCGTTCAGGCGACGAAGTTGTCGTGCTGCCGATCGGTAAGACCACCCGGATCACCGCGATCGACGGCCCGAACGGCCCGGTGGCAGAAGCGTTTCCGCCGATGGCGGTTTCGGTGCGGCTCGCCGACGACATCGATATCTCGCGTGGTGACATGATCGCTCGCACCCACAACCAGCCCAGGATCACACAAGAATTCGACGCGACCGTGTGCTGGATGGCCGACAACGCGGTGCTAGAGCCCGGCCGCGACTACGTTGTCAAGCACACCACCCGAACCGTCCGCGCGAGGATAGCCGGGCTGGATTACCGGCTCGATGTCAACACCCTGCATCGCGACAAGACCGCAACGGCGTTGAAACTCAACGAACTGGGCCGTGTTTCGCTGCGCACCCAGGTGCCGTTGCTGCTTGACGAGTACACCCGCAACGCTAGCACCGGCTCGTTCATCCTCATTGACCCCGACACCAACGGAACGGTGGCGGCGGGCATGGTGTTACGCGACGTCTCGGCCCGCACGCCTAGCCCGAACACGGTGCGGCACAGATCGCTCGTCACTGCGCAAGATCGGCCGCCCAGGGGCAAGACGGTGTGGTTTACCGGACTGTCCGGCTCCGGCAAGTCGTCGGTGGCCATGCTGGTTGAGCGGAAGCTACTCGAAAAGGGCATCTCCGCTTACGTTCTGGACGGCGACAACCTACGGCATGGCCTCAACGCCGACCTGGGCTTTTCCATGGCCGACCGCGCGGAGAACCTGCGCCGGCTGTCGCATGTGGCCACACTGCTCGCCGATTGTGGCCACCTGGTGCTGGTGCCCGCGATCAGCCCCCTTGCTGAGCACCGTGCCCTGGCTCGTAAAGTGCACGCTGATGCGGGAATCGACTTTTTCGAGGTGTTCTGTGACACCCCGCTGCAGGACTGTGAGAGGCGTGATCCCAAAGGGTTGTACGCCAAAGCGCGTGCGGGTGAGATCACGCACTTCACCGGGATCGACAGCCCATATCAGCGGCCCAAGAACCCAGACCTACGGCTTACGCCGGATCGCAGCATAGACGAGCAGGCGCAGGAGGTTATCGACCTGTTGGAGTCATCGTCTTAG

SEQ ID No：4(CysNC氨基酸序列)

MTTLLRLATAGSVDDGKSTLIGRLLYDSKAVMEDQWASVEQTSKDRGHDYTDLALVTDGLRAREQGITIDVAYRYFATPKRKFIIADTPGHIQYTRNMVTGASTAQLVIVLVDARHGLLEQSRRHAFLASLLGIRHLVLAVNKMDLLGWDQEKFDAIRDEFHAFAARLDVQDVTSIPISALHGDNVVTKSDQTPWYEGPSLLSHLEDVYIAGDRNMVDVRFPVQYVIRPHTLEHQDHRSYAGTVASGVMRSGDEVVVLPIGKTTRITAIDGPNGPVAEAFPPMAVSVRLAPDIDISRGDMIARTHNQPRITQEFDATVCWMADNAVLEPGRDYVVKHTTRTVRARIAGLDYRLDVNTLHRDKTATALKLNELGRVSLRTQVPLLLDEYTRNASTGSFILIDPDTNGTVAAGMVLRDVSARTPSPNTVRHRSLVTAQDRPPRGKTVWFTGLSGSGKSSVAMLVERKLLEKGISAYVLDGDNLRHGLNADLGFSMADRAENLRRLSHVATLLADCGHLVLVPAISPLAEHRALARKVHADAGIDFFEVFCDTPLQDCERRDPKGLYAKARAGEITHFTGIDSPYQRPKNPDLRLTPDRSIDEQAQEVIDLLESSS

SEQ ID No：5(Ag85B核酸序列)

ATGACAGACGTGAGCCGAAAGATTCGAGCTTGGGGACGCCGATTGATGATCGGCACGGCAGCGGCTGTAGTCCTTCCGGGCCTGGTGGGGCTTGCCGGCGGAGCGGCAACCGCGGGCGCGTTCTCCCGGCCGGGGCTGCCGGTCGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGCGACATCAAGGTTCAGTTCCAGAGCGGTGGGAACAACTCACCTGCGGTTTATCTGCTCGACGGCCTGCGCGCCCAAGACGACTACAACGGCTGGGATATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTACTACCAGTCGGGACTGTCGATAGTCATGCCGGTCGGCGGGCAGTCCAGCTTCTACAGCGACTGGTACAGCCCGGCCTGCGGTAAGGCTGGCTGCCAGACTTACAAGTGGGAAACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGCAATGGTTGTCCGCCAACAGGGCCGTGAAGCCCACCGGCAGCGCTGCAATCGGCTTGTCGATGGCCGGCTCGTCGGCAATGATCTTGGCCGCCTACCACCCCCAGCAGTTCATCTACGCCGGCTCGCTGTCGGCCCTGCTGGACCCCTCTCAGGGGATGGGGCCTAGCCTGATCGGCCTCGCGATGGGTGACGCCGGCGGTTACAAGGCCGCAGACATGTGGGGTCCCTCGAGTGACCCGGCATGGGAGCGCAACGACCCTACGCAGCAGATCCCCAAGCTGGTCGCAAACAACACCCGGCTATGGGTTTATTGCGGGAACGGCACCCCGAACGAGTTGGGCGGTGCCAACATACCCGCCGAGTTCTTGGAGAACTTCGTTCGTAGCAGCAACCTGAAGTTCCAGGATGCGTACAACGCCGCGGGCGGGCACAACGCCGTGTTCAACTTCCCGCCCAACGGCACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCTCAGCTCAACGCCATGAAGGGTGACCTGCAGAGTTCGTTAGGCGCCGGCTGA

SEQ ID No：6(Ag85B氨基酸序列)

MTDVSRKIRAWGRRLMIGTAAAVVLPGLVGLAGGAATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPAFEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYSDWYSPACGKAGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGSAAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSALLDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDPTQQIPKLVANNTRLWVYCGNGTPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAG

SEQ ID No：7(HspX启动子)

CTGCACCGCGCTCTTGATGACATCGGTGGTCACCATGGTGTCCGGCATGATCAACCTCCGCTGTTCGATATCACCCCGATCTTTCTGAACGGCGGTTGGCAGACAACAGGGTCAATGGTCCCCAAGTGGATCACCGACGGGCGCGGACAAATGGCCCGCGCTTCGGGGACTTCTGTCCCTAGCCCTGGCCACGATGGGCTGGTCGGATCAAAGGCATCCGTTTCCATCGATTAGGAGG

SEQ ID No：8(Ag85BCysD氨基酸序列)

MTDVSRKIRAWGRRLMIGTAAAVVLPGLVGLAGGAATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPAFEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYSDWYSPACGKAGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGSAAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSALLDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDPTQQIPKLVANNTRLWVYCGNGTPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAGGFMAITINMVNPTGFIRYEDVEQEAMTSDVTVGPAPGQYQLSHLRLLEAEAIHVIREVAAEFERPVLLFSGGKDSIVMLHLALKAFRPGRLPFPVMHVDTGHNFDEVIATRDELVAAAGVRLVVASVQDDIDAGRVVETIPSRNPIQTVTLLRAIRENQFDAAFGGARRDEEKARAKERVFSFRDEFGQWDPKAQRPELWNLYNGRHHKGEHIRVFPLSNWTEFDIWSYIGAEQVRLPSIYFAHRRKVFQRDGMLLAVHRHMQPRADEPVFEATVRFRTVGDVTCTGCVESSASTVAEVIAETAVARLTERGATRADDRISEAGMEDRKRQGYF

SEQ ID No：9(pHspX85BCysD核酸序列)

CTAGACGCCACCCTCCGGGCCGTTGCTTCGCAACGTTCAAATCCGCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGCCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGGGGAGACCCCACACTACCATCGGCGCTAGAGCCGA AAGCTT CACCACCACCACCACCACTGAGTTAACTAGCGTACGATCGACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATGCCATCATGGCCGCGGTGATCAGCTAGCCACCTGACGTCGGGGGGGGGGGAAAGCGACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCCATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAATCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCACTAGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAACGCGTGAGCCCACCAGCTCCGTAAGTTCGGGTGCTGTGTGGCTCGTACCCGCGCATTCAGGCGGCAGGGGGTCTAACGGGTCTAAGGCGGCGTGTACGGCCGCCACAGCGGCTCTTAGCGGCCCGGAAACGTCCTCGAAACGACGCATGTGTTCCTCCTGGTTGGTACAGGTGGTTGGGGGTGCTCGGCTGTCGCTGGTGTTTCATCATCAGGGCTCGACGGGAGAGCGGGGGAGTGTGCAGTTGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATATCTGACTTGGAGCTCGTGTCGGACCATACACCGGTGATTAATCGTGGTTTATTATCAAGCGTGAGCCACGTCGCCGACGAATTTGAGCAGCTCTGGCTGCCGTACTGGTCCCTGGCAAGCGACGATCTGCTCGAGGGGATCTACCGCCAAAGCCGCGCGTCGGCCCTAGGCCGCCGGTACATCGAGGCGAACCCAACAGCGCTGGCAAACCTGCTGGTCGTGGACGTAGACCATCCAGACGCAGCGCTCCGAGCGCTCAGCGCCCGGGGGTCCCATCCGCTGCCCAACGCGATCGTGGGCAATCGCGCCAACGGCCACGCACACGCAGTGTGGGCACTCAACGCCCCTGTTCCACGCACCGAATACGCGCGGCGTAAGCCGCTCGCATACATGGCGGCGTGCGCCGAAGGCCTTCGGCGCGCCGTCGATGGCGACCGCAGTTACTCAGGCCTCATGACCAAAAACCCCGGCCACATCGCCTGGGAAACGGAATGGCTCCACTCAGATCTCTACACACTCAGCCACATCGAGGCCGAGCTCGGCGCGAACATGCCACCGCCGCGCTGGCGTCAGCAGACCACGTACAAAGCGGCTCCGACGCCGCTAGGGCGGAATTGCGCACTGTTCGATTCCGTCAGGTTGTGGGCCTATCTTCCCGCCCTCATGCGGATCTACCTGCCGACCCGGAACGTGGACGGACTCGGCCGCGCGATCTATGCCGAGTGCCACGCGCGAAACGCCGAATTTCCGTGCAACGACGTGTGTCCCGGACCGCTACCGGACAGCGAGGTCCGCGCCATCGCCAACAGCATTTGGCGTTGGATCACAACCAAGTCGCGCATTTGGGCGGACGGGATCGTGGTCTACGAGGCCACACTCAGTGCGCGCCATGCGGCCATCTCGCGGAAGGGCGCAGCAGCGCGCACGGCGGCGAGCACAGTTGCGCGGCGCGCAAAGTCCGCGTCAGCCATGGAGGCATTGCTATGAGCGACGGCTACAGCGACGGCTACAGCGACGGCTACAACTGGCAGCCGACTGTCCGCAAAAAGCGGCGCGTGACCGCCGCCGAAGGCGCTCGAATCACCGGACTATCCGAACGCCACGTCGTCCGGCTCGTGGCGCAGGAACGCAGCGAGTGGTTCGCCGAGCAGGCTGCACGCCGCGAACGCATCCGCGCCTATCACGACGACGAGGGCCACTCTTGGCCGCAAACGGCCAAACATTTCGGGCTGCATCTGGACACCGTTAAGCGACTCGGCTATCGGGCGAGGAAAGAGCGTGCGGCAGAACAGGAAGCGGCTCAAAAGGCCCACAACGAAGCCGACAATCCACCGCTGTTCTAACGCAATTGGGGAGCGGGTGTCGCGGGGGTTCCGTGGGGGGTTCCGTTGCAACGGGTCGGACAGGTAAAAGTCCTGGTAGACGCTAGTTTTCTGGTTTGGGCCATGCCTGTCTCGTTGCGTGTTTCGTTGCGTCCGTTTTGAATACCAGCCAGACGAGACGGGGTTCTACGAATCTTGGTCGATACCAAGCCATTTCCGCTGAATATCGTGGAGCTCACCGCCAGAATCGGTGGTTGTGGTGATGTACGTGGCGAACTCCGTTGTAGTGCTTGTGGTGGCATCCGTGGCGCGGCCGCGGTACCAGATCTTTAAAT

粗体＝hspx启动子序列

粗体并加下划线＝克隆位点

斜体＝Ag85B-CysD基因

加下划线＝6组氨酸标签

Claims (12)

1.重组或合成的蛋白质，其序列如SEQ ID No：8所示。

2.核酸，其编码权利要求1所述的蛋白质。

3.核酸，其由权利要求2所述的核酸和分枝杆菌HspX启动子组成。

4.核酸，其核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。

5.疫苗或免疫刺激组合物，其用于在个体中提供针对分枝杆菌的免疫应答，所述疫苗或免疫刺激组合物包含：

-权利要求1所述的重组或合成的蛋白质，或SEQ ID No：2所示的重组或合成的蛋白质；

-化合物，其用于增强针对所述重组或合成的蛋白质的免疫应答。

6.疫苗或免疫刺激组合物，其用于在个体中提供针对分枝杆菌的免疫应答，所述疫苗或免疫刺激组合物包含：

-由SEQ ID No：2所示序列和SEQ ID No：4所示所述序列组成的重组或合成的蛋白质；

-化合物，其用于增强针对所述重组或合成的蛋白质的免疫应答。

7.权利要求5或6所述的疫苗或组合物，其中所述用于增强针对所述分枝杆菌SAP组分之免疫应答的化合物包括单磷脂酰脂质A(MPL)和/或二甲基十八烷基溴化铵(DDA)形式的佐剂。

8.根据权利要求5或6所述的疫苗或组合物，其中所述重组或合成的蛋白质以重组细菌细胞的形式在所述疫苗或组合物中提供，所述重组细菌细胞具有在所述细胞中表达的所述重组或合成的蛋白质。

9.权利要求1所述的蛋白质在制备用于使个体中发生分枝杆菌感染之可能性最小化的药物中的用途。

10.权利要求5或6所述的疫苗或组合物在制备用于使个体中发生分枝杆菌感染之可能性最小化的药物中的用途。

11.权利要求9或10所述的用途，其中所述个体不具有可检测的分枝杆菌感染。

12.权利要求9或10所述的用途，其中所述个体具有分枝杆菌感染的一种或更多种症状。