ES2655190T3 - Prevención y tratamiento de la infección por Mycobacterium - Google Patents

Abstract

Una proteína recombinante o sintética que incluye: - una primera región que tiene una secuencia codificada por un gen que codifica un componente de una vía de asimilación de sulfato de Mycobacterium (SAP), en la que el gen es un gen Mycobacterium CysD que tiene al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO: 1; y - una región adicional que tiene una secuencia codificada por un gen de Mycobacterium Ag85B que tiene una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 5.

Description

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3 µg/ml. Para el análisis de eficacia protectora, se inmunizaron ratones (5/grupo) por vía subcutánea (s.c) una vez con 5 × 105 CFU de M. bovis BCG, o 3 veces a intervalos de 2 semanas con 10 µg de proteína CysDNC coadministrada con dimetil dioctadecil bromuro de amonio (DDA) (1,25 mg/ml) y monofosforil lípido A (MPL) (125 µg/ml) o intramuscularmente (i.m) con 100 µg de vacuna de ADN por inyección. Ocho semanas después de la vacunación final, los ratones fueron expuestos a M. tuberculosis Mt103 en aerosol utilizando un aparato de exposición por inhalación (Glas-Col) con una dosis infecciosa de 100 bacilos viables por pulmón. La carga bacteriana se determinó 4 semanas después de la prueba sembrando en placa homogeneizados de pulmón y bazo.

Análisis estadístico

Para la evaluación de la eficacia protectora, la significancia de las diferencias se evaluó mediante ANOVA de una vía con una comparación por pares de conjuntos de datos agrupados mediante la prueba post hoc de Bonferroni. Para la evaluación de la inducción de respuestas inmunes del huésped por enzimas SAP de ratones infectados o individuos infectados con M. tuberculosis en comparación con ratones no infectados o individuos TST-ve respectivamente, se usó la prueba U de Mann-Whicney (* P<0,05).

Resultados

Inducción de ARNm sulfurilasa de M. tuberculosis ATP en el entorno intracelular se correlaciona con la potente inmunidad específica de antígeno.

El complejo activador de sulfato (SAC) de M. tuberculosis es el primer paso en el SAP (figura 1 complementaria) y constituye 3 actividades catalíticas, ATP sulfurilasa, GTPasa y actividad de APS quinasa codificada por el operón CysDNC (figura 1A). La capacidad del SAC de M. tuberculosis para sobrerregular positivamente su expresión en condiciones de cultivo que imitan el estrés intracelular ((Pinto, 2004 #14), sugiere que su expresión también puede ser inducida en el entorno intracelular. Para probar esto, examinamos los cambios en los niveles de ARNm de CysDNC dentro de células RAW264,7 durante la infección por M. tuberculosis. Encontramos que la expresión de CysDNC se mejoró significativamente, mostrando un aumento de aproximadamente 4,4 veces sobre el nivel encontrado en bacilos cultivados en caldo durante las primeras 48 horas (Figura 1B). También determinamos si la expresión de CysDNC se indujo en bacterias no replicantes para imitar las condiciones encontradas durante la infección latente. Usando el donante de óxido nítrico DETA-NO ((Bryk, 2008 #156) pudimos inhibir la replicación de M. tuberculosis in vitro en comparación con las bacterias no tratadas (Figura 1C). M. tuberculosis CysDNC fue altamente sobrerregulado bajo condiciones de persistencia no replicante y demostró un aumento de 35 veces en la expresión de genes en comparación con micobacterias en crecimiento activo (Figura 1D). Esto implica que CysDNC puede estar involucrado en la capacidad de M. tuberculosis para adaptarse a la variedad de tensiones encontradas en el entorno intracelular y la progresión al estado latente.

Como CysDNC se indujo a altos niveles dentro del entorno intracelular y en bacterias no replicantes, se formuló la hipótesis de que la enzima puede ser reconocida por la respuesta inmune durante la infección por M. tuberculosis. Para probar esto, intranasalmente infectamos ratones con M. tuberculosis y examinamos la frecuencia de células secretoras de IFN-γ en los ganglios linfáticos de los mediastinales (MLN). Tres semanas después de la infección, la estimulación de células MLN con CysDNC ex vivo dio como resultado una fuerte inducción de células T secretoras de IFN-γ, que era similar a los niveles inducidos por la proteína inmuno-dominante Ag85B secretada de M. tuberculosis (figura 2A). Esta fuerte respuesta de células T se mantuvo hasta ocho semanas después de la infección (figura 2B). Se observaron patrones similares de respuestas celulares secretoras de IFN-γ específicas de antígeno en respuesta a CysDNC y Ag85B en el pulmón (datos no mostrados). Además, los ensayos de proliferación de linfocitos de PBMC humanas revelaron que CysDNC se reconoció durante la infección por M. tuberculosis humana (figura 2C). Las respuestas de CysDNC fueron similares a las de la evocación de Ag85B, pero menores que las inducidas por CFP. Sin embargo, CysDNC indujo significativamente la proliferación de PBMCs de pacientes con TB en comparación con los individuos TST-ve (Figura 2C). Estos resultados indican que M. tuberculosis CysDNC, que codifica ATP sulfurilasa es un potente antígeno inmunoestimulador de M. tuberculosis.

Inmunidad protectora contra la exposición de M. tuberculosis virulento después de la vacunación con ADN que codifica ATP sulfurilasa.

La expresión mejorada de los genes que codifican ATP sulfurilasa en el entorno intracelular (Figura 1B), en nuestro modelo de persistencia no replicante (Figura 1C) y la capacidad de este complejo de proteína para inducir una respuesta ex vivo de citocina tipo Th1 específica de antígeno (Figura 2) pueden convertir a los productos codificados en objetivos efectivos para la inmunidad protectora antimicobacteriana. Para determinar esto, se inmunizaron los ratones con vectores de ADN que expresan cysD y/o cysNC y se expusieron a un aerosol con M. tuberculosis. La inmunización con todos los vectores que expresan cysD o cysNC dio como resultado una carga bacteriana significativamente reducida en comparación con los ratones vacunados con el vector control, tanto en el pulmón (Figura 3A) como en el bazo (Figura 3B) (p <0,01). En todos los experimentos, hubo una tendencia creciente a que ADN-cysD proporcionara una mejor eficacia protectora que ADN-cysNC en el pulmón, mientras que el uso de una combinación de ADN-cysD y ADN-cysNC igualaba la protección observada con ADN-cysD solo. La eficacia protectora fue significativamente mayor en el bazo cuando los ratones se inmunizaron con una combinación de estos dos

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El reconocimiento mejorado de los antígenos micobacterianos por la respuesta inmune del huésped no siempre correlaciona la protección contra la exposición con M. tuberculosis virulenta en modelos animales ((Gartner, 2007 #215; Kamath, 1999 #143; Skinner, 2003 #115). Nosotros por lo tanto, evaluamos si CysDNC fue protector en nuestro modelo murino de baja dosis de infección por aerosol de M. tuberculosis. Cuando se administraron como vacunas de ADN, CysD y CysNC fueron protectores como componentes individuales tanto en el pulmón como en el bazo, y una combinación de las dos estructuras logró un nivel de protección similar a la inducida por BCG (Figura 3). Por lo tanto, la fuerte expresión de genes que codifican CysDNC se correlaciona con el efecto protector del complejo antigénico en los modelos utilizados aquí. Sin embargo, la adición de vacunas de ADN que codifican otros componentes del SAP no mejoró el efecto protector de CysDNC, a pesar del hecho de que las proteínas fueron reconocidas por PBMCs de pacientes con TB, se sobrerregularon dentro de los macrófagos e indujeron fuertes respuestas de IFN-_ de las células T de ratones infectados con M. tuberculosis (Figura 4). No está claro por qué CysDNC parece ser un miembro dominante del SAP en términos de eficacia protectora, pero puede estar relacionado con respuestas restringidas al MHC en base a la cepa de ratón utilizada en este estudio. También es interesante observar que los antígenos de SAP se proponen como proteínas intracelulares o asociadas a la membrana debido a su función en el metabolismo del azufre (de Souza, 2011, #206), y hemos confirmado esto para algunos de los miembros por inmunoprecipitación Western (no se muestra). Sin embargo, todos los antígenos de M. tuberculosis en ensayos clínicos son proteínas secretadas, ya que se predice que son los objetivos iniciales de la inmunidad del huésped ((Kaufmann, 2011 #196). Este estudio sugiere que las proteínas no secretadas pueden además ser componentes adecuados de nuevas formulaciones de vacunas contra TB. Además, la reciente identificación de los antígenos asociados a latencia inducidos por estrés que mejoran la protección en las últimas etapas después de la infección por M. tuberculosis ((Aagaard, 2011 #213) justifica pruebas adicionales de CysDNC en modelos similares, considerando la marcada inducción del complejo proteico en bacterias no replicantes y en respuesta a estrés in vitro.

Una propiedad importante de las vacunas de subunidades potenciales es la capacidad de "reforzar" la protección con la inmunización previa con BCG, ya que este es el papel propuesto para tales vacunas en los nuevos calendarios de vacunación contra la TB (Kaufmann, 2011 #196). Un puñado de proteínas ha demostrado una capacidad para reforzar la protección inducida por BCG en la infección experimental por M. tuberculosis ((Lu, 2011 #144; Dey, 2011 #145; Rouanet, 2009 #214). Ahora se puede añadir CysDNC a esta lista, ya que el complejo antígeno pudo aumentar significativamente el efecto protector de solo BCG en el pulmón, el sitio primario de infección en el modelo utilizado (Figura 6).

Además de definir el papel antigénico de las proteínas SAP, este estudio también ha ampliado nuestro conocimiento sobre la regulación de la expresión del gen SAP durante la infección. Todos los componentes del SAP probado mostraron una sobrerregulación dentro de la línea celular de macrófagos utilizada aquí. Esta adaptación al entorno del fagosoma es una indicación de la capacidad de la bacteria para suministrar cisteína a la célula de manera oportuna, que ha sido ampliamente revisada por Hatzios y Bertozzi ((Hatzios, 2011 #167). Puede ser que las enzimas en el SAP regulan la expresión de cada uno. Por ejemplo, se ha demostrado que la serina acetil transferasa se asocia y forma un complejo con la última enzima en la vía o-acetilserina sulfhidralasa (OASS) (Droux, 1998 #218). Mientras que esta interacción regula negativamente el OASS ((Mino, 2000 #222; Schnell, 2007 #87), similar a la ATP-sulfurilasa, su expresión y actividad pueden depender del requerimiento de cisteína ((Kredich, 1966 #219; Mino, 1999 #220; Mino, 2000 #221; Pinto, 2004 #14). Además, la E. coli ATP sulfurilasa forma un complejo apretado con OASS ((Wei, 2002 #96) y es este complejo el que puede activar el sulfato para producir APS (figura suplementaria 1). Se ha sugerido que, dadas las similitudes entre E. coli y M. tuberculosis ATP sulfurilasas, que el sistema micobacteriano también forma un complejo de orden superior, que une funciones catalíticas con otras enzimas en el SAP ((Sun, 2005 #13). Esto no ha sido probado formalmente, sin embargo, puede ser la razón por la cual todas las enzimas del SAP inducen respuestas inmunitarias robustas del huésped (Figura 2, Figura 4B & C). También destacando la regulación de los genes del metabolismo del azufre está su transcripción mejorada tras la exposición a diversos antibióticos que pueden influir en cómo M. tuberculosis responde a estos medicamentos ((Hatzios, 2011 #167). Presumiblemente los genes sensibles a los fármacos codifican proteínas que son relevantes para el modo de acción de los fármacos y muchas enzimas que metabolizan azufre son fármacos objetivo prometedores ((Bhave, 2007 #1).

En resumen, hemos identificado componentes del SAP como proteínas inducidas por células huésped que son componentes antigénicos principales de M. tuberculosis.

Ejemplo 2

El nicho preferido dentro del hospedador de micobacterias virulentas y la cepa atenuada de vacuna BCG es el entorno intracelular del macrófago. Se ha observado que las micobacterias también tienen la capacidad de infectar y persistir dentro de las DCs y estimulan las respuestas de las células T in vivo [8,9].

Nuestra hipótesis es que la expresión dirigida de antígeno por (r) BCG recombinante dentro de las DCs puede influir en la generación posterior de inmunidad específica de antígeno. Consideramos que el promotor que controla la expresión del gen hspX de M. tuberculosis puede ser un candidato adecuado para dirigir la expresión de antígeno a las APCs después de la vacunación con BCG.

HspX, o la proteína α-cristalina, es un miembro de las proteínas de choque térmico de peso molecular pequeño que actúan como chaperones independientes de ATP [10, 11]. El promotor hspX se induce rápidamente a la entrada de

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Tabla complementaria 1: cebador y clones para purificación de proteínas utilizados en este estudio

Para PCR en tiempo real

Anotación de genes

nombre del gen cebador sentido cebador antisentido

cysDN

ATP sulfurilasa 5'-agt cat cgc cga aac tgc -3' 5'-ttg cca tcg tcg acg gaa -3'

cysH

APS reductasa 5'-gac atc gcg ggt gga ca -3' 5'-gac gga ctc gat cgc atc tc -3'

sirA

Sulfato reductasa 5'-gtt cga gca cag cat ttg gt -3' 5'-gtc cgt cgt cga tca tct gt -3'

cysk1

O-Acetil-serina Sulfidralsa 5'-ttc tcg aac cca cga gcg -3' 5'-ccc gga gtg agg atg agt tc-3'

cysE

Serina Acetlisulfidralsa 5'-ttc atc gac cac gcg acc -3' 5'-gat cgg acc gag gac ctt g -3'

rrs

16s ARNr 5'-agg cag cag tgg gga ata-3' 5'-cta ccg tca atc cga gag aa-3'

Para la clonación de vacunas de ADN: todos los genes clonados en pcADN3. El sitio de restricción de la enzima utilizado en la clonación está resaltado.

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Cebador sentido cebador antisentido

ADN-cysD

Se cortó cysD de un vector pET22b (Novagen) usando enzimas de restricción BamHI y XhoI y se clonó en pcADN3 cortado con las mismas enzimas.

ADN-cysN

Se cortó cysN de un vector pET22b usando enzimas de restricción BamHI y NotI y se clonó en pcADN3 cortado con las mismas enzimas

ADN-cysH

5'-acg aaa get tat gag egg cga gac a3' 5'-ggc ggg ate ccg agg cgt gca acc c3'

ADN-sirA

5'-tag gaa gct tat gtc cgc gaa gga g-3' 5'-tcg cgg tac ctc gca ggt cgt cct c-3'

ADN-cysK1

5'-ggc gaa gct tat gag cat cgc cga g3' 5'-gca tgg atc cgt cag cca cgt cgg c3'

ADN-cysE

5'-tga caa gct tat gct gac ggc cat g -3' 5'-tat tgg tac cga tcg aga agt cct c-3'

Para purificación de proteína

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Descripción Referencia

CysDN

Descrito anteriormente ((Pinto, 2004; Sun, 2005)

CysH

Descrito anteriormente ((Sun, 2006)

SirA

Descrito anteriormente ((Pinto, 2007)

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Claims (1)

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