CN104237145B - 一种快速测定葡萄糖氧化酶活力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种快速测定葡萄糖氧化酶活力的方法。所述方法包括以下步骤：(1)绘制过氧化氢浓度‑邻联茴香胺显色剂吸光值标准曲线；(2)对待测葡萄糖氧化酶样品进行预处理；(3)利用过氧化氢浓度‑吸光值标准曲线计算试验样品中葡萄糖氧化酶活力。该方法快速可靠，操作简单，灵敏准确。该检测方法原理是在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和棕色的氧化型邻联茴香胺，棕色的氧化型邻联茴香胺与硫酸溶液反应变为粉红色，可于最大吸收波长540nm处快速比色测定。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种快速测定葡萄糖氧化酶活力的方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，简称GOD)是一种需氧脱氢酶，其系统命名为β-D-葡萄糖氧化还原酶。该酶最早于1928年由Mǖller从黑曲霉中分离并报道，Pazur于1965年获得了纯的葡萄糖氧化酶。在有氧气存在的情况下，葡萄糖氧化酶能专一性地氧化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖酸和过氧化氢，在葡萄糖酸盐生产工业、食品添加剂、动物饲料添加剂、生化检测和生物传感器等方面具有广泛的应用。
目前，葡萄糖氧化酶活力主要的检测方法有滴定法、电化学法和分光光度法。滴定法的原理是葡萄糖氧化酶酶催化葡萄糖生成葡萄糖醛酸，再通过酸碱滴定可以间接测定出葡萄糖醛酸的产量，然后根据葡萄糖醛酸的产生量计算出GOD的酶活力。此方法虽然简单易行，成本低，但是该方法存在检测误差大和灵敏度低的缺点，而且需要进行繁复的移液滴定操作，工作量较大。电化学法的原理是根据酶促反应中的电压或电流的变化来测量氧化还原性酶活力，以氧电极进行测定，然而这个方法容易受到检测液中溶氧和其他电化学活性物质的干扰，从而影响实验结果。分光光度法的原理是在有氧的情况下，葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢。随后，辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化氢与显色底物发生反应，然后采用分光光度计检测生成的有色物质。目前利用此原理进行GOD酶活力检测的方法主要有靛红褪色法、醌亚胺法、邻苯二胺法和邻联茴香胺法等。虽然分光光度法非常灵敏，但遗憾的是以上的方法在已报道的文献中存在着显色物质不稳定，数据重复性不好，标准曲线线性范围较窄以及检测GOD酶活力结果较低的情况，尚停留在定性分析的基础上，不适合进行推广和制定标准。因此，建立快速、准确、灵敏和检测成本低的GOD酶活力检测方法一直是研究工作者努力追求的目标。
为了克服GOD酶活力检测体系的缺点，设计出快速可靠，操作简单，灵敏准确的检测方法，拓宽检测体系的适用范围，改正不合理的因素，本发明提供一种定性和定量测定葡萄糖氧化酶活力的方法，通过反复验证，建立了较为实用可靠的酶活力检测体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种定性和定量测定葡萄糖氧化酶活力的方法。
根据本发明的快速测定葡萄糖氧化酶活力的方法包括以下步骤：
(1)绘制过氧化氢浓度-邻联茴香胺显色剂吸光值标准曲线，先分别吸取过氧化氢标准溶液0.25mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL和0.75mL，分别用磷酸盐缓冲液定容至25mL，配成终浓度分别为24μg/mL～72μg/mL的过氧化氢浓度梯度系列，在试管中依次加入2.5mL邻联茴香胺稀释液、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，混匀后再分别加入上述不同浓度过氧化氢标准溶液各0.1mL，混匀后加入2mL 2mol/L的硫酸溶液，振荡均匀后在540nm处用1cm杯测定吸光值。以吸光值为横坐标，过氧化氢浓度为纵坐标绘制标准曲线；
(2)对待测葡萄糖氧化酶样品进行预处理，以磷酸缓冲液稀释样品，稀释后的样品中葡萄糖氧化酶活力控制在0.8～2.8U/mL之间；
(3)反应时，在试管中依次加入2.5mL邻联茴香胺稀释液、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，振荡均匀后在规定温度水浴5min后，测定管加入已稀释的酶样品溶液0.1mL，在规定温度反应3min后，加入2mol/L的硫酸溶液2mL终止反应，振荡均匀并冷却至室温后，在540nm处用1cm杯测定吸光值，以热失活的酶液做空白对照，利用过氧化氢浓度-吸光值标准曲线计算试验样品中葡萄糖氧化酶活力。
GOD酶活力的检测原理如下所示：
整个过程包括三个步骤：
第一步，在水溶液中，在GOD的存在下，1molβ-D-葡萄糖和1mol分子氧反应生成1mol葡萄糖酸和1mol的过氧化氢；
第二步，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在辣根过氧化物酶的作用下，生成水和棕色的氧化型邻联茴香胺；
第三步，棕色的氧化型邻联茴香胺与硫酸溶液反应生成粉红色的氧化型邻联茴香胺。
上述三步反应均在同一玻璃试管中进行，操作非常方便。
根据本发明的具体实施方式，在测定酶活力前，先要配制规定pH的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，然后缓冲液配制180g/L的葡萄糖溶液，用甲醇配制1％的邻联茴香胺储存液，使用前用磷酸盐缓冲液稀释，即0.1mL邻联茴香胺甲醇储存液加入到12mL磷酸盐缓冲液中混匀。还需配制100U/mL的辣根过氧化物酶溶液和2mol/L H2SO4溶液。最后，注意在配制2400mg/L过氧化氢标准溶液前要预先用KMnO4标定30％过氧化氢溶液。具体实施步骤如下：
(1)在反应前，要先进行过氧化氢浓度-邻联茴香胺显色剂吸光值标准曲线的绘制。先分别吸取过氧化氢标准溶液0.25mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL和0.75mL，分别用磷酸盐缓冲液定容至25mL，配成终浓度分别为24μg/mL～72μg/mL的过氧化氢浓度梯度系列。选择24μg/mL～72μg/mL的过氧化氢浓度梯度系列，是因为经反复试验，在该范围内对应的吸光值大小与GOD的酶活力大小才呈线性关系。
(2)在试管中依次加入2.5mL邻联茴香胺稀释液、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，混匀后再分别加入上述不同浓度过氧化氢标准溶液各0.1mL，混匀后加入2mL 2mol/L的硫酸溶液，振荡均匀后在540nm处用1cm杯测定吸光值。以吸光值为横坐标，过氧化氢浓度为纵坐标绘制标准曲线。
(3)对待测样品进行预处理，固体样品一般称取质量1g左右，精确至0.001g，置于锥形瓶中，加入100mL磷酸缓冲液，磁力搅拌或摇床振荡20min，再用磷酸缓冲液稀释至适当倍数，液体样品直接用磷酸缓冲溶液稀释至适当倍数。不仅要使反应体系中葡萄糖的量要远远过量，也要使GOD酶活力的大小与吸光值的大小呈线性关系，因此规定稀释后的样品中葡萄糖氧化酶活力控制在0.8～2.8U/mL之间。
(4)反应时，在试管中依次加入2.5mL邻联茴香胺稀释液、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，振荡均匀后在规定温度水浴5min后，测定管加入已稀释至适当倍数的酶样品溶液0.1mL，在规定温度反应3min后，加入2mol/L的硫酸溶液2mL终止反应，振荡均匀并冷却至室温后，在540nm处用1cm杯测定吸光值。 以热失活的酶液做空白对照，利用过氧化氢浓度-吸光值标准曲线计算试验样品中葡萄糖氧化酶活力。反应时间设定为3min，是因为经过反复试验，发现GOD催化葡萄糖的反应在3min为线性催化反应，即酶催化反应速率与酶浓度大小呈线性关系。而540nm为该比色液的最大吸收波长。在测定葡萄糖氧化酶活力时，一般选取该酶的最适反应pH和最适反应温度分别作为反应时所需缓冲液的pH值和水浴锅的设定温度。
GOD酶活力定义为，1g固体酶粉(或1mL液体酶)，于一定温度和pH值条件下，1min催化β-D-葡萄糖氧化产生出0.1μg过氧化氢所需的酶量，即为1个酶活力单位，以U/g(或U/mL)表示。
本发明采用的是一种新的分光光度法，该方法快速可靠，操作简单，灵敏准确。该检测方法原理是在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和棕色的氧化型邻联茴香胺，棕色的氧化型邻联茴香胺与硫酸溶液反应变为粉红色，可于最大吸收波长540nm处快速比色测定。
本发明具有以下特点：
1、本发明所建立的新型比色法具有快速灵敏的特点，对过氧化氢浓度的测定通过棕色的氧化型邻联茴香胺与硫酸溶液反应生成粉红色物质的吸光值来实现，且整个酶催化反应时间为3min，比已报道的比色法具有更短的反应时间。
2、在本发明中，反应条件温和，一般不受样品中其他杂质的干扰，测试样品适用范围宽泛。配制的邻联茴香胺溶液浓度低，配制时若在通风橱操作，则不会对人体产生任何伤害。检测中需要的辣根过氧化物酶量少，成本低，容易买到。
3、根据本发明的方法建立的GOD酶活力评价体系，仅需要水浴锅和可见分光光度计，不需要精密仪器和复杂的操作步骤，适用于广大企事业单位、科研机构，医院和学校等普遍使用。
附图说明
图1显示本发明实施例中测定的过氧化氢浓度-邻联茴香胺显色剂吸光值标准曲线，测定条件为温度37℃，pH6.0。
图2显示本发明实施例1中GOD酶活力随溶液pH值变化的关系曲线。以剩余最高酶活力为100％，其他条件下的酶活力占最高酶活力的百分数即为该酶在此pH 下的相对酶活力。
图3显示本发明实施例1中GOD酶活力随反应温度变化的关系曲线。以剩余最高酶活力为100％，其他条件下的酶活力占最高酶活力的百分数即为该酶在此温度下的相对酶活力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
葡萄糖氧化酶液体样品由新华扬生物股份有限公司提供，测定其在pH6.0，温度37℃下的葡萄糖氧化酶活力。将液体样品直接用0.1mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液稀释至适当倍数。然后，在试管中依次加入2.5mL邻联茴香胺稀释液、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，振荡均匀。在37℃水浴5min后，测定管加入已稀释至适当倍数的样品酶溶液0.1mL，37℃反应3min后，加入2mol/L的硫酸溶液2mL终止反应，振荡均匀并冷却至室温后，在540nm处用1cm杯测定吸光值。以热失活的酶液做空白对照，最后葡萄糖氧化酶活力通过公式1进行计算：
X＝[(A-A0)×K+C0]×N/T/10 (1)
式中：X—试样中的葡萄糖氧化酶活力，U/mL；
A—酶反应组的吸光度；
A0—空白组的吸光度；
K—标准曲线的斜率；
CO—标准曲线的截距；
N—试样的总稀释倍数；
T—反应时间3min；
10—产生出0.1μg过氧化氢所需的酶量为1个酶活力单位。
同一样品三个平行测定值的相对误差不超过5.0％，三者的平均值为最终的酶活力测定值，重复操作两次。样品酶活力检测结果见表1。
实施例2
葡萄糖氧化酶粉剂样品由武汉鼎国生物技术有限公司提供，标示酶活力范围300～350U/mg，测定其在pH6.0，温度37℃下的葡萄糖氧化酶活力。用千分之一天平 准确称取固体粉剂约1g，置于锥形瓶中，并记录下粉剂的质量。然后加入100mL0.1mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液，摇床振荡20min后静置至分层，再吸取上清液1ml，用0.1mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液稀释至适当倍数。后续操作按照实施例1中所描述的步骤进行。最后葡萄糖氧化酶活力通过公式2进行计算：
X＝[(A-A0)×K+C0]×N/(T×M)/10 (2)
式中：X—试样中的葡萄糖氧化酶活力，U/g；
A—酶反应组的吸光度；
A0—空白组的吸光度；
K—标准曲线的斜率；
CO—标准曲线的截距；
N—试样的总稀释倍数；
T—反应时间3min；
M—试样的质量，g；
10—产生出0.1μg过氧化氢所需的酶量为1个酶活力单位。
同一样品三个平行测定值的相对误差不超过5.0％，三者的平均值为最终的酶活力测定值，重复操作两次。样品酶活力检测结果见表1。
表1 样品酶活力检测结果
注：表中检测的酶活结果均为平均值±标准差(n＝3) 。
Claims (1)
1.一种快速测定葡萄糖氧化酶活力的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)绘制过氧化氢浓度-邻联茴香胺显色剂吸光值标准曲线，先分别吸取过氧化氢标准溶液0.25mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL和0.75mL，分别用磷酸盐缓冲液定容至25mL，配成终浓度分别为24μg/mL～72μg/mL的过氧化氢浓度梯度系列，在试管中依次加入2.5mL邻联茴香胺稀释液、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，混匀后再分别加入上述不同浓度过氧化氢标准溶液各0.1mL，混匀后加入2mL 2mol/L的硫酸溶液，振荡均匀后在540nm处用1cm杯测定吸光值，以吸光值为横坐标，过氧化氢浓度为纵坐标绘制标准曲线；
(2)对待测葡萄糖氧化酶样品进行预处理，以磷酸缓冲液稀释样品，稀释后的样品中葡萄糖氧化酶活力控制在0.8～2.8U/mL之间；
(3)反应时，在试管中依次加入2.5mL邻联茴香胺稀释液、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，振荡均匀后在规定温度水浴5min后，测定管加入已稀释的酶样品溶液0.1mL，在规定温度反应3min后，加入2mol/L的硫酸溶液2mL终止反应，振荡均匀并冷却至室温后，在540nm处用1cm杯测定吸光值，以热失活的酶液做空白对照，利用过氧化氢浓度-吸光值标准曲线计算试验样品中葡萄糖氧化酶活力。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410409560.2A CN104237145B (zh) | 2014-08-19 | 一种快速测定葡萄糖氧化酶活力的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104237145A CN104237145A (zh) | 2014-12-24 |
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