CN104232579B

CN104232579B - 一种恒河猴外周血单核巨噬细胞的培养方法及其应用

Info

Publication number: CN104232579B
Application number: CN201410510022.2A
Authority: CN
Inventors: 桑明; 霍文哲; 刘金彪; 代明; 周立; 高建峰; 杨四军; 刘航
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2014-09-28
Filing date: 2014-09-28
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-09-28
Also published as: CN104232579A

Abstract

本发明涉及恒河猴外周血单核巨噬细胞的培养方法，具体为分离外周血单个核细胞，收集的外周血单个核细胞用PBS重悬、洗涤2次，洗过的细胞经离心回收，每次1200 rpm离心8 min，最后用含2%‑4%猴自体血清、1%青链霉素和1‰HEPES的RPMI 1640培养液重悬，重悬的细胞的密度在3×10⁶个细胞/ml，立即加入到CELLBIND Surface的96孔培养板，0.8×10⁶个细胞/孔，或48孔培养板，3×10⁶个细胞/孔中培养，24h后将未贴壁细胞用RPMI 1640培养液洗弃，之后用含2%‑4%猴自体血清的完全培养基继续培养贴壁的细胞，以后每2~3天换一次培养液，7天后观察细胞形态，判定细胞分化结果。分化培养得到的恒河猴单核巨噬细胞纯度高，具有典型巨噬细胞形态学和免疫学特性。该方法简单、经济、有效。

Description

一种恒河猴外周血单核巨噬细胞的培养方法及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种恒河猴外周血单核巨噬细胞的培养和鉴定方法。

背景技术

巨噬细胞分布于机体的多种组织中，其功能不仅仅限于清除体内垃圾，并且在机体的不同组织和器官中也发挥了监视入侵病原微生物及诱导天然免疫应答等多种生理功能。在机体与病原微生物密切接触的免疫前沿器官内有大量巨噬细胞，如淋巴系统、肺、肠的固有层等。巨噬细胞“常驻”各组织器官中，通过清除凋亡和坏死细胞及外来入侵微生物，发挥其生理平衡和免疫功能(Gordon S,Taylor PR:Monocyte and macrophage heterogeneity.Nature Reviews Immunology[J]2005；5:953-964)。巨噬细胞可引起适度的对抗感染的免疫反应，能通过吞噬和识别病原微生物诱导天然免疫，亦可通过发挥抗原递呈功能激活T细胞，从而引起获得性免疫应答(Peiser L,Gordon S:The function of scavenger receptorsexpressed by macrophages and their role in the regulation of inflammation.Microbesand Infection[J]2001；3:149-159；Peiser L,Mukhopadhyay S,Gordon S:Scavengerreceptors in innate immunity.Current Opinion in Immunology[J]2002；14:123-128；Aderem A:Phagocytosis and the inflammatory response.Journal of InfectiousDiseases[J]2003；187:S340-S345)。

分离培养巨噬细胞对免疫学与病毒学等相关研究十分重要，因此，有必要建立分化培养巨噬细胞的方法。由于组织中的巨噬细胞很难分离和富集，使用外周血单核细胞体外分化培养巨噬细胞，建立体外培养单核细胞来源的巨噬细胞已成为广泛接受的科学手段。尽管已有诸多有关体外分化培养人巨噬细胞的方法学的报道(Plesner A:Increasing the yield of human mononuclear cells and lowserum conditions for in vitro generation of macrophages with m-csf.Journal ofimmunological methods[J]2003；279:287-295；Plesner A,Greenbaum CJ,LernmarkLow serum conditions for in vitro generation of human macrophages withmacrophage colony stimulating factor.Journal of immunological methods[J]2001；249:53-61；Gersuk G,Hiraoka A,Marr KA:Human monocytes differentiateinto macrophages under the influence of human kpb-m15conditioned medium.Journal of immunological methods[J]2005；299:99-106)，但有关体外培养非人灵长类动物单核巨噬细胞的报道却十分有限。鉴于非人灵长类动物，已被广泛用于作为人类疾病的模型来研究，建立体外培养非人灵长类动物原代单核巨噬细胞的方法十分必要。Rozner等在RPMI-1640中加入1％人血清、M-CSF及IL-1β成功使用恒河猴外周血单核细胞分化培养巨噬细胞(Rozner AE,Dambaeva SV,Drenzek JG,Durning M,Golos TG:Generation of macrophages from peripheralblood monocytes in the rhesus monkey.Journal of immunological methods[J]2009；351:36-40)；Sisk等利用恒河猴和短尾猴的外周血，通过在HBSS培养基中加入M-CSF及20％的自体血清，体外分化培养猕猴原代巨噬细胞(Sisk JM,Witwer KW,Tarwater PM,Clements JE:Siv replication is directly downregulated byfour antiviral mirnas.Retrovirology[J]2013；10:95)。尽管这些方法的确能在体外分化培养猴巨噬细胞，但这些方法存在以下缺点：1)需在培养基中加入细胞生长因子，除了大大增加实验的费用外，这些细胞生长因子(巨噬细胞集落刺激因子M-CSF和白细胞介素IL-1β等)在促进单核细胞分化成巨噬细胞的同时，也能激活巨噬细胞，干扰实验结果；2)由于人血清中的多种抗原成分可激活或抑制非人灵长类动物巨噬细胞，因此，在培养基中加入人血清也会直接或间接地影响实验数据；3)尽管将高浓度的自体血清用于体外分化培养单核巨噬细胞没有环境改变的影响，含有能够最大限度的满足细胞生长分化所需要的各种理化因素，但用于试验的非人灵长类动物如猕猴体重仅仅4～5kg,与人类比较个体非常小,全身血容量少，因此需要在保证体外分化培养的巨噬细胞正常生长的前提下降低自体血清的用量。

发明内容

本发明是针对目前体外培养非人灵长类动物外周血单核巨噬细胞存在的问题而做出的，本发明的一个目的在于提供一种用于分离和培养外周血单核巨噬细胞的可重复性方法，使用的RPMI1640培养基中加入低浓度(2％-4％)的自体血清，不加细胞生长因子，能较快且稳定地在体外培养出高纯度的，具有典型巨噬细胞形态学和免疫学特性的恒河猴单核巨噬细胞。

为实现上述目的，本发明提供的体外培养恒河猴外周血单核巨噬细胞的方法，其步骤是：

1、分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)；

2、培养收集的PBMCs：收集的PBMCs用PBS重悬、洗涤2次，洗过的细胞经离心回收(每次1200rpm离心8min)，最后用含2％-4％猴自体血清、1％青链霉素和1‰HEPES的RPMI 1640培养液重悬(重悬的细胞的密度在3×10⁶个细胞/ml)。立即加入到CELLBIND Surface的96孔培养板(0.8×10⁶个细胞/孔)或48孔培养板(3×10⁶个细胞/孔)中培养，24h后将未贴壁细胞用RPMI 1640培养液洗弃，之后用含2％-4％猴自体血清的完全培养基继续培养贴壁的细胞。以后每2～3天换一次培养液，7天后观察细胞形态，判定细胞分化结果；

3、培养细胞鉴定，包括细胞形态学观察、用流式细胞仪检测细胞表面CD14表达水平、细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激后巨噬细胞特异性细胞因子的表达检测；

所述的完全培养基含2％的恒河猴自体血清；

其中细胞形态学观察，将培养第4天和第7天的贴壁细胞直接置于倒置显显微镜下，高倍镜(200x)观察、拍照；

巨噬细胞表面抗原CD14表达水平的检测，采用如下步骤：分化培养第4天和第7天的恒河猴单核巨噬细胞先用PBS洗3遍，加0.25％的胰酶消化5分钟至大部分细胞收缩变圆，加入含2％自体血清的完全培养基终止消化，将细胞吹打悬浮，收集细胞。继续用PBS洗2遍后加50μl PBS重悬，制成单个细胞悬液，并加入CD14-Percp-Cy5.5(BD，USA)抗体2μl，阴性对照管加2μl同型(Isotype)抗体IgG2-Percp-Cy5.5(BD，USA)，4℃避光孵育15分钟后用PBS洗2遍，去除多余抗体后加入固定液(2％多聚甲醛)重悬细胞，用流式细胞仪(BD FACS Verse，USA)检测细胞表面CD14表达水平；

细菌脂多糖LPS刺激后巨噬细胞特异性细胞因子的表达检测，采用如下步骤：细菌脂多糖LPS(10ng/ml或100ng/ml)加入到分化7天的恒河猴单核巨噬细胞培养液中，4h后用Tri-reagent(Molecular Research Center,Cincinnati,USA)提取总RNA用于实时定量RT-PCR检测细胞因子TLR4、IFN-β、IFN-λ3、TNF-α、IL-6、MxA 和GAPDH的mRNA表达水平；

猴免疫缺陷病毒SIV或人-猴嵌合免疫缺陷病毒SHIV感染恒河猴原代巨噬细胞，并产生增殖性复制。使用10³TCID50的病毒(SIVmac251、SIVmac17E-Br和SHIV KU-1)感染上述方法培养的猴巨噬细胞，37℃感染2h，RPMI 1640培养液洗3遍去除残余病毒后，加入含2％猴自体血清的完全培养基继续培养。每天收集细胞培养上清200μl用于提取细胞总RNA(存于-80℃)。提取的RNA经过逆转录PCR得到cDNA产物，再对所得的cDNA进行实时定量PCR反应，测定病毒载量，计算每毫升上清中病毒的拷贝数，证明这些病毒可以在巨噬细胞中扩增，因此，本发明提供的培养方法获得的恒河猴外周血单核巨噬细胞可以应用于治疗或预防HIV药物的筛选。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本研究提供了一种简单、经济、有效地体外培养分化和鉴定恒河猴巨噬细胞的方法。这种方法适于原代恒河猴单核细胞的贴壁和分化，分化出的恒河猴单核巨噬细胞纯度高，且经过7天培养后的细胞具有典型的巨噬细胞形态特征和免疫学特性，此外，我们的方法能避免细胞被活化，降低对实验结果的干扰、步骤少，减少污染的机会，适合于需使用恒河猴单核巨噬细胞的科研工作及治疗或预防HIV药物的筛选。

附图说明

图1为恒河猴外周血单核细胞分化培养第4天和第7天200倍倒置显微镜下观察图，比例尺＝50μm；

A为经过贴壁培养第4天的细胞镜下生长形态；B为经过贴壁培养第7天的细胞镜下生长形态；

图2为恒河猴外周血单核细胞分化培养第4天和第7天细胞表面抗原CD14表达示意图；

A为经过贴壁培养第4天的细胞表面抗原CD14表达；B为经过贴壁培养第7天的细胞表面抗原CD14表达；

图3为贴壁培养第7天，不同浓度胎牛血清和自体血清对恒河猴单核巨噬细胞分化的作用，比例尺＝50μm；

图4为在10ng/ml或100ng/ml LPS刺激的诱导下，分化7天的恒河猴外周血单核巨噬细胞特异性细胞因子表达水平比较图；

A为培养液中未加M-CSF培养分化的恒河猴外周血单核巨噬细胞特异性细胞因子表达水平；B为培养液中加入M-CSF(10ng/ml)培养分化的恒河猴外周血单核巨噬细胞特异性细胞因子表达水平；

图5为猴免疫缺陷病毒SIV或人-猴嵌合免疫缺陷病毒SHIV在猴巨噬细胞中的增殖性复制及细胞病变示意图；

A为SIVmac251、SIVmac17E-Br和SHIV KU-1在培养7天分化良好的恒河猴原代巨噬细胞中复制示意图；B为未感染或感染SIVmac17E-Br的恒河猴原代巨噬细胞示意图，比例尺＝50μm；

图6为聚肌胞苷酸(PolyI:C)抑制猴免疫缺陷病毒(SIV)或人-猴嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)在恒河猴巨噬细胞中的复制示意图；

具体实施方式

现结合以下实施例来更加详细地描述本发明的用于非人灵长类动物外周血单核巨噬细胞的培养和鉴定方法。提供这些实施例的目的仅在于示例性地说明本发明，不能将其理解为是对本发明的范围和实质的限制。

本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

相关溶液如下：

磷酸盐缓冲液/PBS pH 7.4

淋巴细胞分离液/Ficoll(GE Healthcare)

细菌脂多糖/LPS(InvivoGen公司)

完全培养基(体积百分比)：96.9％RPMI 1640培养液(Gibco，11875-093)；2％恒河猴自体血清；1％青链霉素(10⁴U/ml)；1‰HEPES/4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(Gibco，15630-080，10mol/L)

【实施例1】恒河猴外周血单核巨噬细胞分离培养

用氯胺酮对健康成年(4-5岁)中国恒河猴进行肌注麻醉(10mg/kg)，分别用含肝素钠抗凝的真空采血管采集静脉血5-10ml和无抗凝剂真空采血管采集全血5ml。抗凝血用于PBMCs的分离，非抗凝血自凝后用于猴血清的分离。将抗凝全血(5-10ml)用磷酸盐缓冲液(PBS)对倍稀释，然后缓慢加入到稀释血液1/2体积的淋巴细胞分离液(Ficoll)上层，22℃1800rpm/min离心30分钟，吸出介于血浆稀释液与Ficoll之间的PBMCs层。收集的细胞用等体积PBS重悬、洗涤2次，洗过的细胞经离心回收(每次1200rpm离心8分钟)，最后用含2％猴自体血清、1％青链霉素和1‰HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)的RPMI1640培养液重悬(重悬的细胞的密度在3×10⁶个细胞/ml)。分离出的恒河猴PBMCs立即加入CELLBIND Surface的96孔培养板(0.8×10⁶个细胞/孔)或48孔培养板(3×10⁶个细胞/孔)中培养。24h后将未贴壁细胞用RPMI 1640培养液洗弃，之后用含2％猴自体血清的完全培养基继续培养贴壁的细胞。将培养第4天和第7天的贴壁细胞直接置于倒置显微镜下，高倍镜(200x)观察、拍照，观察细胞形态，判定细胞分化结果。分化良好的恒河猴单核巨噬细胞贴壁能力强，占据培养板板底的大部分区域，细胞的胞体形态多样，多数呈长梭形，或不规则形，边缘多不整齐，有的可见伪足。细胞核形态呈圆或椭圆，亦有肾形，位于细胞中央或偏一侧，胞质多少不一，有时可见空泡或包涵体(如图1)。

【实施例2】流式细胞术鉴定培养的恒河猴外周血单核巨噬细胞

分化培养第4天和第7天的恒河猴单核巨噬细胞先用PBS洗3遍，加0.25％的胰酶消化5分钟至大部分细胞收缩变圆，加入含2％自体猴血清的完全培养基终止消化，将细胞吹打悬浮，收集细胞。继续用PBS洗2遍后加50μl PBS重悬，制成单个细胞悬液，并加入CD14-Percp-Cy5.5(BD，USA)抗体2μl，阴性对照管加2μl同型(Isotype)抗体IgG2-Percp-Cy5.5(BD，USA)，4℃避光孵育15分钟后用PBS洗2遍，去除多余抗体后加入固定液(2％多聚甲醛)重悬细胞，用流式细胞仪(BD FACS Verse，USA)检测细胞表面CD14表达水平。经检测，经过4天和7天分化培养得到的恒河猴单核巨噬细胞表面CD14的阳性表达率分别为91.7±2.33％和96.4±1.93％(如图2)。

【实施例3】不同浓度猴自体血清或胎牛血清对恒河猴单核巨噬细胞分化的作用

用含2％，4％，8％和10％猴自体血清或胎牛血清的RPMI 1640培养置于96孔(0.8×10⁶个细胞/孔)或48孔(3×10⁶个细胞/孔)培养板中的猴PBMCs，24h后将未贴壁细胞洗弃，继续培养7天后拍照。如图3所示(图中所有图比例尺一致)，对恒河猴单核巨噬细胞分化的作用，猴自体血清优于胎牛血清，低比例自体血清优于高比例血清。随着血清比例降低，贴壁细胞增多，且分化的巨噬细胞形态一致性高。含2％猴自体血清的RPMI 1640培养条件下，大多数(>85％)单核细胞能贴壁，并分化为巨噬细胞。相比而言，含2％-10％的胎牛血清或高浓度(4％-10％)猴自体血清的RPMI 1640培养基培养下，猴单核细胞的贴壁和分化较差(如图3)。分化良好的巨噬细胞贴壁能力强，占据板底大部分区域。胞体形态多样，多数呈长梭形，或不规则形，边缘多不整齐，有的可见伪足(图1A、B)，细胞核形态呈圆或椭圆，亦有肾形，位于细胞中央或偏一侧，胞质多少不一，有时可见空泡或包涵体。

【实施例4】不同浓度LPS刺激的诱导下，比较培养液中未加M-CSF和加入M-CSF分化7天的恒河猴外周血单核巨噬细胞特异性细胞因子mRNA表达水平

细菌脂多糖LPS(10ng/ml或100ng/ml)加入到分化7天的恒河猴单核巨噬细胞培养液中(此培养液中未加M-CSF)，4h后用Tri-reagent(MolecularResearch Center,Cincinnati,USA)提取总RNA用于实时定量RT-PCR检测细胞因子TLR4、IFN-β、IFN-λ3、TNF-α、IL-6、MxA和GAPDH的mRNA表达水平。使用NanoDrop2000(Thermo，USA)测定细胞总RNA浓度，取1μg总RNA用于mRNA表达水平检测。使用逆转录试剂盒(Promega，USA)进行逆转录，采用随机引物37℃扩增1h，然后95℃5分钟终止反应，反应产物4℃保存。实时定量PCR用SYBR green Supermix(Bio-Rad，USA)试剂盒。反应条件为95℃1min，95℃5s→60℃10s，40个循环。实时定量PCR引物序列如表1所示。Ct值相对GAPDH进行均一化，采用2^-ΔΔCt方法计算mRNA的表达水平。如图4A所示，分化培养得到的恒河猴单核巨噬细胞对LPS敏感。在LPS刺激的诱导下，恒河猴单核巨噬细胞的TLR4、干扰素(IFN-β,IFN-λ₃)、炎性因子(TNF-α,IL-6)和干扰素诱导因子(MxA)表达显著升高，与未用LPS刺激细胞相比差异均有统计学意义，且表达水平与LPS诱导剂量成正相关。

培养液中加入M-CSF(10ng/ml)培养分化的巨噬细胞的部分信号通路被激活，LPS诱导的细胞因子的表达相对较低(如图4B)，与未加M-CSF培养的细胞相比差异均有统计学意义。

表1实时定量PCR所用引物序列

【实施例5】猴免疫缺陷病毒SIV/人-猴嵌合免疫缺陷病毒SHIV感染恒河猴巨噬细胞，复制情况观察

将分化良好的恒河猴单核巨噬细胞培养基更换为无血清培养液培养3h。使用10³TCID50的病毒(SIVmac251、SIVmac17E-Br和SHIV KU-1)感染细胞，37℃感染2h，RPMI 1640培养液洗3遍去除残余病毒后，加入含2％猴自体血清的完全培养基继续培养。每天收集细胞培养上清200μl用于提取细胞总RNA(存于-80℃)。提取的RNA经过逆转录PCR得到cDNA产物，再对所得的cDNA进行实时定量PCR反应，测定病毒载量，计算每毫升上清中病毒的拷贝数。取200μl细胞培养上清中提取的病毒RNA用于病毒载量测定，逆转录和实时定量PCR方法同上。SIV GAG引物序列如表1所示。实时定量PCR中同时扩增SIVGAG标准品建立标准曲线，计算每毫升上清中SIV GAG的拷贝数。SIVmac251、SIVmac17E-Br和SHIV KU-1均能在含2％猴自体血清培养的猴巨噬细胞中复制，可产生感染性病毒，感染4天后，病毒载量(SIV GAG拷贝数)可达10⁶/ml以上(如图5A)。SIV感染本方法培养的巨噬细胞，可造成明显细胞病变。与未感染的细胞相比，感染10天后的猴巨噬细胞变大，形成大量空泡样多核细胞(图5B)。

【实施例6】聚肌胞苷酸PolyI:C抑制SIV或SHIV在猴巨噬细胞中的复制

该实例可作为抗艾滋药物筛选细胞模型。用PolyI:C(1或10μg/ml)处理猴巨噬细胞12小时后，SIVmac251或SHIV KU-1感染猴巨噬细胞，感染3小时后洗去病毒，加入新鲜培养液继续培养，7天后收集细胞培养上清，用实施例5中的方法检测SIV GAG的拷贝数。如图6，感染前PolyI:C处理细胞，病毒的复制被显著抑制。

采用PolyI:C后处理的方法也可显著抑制病毒的复制(如图6)。具体来说，SIVmac251或SHIV KU-1感染猴巨噬细胞，感染3小时后洗去病毒，加入新鲜培养液继续培养，72小时后用PolyI:C(1或10μg/ml)处理猴巨噬细胞12小时，加入新鲜培养液继续培养7天，收集细胞培养上清，用实施例5中的方法检测SIV GAG的拷贝数。因此，待检测药物的抗艾滋病毒活性检测可利用该细胞模型进行。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 一种恒河猴外周血单核巨噬细胞的培养方法及其应用

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Claims

1.一种恒河猴外周血单核巨噬细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）；

B、培养收集的PBMCs：收集的PBMCs用PBS重悬、洗涤2次，洗过的细胞经离心回收，每次1200 rpm离心8 min，最后用含2%-4%猴自体血清、1%青链霉素和1‰HEPES的RPMI 1640培养液重悬，重悬的细胞的密度在3×10⁶个细胞/ml，立即加入到CELLBIND Surface的96孔培养板，0.8×10⁶个细胞/孔，或48孔培养板，3×10⁶个细胞/孔中培养，24h后将未贴壁细胞用RPMI 1640培养液洗弃，之后用含2%猴自体血清的完全培养基继续培养贴壁的细胞，以后每2~3天换一次培养液，7天后观察细胞形态，判定细胞分化结果，所述完全培养基按体积百分比由96.9% 的Gibco公司货号为11875-093的RPMI 1640培养液、2% 恒河猴自体血清、1% 的浓度为10⁴U/ml青链霉素、1‰的Gibco公司货号为15630-080，浓度为10 mol/L的HEPES/4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸组成；

C、培养细胞鉴定：包括细胞形态学观察、用流式细胞仪检测细胞表面CD14表达水平、细菌脂多糖刺激后巨噬细胞特异性细胞因子的表达检测。

2.权利要求1所述方法制备的恒河猴外周血单核巨噬细胞应用于治疗或预防HIV药物的筛选。