CN104232560B

CN104232560B - 养殖微藻的方法及生产油脂的方法

Info

Publication number: CN104232560B
Application number: CN201310229352.XA
Authority: CN
Inventors: 荣峻峰; 周旭华; 朱俊英; 黄绪耕; 程琳
Original assignee: Sinopec Research Institute of Petroleum Processing; China Petroleum and Chemical Corp
Current assignee: Sinopec Research Institute of Petroleum Processing; China Petroleum and Chemical Corp
Priority date: 2013-06-09
Filing date: 2013-06-09
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2033-06-09
Also published as: CN104232560A

Abstract

本发明涉及养殖微藻的方法及生产油脂的方法，其中的养殖方法包括：接种后的藻液中，以氮原子计的氮肥浓度大于30mmol/L，光自养培养＞10天收获。本发明的方法可用于大规模、低成本、高效率地养殖微藻，不但能保证微藻的快速生长，而且能使微藻有较高的油脂含量。

Description

养殖微藻的方法及生产油脂的方法

技术领域

本发明涉及养殖微藻的方法及生产油脂的方法。

背景技术

微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，它是由阳光驱动的细胞工厂，通过微藻细胞高效的光合作用，吸收CO₂，将光能转化为脂肪或淀粉等碳水化合物的化学能，并放出O₂。利用微藻生产生物能源与化学品可以同时达到“替代化石能源、减少CO₂排放、净化废气与污水”三个目的。“微藻生物技术”的优势在于以下几个方面：①微藻是光合效率最高的原始植物，与农作物相比，单位面积的产率高出数十倍。微藻也是自然界中生长最为迅速的一种植物，通常在24h内，微藻所含生物质可以翻倍，在其“指数生长期”内其生物量翻倍时间可以缩短到3.5h。②微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，因此微藻可以不同农作物争地、争水。③产油率高，微藻干细胞的含油量可高达70％，微藻没有高等植物的根茎叶等细胞分化，在缺氮等条件下，某些单细胞微藻可大量积累油脂，是最有前景的产油生物。④微藻的培养需要利用工业废气中的CO₂，缓解温室气体的排放，也可以吸收工业废气中的氮Ox，减少环境的污染。⑤生产微藻生物柴油的同时，还可以生产相当数量的微藻生物质，还可进一步获得蛋白质、多糖、脂肪酸等高价值产品。

微藻可分为原核藻类和真核藻类，原核藻类以蓝藻为主，含叶绿素a、不形成细胞器、能进行光合作用，细胞中蛋白质含量高，可达干重的70%，脂肪含量低，为5%左右；真核藻类种类比较多，是主要的生物燃料藻种的来源。常见的微藻主要归于以下八个门类：硅藻门（Bacillariophyta）、绿藻门（Chlorophyta）、金藻门（Chrysophyta）、蓝藻门（Cyanophyta）、甲藻门（Pyrroptata）、红藻门（Rhodophyta）、隐藻门（Cryptophyta）和黄藻门（Xanthophyta）。其中，硅藻门、绿藻门和金藻门是最具潜力的生物柴油藻种来源。

微藻高效规模化养殖技术，即通过研究开发微藻规模化养殖的新设备与新工艺来高效、低成本地获得微藻生物量，是微藻生物技术的核心之一。影响微藻生长的因素很多，主要有光、营养盐、CO₂、pH、温度和O₂等，这些因素在微藻规模培养过程中所产生的影响尤为突出。研究表明，微藻的生长及脂类物质的含量与光照、氮、磷和温度等培养条件密切相关。不同藻类生长和积累脂类物质的培养条件不尽相同，应该根据不同的藻种确定最佳培养条件，提高生长速率和油脂含量。微藻的养殖需要有充足的阳光、CO₂、水和无机盐，温度通常要控制在20～30℃，养殖介质必须能够提供组成微藻细胞的无机元素，如氮、P、K、Si、Fe等。

目前对于大部分微藻尤其是绿藻而言，提高其细胞油脂含量的主要培养方法是条件胁迫，尤其是缺氮胁迫,即将藻细胞接种于缺氮环境的培养体系中以改变体内代谢的途径，更多地合成脂肪而非蛋白质或糖类，从而达到提高脂肪含量的目的。然而限制氮源会影响细胞的正常分裂和生长，使细胞活力下降，导致生物量急剧下降，最后总的脂肪产量并未提升。现有的方法是，先在氮源充足的条件下快速积累微藻生物量，然后再将微藻从富氮的培养基中分离出来再放入缺氮培养基中，进行条件胁迫以提高脂肪含量。这种方法不适合大规模工业生产，因为将微藻从富氮的培养基中分离出来再放入缺氮培养基中过程繁琐且能耗极高。

如何高效率、低成本地采收微藻一直是微藻生物技术中的难题，主要原因是：微藻个体微小（通常小于20微米）且藻液浓度很低（在采收浓度下，通常不到藻液质量的3‰）。现有的微藻采收方法主要是絮凝法、过滤法、离心法和沉降法。其中，絮凝法、过滤法和离心法的工艺较复杂、成本较高。沉降法具有操作简便、节省能源等优点，如CN101748068公开了一种微藻收获方法，该方法利用重力学原理，针对高密度连续培养光合生物反应系统进行不完全收获，对于浓度大于10⁷个每毫升的藻液（相当于OD₆₈₀=1.0），沉降率一般可达60%以上，沉降后分离出的上层清液返回光反应系统继续利用，对于不容易沉降的微藻，如小球藻，需要使用pH调节剂将藻液pH调节至强碱性，使微藻产生自絮凝以加快沉降。该方法仍存在以下不足：①调节pH强碱性使其自絮凝，会导致成本的增加并影响微藻的活力，不利于循环利用藻种；②某些情况下，轻微的扰动就会使微藻重新分散，不利于分离沉降后的清液。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种养殖微藻的方法，既能保证微藻的快速生长，又能大幅提高其油脂含量。本发明的目的之二是提供一种生产油脂的方法，该方法在实现目的一的基础上，进一步解决微藻沉降采收过程中存在的问题，从而能以更低成本获得油脂。

一种养殖微藻的方法，接种后的藻液中，以氮原子计的氮肥浓度大于30mmol/L，光自养培养＞10天收获。

优选的情况下，接种后的藻液中，以氮原子计的氮肥浓度为40～200mmol/L。

接种的方式既可以将藻种与培养基混合，也可以将含有藻种的藻液与培养基混合。“接种后的氮肥浓度”是指按混合比例计算的平均氮肥浓度。

所述的氮肥优选为硝酸盐或尿素。

所述的微藻优选属于绿藻门，更优选为小球藻或栅藻，进一步优选为小球藻。

根据本发明的方法，在培养微藻的过程中还需要维持微藻正常生长所需要的其它必要条件，如提供合适的光照、温度，以及其它微藻生长所必须的营养成份，调控藻液中的CO₂、溶解氧、水、无机盐、必要营养物质、pH值等在合适的范围内，使其适宜微藻的快速生长与繁殖。这些技术是本领域技术人员所熟知的。

一般地，培养温度为15～40℃，优选为25～35℃；光强为2000～200000勒克斯，优选为5000～150000勒克斯；在微藻培养过程中通入CO₂，并使藻液pH值在6～10的范围内。

不同种类的微藻对营养成分的质和量的需求会有不同。根据本发明的方法，藻液中除氮肥外的其它营养成分可根据具体的微藻，参照现有培养基的配方进行配制。微藻对营养盐的需求也有很多共同点，因此一些培养基的配方可应用于多种微藻的养殖，如BG11培养基被广泛用于绿藻的养殖。本发明中，当所述微藻为绿藻时，可按照BG11培养基配制藻液中除氮肥外的其它营养成分。

本发明中，微藻的培养可以采用分级扩大的方式，比如藻种经过1L、5L、50L、500L…逐级放大培养。接种的起始浓度一般可以控制在藻液光密度值（OD值）为0.2～1的范围内。养殖时间通常在10天以上，优选在15天以上。

一种生产油脂的方法，包括微藻养殖、微藻采收、微藻油脂的分离和提取，其中的微藻养殖采用上述的方法。

优选的情况下，微藻采收步骤包括：当藻液的光密度值OD₆₈₀>1.6且依赖微藻自身生长使藻液pH值≥7时，在温度≤40℃的条件下，沉降24小时以上；然后在20℃～40℃下，收获下层沉降的藻液，上层OD₆₈₀≤0.6的藻液返回微藻养殖步骤循环利用。

试验发现，虽然采收时的藻液浓度很低（不到藻液质量的3‰），但藻液浓度仍对微藻沉降有明显的影响，当藻液的光密度值OD₆₈₀＜1.6时，微藻十分难于沉降。根据本发明的方法，需将藻液的光密度值OD₆₈₀控制在>1.6，优选＞2，更优选＞3.5，进一步优选＞7。

试验发现，当藻液呈酸性时，微藻十分难于沉降。根据本发明的方法，需要将藻液的pH值控制在≥7。本发明不需要将藻液pH调节至强碱性，只需要依赖微藻自身生长导致的藻液pH值上升使其处于非酸性状态即可。优选的条件下，依赖微藻自身生长使藻液pH值为7～9时，再进行沉降。

优选的情况下，当藻液的光密度值OD₆₈₀>3.5且依赖微藻自身生长使藻液pH值为7～9时，再进行采收；更优选的情况下，当藻液的光密度值OD₆₈₀>7且依赖微藻自身生长使藻液pH值为7～9时，再进行采收。

沉降深度可依据具体的微藻和现有技术确定，一般为50mm～1000mm，较佳的深度为50～120mm。

试验发现，当温度<20℃时，轻微的藻液扰动，就会使沉降的微藻重新分散，因此需要将收获温度控制在20℃～40℃。

优选的情况下，返回微藻养殖步骤的藻液的OD₆₈₀为0.4～0.6。

在不违背本发明之目的且不相互矛盾的情况下，本发明中的各技术特征可任意组合，其同样属于本发明公开的内容。

本领域的技术人员熟知，采用氮饥渴的技术可以提高微藻的油脂含量，然而，该方法不适合大规模工业生产，因为将微藻从富氮的培养基中分离出来再放入缺氮培养基中过程繁琐且能耗极高。此外，由于氮源的限制使细胞的分裂、生长受到限制，细胞活力下降而导致生物量急剧下降，最后总的脂肪产量并未提升。传统的BG11培养基被广泛用于绿藻的养殖，而传统的BG11培养基采用硝酸钠为氮源，且藻液中的N含量约为18mmol/L，采用传统的BG11培养基可以使绿藻较好的生长，但是绿藻的油脂含量较低。经过研究，完全出乎意料地发现，采用超出通常用量的高浓度氮源，不但可以使微藻具有较高的油脂含量，而且使微藻具有较高的生长速率。本发明的技术方案揭示：当藻液的N含量远高于正常藻液的N含量时，具体地说当N含量大于30mmol/L时，微藻不但可以快速的生长，而且所得到的微藻油脂含量更高。此外，较高浓度的氮源（尿素）还大大降低了病虫害的发生。

本发明提供的方法在规模养殖中具有较大的优势，操作简便易行，大量氮源（尿素）的存在有助于病虫害的防治。更为重要的是，采用本发明的方案，既能保证微藻的正常生长，又能使微藻积累较多的油脂。

附图说明

附图1是微藻养殖生长曲线。

具体实施方式

下面以实施例详细说明本发明，但并不因此构成对本发明的限制。

藻液光密度值（OD₆₈₀值）测定：

光密度值用分光光度计测定，以蒸馏水作对照，测定藻液在波长680nm处的吸光值，作为微藻养殖浓度的指标。

微藻含油量测定：

采用索氏提取器测定，首先将适量藻液离心、干燥，仔细研磨成细粉一确保微藻有效破壁，称量，用滤纸包裹放入提取器中，加入甲醇和三氯甲烷，在90℃下抽提6小时，将两种混合溶剂烘干，恒重称取遗留下的物质，测得含油量的公式：含油％=抽提物重（G）/干粉重（G）100％。

微藻培养基的配制：

按表1配方配制水溶液（表1中的微量元素A5按表2配方配制），使用时稀释成1000倍的培养基。

表1

表2

藻液沉降性能的测定

藻液光密度值在沉降前后的变化记为沉降率，作为衡量藻液的沉降性能的指标，测量位置在液面下4cm。记沉降前的光密度值为OD₁，沉降后的光密度值为OD₂。

沉降率=（OD₂-OD₁）/OD₂×100%

实施例1

采用两级扩大的基本工艺流程进行小球藻的培养。一级接种培养：1L玻璃三角瓶装入约700ml培养基，培养基采用BG11培养基（表1），一级接种培养基采用尿素为氮肥，接种后藻液的N含量为40mmol/L，控制光照和温度适宜，通入2%（v/v）的CO₂/空气混合气进行通气培养，混合气经过过滤膜过滤净化。检测藻液的OD值，当藻液OD值达到5以上时可以进行二级扩大培养。二级扩大培养：扩大培养在5L玻璃三角瓶中进行，装入3～4L培养基（培养基母液经高压、高温灭菌或煮沸消毒，培养用水采用过滤消毒的自来水），接种后藻液的N含量为40mmol/L,按最终藻液OD值为0.3～0.6接入上述一级培养的藻种进行培养。以自然光为光源，控制光强度在6000～100000勒克斯的范围内，室温培养。通入2%（v/v）的CO₂/空气混合气进行通气培养，混合气经过滤膜过滤净化。连续培养14天后收获。生长曲线见图1。

实施例2

小球藻的养殖，方法同实例1，不同之处在于接种后藻液的N含量为66mmolg/L。生长曲线见图1。

实施例3

小球藻的养殖，方法同实例1，不同之处在于接种后藻液的N含量为100mmol/L。

实施例4

小球藻的养殖，方法同实例1，不同之处在于以硝酸钠为氮肥，接种后藻液的N含量为150mmol/L。

实施例5

栅藻的养殖，方法同实例1，不同之处采用硝酸钠作为N肥，在于接种后藻液的N含量为66mmol/L。

比较例1

小球藻的养殖，方法同实例1，不同之处在于培养基以硝酸钠为氮肥，接种后藻液的N含量18mmol/L。生长曲线见图1。

比较例2

栅藻的养殖，方法同实例1，不同之处在于接种后藻液的N含量为10mmol/L。

比较例3

小球藻的养殖，方法同实例1，不同之处在于连续培养8天后收获。

实施例6

将小球藻藻液置于烧杯中，藻液OD₆₈₀为2.367，pH=7，环境温度为25℃，避光沉降24h，上清液OD₆₈₀为0.250，沉降率达到89%，48h后沉降率达到90%。

实施例7

将小球藻藻液置于烧杯中，藻液OD₆₈₀为7.290，pH=8，环境温度为30℃，避光沉降24h，上清液OD₆₈₀为0.507，沉降率达到93%，48h后沉降率达到93.4%。收集上清液，将其与BG11培养基以1：1比例混合放于养殖系统中继续培养，14天后OD₆₈₀为6.521。

实施例8

将小球藻藻液置于烧杯中，藻液OD₆₈₀为3.521，pH=9，环境温度为35℃，避光沉降24h，上清液OD₆₈₀为0.247，沉降率达到93%。

比较例4

将小球藻藻液置于烧杯中，藻液OD₆₈₀为1.575，pH=8，环境温度为25℃，避光沉降24h，上清液OD₆₈₀为1.114，沉降率仅达到29%，48h后沉降率只达到66%。

比较例5

将小球藻藻液置于烧杯中，藻液OD₆₈₀为3.928，pH=6，环境温度为25℃，避光沉降48h，上清液OD₆₈₀为1.288，沉降率为67%。

比较例6

将小球藻藻液置于丝扣试剂瓶中，藻液OD₆₈₀为9.2，pH=8，45℃水浴恒温2h，避光沉降24h，上清液OD₆₈₀为0.94，将清液回收，以1:1的比例添加BG11培养基继续培养，24h后OD₆₈₀为0.4，48h后为0.1。

表3试验结果

	实例1	实例2	实例3	实例4	实例5	比较1	比较2	比较3
									油含量/m%	25.8	29.6	25.5	26.8	23.6	21.6	13.03	18.9

表3的试验结果表明，当培养基中氮肥浓度高于正常值且光自养培养10天以上时，小球藻和栅藻的油脂含量均比正常添加量有显著提高，且微藻生长速率较高。

Claims

1.一种生产油脂的方法，包括微藻养殖、微藻采收、微藻油脂的分离和提取，其中的微藻养殖采用以下的方法：所述的微藻为栅藻，接种后的藻液中，以氮原子计的氮肥浓度为40～66mmol/L，所述的氮肥为硝酸盐或尿素；按照BG11培养基配制藻液中除氮肥外的其它营养成分；培养温度为15～40℃，光强为2000～200000勒克斯，在微藻培养过程中通入CO₂，并使藻液pH值在6～10的范围内；光自养培养10天以上收获。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻养殖中，培养温度为25～35℃，光强为5000～150000勒克斯。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻养殖中，培养15天以上收获。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，微藻采收步骤包括：当藻液的光密度值OD₆₈₀>1.6且依赖微藻自身生长使藻液pH值≥7时，在温度≤40℃的条件下，沉降24小时以上；然后在20℃～40℃下，收获下层沉降的藻液，上层OD₆₈₀≤0.6的藻液返回微藻养殖步骤循环利用。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，返回微藻养殖步骤的藻液的OD₆₈₀为0.4～0.6。

6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，当藻液的光密度值OD₆₈₀>3.5且依赖微藻自身生长使藻液pH值为7～9时，再进行采收。