CN104232521A - 用于降解乙草胺的细菌、筛选方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种用于降解乙草胺的细菌、筛选方法及其应用。该用于降解乙草胺的细菌，该细菌为YCA-1(Cupriavidus oxalaticus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCC No.9127。本发明提供的这种YCA-1，其可以乙草胺作为氮源并进行增殖，因此，其可以作为降解乙草胺的微生物并进行利用，通过实验证明，在相应的培养条件下，YCA-1可以使乙草胺浓度为50-150mg/L基础盐培养基中的乙草胺在5天之内完全降解。在具体使用的过程中，可将大量扩培的YCA-1制成以其为活性成分的降解剂并修复含有乙草胺农药的土壤。

Description

用于降解乙草胺的细菌、筛选方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种用于降解乙草胺的细菌、筛选方法及其应用。

背景技术

乙草胺，英文通用名为Acetochlor，由美国Monsanto公司1971年首先开发成功，分子式为C₁₄H₂₀ClNO₂，其分子量为269.5。乙草胺纯品为无色液体，原药为淡黄色、棕色或者紫色透明液体，50％乙草胺乳油为蓝紫色油状物，不易光解，不易挥发，沸点大于200℃，密度为1.11g/mL(30℃)，在强酸强碱下分解，溶于甲醇、丙酮等多种有机溶剂。

研究表明，乙草胺可以作为芽前除草剂，其作用机制主要是通过干扰植物体内核酸代谢及蛋白质合成，使幼芽和幼根停止生长；因此，乙草胺是一种环境内分泌干扰物。所谓“环境内分泌干扰物”是指能通过干扰激素功能，引起个体可逆性或不可逆性生物学效应的环境激素，因此通常又被称作“干扰内分泌化合物”。

另外，相关研究表明，乙草胺可引起爪蟾腹部水肿，面部畸形，脊柱、尾巴弯曲等；因此，Monsanto公司在刚开始推出乙草胺作为农药时，由于被怀疑有致癌作用，美国环保局担心其会通过地下水进入饮水系统并对人类造成安全隐患，因此，其应用一直被受到限制，直到1994年才予以登记进入市场。我国是从20世纪90年代初才开始将乙草胺产业化，现在已有多家企业进行生产，年生产能力达到5万吨。

在农业生产中，除草剂等化学农药的施用一直是保证粮食作物增产稳产有效的手段之一。尤其是随着乙草胺除草剂的大量使用，使得土壤中残存的乙草胺逐渐累积，进而造成严重的土壤污染；另外，乙草胺农药生产过程中产生的废水废气也通过排放以及流失等方式积累到土壤中，进一步的加剧了土壤的污染。但是，乙草胺的自然降解耗时较长，显然不能有效解决土壤中乙草胺逐渐累积的现状。

目前，微生物为农田中农药残留(包括乙草胺)的主要降解者，逐渐成为农药污染土壤生物修复的热点。因此，提供一种能够降解乙草胺的微生物，并将其应用到乙草胺农药土壤的修复中是本领域技术人员亟待解决的一个技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于降解乙草胺的细菌，以解决上述的技术问题。本发明的另一个目的在于提供一种上述用于降解乙草胺的细菌的筛选方法。

在本发明的实施例中提供了用于降解乙草胺的细菌，该细菌为YCA-1(Cupriavidus oxalaticus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCC No.9127。此外，细菌的保藏时间为：2014年05月06日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，YCA-1为该细菌的简称，Cupriavidus oxalaticus为其拉丁名。

该菌为革兰氏阳性，菌落圆形、乳白色，可利用的碳源包括葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、苹果酸和柠檬酸。本发明提供的这种YCA-1，其可以乙草胺作为氮源并进行增殖，因此，其可以作为降解乙草胺的微生物并进行利用，通过实验证明，在相应的培养条件下，YCA-1可以使乙草胺浓度为50-150mg/L基础盐培养基中的乙草胺在5天之内完全降解。在具体使用的过程中，可将大量扩培的YCA-1制成以其为活性成分的降解剂并修复含有乙草胺农药的土壤。

本发明实施例还提供了一种上述用于降解乙草胺的细菌的筛选方法，包括以下步骤：

1)、将供试泥样置于含有乙草胺的基础盐液体培养基中，摇床培养后得到第一混合菌液；

2)、将所述第一混合菌液接种到另一含有乙草胺的基础盐液体培养基中，进行传代培养，得到第二混合菌液；

3)、将所述第二混合菌液涂布在含有乙草胺的无机盐固体培养基中，进行暗培养至平板上长出单菌落后分别收集，并利用LB培养基划线纯化，得到多个纯化后的单菌落；

4)、将多个所述纯化后的单菌落接种到含有乙草胺的基础盐液体培养基中，得到多个单菌菌液；

5)、将多个所述单菌菌液分别利用含有乙草胺的基础盐液体培养基摇床培养后，分别测定基础盐液体培养基中乙草胺的残留浓度，并筛选出使得乙草胺浓度降低的单菌菌液，得到细菌YCA-1。

可选的，在步骤1)、步骤2)、步骤4)和步骤5)中：

所述基础盐液体培养基，按照重量份数计，包括：

氯化钠0.8-1.2份、磷酸二氢钠1.2-1.8份、磷酸氢二钠0.3-0.7份、硫酸镁0.1-0.3份、硫酸亚铁0.01-0.03份、氯化钙0.02-0.06份、柠檬酸钠0.3-0.7份、水1000份；

且在所述含有乙草胺的基础盐液体培养基中，乙草胺含量为48-52mg/L。

可选的，在步骤1)中：

所述供试泥样取自乙草胺生产厂的废水排水道；且所述供试泥样与所述含有乙草胺的基础盐液体培养基质量比为1:20。

可选的，在步骤1)中：所述摇床培养的温度为30℃、转速为200转/分钟、时间为7天。

可选的，在步骤2)中：所述接种的接种量为5％。

可选的，在步骤3)中：所述暗培养的温度为30℃，时间为2天。

可选的，在步骤3)中：所述LB培养基，按照重量份数计，包括：蛋白胨8-12份、酵母膏4-6份、氯化钠8-12份、琼脂18-22份、水1000份。

可选的，在步骤5)中：所述摇床培养的温度为30℃、转速为200转/分钟、时间为5-7天。

上述的用于降解乙草胺的细菌在作为乙草胺降解剂的活性成分，并在降解乙草胺中的应用。

由于YCA-1可以乙草胺为氮源进行繁殖，因此，以其为活性成分并制成相应的降解剂后可修复含有大量乙草胺的土壤。

本发明提供的这种筛选方法，采用了富集分离的培养方式从供试泥样中筛选了出能以乙草胺为唯一氮源生长的菌群，具有针对性强，筛选结果理想的效果，以期为周期短、见效快的含乙草胺的土壤修复提供保障。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1提供的用于降解乙草胺的细菌的筛选流程示意图；

图2为本发明实施例2中不同的培养温度下，细菌YCA-1的测定结果图；

图3为本发明实施例2中不同pH的培养基下，细菌YCA-1的测定结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本发明中的具体实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

在本发明的实施例中提供了用于降解乙草胺的细菌，该细菌为YCA-1(Cupriavidus oxalaticus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCC No.9127。该菌为革兰氏阳性，菌落圆形、乳白色，可利用的碳源包括葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、苹果酸和柠檬酸。本发明提供的这种YCA-1，其可以乙草胺作为氮源并进行增殖，因此，其可以作为降解乙草胺的微生物并进行利用，通过实验证明，在相应的培养条件下，YCA-1可以使乙草胺浓度为50-150mg/L基础盐培养基中的乙草胺在5天之内完全降解。在具体使用的过程中，可将大量扩培的YCA-1制成以其为活性成分的降解剂并修复含有乙草胺农药的土壤。

接下来，本发明举出了上述用于降解乙草胺的细菌的筛选方法的具体实施例：

实施例1

本实施例提供的用于降解乙草胺的细菌的筛选方法以下步骤：

步骤101：将供试泥样置于含有乙草胺的基础盐液体培养基中，摇床培养后得到第一混合菌液；

该步骤为将供试泥样与含有乙草胺的基础盐液体培养基混合的步骤，由于在该培养基中，其仅仅包含了乙草胺作为微生物的氮源(或碳源)，所以，在培养的过程中，一切能够分解并利用乙草胺的微生物则可以进行正常的增殖，而不能利用乙草胺的为生活则会死亡，进而初步筛选出了第一混合菌液。

步骤102：将所述第一混合菌液接种到另一含有乙草胺的基础盐液体培养基中，进行传代培养，得到第二混合菌液；

第一混合菌液在增殖的过程中，其可能会大量的消耗培养基的养分(乙草胺或各种无机盐)，因此，得到第一混合菌液之后，需要将其再次接种，并进行传代培养，获得进一步筛选的第二混合菌液。

步骤103：将所述第二混合菌液涂布在含有乙草胺的无机盐固体培养基中，进行暗培养至平板上长出单菌落后分别收集，并利用LB培养基划线纯化，得到多个纯化后的单菌落；

基于上述同样的理由，获得第二混合菌液之后，为了获得纯的单菌落，需对其利用固体培养基进行培养，在培养的过程中，使用含有乙草胺的无机盐固体培养基暗培养，这样，不同的微生物会长出不同的菌落，然后分别挑选多个单菌落，将其利用LB培养基划线纯化，得到多个纯化后的单菌落。

步骤104：将多个所述纯化后的单菌落接种到含有乙草胺的基础盐液体培养基中，得到多个单菌菌液；

纯化后的单菌落接种到含有乙草胺的基础盐液体培养基中，保证其正常繁殖，并且可得到多个单菌菌液，得到的多个单菌菌液通过后续的培养以及测定其对含有乙草胺的基础盐液体培养基的降解效果进而可分离出所需的细菌。

步骤105：将多个所述单菌菌液分别利用含有乙草胺的基础盐液体培养基摇床培养后，分别测定基础盐液体培养基中乙草胺的残留浓度，并筛选出使得乙草胺浓度降低的单菌菌液，得到细菌YCA-1。

在步骤105中，将单菌菌液分别摇床培养的过程中，可能会消耗培养基中的乙草胺，因此，通过分别测定基础盐液体培养基中乙草胺的残留浓度，并筛选出使得乙草胺浓度降低的单菌菌液，进而获得目标细菌。在培养的过程中也会获得一些降解效果不理想的微生物，一般而言，其可能是实验误差或者微生物本身耐性较强等原因导致，因此，排出筛选范围，而获得细菌YCA-1其可以使乙草胺浓度为50-150mg/L基础盐培养基中的乙草胺在5天之内完全降解，降解效果非常显著。

为了使得本发明上述实施例的用于降解乙草胺的细菌得到更好的应用，更加有效应用到生物修复的领域中，本发明还在上述实施例的基础之上提供了实施例2，实施例2在上述实施例1的基础之上进行了进一步的限定和增加，现做详细的阐述和解释：

实施例2

在本实施例中，用于降解乙草胺的细菌的筛选方法包括以下步骤：

S1：将供试泥样置于含有乙草胺的基础盐液体培养基中，摇床培养后得到第一混合菌液；

具体的，为了能够找到能够耐受乙草胺，并含有大量被筛选的细菌的供试样本，进而获得较高的筛选效果；在本实施例中，选用了草胺生产厂的废水排水道作为取样地点，由于该地点乙草胺的浓度很大，所以能够存活的微生物其可能会较大程度地利用乙草胺，因此，取自乙草胺生产厂的废水排水道使得供试样本的目的性更强，进一步的助于分离筛选的顺利进行。

另外，通过对基础盐液体培养基的组份进行优选配比，保证微生物的正常繁殖，优选的，所述基础盐液体培养基，按照重量份数计，包括：氯化钠0.8-1.2份、磷酸二氢钠1.2-1.8份、磷酸氢二钠0.3-0.7份、硫酸镁0.1-0.3份、硫酸亚铁0.01-0.03份、氯化钙0.02-0.06份、柠檬酸钠0.3-0.7份、水1000份。更优选的，氯化钠1份、磷酸二氢钠1.5份、磷酸氢二钠0.5份、硫酸镁0.2份、硫酸亚铁0.01份、氯化钙0.04份、柠檬酸钠0.4份、水1000份。更具体的，氯化钠1.0g，磷酸二氢钠1.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸亚铁0.01g，氯化钙0.04g，柠檬酸钠0.5g，水1L。

而且，所述含有乙草胺的基础盐液体培养基中，乙草胺含量为48-52mg/L，优选50mg/L。将供试泥样与含有乙草胺的基础盐液体培养基混合时，所述含有乙草胺的基础盐液体培养基质量比为1:20。

此外，在摇床培养的过程中，为了通过优化实验设计，获得最佳的培养条件：所述摇床培养的温度为30℃、转速为200转/分钟、时间为7天；在该条件下，细菌繁殖迅速，大量的微生物可呈现对数期生长，为后续的传代培养提供了保障。

S2：将所述第一混合菌液接种到另一含有乙草胺的基础盐液体培养基中，进行传代培养，得到第二混合菌液；

第一混合菌液中的微生物其生理活性旺盛，因此，需要对其接种量进行有效控制，接种量太大则会导致后续的营养不能保证其繁殖所需，而接种量太小则会影响其筛选效果。由于目前还未见该菌的报道，因此，对其接种量的控制(5％)是通过大量的探索和研究获得的；另外，该步骤中所用的含有乙草胺的基础盐液体培养基与S1中的一致。

S3：将所述第二混合菌液涂布在含有乙草胺的无机盐固体培养基中，进行暗培养至平板上长出单菌落后分别收集，并利用LB培养基划线纯化，得到多个纯化后的单菌落；

具体的，在该步骤中，为了实现较好的纯化效果，对在涂布之前，对第二混合菌液进行梯度稀释。另外，在该步骤中，按培养的温度为30℃，时间为2天。温度稍高或稍低以及培养时间超过两天则会出现微生物死亡的现象。因此，培养的温度严格控制在30℃，时间为2天。

此外，为了保证单菌落的快速繁殖，获得活性较高的单菌落，优选的，所述LB培养基，按照重量份数计，包括：蛋白胨8-12份、酵母膏4-6份、氯化钠8-12份、琼脂18-22份、水1000份；更优选的，蛋白胨10份、酵母膏5份、氯化钠10份、琼脂20份、水1000份；具体的，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，氯化钠10.0g，琼脂20.0g，水1L。

S4：将多个所述纯化后的单菌落接种到含有乙草胺的基础盐液体培养基中，得到多个单菌菌液；

该步骤与步骤104一致，在此不作赘述。

S5：将多个所述单菌菌液分别利用含有乙草胺的基础盐液体培养基摇床培养后，分别测定基础盐液体培养基中乙草胺的残留浓度，并筛选出使得乙草胺浓度降低的单菌菌液，得到细菌YCA-1。

每个单菌菌液(纯菌菌液)用含有乙草胺的基础盐液体培养基摇床培养后，测定基础盐液体培养基中乙草胺的残留浓度，并筛选出使得乙草胺浓度降低的单菌菌液，以期获得细菌YCA-1。

另外，为了保证测量的准确性，每个单菌菌液(纯菌菌液)用含有乙草胺的基础盐液体培养基摇床培养后，获得一次待测菌液，将一次待测菌液接种(接种量与步骤S2一致，均为5％)到另一新的含有乙草胺的基础盐液体培养基，摇床培养，并测定其降解效果。

另外，在该步骤中，为了获得优选的培养条件，本发明对单菌菌液(纯菌菌液)利用含有乙草胺的基础盐液体培养基摇床培养过程中的条件进行了优选。

具体的，通过将该步骤中获得的细菌YCA-1设定不同的温度，并对含有乙草胺的基础盐液体培养基的pH设定不同梯度，测定相应条件下，细菌YCA-1的OD600，进而优选出其培养参数。

通过图2可以看出，细菌YCA-1在不同培养温度生长情况不同，温度为25℃时，OD600可以达到0.153左右；温度为35℃时，OD600可以达到0.214，但其在30℃条件下的OD600可以达到0.301，生长最好，因此，该步骤中的摇床培养过程中的温度优选30℃。

通过图3示出了细菌YCA-1在不同的pH条件(具体的含有乙草胺的基础盐液体培养基)下生长情况，由图3可知，菌株的最适pH明显为7，但其可耐受pH范围是6-8。

因此，在该步骤中，摇床培养的温度为30℃、转速为200转/分钟、时间为5-7天；而且，含有乙草胺的基础盐液体培养基的pH为7(本实施例上述步骤中对基础盐液体培养基配方的设定以及乙草胺的浓度即可保证其pH为7)。

另外，本实施例还对获得的细菌YCA-1的降解效果进行了验证，通过将含有乙草胺的基础盐液体培养基设定不同的浓度，检测培养基中的乙草胺的残留量，进而证实其具有高效降解乙草胺的功效。具体数据请参考表1：

表1细菌YCA-1对不同浓度乙草胺培养液的降解效果

通过表1可以看出，细菌YCA-1在不同浓度乙草胺培养基中对乙草胺具有降解效果；乙草胺培养基包括50至750mg/L总共4个梯度。当初始乙草胺浓度为50或150mg/L时，该菌在5天之内能完全从培养基中除去乙草胺(100％)。

综上所述，本发明提供的这种细菌YCA-1，其可用于降解乙草胺的细菌，进一步的，通过大量的扩培养，并以其为活性成分制成相应的降解制剂，并用于含有乙草胺土壤的修复中。

此外，本发明对提取获得的细菌YCA-1，进行了16s rDNA基因序列测序，其序列如SEQ ID NO：1所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于降解乙草胺的细菌，其特征在于，该细菌为YCA-1(Cupriavidus oxalaticus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCC No.9127。

2.一种根据权利要求1所述的用于降解乙草胺的细菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、将供试泥样置于含有乙草胺的基础盐液体培养基中，摇床培养后得到第一混合菌液；

2)、将所述第一混合菌液接种到另一含有乙草胺的基础盐液体培养基中，进行传代培养，得到第二混合菌液；

3)、将所述第二混合菌液涂布在含有乙草胺的无机盐固体培养基中，进行暗培养至平板上长出单菌落后分别收集，并利用LB培养基划线纯化，得到多个纯化后的单菌落；

4)、将多个所述纯化后的单菌落接种到含有乙草胺的基础盐液体培养基中，得到多个单菌菌液；

5)、将多个所述单菌菌液分别利用含有乙草胺的基础盐液体培养基摇床培养后，分别测定基础盐液体培养基中乙草胺的残留浓度，并筛选出使得乙草胺浓度降低的单菌菌液，得到细菌YCA-1。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，在步骤1)、步骤2)、步骤4)和步骤5)中：

所述基础盐液体培养基，按照重量份数计，包括：

氯化钠0.8-1.2份、磷酸二氢钠1.2-1.8份、磷酸氢二钠0.3-0.7份、硫酸镁0.1-0.3份、硫酸亚铁0.01-0.03份、氯化钙0.02-0.06份、柠檬酸钠0.3-0.7份、水1000份；

且在所述含有乙草胺的基础盐液体培养基中，乙草胺含量为48-52mg/L。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，在步骤1)中：

所述供试泥样取自乙草胺生产厂的废水排水道；且所述供试泥样与所述含有乙草胺的基础盐液体培养基质量比为1:20。

5.根据权利要求2-4任一项所述的筛选方法，其特征在于，在步骤1)中：

所述摇床培养的温度为30℃、转速为200转/分钟、时间为7天。

6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，在步骤2)中：

所述接种的接种量为5％。

7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，在步骤3)中：

所述暗培养的温度为30℃，时间为2天。

8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，在步骤3)中：

所述LB培养基，按照重量份数计，包括：

蛋白胨8-12份、酵母膏4-6份、氯化钠8-12份、琼脂18-22份、水1000份。

9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，在步骤5)中：

所述摇床培养的温度为30℃、转速为200转/分钟、时间为5-7天。

10.权利要求1所述的用于降解乙草胺的细菌在作为乙草胺降解剂的活性成分，并在降解乙草胺中的应用。