CN104231114A - 一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂，为侧链含有疏水单元和荧光单元的乙二醇壳聚糖高分子。该细胞膜荧光成像试剂，基于多位点锚定技术，其生物相容性好、合成简单、成本低廉、染色时间短且不易被细胞内吞，可以用做细胞膜特异性示踪标记探针。

Description

一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于多位点锚定技术的细胞膜特异性荧光成像试剂，还涉及该试剂的制备方法。

背景技术

细胞膜不仅在结构上将细胞个体包裹形成稳定的内部环境，而且在功能上参与了物质运输、能量传递、信号转导、囊泡运输、细胞生长、分化、粘附、转移、应激、胞吞、胞吐、凋亡、坏死、自噬等很多重要生物学过程，因此关于细胞膜的研究越来越受到重视。采用荧光染料对细胞膜进行标记和示踪的荧光成像技术是研究细胞膜结构和功能的有力手段。

然而，目前市售的亲脂性荧光染料如DiD家族(DiO、DiI、DiA、DiR等)和FM家族(FM 4-64、FM 2-10等)存在很多的不足。如DiD家族为长链亲脂性二烷基碳菁类染料，与细胞膜接触后，这种染料会在细胞质中逐步扩散，将整个细胞染色。由于该类染料为小分子，它们很容易被内吞并使细胞内部各种细胞器的膜结构均被染色，因此失去了细胞膜成像的特异性。FM染料家族虽然通过增加极性头部的方式一定程度上提高了染料分子在细胞膜上的稳定性，但染色10min以上仍然会造成内吞。

为了解决荧光染料内吞的问题，目前也有很多科研人员开发了一些新型染料用于细胞膜成像，其中主要是通过在疏水锚定基团上增加亲水性头部的方式进行设计。如把极性头部设计成四个精氨酸多肽，通过带正电的方式增加在膜上的亲和力(ACS Appl.Mater.Interfaces 2014,6,8971–8975.)。也有报道把极性头部设计成聚甘油树状大分子，不仅提高了水溶性，防止了内吞，而且还可以耐受不同的pH环境和不同离子强度(Bioconjugate Chem.2013,24,153–158.)。尽管这些新型细胞膜特异性染料比市售的染料效果好，但都是利用一条或两条疏水尾巴作为细胞膜锚定单元，通过改善亲水性头部的方式进行设计。由于它们都是小分子荧光染料，所以很容易被细胞内吞(尤其染色时间长时，内吞更明显)，并进一步导致这种单一位点锚定的方式很难有技术突破。加之其合成复杂、成本高等因素，难以大规模应用。因此，非常有必要开发一种新型的细胞膜特异性成像试剂。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种染色时间短且不易被细胞内吞的细胞膜成像试剂。

技术方案：本发明提供的一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂，为侧链含有疏水单元和荧光单元的乙二醇壳聚糖。乙二醇壳聚糖在任何pH值的水溶液中均有很好的溶解性，并且具有低免疫原性、生物相容性、生物可降解性、生物活性等特点。疏水单元可通过疏水相互作用多位点地插入细胞膜，并把高分子和荧光分子锚定到细胞膜上；同时，乙二醇壳聚糖把疏水单元和荧光单元以共价方式交联起来，防止其被细胞内吞；荧光分子实现荧光成像。

作为优选，所述疏水单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在5％到30％；所述荧光单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在1％到5％。

作为另一种优选，所述乙二醇壳聚糖(glycol chitosan)的分子量在10000以上，优选10000-100000。

作为另一种优选，所述疏水单元包括胆固醇、磷脂分子、烷烃和维生素E；所述疏水单元通过聚乙二醇高分子链接到乙二醇壳聚糖的氨基上；所述其中聚乙二醇高分子分子量在500以上。

作为另一种优选，所述荧光单元包括异硫氰酸荧光素或磺基罗丹明B磺酰氯，其通过与氨基反应接枝在乙二醇壳聚糖表面。

本发明还提供了上述一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)取疏水单元分子和乙二醇壳聚糖分别溶于PBS缓冲液中，混匀，室温反应；

产物透析、冻干；

(2)产物和荧光单元分子室温反应，产物透析、冻干，即得。

有益效果：本发明提供的细胞膜荧光成像试剂，基于多位点锚定技术，其生物相容性好、合成简单、成本低廉、染色时间短且不易被细胞内吞，可以用做细胞膜特异性示踪标记探针。

具体而言，本发明相对于现有技术，具有以下突出的优势：

(1)该试剂的组成成分如乙二醇壳聚糖、PEG等的选用都具备生物相容性，而且疏水单元分子更是动物细胞的固有成分，因此该试剂毒性低，100μg/mL以下，MTT试验显示对细胞活力几乎无影响(如图2所示)。

(2)该试剂所用的乙二醇壳聚糖水溶性好，同时PEG的引入，也进一步增加了成像试剂整体的水溶性，可以方便地直接用于细胞膜成像。

(3)本发明采用了多位点锚定技术，高分子上只要有一个胆固醇分子插入细胞膜后，就会促进同一高分子骨架上其他锚定单元陆续插膜，因此该成像试剂染色所需时间短，在50μg/mL时，5min即可染色。不仅提高了染色效率，而且由于染色时间的降低同时降低了被细胞内吞的可能性。

(4)本发明各疏水锚定单元和成像单元均以共价键的方式连接在壳聚糖高分子骨架上，与细胞膜结合后可以形成包被状网络结构，使其不易被细胞内吞，因此增加了在细胞膜上的保持时间，提高了细胞膜染色的特异性。实验显示，100μg/mL条件下，细胞染色1小时也没有明显内吞现象发生。

(5)该试剂的乙二醇壳聚糖上剩余的氨基带有的正电荷，会与带负电荷的细胞膜发生静电相互作用，增加与细胞膜的亲和力，因而进一步促进了染料在细胞膜上的保持时间。

(6)本发明所提出的多位点锚定方案可以作为一个应用平台，通过改变不同的锚定单元以及荧光单元而开发出各种功能和各种颜色的探针，可以应用于更加复杂和特异的细胞膜结构和功能研究。

附图说明

图1为基于多位点锚定的荧光成像试剂的分子结构图；

图2为本发明荧光试剂对HepG2肝癌细胞生存活力的影响评价试验(MTT试验)；

图3(a)、3(b)、3(c)分别为本发明荧光试剂对AT-II正常肺上皮细胞细胞膜染色效果图。

具体实施方式

实施例1

多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂chitosan-30％cholesterol-2％FITC的设计、合成和细胞膜荧光染色方法如下：

试剂的设计：所述成像试剂的分子结构图见图1，该试剂以乙二醇壳聚糖(glycolchitosan)高分子为骨架，侧链含有30％的聚乙二醇2000-胆固醇(PEG2000-cholesterol)疏水单元和2％的FITC荧光单元。所述的乙二醇壳聚糖高分子，具有良好的生物相容性和水溶性，其分子量需大于10000。所述的胆固醇疏水单元，通过PEG2000链接到壳聚糖氨基上，PEG链段可以增加水溶性。所述的FITC荧光分子，经过与氨基反应直接链接到壳聚糖高分子上，FITC荧光分子实现荧光成像。胆固醇疏水单元可通过疏水相互作用多位点地插入细胞膜，并把壳聚糖高分子和荧光分子锚定到细胞膜上。同时，壳聚糖高分子把各个疏水侧链单元和荧光分子单元联系在一起，当与细胞膜结合后可以形成包被状网络结构，防止其被细胞内吞。

试剂的合成，包括以下步骤：以乙二醇壳聚糖高分子(glycol chitosan)、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇2000-胆固醇(NHS-PEG2000-cholesterol)和FITC为原料，合成锚定单元占壳聚糖重复单元数的百分比为30％，荧光分子单元占壳聚糖重复单元数的百分比为2％的成像试剂chitosan-30％cholesterol-2％FITC，具体为：分别称取5mgNHS-PEG2000-cholesterol和1.34mg glycol chitosan(聚合度：大于400；分子量约80000)并分别溶于PBS缓冲液(pH 7.4,50mM)，再将两者混合后，磁子搅拌室温反应4h；反应结束后于截留分子量为10k的透析袋中透析3天进行纯化，之后冻干制成中间产品壳聚糖-胆固醇复合物；然后，称取1mg壳聚糖-胆固醇复合物并溶于PBS缓冲液(pH＝7.8,50mM)，加入8.1μg FITC(取自8.1μL预先配置的1mg/mL的FITC溶液，溶剂为DMF)室温反应过夜；反应结束后于截留分子量为10k的透析袋中透析3天除去未反应的游离FITC荧光分子；最后将冷冻干燥制得的成像试剂chitosan-30％cholesterol-2％FITC置于-20℃中冷冻保存。

细胞膜染色成像实验：所述成像试剂chitosan-30％cholesterol-2％FITC溶于PBS制成4mg/mL的储存液，再将储存液用DMEM完全培养基(DMEM不完全培养基+10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素双抗)稀释成终浓度为100μg/mL的工作液。AT-II正常肺上皮细胞于共聚焦培养板上培养12小时后，先吸去培养基，PBS洗两次，加入100μg/mL工作液放回二氧化碳培养箱染色5min。染色结束后PBS洗2-3次，重新加入DMEM完全培养基并将细胞置于激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

染色结果如图3(a)所示，可见细胞膜被均匀的标记上绿色荧光，且细胞内部没有亮点，说明没有发生染料的内吞，实现了细胞膜特异性荧光成像。

实施例2

本实施例的实施方法与实施例1中的方法一致，只是选用的乙二醇壳聚糖高分子分子量约100000，胆固醇锚定单元占壳聚糖重复单元数的百分比由30％变为10％，合成的成像试剂组成为chitosan-10％cholesterol-2％FITC，染色后成像效果如图3(b)所示。

实施例3

本实施例的实施方法与实施例1中的方法一致，只是选用的乙二醇壳聚糖高分子分子量约10000，染色时间由5min延长至1小时，染色后成像效果如图3(c)所示。由图可知，虽然染色时间延长，但并没有引起明显的染料的内吞。

实施例4

本实施例的实施方法与实施例1中的方法一致，只是胆固醇锚定单元占壳聚糖重复单元数的百分比由30％变为5％，荧光分子FITC其占高分子重复单元数的百分比改为1％，合成的成像试剂组成为chitosan-5％cholesterol-1％FITC。

实施例5

本实施例的实施方法与实施例1中的方法一致，只是荧光分子FITC其占高分子重复单元数的百分比改为5％，合成的成像试剂组成为chitosan-30％cholesterol-5％FITC。

实施例6

本实施例的实施方法与实施例4中的方法基本一致，只是将NHS-PEG2000-cholesterol分子中的胆固醇疏水单元依次改成磷脂分子(1,2-肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺，DMPE)、烷烃(十八个碳原子，C18)和维生素E等疏水侧链，合成的成像试剂组成为chitosan-5％DMPE-1％FITC，chitosan-5％C18-1％FITC或者chitosan-5％Vitamine E-1％FITC。

实施例7

本实施例的实施方法与实施例4中的方法基本一致，只是将实施例1中的荧光分子FITC替换成为磺基罗丹明B磺酰氯，合成的成像试剂组成为chitosan-5％cholesterol-1％Rodamine B。

Claims (6)

1.一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：该试剂为侧链含有疏水单元和荧光单元的乙二醇壳聚糖高分子。

2.根据权利要求1所述的一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所述疏水单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在5％到30％；所述荧光单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在1％到5％。

3.根据权利要求1所述的一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所述乙二醇壳聚糖的分子量在10000以上，优选10000-100000。

4.根据权利要求1所述的一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所述疏水单元包括胆固醇、磷脂分子、烷烃和维生素E；所述疏水单元通过聚乙二醇高分子链接到乙二醇壳聚糖的氨基上；所述其中聚乙二醇高分子分子量在500以上。

5.根据权利要求1所述的一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所述荧光单元包括异硫氰酸荧光素或磺基罗丹明B磺酰氯，其通过与氨基反应接枝在乙二醇壳聚糖表面。

6.一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)取疏水单元分子和乙二醇壳聚糖分别溶于PBS缓冲液中，混匀，室温反应；产物透析、冻干；

(2)产物和荧光单元分子室温反应，产物透析、冻干，即得。