CN104221858A

CN104221858A - 一种用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基及其成活方法

Info

Publication number: CN104221858A
Application number: CN201410439111.2A
Authority: CN
Inventors: 耿兴敏; 吴影倩; 王良桂; 徐雁南
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing moisten Ecological Agriculture Development Co., Ltd.
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-08-29
Also published as: CN104221858B

Abstract

本发明公开了一种用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基及其成活方法，该培养基的基本培养基为WPM，并添加有15~60g/L蔗糖、0~80mg/LGA₃、0~2.0mg/LIAA、0~10mg/L2ip。本发明用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基及其成或方法，针对中国野生杜鹃杂交幼胚萌发率的特点，以大量杂交组合的杂交胚为试验材料，成功利用组培方法研究创造出适宜野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养，并建立起有效的野生杜鹃杂交胚的成活方法，提高了野生杜鹃杂交胚的萌发率，具有很好的实用性和较好的工业应用前景。

Description

一种用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基及其成活方法

技术领域

本发明属于植物繁育技术领域，具体涉及一种用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基及其成活方法。

背景技术

杜鹃(Rhododendron L.)是杜鹃花科杜鹃属植物的总称，是我国传统十大名花之一，被誉为“花中西施”。杜鹃不仅有很高的观赏价值，还具有很高的药用、食用价值。全世界约有960种杜鹃花属植物，我国野生杜鹃花资源非常丰富，约有杜鹃花542种，是世界杜鹃花分布中心，但是大多优良野生杜鹃仍然隐匿于山间，我国的杜鹃花园艺栽培品种总数不到300种，杂交育种研究也远远落后于其他国家。中国现有授权保护的杜鹃花园艺品种多由芽变选种获得，仅有少数是通过杂交育种得来，利用本国资源培育新品种对于中国杜鹃花品种开发极为重要。杜鹃远缘杂交同时存在受精前、后障碍，受精后障碍主要表现为胚珠停止发育，种子不能发芽和后代白化苗等情况。受精后障碍的克服，可通过未成熟种子的培养来进行胚拯救，提高种子的萌发率及成苗率。

Ureshino(URESHINO,K.,I.MIYAJIMA and M.AKABANE.Effectivenes s of three-way crossing for the breeding of yellow-flowered evergreen azalea[J].Euphytica.1998,140(2)：113–118.)等以Anderson为基本培养基对常绿杜鹃和日本落叶黄花杜鹃的杂交胚进行了胚拯救。Anderson(MICHISHITA AYAN O,KENJI URESHINO AND IKUO MIYAJIMA.Shortening the period from cr ossing to the seedling stage through ovule culture of interspecific crosses of A zalea(Rhododendron spp.)[J].Journal of the Japanese Society for Horticultur al Science.2001,70(1):54-59)、WPM(EECKHAUT TOM,ELLENl DE KE YSER,VAN HUYLENBROECK J,et al.Application of embryo rescue after i nterspecific crosses in the genus Rhododendron[J].Plant Cell Tiss Organ Cult.2007,89(1):29–35.)等培养基在杜鹃杂交胚拯救中也有所应用。但针对杜鹃不同杂交组合，最适培养基类型的研究还鲜见报道，尤其是国内有关杜鹃杂交胚的组培技术还未见报道。仅刘燕(刘燕,王济红,陈训等.大白杜鹃种子胚组织培养研究[J].贵州农业科学,2010,38(12)：30-33.)等以1/4MS为基本培养基，对大白花杜鹃(R.decorum)的种子胚进行了组培配方的探讨。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基，对杂交胚进行胚拯救，提高萌发率。本发明的另一目的是提供一种野生杜鹃杂交胚的成活方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基，基本培养基为WPM，并添加有15～60g/L蔗糖、0～80mg/L GA₃、0～2.0mg/L IAA、0～10mg/L 2ip；其中，GA₃、IAA、2ip三者的浓度不同时为0。

所述的GA₃浓度为50-80mg/L，所述的IAA浓度为0.5mg/L，无添加2ip。

所述的野生杜鹃杂交胚为映山红×云锦杜鹃的杂交胚，添加的蔗糖浓度为15g/L。

所述的野生杜鹃杂交胚为马银花×云锦杜鹃杂交胚，添加的蔗糖浓度为30g/L或60g/L。

所述的野生杜鹃杂交胚为马银花×云锦杜鹃杂交胚，在WPM中添加有20mg/L GA₃、0.5mg/L IAA、2mg/L 2ip。

一种野生杜鹃杂交胚的成活方法，包括以下步骤：

1)以南京地区的映山红、锦绣杜鹃和马银花为母本，自交的同时，与采自庐山的云锦杜鹃和采自昆明植物园的映山红、白花杜鹃、窄叶杜鹃和薄皮杜鹃进行杂交授粉；授粉3个月后，采集的蒴果；

2)采集的蒴果，用75％乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，再用10％NaClO消毒15min，无菌水冲洗5遍后剥胚，对杂交幼胚进行培养；

3)采用成活培养基对杂交幼胚进行培养，光照12h/d，光照强度1600lx，温度25±0.5℃；培养80天后幼胚萌发；所述的成活培养基的基本培养基为WPM，添加8g/L琼脂，pH值5.0，并额外添加有15～60g/L蔗糖、0～80mg/L GA₃、0～2.0mg/L IAA、0～10mg/L 2ip；其中，GA₃、IAA、2ip三者的浓度不同时为0。

有益效果：与现有技术相比，本发明的用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基及其成或方法，针对中国野生杜鹃杂交幼胚萌发率的特点，以大量杂交组合的杂交胚为试验材料，成功利用组培方法研究创造出适宜野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养，并建立起有效的野生杜鹃杂交胚的成活方法，提高了野生杜鹃杂交胚的萌发率，具有很好的实用性和较好的工业应用前景。

附图说明

图1是不同激素浓度对杂交胚萌发影响的复合极差图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

以下实施例中所使用的试验材料为：2012年3月底或4月初杜鹃花期，以南京地区栽培的的映山红(R.simsii)、锦绣杜鹃(R.pulchrum)和马银花(R.ovatum)为母本，自交的同时，与采自庐山的云锦杜鹃(R.fortunei)和采自昆明植物园的映山红(R.simsii)、白花杜鹃(R.mucronatum)、窄叶杜鹃(R.araiophyllum)和薄皮杜鹃(R.taronense)进行杂交授粉。授粉3个月后，采集的蒴果为试验材料。

实施例1

采集蒴果，用75％乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，再用10％NaClO消毒15min，无菌水冲洗5遍后剥胚，对杂交幼胚进行培养。

1)采用MS，1/4MS，WPM，改良的Anderson4种不同培养基对杂交幼胚进行培养，培养基中含50mg/L GA₃，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH值调整为5.0，光照12h/d，光照强度1600lx，温度25±0.5℃。培养80天后统计幼胚萌发率。结果如表1所示。

表1不同组合杂交胚在不同基本培养基上萌发率的多重比较

注：同一列内不同小写字母表示在P＜5％水平上有显著性差异。

综合表1数据可以看出，大多数杂交组合的杂交胚在WPM培养基中萌发较好，且整体生长状态较好，其次是在MS培养中，适宜的组合数仅次于WPM培养基。因此以下实验都以WPM为基本培养基。

2)以WPM为基本培养基对杂交幼胚进行培养，蔗糖浓度梯度为15、30、45、60g/L，添加50mg/L GA₃，8g/L琼脂，pH值调整为5.0，光照12h/d，光照强度1600lx，温度25±0.5℃。培养80天后统计幼胚萌发率。结果如表2所示。

表2.不同的蔗糖浓度对杂交胚萌发率的影响

注：映山红×云锦杜鹃杂交2个月后采收杂交胚，马银花×云锦杜鹃杂交3个月后采收杂交胚。

从表2的数据可以看出，映山红×云锦杜鹃的杂交胚在各种蔗糖浓度的培养基中都有萌发，并且蔗糖浓度越低，杂交胚萌发率越高。数据分析结果显示，添加15g/L蔗糖的萌发率(72.2％)显著高于其它蔗糖浓度。马银花×云锦杜鹃杂交胚在各种蔗糖浓度都有萌发，添加30g/L和60g/L蔗糖的萌发率(均为12.5％)显著高于15g/L和45g/L蔗糖的。

3)以WPM为基本培养基对杂交幼胚进行培养，添加蔗糖30g/L，琼脂8g/L。对GA₃、IAA和2ip进行3因素4水平的正交实验设计，其中以GA₃浓度梯度为0、20、50、80mg/L；IAA浓度梯度为0、0.5、1.0、2.0mg/L；2ip浓度梯度为0、2、5、10mg/L。pH值调整为5.0，光照12h/d，光照强度1600lx，温度25±0.5℃。培养80天后统计幼胚萌发率。结果如表3所示。

表3.不同的激素浓度和配比对不同杂交胚萌发率的影响

注：同一列内不同字母表示在P＜5％水平上有显著差异

从表3的结果可以看出，映山红×云锦杜鹃的2个月胚龄的杂交胚，除编号10的培养基外，在其它各种配方培养基中均有萌发。马银花×云锦杜鹃的3个月胚龄的杂交胚在各培养基中都有萌发。通过极差分析，本试验三个因素对映山红×云锦杜鹃、马银花×云锦杜鹃的杂交胚萌发率的影响都依次为2ip>GA₃>IAA。

根据表3结果得到的复合极差直观图(图1)可知，对于3个月胚龄马银花×云锦杜鹃杂交胚的萌发率，虽然其最佳因素组合(GA₃0mg/L+IAA 0.5mg/L+2ip0mg/L)，与本正交试验结果中最佳组合(GA₃20mg/L+IAA 0.5mg/L+2ip 2mg/L)不一致，但通过数据多重分析，各激素的添加对马银花×云锦杜鹃杂交胚的影响并不显著。另一方面，根据试验观察，适当激素的添加可以有杂交胚生长健壮，因此推荐试验结果中GA₃20mg/L+IAA 0.5mg/L+2ip 2mg/L配方，用于马银花×云锦杜鹃杂交胚的培养。

对于2个月胚龄映山红×云锦杜鹃杂交胚的萌发率，其最佳因素组合为GA₃50mg/L+IAA 0.5mg/L+2ip 0mg/L。与本正交试验结果中，如表3所示，杂交胚在GA₃50mg/L+IAA 2mg/L+2ip 0mg/L(试验编号15)和GA₃80mg/L+IAA0.5mg/L+2ip 0mg/L(试验编号8)两种配方中萌发率最高，但在配方15中，杂交胚形成愈伤组织，并很快褐化，因此杂交胚在配方8(GA₃80mg/L+IAA0.5mg/L+2ip 0mg/L)中的萌发最好，并且与极差分析最佳组合(GA₃50mg/L+IAA0.5mg/L+2ip 0mg/L)基本吻合，并且多重比较分析结果表明50mg/L和80mg/L浓度的GA₃对杂交胚的萌发影响不显著。因此本实验最佳培养基配方GA₃ 50-80mg/L+IAA 0.5mg/L。

Claims

1.一种用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基，其特征在于：基本培养基为WPM，并添加有15~60g/L蔗糖、0~80 mg/L GA₃ 、0~2.0 mg/L IAA、0~10 mg/L 2ip；其中，GA₃ 、IAA、2ip三者的浓度不同时为0。

2.根据权利要求1所述的用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基，其特征在于：所述的GA₃浓度为 50-80mg/L，所述的IAA浓度为0.5mg/L，无添加2ip。

3.根据权利要求1或2所述的用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基，其特征在于：所述的野生杜鹃杂交胚为映山红×云锦杜鹃的杂交胚，添加的蔗糖浓度为15 g/L。

4.根据权利要求1或2所述的用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基，其特征在于：所述的野生杜鹃杂交胚为马银花×云锦杜鹃杂交胚，添加的蔗糖浓度为30g/L或60g/L。

5.根据权利要求1所述的用于野生杜鹃杂交胚的成活培养的培养基，其特征在于：所述的野生杜鹃杂交胚为马银花×云锦杜鹃杂交胚，在WPM中添加有20mg/L GA₃、0.5mg/L IAA 、2mg/L 2ip。

6.一种野生杜鹃杂交胚的成活方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以南京地区的映山红、锦绣杜鹃和马银花为母本，自交的同时，与采自庐山的云锦杜鹃和采自昆明植物园的映山红、白花杜鹃、窄叶杜鹃和薄皮杜鹃进行杂交授粉；授粉3个月后，采集的蒴果；

2）采集的蒴果，用75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，再用10%NaClO消毒15min，无菌水冲洗5遍后剥胚，对杂交幼胚进行培养；

3）采用成活培养基对杂交幼胚进行培养，光照12h/d，光照强度1600lx，温度25 0.5℃；培养80天后幼胚萌发；所述的成活培养基的基本培养基为WPM，添加8g/L琼脂，pH值5.0，并额外添加有15~60g/L蔗糖、0~80 mg/L GA₃ 、0~2.0 mg/L IAA、0~10 mg/L 2ip；其中，GA₃ 、IAA、2ip三者的浓度不同时为0。