CN104212871A - 一种卷烟滤嘴水浸提液Ames试验阳性对照设置方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种卷烟滤嘴水浸提液Ames试验阳性对照设置方法。该方法为：（1）选取相同数量的待测样品组卷烟滤嘴和用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴；（2）配制浓度为10-20mg/mL的直接黑38水溶液；（3）在用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴上均匀喷洒直接黑38水溶液，待其自然干燥后备用；（4）用相同的方法对相同数量的阳性对照组滤嘴和待测样品组滤嘴进行浸提；（5）将得到的水浸提液进行Ames试验。通过该方法设置的阳性对照，可以验证卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的Ames试验是否可靠。
Description
技术领域
本发明属于烟草技术领域，具体涉及一种对卷烟滤嘴水浸提液进行Ames试验时的阳性对照设置方法。
背景技术
沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)，建立于1975年，是一种快速检测化合物致突变性的方法。鼠伤寒沙门菌的组氨酸缺陷型（his-）菌株不能在缺乏组氨酸的培养基中生长，但在诱变剂作用下，细菌可发生大量回复突变，形成能够自行合成组氨酸的野生型（his+）菌株，并能在缺乏组氨酸的培养基上生出肉眼可见的菌落。因此，可通过计数平皿中回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。它常常作为食品、药品、牙科材料等的安全性生物学检测手段之一。
由于卷烟滤嘴和人口腔直接接触，存在潜在的健康风险，因此，有必要采用Ames试验手段，对其可能存在的潜在危害进行考察。采用Ames试验对卷烟滤嘴进行安全性毒理学检测时，首先需要对卷烟滤嘴进行提取，然后再对提取液进行Ames试验。因此，试验过程中需要设置阳性对照，以验证提取和后续的Ames试验是否可靠。
现有的Ames试验阳性对照设置方法有两类：第一种方法，如果受试物可以制备成溶液或混悬液，则使用一定浓度的已知阳性诱变剂直接加到顶层培养基中制成阳性对照；第二种方法，如果受试物需要制备浸提液进行测试，则阳性对照最好为和受试物性质相同和相近的具有诱变性的材料，并且该材料使用和受试物相同的方法进行提取后，其浸提液应在Ames试验中呈明显的阳性反应。
然而现有方法并不适用于卷烟滤嘴浸提液的细胞毒性试验，这是因为对卷烟滤嘴进行Ames试验需要制备卷烟滤嘴浸提液，因此，使用上述第一种方法设置阳性对照则无法验证提取的过程是否可靠。而对于使用第二种方法，由于目前现有的卷烟滤嘴品种未发现具有诱变性，并且没有与滤嘴性质相近的具诱变性的材料，因此为验证卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的Ames试验是否可靠，有必要开发一种针对卷烟滤嘴水浸提液Ames试验的阳性对照设置方法。
经文献搜索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对卷烟滤嘴水浸提液进行Ames试验时的阳性对照设置方法。通过该方法设置的阳性对照，可以验证卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的Ames试验是否可靠。
卷烟抽吸时滤嘴与人的口腔接触，对卷烟滤嘴进行提取需要选用和人唾液性质相接近的溶剂（水或人工唾液），因此人为添加到滤嘴上的阳性物也应该为水溶性的。本发明使用直接黑38作为人为添加的诱变剂。直接黑38的CAS号为1937-37-7，是一种水溶性的染料，具有致突变性。因此，通过将直接黑38添加到滤嘴上作为阳性对照组，然后和待测样品组一起制备水浸提液进行Ames试验，如果阳性对照呈阳性结果，则说明卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的Ames试验是可靠的。
本发明可通过下述技术方案来实现：
步骤（1）：选取相同数量的待测样品组卷烟滤嘴和符合制备阳性对照条件的卷烟滤嘴（作为用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴）；
步骤（2）：配制浓度为10-20 mg/mL的直接黑38水溶液；
步骤（3）：在用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴上均匀喷洒步骤（2）配制的直接黑38水溶液，喷洒量应使直接黑38在卷烟滤嘴浸提试验测试体系中的理论完全溶出终浓度大于等于1 mg/mL，并使卷烟滤嘴充分吸收直接黑38溶液，待其自然干燥后作为阳性对照组卷烟滤嘴备用；
步骤（4）：用相同的方法对相同数量的步骤（3）制备的阳性对照组卷烟滤嘴和待测样品组卷烟滤嘴进行浸提；
步骤（5）：对步骤（4）得到的水浸提液用微孔滤膜过滤除菌后进行Ames试验，试验使用TA98菌株，并在加入代谢活化系统S9的条件下进行。测试的剂量为1000μL/皿、500μL /皿、250μL /皿和125μL /皿，4个剂量。
所述步骤（1）中的符合制备阳性对照条件的卷烟滤嘴是指: （1）用于制备阳性对照的卷烟滤嘴不会因与直接黑38发生较强化学反应而影响其阳性结果；（2）用于制备阳性对照的卷烟滤嘴不会因与直接黑38产生较强吸附作用而影响其阳性结果。
所述步骤（3）中的理论完全溶出浓度是指：根据所配制的直接黑38溶液实际浓度、直接黑38溶液的实际喷洒量和提取时实际所加的溶剂量，在假定喷洒在滤嘴上的SDS在浸提时可以100%溶出的条件下计算得到的浓度。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明的卷烟滤嘴水浸提液Ames试验阳性对照设置方法操作简单易行，经济实用。本专利使用的人为添加的阳性物直接黑38，是一种水溶性的染料,易于溶解在滤嘴的提取溶剂蒸馏水中，由于直接黑38溶于水呈绿光黑色，因此可以直观的从提取液的颜色看出提取效果，并且在本专利规定的测试剂量下并且在本发明规定的测试剂量下，产生的颜色对Ames试验没有影响。本发明专利所设置的直接黑38的浓度和测试剂量可使得Ames试验呈阳性结果。通过该方法设置的阳性对照，可以验证卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的Ames试验是否可靠。
附图说明
图1是以本发明的方法制备人为阳性滤嘴作为阳性对照，对3种随机挑选的市售卷烟滤嘴的水浸提液进行Ames试验所得到的不同浓度的浸提液的回复突变数柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
以本发明的方法制备人为的阳性卷烟滤嘴作为阳性对照组，对3种随机挑选的市售卷烟滤嘴进行Ames试验。
1、随机挑选3种市售卷烟，每种随机抽取20支用于制备待测样品组卷烟滤嘴。随机抽取20支符合制备阳性卷烟滤嘴条件的肯塔基3R4F卷烟用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴。将上述卷烟滤嘴切割下来备用，切割时应避免切到接装纸和卷烟纸的交叠部分，以防止将卷烟纸和烟丝带入滤嘴样品中。
2、配制浓度为10mg/mL的直接黑38水溶液。
3、在用于制备阳性对照的3R4F卷烟滤嘴上均匀喷洒步骤2配制的直接黑38水溶液10mL,使直接黑38在卷烟滤嘴浸提试验测试体系中的理论完全溶出终浓度为1 mg/mL（提取时加水量为100mL），使卷烟滤嘴充分吸收添加的直接黑38溶液，待卷烟滤嘴自然干燥后作为阳性卷烟滤嘴对照组备用。
4、用100mL蒸馏水对步骤3制备好的阳性对照组卷烟滤嘴和3种待测样品组卷烟滤嘴（样品1、样品2和样品3）在40℃下静置提取30min。
5、对得到的水浸提液进行Ames试验，测定条件如下：
（1）将得到的滤嘴提取液用微孔滤膜过滤除菌；
（2）使用TA98菌株进行测试；
（3）试验在加入代谢活化系统S9的条件下进行；
（4）滤嘴提取液细菌回复突变试验试验测试的剂量为1000μL/皿、500μL /皿、250μL /皿和125μL /皿，4个剂量；
（5）培养48小时后观察结果。
6、Ames试验得到的各样品不同浓度下的细菌回复突变数见图1。由试验结果可见，所测试的3个样品组滤嘴的提取液在4个受试浓度下均未超过空白对照自发回复突变数的2倍，因此均为阴性结果。人为阳性对照滤嘴提取液的回复突变数随测试浓度的增高而增高，呈现出较为明显的剂量反应关系。人为阳性对照滤嘴提取液4个受试浓度的回复突变数都已超过空白对照自发回复突变数的2倍，因此为阳性结果。说明本实施例中卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的Ames试验是可靠的。
直接黑38水溶液的配制浓度还可以为15mg/mL、20mg/mL等。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (2)
1.一种卷烟滤嘴水浸提液Ames试验阳性对照设置方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
步骤（1）：选取相同数量的待测样品组卷烟滤嘴和符合制备阳性对照条件的卷烟滤嘴；
步骤（2）：配制浓度为10-20 mg/mL的直接黑38水溶液；
步骤（3）：在用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴上均匀喷洒步骤（2）配制的直接黑38水溶液，喷洒量应使直接黑38在卷烟滤嘴浸提试验测试体系中的理论完全溶出浓度大于等于1 mg/mL，并使卷烟滤嘴充分吸收直接黑38溶液，待其自然干燥后作为阳性对照组卷烟滤嘴备用；
步骤（4）：用用相同的方法对相同数量的步骤（3）制备的阳性对照组卷烟滤嘴和待测样品组卷烟滤嘴进行浸提；
步骤（5）：对步骤（4）得到的水浸提液进行Ames试验，测试的剂量为1000μL/皿、500μL /皿、250μL /皿和125μL /皿，4个剂量。
2.根据权利要求1所述的卷烟滤嘴水浸提液Ames试验阳性对照设置方法，其特征在于：所述的水浸提液进行Ames试验条件如下：
（1）将得到的滤嘴提取液用微孔滤膜过滤除菌；
（2）使用TA98菌株进行测试；
（3）试验在加入代谢活化系统S9的条件下进行。
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