CN104212835A - 一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法及其用途。本发明提供一种高ALT乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：向Tlr2基因缺陷小鼠给药HBV基因组DNA质粒，从而构建HBV乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。本发明所提供的小鼠模型构建过程相对简单，技术手段相对容易，构建成本低。此外，本发明所采用的HBV质粒载体本身不具有毒性，不会诱导小鼠的免疫应答，还能够避免了嵌合体小鼠模型中存在的重症免疫缺陷，且所得HBV感染模型具有更高的血清ALT水平和明显的肝脏炎症表现。

Description

一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法及其用途，并进一步涉及由所述乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法构建获得的小鼠模型及其用途。本发明所构建的动物模型可用于HBV急性感染相关机制的体内实验，在HBV感染与发病机制的研究中具有很好的应用价值。

背景技术

已有的用于HBV感染体内实验的小鼠模型按其构建方法的不同分为转基因小鼠模型、病毒载体转染小鼠模型、嵌合体小鼠模型及尾静脉高压注射小鼠模型，这些方法均存在着一些问题，具体来说：

(1)转基因小鼠模型是将HBV基因组通过转基因技术接入小鼠基因组中，能够产生类似人类体内的HBV病毒颗粒和具有传染性，可以用于HBV致病机制的体内研究，也可用于抗病毒药物抑制病毒复制的相关研究，但有其先天的不足：首先，转基因技术相对复杂且成本较高；其次，由于未知的原因，整合到小鼠基因组中的HBV基因不能产生cccDNA(在人类体内cccDNA是HBV复制的天然转录模板)；另外，由于是转基因的关系，小鼠的免疫系统是将病毒识别为自身物质，需要再转入特异性的T淋巴细胞才能进行相关的机体免疫研究，限制了该模型的研究应用范围。

(2)病毒载体转染小鼠模型是将带有HBV基因组的腺病毒载体转染到小鼠体内，通过腺病毒载体，HBV基因组可以有效地转染入小鼠肝脏内并复制，可以产生轻到中度的肝脏炎症及血清谷丙转氨酶(ALT)升高，可以用于在体内研究免疫介导的病毒清除机制，同样其也有自身的缺点，腺病毒本身具有毒性，且能诱导机体的免疫应答限制了其应用。

(3)嵌合体小鼠模型首先需要放射线照射灭活其骨髓细胞，与重症联合免疫缺陷鼠(SCIDmice)的骨髓细胞重组作为预处理，再移植入已在体外感染HBV的人类肝组织片段构建嵌合体小鼠模型，此外还有通过免疫缺陷的转基因小鼠构建嵌合体模型，如uPA\SCID小鼠，由于携带了人类肝细胞，所以该模型还可以用于其他嗜人肝细胞病毒重叠感染的研究，嵌合体小鼠模型构建成本高且过程复杂，由于是重症免疫缺陷小鼠，限制了其在疫苗及适应性免疫应答机制方面的应用。

(4)尾静脉高压注射构建的小鼠模型是近年来新出现的HBV感染动物模型，构建过程相对简单，易于推广，通过小鼠的尾静脉向小鼠体内快速高压注射HBV病毒基因组，跨过物种特异性屏障使HBV病毒有效的转入小鼠的肝脏，从而构建体内有HBV复制的小鼠模型，而之前采用裸鼠或C57B/L小鼠构建的小鼠模型肝脏炎症不明显，ALT升高不显著。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法及其用途，并进一步提供由所述乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法构建获得的小鼠模型及其用途。本发明亦使用尾静脉高压注射，但采用的是Tlr2基因缺陷小鼠，克服了以上小鼠模型的不足。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种高ALT乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：向Tlr2基因缺陷小鼠给药HBV基因组DNA质粒，从而构建HBV乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。

优选的，所述Tlr2基因缺陷小鼠为纯合Tlr2基因缺陷(Tlr2^-/-)小鼠或杂合Tlr2基因缺陷(Tlr2^+/-)小鼠。

更优选的，所述Tlr2基因缺陷小鼠为杂合Tlr2基因缺陷(Tlr2^+/-)小鼠。

所述杂合Tlr2基因缺陷小鼠为纯合Tlr2基因缺陷(Tlr2^-/-)小鼠与野生型小鼠杂交繁衍获得，野生型小鼠优选为C57BL/6小鼠。

所述纯合Tlr2基因缺陷(Tlr2^-/-)小鼠和C57BL/6小鼠均引进自国家遗传工程小鼠资源库-南京大学模式动物研究所。

相关纯合Tlr2基因缺陷小鼠(Tlr2^-/-小鼠)与杂合Tlr2基因缺陷小鼠(Tlr2^+/-小鼠)的基因鉴定方法具体为：实验小鼠剪尾抽提基因组DNA，通过特异引物及聚合酶链反应(PCR)方法扩增Tlr2基因片段，最后进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳条带大小鉴定小鼠的Tlr2基因型。

优选的，所述向Tlr2基因缺陷小鼠给药HBV基因组DNA质粒的具体方式为经小鼠尾静脉注射，给药量为19.5-20.5μg。

更优选的，所述注射具体为经小鼠尾静脉高压注射。

进一步优选的，所述小鼠尾静脉高压注射包括如下步骤：将HBV基因组DNA质粒以9.75-10.25μg/mL的浓度溶于注射溶质中形成注射液，在5-10秒内通过小鼠尾静脉将1.95-2.05mL注射液注射入小鼠体内。

所述注射溶质可为本领域中各种常用的适合于小鼠的医用注射溶质，优选为医用林格式液(Ringer液)。

通过高压注射的方法可以迅速让小鼠肝脏处于充血状态，从而使得HBV基因组DNA质粒在肝脏充分灌注并转染。

优选的，所述高ALT具体指血清ALT水平≥100IU/L。相对于传统尾静脉高压注射构建的小鼠模型的ALT水平(通常在50-80范围)有较大幅度提高。

更优选的，所述高ALT具体指血清ALT水平≥150IU/L。

更优选的，所述高ALT具体指血清ALT水平≥250IU/L。

进一步优选的，所述高ALT具体指血清ALT水平≥300IU/L。

优选的，所述HBV基因组DNA质粒为野生型HBV质粒或突变型HBV质粒。

所述野生型HBV质粒中HBV基因组DNA的参考序列号为NC_003977.1。

更优选的，所述突变型HBV质粒中HBV基因组DNA的突变位点为：1753T>C、1762A>T/1764G>A、1896G>A。其中1762和1764是联合突变，故用1762A>T/1764G>A表示。

优选的，所述HBV基因组DNA质粒的构建方法为：将HBV基因组DNA构建入载体质粒后获得，具体构建方法可参见Yu等，JOURNAL OF VIROLOGY，Distinct Modes ofRegulation of Transcription of Hepatitis B Virus by the Nuclear Receptors HNF4αandCOUP-TF1，February 2003vol.77no.42489-2499。

更优选的，所述载体质粒为pSP65质粒，质粒购自美国Promega公司。

携带HBV基因组DNA的野生型HBV质粒或突变型HBV质粒由复旦大学分子病毒学重点实验室提供。

本发明第二方面提供所述乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域的用途。

本发明第三方面提供一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型，由所述乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法构建获得。

本发明第四方面提供由所述乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法构建获得的乙型肝炎病毒感染的小鼠模型在筛选预防或治疗乙型肝炎的药物中的用途。

本发明通过检测反应小鼠模型中HBV复制水平及肝脏炎症程度，验证了相关小鼠模型的成功构建，包括检测血清中ALT水平，血清乙肝病毒核酸(HBV DNA)水平，血清乙肝表面抗原(HBsAg)及乙肝e抗原(HBeAg)定量，肝组织病理学检查直接观察肝脏炎症，免疫组化检测肝组织中HBsAg，具体方法为：经小鼠眼眶下静脉丛采血，全血经离心后分离出血清进行相应的检测；肝病理学检查在实验最后进行，牺牲小鼠后剖腹取得其肝脏大体标本，使用福尔马林液固定，制片后行相应的病理学及免疫组化检查。

本发明构建的HBV急性感染小鼠模型与已有的类似小鼠模型相比具有众多有益效果。首先，本小鼠模型构建过程相对简单，技术手段相对容易，构建成本低，不像转基因小鼠及嵌合体小鼠那样对技术要求高，构建过程复杂且成本高，所以本小鼠模型更易推广应用；其次，本发明所采用的HBV质粒载体不像腺病毒载体，本身不具有毒性，也不会诱导小鼠的免疫应答；此外，本小鼠模型避免了嵌合体小鼠模型中存在的重症免疫缺陷；最后，不同于在C57B/L小鼠(B6小鼠)中通过尾静脉高压注射构建的小鼠模型，本发明通过Tlr2基因缺陷小鼠构建的HBV感染模型具有更高的血清ALT水平和明显的肝脏炎症表现。

附图说明

图1显示为本发明构建的急性HBV感染小鼠模型可模拟急性乙型肝炎的血清ALT升高表现示意图，其中B代表B6小鼠，C代表Tlr2-/-小鼠，Z代表Tlr2+/-小鼠；W代表注射野生型HBV质粒，M代表注射突变型HBV质粒；

图2显示为本发明构建的急性HBV感染小鼠模型可以模拟急性乙型肝炎的肝组织病理学的肝炎表现；

图3显示为本发明鉴别小鼠的Tlr2基因型电泳图；

图4显示为本发明实验小鼠血清ALT水平变化示意图，其中B代表B6小鼠，C代表Tlr2-/-小鼠，Z代表Tlr2^+/-小鼠；R代表注射Ringer液，K代表注射空质粒，W代表注射野生型HBV质粒，M代表注射突变型HBV质粒，每个时间点数据用均值±标准差(mean±SD)表示；

图5显示为本发明实验小鼠血清HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平变化示意图，其中B代表B6小鼠，C代表Tlr2^-/-小鼠，Z代表Tlr2^+/-小鼠；R代表注射Ringer液，K代表注射空质粒，W代表注射野生型HBV质粒，M代表注射突变型HBV质粒，每个时间点数据用均值±标准差(mean±SD)表示；

图6显示为本发明肝组织病理学示意图：图a所示为对照组(B6)小鼠肝组织病理(放大100倍)；图b所示为本发明构建小鼠模型肝组织病理(放大200倍)；

图7显示为本发明注射HBV质粒的小鼠的免疫组化检查示意图；

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明实施例中所使用的实验材料和仪器如下：DNA聚合酶体系(美国Promega)，dNTP混合液(日本TaKaRa)；Eppendorf 5415D型高速离心机，BIO-RAD稳压稳流电泳仪，BIO-RAD凝胶成像系统，PCR System 9700热循环仪，BeckmanCoulter全自动生化分析仪，DK-8D型电热恒温水槽。

实验小鼠：纯合Tlr2基因缺陷小鼠(Tlr2^-/-小鼠)与C57BL/6小鼠(B6小鼠)引进至国家遗传工程小鼠资源库-南京大学模式动物研究所，杂合Tlr2基因缺陷小鼠(Tlr2^+/-小鼠)由本发明实验中使用Tlr2^-/-小鼠与B6小鼠杂交繁殖而来。所有实验小鼠均饲养在上海瑞金医院实验医学研究中心SPF级动物房内并喂食常规饲料和水源，近交繁殖实验小鼠。实验组小鼠分为Tlr2^-/-小鼠组(代号C)，Tlr2^+/-小鼠组(代号Z)，对照组小鼠为B6小鼠组(代号B)，每组再根据注射液成分的不同分为4个亚组，注射液成分包括Ringer液(代号R)，空载体质粒(代号K)，野生型HBV质粒(代号W)，突变型HBV质粒(代号M)，每亚组每次实验的小鼠数不少于3只，采用8到10周龄的健康雄性小鼠构建动物模型。

实施例1

小鼠Tlr2基因型的鉴定：

(1)抽提实验小鼠基因组DNA：剪取小鼠尾端约0.8厘米，以50μl蛋白酶K液裂解(10mg/mL)，56℃水浴过夜，次日离心(12000转/分，室温离心10分钟)，加70％乙醇0.5ml，吹吸数次至出现絮状沉淀，室温下以13200转/分离心3分钟，弃上清后晾干，加200μlddH₂O溶解得到小鼠基因组DNA，4℃保存。

(2)PCR及凝胶电泳实验鉴定小鼠基因型：

PCR体系配制(50μl)：

表1

PCR扩增程序如表2所示：

表2

PCR所得产物进行琼脂糖凝胶电泳：根据电泳后条带大小不同鉴别小鼠的Tlr2基因型，电泳图如图3所示，其中B6小鼠(即图中Tlr2^+/+)基因组DNA的PCR产物片段长度为498bp，纯合Tlr2基因缺陷小鼠(即图中Tlr2-/-)基因组DNA的PCR产物片段长度为334bp。

实施例2

病毒学指标检测采样：

尾静脉高压注射：在5至10秒钟内通过小鼠尾静脉高压注射溶有相应质粒的2ml Ringer液，每只小鼠共注射1次。其中每组的R亚组中的实验小鼠只注射了2ml Ringer液，不含任何质粒，K亚组每只小鼠注射了20μg的空载体质粒，W亚组每只小鼠注射了20μg的野生型HBV质粒，M亚组每只小鼠注射了20μg的突变型HBV质粒。

外周血采取与处理：经小鼠眼眶下静脉丛采取外周血，每次采全血约200μl，采血的时间点分别为尾静脉高压注射前采血(day0)，尾静脉高压注射后第3天(day3)、第7天(day7)、第10天(day10)、第14天(day14)、第17天(day17)、第21天(day21)、第28天(day28)，其中day3、day7对应第一周(week1)，day10、day14对应第二周(week2)，day17、day21对应第三周(week3)，day28对应第四周(week4)，采取的新鲜血以12000转/分在室温下离心10分钟，吸取上层血清进行相应检测。

实施例3

血清ALT检测：分别取每组day0、day3、day7、day10、day14、day17、day21及day28时间点的小鼠血清各50μl，按1:1的比例加0.9％的生理盐水(NS)，混匀后在Beckman Coulter全自动生化分析仪检测ALT水平，测定值的单位是IU/L。实验小鼠血清ALT水平变化如图4所示，通过实验证明本发明构建的急性HBV感染小鼠模型(包括纯合和杂合的Tlr2基因缺陷小鼠)较已有的C57BL/6(B6)小鼠构建的HBV感染模型，具有更高的ALT水平，能更好地模拟由HBV感染所致肝炎的生化学表现。另外，如图1所示，以注射质粒三周后的数据比较可见，本发明小鼠模型(CW、ZW、CM、ZM组小鼠)较对照小鼠(BW、BM组小鼠)有明显升高的血清ALT水平(有统计学意义：*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001)。

实施例4

血清HBsAg、HBeAg及HBV DNA检测：取每组day3、day7及day17时间点的小鼠血清各20μl送检瑞金医院病毒室检测HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平，HBsAg的检测单位是IU/mL，HBeAg的检测单位是S/CO，HBV DNA的检测单位是IU/mL。HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平变化示意图如图5所示，在尾静脉高压注射质粒后早期的水平最高，并随着时间推移下降，且此三项病毒学指标下降趋势一致。这一血清病毒学变化也很好的模拟了人类急性HBV感染的过程。需要特别指出的是：突变HBV质粒(M)不表达HBeAg，所以血清里检测不到HBeAg(如图5所示，即CM、ZM亚组不表达HBeAg)。

实施例5

肝组织病理学及免疫组化检查：所有实验时间点采血结束后，牺牲小鼠并剖腹取肝脏大体标本，以10％福尔马林液固定，送检复旦大学上海医学院病理学教研室进行病理学及免疫组化检查，病理改变按肝组织炎症活动坏死程度的分级(G)和纤维化程度的分期(S)评分，炎症活动度分级(Grade,G)为4级(G1～4)，评分越高炎症越严重，纤维化程度分期(Stage,S)为4期(S1～4)，分期越高纤维化越明显。免疫组化实验主要检测肝组织中的乙肝表面抗原(HBsAg)成分。

实验小鼠的肝组织病理学及免疫组化结果如下：本发明构建的小鼠模型(即小鼠Tlr2^-/-小鼠，Tlr2^+/-小鼠)的肝组织中可见炎症表现，程度可达到2级(G2)，由于是急性HBV感染模型，故没有观察到纤维化，即纤维化程度0级(S0)，而对照组小鼠(即B6小鼠)病理学检查正常，无肝脏炎症表现(G0S0)，光镜下的实验小鼠组织病理学表现(HE染色)具体如图2、6所示，其中图6-a所示为对照组(B6)小鼠肝组织病理(放大100倍)，无炎症表现，肝细胞索排列整齐，未见淋巴细胞浸润，图6-b所示为本发明构建小鼠模型(ZM组)肝组织病理(放大200倍)，可见小叶炎症及淋巴细胞浸润(白色箭头所指)，周围肝细胞索排列紊乱，图2所示为本发明构建小鼠模型(ZM组)肝组织病理(放大400倍)，光镜下可见小叶炎症及淋巴细胞浸润。

实验小鼠的免疫组化检查结果如下：在注射HBV质粒的小鼠中，肝组织免疫组化检查标记HBsAg为阳性(如图7所示)，这也同时从组织病理学上证明本发明构建的小鼠模型是成功的。图7中，实验小鼠(ZM组)肝组织免疫组化标记HBsAg阳性(镜下放大400倍)，图中所示肝细胞的胞浆内棕色物质(白色箭头所示)即是通过带有免疫过氧化物酶的HBsAg抗体标记的乙肝表面抗原(HBsAg)。

可见，本发明所提供的小鼠模型构建过程相对简单，技术手段相对容易，构建成本低。此外，本发明所采用的HBV质粒载体本身不具有毒性，不会诱导小鼠的免疫应答，还能够避免了嵌合体小鼠模型中存在的重症免疫缺陷，且所得HBV感染模型具有更高的血清ALT水平和明显的肝脏炎症表现。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种高ALT乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：向Tlr2基因缺陷小鼠给药HBV基因组DNA质粒，从而构建HBV乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。

2.如权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Tlr2基因缺陷小鼠为纯合Tlr2基因缺陷小鼠或杂合Tlr2基因缺陷小鼠。

3.如权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，向Tlr2基因缺陷小鼠给药HBV基因组DNA质粒的给药量为19.5-20.5μg。

4.如权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述高ALT具体指血清ALT水平≥100IU/L。

5.如权利要求4所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述高ALT具体指血清ALT水平≥300IU/L。

6.如权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述HBV基因组DNA质粒为野生型HBV质粒或突变型HBV质粒。

7.如权利要求6所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述野生型HBV质粒中HBV基因组DNA的参考序列号为NC_003977.1。

8.如权利要求6所述的乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述突变型HBV质粒中HBV基因组DNA的突变位点为：1753T>C、1762A>T/1764G>A、1896G>A。

9.如权利要求1-8任一权利要求所述的小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域的用途。

10.如权利要求1-8任一权利要求所述的小鼠模型的构建方法构建获得的乙型肝炎病毒感染的小鼠模型在筛选预防或治疗乙型肝炎的药物中的用途。