CN104212825A

CN104212825A - 欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因 VlAP17及其应用

Info

Publication number: CN104212825A
Application number: CN201410369675.3A
Authority: CN
Inventors: 王西平; 郭荣荣
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2014-07-30
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2034-07-30
Also published as: CN104212825B

Abstract

本发明中公开了一种欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17及其应用。所公开的基因完整开放阅读框序列全长1074bp，编码358个氨基酸。发明人构建了pCAMBIA2300-35S-VlAP17过量表达载体，通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥。在拟南芥中过量表达VlAP17明显提高了拟南芥对于渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫的耐受力。所公开的应用是基因VlAP17用于提高植株的抗盐胁迫能力和干旱胁迫能力的应用。

Description

欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因 VlAP17及其应用

技术领域

本发明涉及植物抗逆基因鉴定及基因工程技术领域，特别涉及一个欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17。

背景技术

天冬氨酸蛋白酶(APs)广泛分布于植物，动物，微生物及病毒中。根据它们的氨基酸序列同源性共分为14个不同的家族，根据它们的进化关系和三维结构又可分为6个不同的分支。植物天冬氨酸蛋白酶分布于AA分支的A1，A3，A11和A12以及AD分支的A22家族。大多数植物天冬氨酸蛋白酶与来源不同的类胃蛋白酶共同属于A1家族。与A1家族的其他成员相似，植物天冬氨酸蛋白酶在酸性pH条件下具有活性，受胃蛋白酶抑制剂的特异抑制，有两个具有催化活性的天冬氨酸残基。

目前已从多种植物中检测并纯化出天冬氨酸蛋白酶。然而，它们的生物学功能并没有像哺乳动物、微生物或病毒中的天冬氨酸蛋白酶那样得到很好的表征，在这些物种中天冬氨酸蛋白酶执行多种不同的功能，包括特异的蛋白加工(如：高血压蛋白原酶),蛋白质降解(如：胃酶如凝乳酶，胃蛋白酶和胃亚蛋白酶)或病毒多聚蛋白加工(人体免疫病毒AP)。关于植物天冬氨酸蛋白酶功能的了解来自于假设的蛋白质底物的共定位研究、特定组织或特异条件下的这些底物在离体条件或特异表达下的加工或降解的实验证据。总的来说，植物APs参与不同植物器官的蛋白质加工或降解，以及植物衰老，逆境响应，程序性细胞死亡和再生。

在自然生长环境中，植物经常暴露于复杂多变的生物与非生物胁迫中。为了改善植物对胁迫和疾病的抵抗能力，研究各种胁迫途径中抗逆基因的功能是很重要的。但现有的关于AP基因在抗逆方面的研究还很少。

发明内容

本发明的目的在于，提供一个欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17，并证明了该基因在抗逆方面的功能。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17，其特征在于，该欧美杂交葡萄巨峰抗逆基因VlAP17的编码区序列如SED ID NO:1所示。

本发明首次构建了pCAMBIA2300-35S-VlAP17过量表达载体，并通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥。研究了欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17过量表达的转基因株系和野生对照在渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫处理下的生长情况。

本发明的欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17能明显提高拟南芥对于渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫的耐受力。

在胁迫条件下，转基因株系中的活性氧(ROS)的积累也是明显少于野生对照,而活性氧清除剂SOD，CAT，POD的酶活性显著高于野生型对照。在含有氯化钠(NaCl)和甘露醇(Mannitol)的培养基上，具有欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17的株系萌发率显著高于野生对照,根长也明显长于对照。以上结果都表明欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐胁迫和干旱胁迫的能力。

附图说明

图1是氯化钠和甘露醇引起的渗透胁迫对野生对照(WT)和转基因株系VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)萌发的影响。其中，A图是在MS培养基上的图片，B图是在MS培养基+130mM的NaCl上的图片，C图是在MS培养基+200mM甘露醇(Mannitol)上的图片，图D是野生对照WT、转基因株系L1,L2,L3在MS培养基，含有130mM氯化钠和200mM甘露醇的渗透培养基上的萌发率，*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。

图2是氯化钠和甘露醇引起的渗透胁迫对野生对照WT、转基因株系L1,L2,L3根系发育的影响。A图是将苗龄5天的野生对照WT、VlAP7转基因株系L1,L2,L3分别移栽到在MS培养基，含有130mM氯化钠和200mM甘露醇的渗透培养基上生长一周后的根系生长图。B图是野生型对照和转基因株系在不同培养基上的根长。C图是野生型对照和转基因株系在不同培养基上的侧根数量，*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。

图3是氯化钠和甘露醇引起的渗透胁迫对野生对照WT、VlAP17转基因株系L1,L2,L3中叶绿素含量，电导率，丙二醛(MDA)含量，内源ABA含量的影响。将苗龄7天的无菌苗从萌发培养基中分别移栽到在MS培养基，含有130mM氯化钠和200mM甘露醇的渗透培养基上生长一周后测定叶片中的叶绿素含量(A图)，电导率(B图)，MDA含量(C图)和内源ABA含量(D图)。*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。

图4是野生对照，转基因株系VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)的盆栽苗对盐胁迫和干旱胁迫的反应。A图为胁迫处理一周后的植株代表图，a图为对照，b图为200mM氯化钠处理后的植株生长情况，c图为干旱胁迫一周后的植株生长情况，d图为干旱胁迫一周后复水24小时后的植株生长情况。B图是干旱胁迫一周后复水24后野生对照和转基因株系的复活率，*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。C图是将正常生长条件下的苗龄3周的野生对照和转基因株系的叶片从植株上采集下来放于自然环境中进行失水处理。每隔15分钟称量一次鲜重，失水率通过与初始鲜重之间的差值与初始鲜重之间的比值进行计算。D图是用台盼兰对盐胁迫和干旱胁迫一周后的野生对照和转基因株系中的死细胞进行染色的情况。

图5是野生对照，转基因株系VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)盆栽苗在盐胁迫和干旱胁迫条件下活性氧积累及活性氧清除剂的活性分析。A图是用NBT对超氧化物的阴离子(O₂ ^-)进行染色后的叶片代表图。B图是用DAB对过氧化氢(H₂O₂)进行染色后的叶片代表图。C图是超氧化物歧化酶(SOD)的酶活性，D图是过氧化氢酶(CAT)的酶活性，E图是过氧化物酶(POD)的酶活性，*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。

图6是正常生长条件下的野生对照和转基因株系VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)盆栽苗的叶片在不同浓度的外源ABA处理后的气孔开张情况。A图是外源ABA处理后的气孔张开情况代表图。B图是外源ABA处理后野生对照和转基因株系叶片上气孔开度的平均值，*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。

图7是胁迫相关基因在野生对照和转基因株系VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)中的表达情况。A图是用200mM氯化钠处理苗龄四周的成苗一周，采集叶片提RNA并反转录后利用实时定量PCR技术测定胁迫基因表达量。B图是对苗龄四周的野生对照和转基因株系成苗进行干旱处理一周，采集叶片提RNA并反转录后利用实时定量PCR技术测定胁迫基因表达量。*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施方式

在自然生长环境中，植物经常暴露于复杂多变的生物与非生物胁迫中。为了改善植物对胁迫和疾病的抵抗能力，研究各种胁迫途径中抗逆基因的功能是很重要的。但现有的关于AP基因在抗逆方面的研究还很少。因此，在本申请中，发明人通过分析葡萄中AP基因家族成员对各种生物和非生物胁迫以及激素处理的反应筛选出响应干旱和盐胁迫的AP17基因。

迄今为止，关于AP基因在胁迫中发挥作用的研究还很少。但也有研究表明，在拟南芥中，ASPG1基因(定位在保卫细胞中的一个天冬氨酸蛋白酶基因)可以通过ABA信号途径使植物抵御干旱胁迫。此外，也有研究表明当大麦遭受不同的非生物胁迫时，其叶片中的FeAP9基因上调表达。在本申请中，发明人也发现C组的葡萄AP基因可能在抵抗非生物胁迫方面起到了关键作用，如VlAP13,VlAP17,VlAP25,VlAP28,VlAP39,和VlAP44基因在巨峰葡萄受到盐或干旱胁迫后，表达量上调；此外，对巨峰葡萄进行外源ABA处理结果显示，处于C组中VlAP8，VlAP17，VlA25的基因表达量也明显上调。

植物根系的形成与植物的抗旱和抗盐性密切相关，在130mM NaCl或200mM甘露醇处理时，过量表达VlAP17可以增加拟南芥的根长及侧根数，这将有利于植株吸收更多的水分，提高植株的抗盐，抗旱性。细胞膜具有选择透过性，这是植物维持正常生理功能的重要条件之一。它可以阻止不需要或对细胞有害的物质进入细胞，是植物的一种自我保护。但当植物长期处于逆境时，细胞膜的选择透性降低甚至消失，细胞内物质就会大量外渗，从而引起植株电导率的变化。可以通过这种变化来了解植株细胞膜的受伤害程度进而说明所测植株的抗逆性强弱。在本申请中，发明人对130mM NaCl或200mM甘露醇处理一周后的植株测定电导率发现，野生植株的电导率明显高于转基因株系，说明在胁迫条件下，VlAP17基因的转入改善了拟南芥植株的抗逆性。另外，干旱胁迫和盐胁迫往往伴随着丙二醛的积累，而丙二醛的积累会对细胞膜造成损伤并导致细胞死亡。本申请中，发明人发现在受到盐和甘露醇胁迫后，VlAP17转基因拟南芥幼苗中的丙二醛含量明显低于野生型。

活性氧是一类具有比氧分子活泼的氧的某些衍生物，如过氧化氢(H₂O₂)、超氧化物的阴离子(O₂ ^-)和羟基(-OH)等。正常条件下，植物细胞中的活性氧(ROS)并不会对植物产生严重的伤害，但是髙盐和干旱胁迫条件下，活性氧平衡被打破，植物细胞产生过量的ROS而无法被及时清除，造成了严重氧化伤害，进而影响到了植物正常的生理代谢。所以及时清除过量的ROS，维持植物体内氧平衡，对于改善植物抗逆性具有重要的作用。最近的研究已经表明，拟南芥保卫细胞中的一个天冬氨酸蛋白酶基因ASPG1的过量表达能增强干旱胁迫下叶片中的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性。本申请中，发明人对干旱和盐胁迫下的拟南芥植株进行了活性氧清除剂的酶活性分析，结果表明在非生物胁迫下，VlAP17转基因植株中的超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性均显著提高，同时，H₂O₂和O₂ ^-的积累明显减少。

发明人利用同源克隆技术，根据欧洲葡萄黑比诺基因组序列采用反转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，以欧美杂交葡萄巨峰叶片总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，扩增了欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17，该基因完整开放阅读框序列全长1074bp，编码357个氨基酸。

分析表明该基因包括一个高度保守的ASP结构域，该结构域包含两个DTG活性位点和一个膜定位信号。

为了一步研究欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17在植物抵御干旱胁迫和盐胁迫中的具体功能，发明人构建了pCAMBIA2300-35S-VlAP17(酶切位点为XbaI和KpnI)过量表达载体，将其在野生拟南芥植株中过量表达。发现具有欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17的株系在渗透胁迫培养基上的种子萌发率显著高于野生对照，而且经过长期培养后，发现具有欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17的植株可以在渗透培养基上长出强壮根系，健康的子叶和真叶，而野生对照在种子萌发后，子叶和根系无法正常生长直至植株枯黄变褐死亡。

在研究中，发明人对幼苗转基因植株和野生对照进行了盐胁迫和甘露醇渗透胁迫处理，并测定了植株中的叶绿素含量，电导率，丙二醛含量及内源ABA含量。结果表明在渗透胁迫条件下，转基因植株中的叶绿素含量及内源ABA含量均比野生对照中的较高，而丙二醛含量和电导率均比野生对照低。此外，发明人还对成苗转基因植株进行了盐胁迫和干旱处理并利用化学染色的方法分别检测了在盐胁迫和干旱胁迫处理后叶片或植株中超氧阴离子自由基(O₂ ^.-)和过氧化氢(H₂O₂)的水平并分析了其中的活性氧清除剂超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的酶活性。结果表明在胁迫处理后，与野生对照相比转基因株系中活性氧积累较少，受的氧化胁迫也较小，同时三种活性氧清除剂的酶活性较高。说明欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17的过量表达可能参与了ROS的清除过程从而增强了植株的抗胁迫能力。

以下是欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17的编码区序列以及抗盐胁迫和干旱胁迫功能实验验证的具体步骤。

A、在前期研究分析欧美杂交葡萄品种巨峰中30个AP家族基因在不同胁迫处理及激素处理后的表达的基础上，利用同源克隆技术，以欧美杂交葡萄品种巨峰叶片总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，扩增得到了欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17序列，该欧美杂交葡萄巨峰抗逆基因VlAP17的编码区序列如下：

B、将欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17序列的完整开放阅读框插入CaMV35S启动子下游，构建了植株过量表达载体并将其通过农杆菌介导的花絮浸染法将其导入野生型拟南芥哥伦比亚C0。筛选获得了表现型良好的VlAP17转基因株系(L1,L2,L3)。

C、参见图1-7，发明人鉴定了VlAP17转基因株系(L1,L2,L3)能明显提高拟南芥对于渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫的耐受力。此外，在胁迫条件下，转基因株系中的活性氧(ROS)的积累也是明显少于野生对照,而其中的活性氧清除剂(SOD,CAT，POD)的酶活性显著高于野生对照。在MS培养基中添加氯化钠(NaCl)和甘露醇(Mannitol)，VlAP17转基因株系(L1,L2,L3)的萌发率显著高于野生对照。在氯化钠(NaCl)和甘露醇(Mannitol)胁迫培养基上，转基因株系的根长明显长于对照，侧根数明显多于对照。

以上结果都表明欧美杂交葡萄巨峰抗逆基因VlAP17在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐胁迫和干旱胁迫的能力。

以下是发明人给出的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。

实施例1：过量表达的转基因株系和野生对照在渗透胁迫情况下的萌发

三个转基因株系(L1,L2,L3)和野生对照(WT)在MS培养基上2d时开始萌发，4d后萌芽率都能达到96％以上。而在含有氯化钠和甘露醇的培养基上培养10d后，氯化钠培养基上的转基因株系(L1,L2,L3)的萌发率分别达到了69.15％、62.79％、81.93％，而野生对照(WT)的萌发率只有4.39％，明显低于转基因植株。在含有甘露醇的培养基上，转基因株系(L1,L2,L3)的萌发率分别达到了42.95％，45.58％，72.18％，而野生对照(WT)的萌发率只有11.76％(图1)。

实施例2：欧美杂交葡萄巨峰抗逆基因VlAP17转基因拟南芥T3代幼苗对渗透胁迫的抗性

为了进一步测定VlAP17转基因株系(L1,L2,L3)的抗胁迫能力，发明人将播种在萌芽培养基中的5天苗龄的幼苗分别移栽到在MS培养基，含有130mM氯化钠和200mM甘露醇的渗透培养基上观察其根系发育情况。结果表明，转基因株系和野生对照在MS培养基上根系可以正常生长，而在盐胁迫和甘露醇胁迫培养基中，所有植株的根系生长都比较缓慢。一周后观察所有植株的根系生长情况，发现野生对照在盐胁迫和甘露醇胁迫培养基上根系较短，生长矮小，幼苗枯黄，而转基因株系虽然比MS培养基上的苗子生长缓慢，但根系强壮，基本可以正常生长(图2A)。盐胁迫和甘露醇胁迫条件下，转基因株系的根长比野生型较长，侧根数量也比野生型较多(图2B，C)。表明欧美杂交葡萄巨峰抗逆基因VlAP17的过量表达抵消了部分盐胁迫和甘露醇胁迫对植株根系生长的抑制作用。

为了进一步测定VlAP17转基因株系(L1,L2,L3)对水分胁迫的响应，发明人将播种在萌芽培养基中的7天苗龄的幼苗分别移栽到在MS培养基，含有130mM氯化钠和200mM甘露醇的渗透培养基上进行渗透胁迫处理并测定了处理一周后的叶绿素含量，电导率，丙二醛(MDA)含量和内源ABA含量。结果表明三个转基因株系(L1,L2,L3)在氯化钠胁迫后的叶绿素含量分别为0.39、0.39、0.32mg/g鲜重，而野生对照(WT)的叶绿素含量则为0.20mg/g鲜重。甘露醇处理后，三个转基因株系(L1,L2,L3)的叶绿素含量分别为0.40、0.35、0.37mg/g鲜重，而野生对照(WT)则为0.19mg/g鲜重(图3A)。氯化钠胁迫后三个转基因株系(L1,L2,L3)的电导率分别为37.18％、39.15％、36.07％,而野生对照(WT)的电导率达到了62.44％。甘露醇胁迫后三个转基因株系(L1,L2,L3)的电导率分别为25.88％、26.79％、27.16％，而野生对照(WT)的电导率达到了33.75％(图3B)。氯化钠胁迫后三个转基因株系(L1,L2,L3)中的丙二醛(MDA)含量分别为23.34、20.51、19.51nmol/g鲜重，而野生对照(WT)中的丙二醛含量则为35.61nmol/g鲜重。甘露醇胁迫后三个转基因株系(L1,L2,L3)中的丙二醛含量分别为20.91、16.86、18.84nmol/g鲜重，而野生对照(WT)中的丙二醛含量则为26.51nmol/g鲜重(图3C)。这些结果表明在盐胁迫和甘露醇胁迫过程中，转基因株系受到的渗透伤害显著低于对照，过量表达的欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17提高了植株对渗透胁迫的耐受力。氯化钠胁迫后三个转基因株系(L1,L2,L3)中的内源ABA含量分别为83.72、72.44、80.99ng/g鲜重，而野生对照(WT)中的内源ABA含量为69.06ng/g鲜重。甘露醇胁迫后三个转基因株系(L1,L2,L3)中的内源ABA含量分别为71.14、89.41、94.51ng/g鲜重，而野生对照(WT)中的内源ABA含量为59.18ng/g鲜重(图3D)。

这些结果都表明欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17在拟南芥中的过量表达明显提高了幼苗对渗透胁迫的抗性。

实施例3：欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17转基因拟南芥T3代植株对盐胁迫和干旱胁迫的抗性

在前面的研究中已经证明欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17对盐胁迫和甘露醇胁迫处理都有积极的响应。所以发明人着重研究了拟南芥成年植株对各种胁迫的反应。

为了避免外界和人为因素的影响，发明人将转基因植株[VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)]和野生对照种植于同一穴盘中。对生长四周的成苗植株进行盐胁迫和干旱胁迫处理，结果显示盐胁迫处理一周后，转基因植株(L1,L2,L3)和野生对照(WT)出现了明显不同的性状表现。未转基因的野生植株都出现了较为严重的枯黄和皱缩现象，而转基因株系(L1,L2,L3)虽然也出现了不同程度的黄斑，但生长状态明显好于对照(图4A-b)。干旱胁迫处理一周后，野生对照(WT)和转基因株系(L1,L2,L3)均出现叶片萎蔫及失水现象，但是转基因株系的萎蔫症状较轻(图4A-c),对干旱胁迫一周后的植株进行复水处理，24小时后发现三个转基因株系(L1,L2,L3)的成活率分别为69.44％,79.12％,72.22％，而野生对照(WT)的成活率仅为1.85％(图4A-d,图4B)。此外，发明人还对正常生长条件下的4周苗龄的野生对照(WT)和转基因株系(L1,L2,L3)进行了失水处理。结果显示在整个失水处理过程中，转基因株系失水率都低于野生对照。在150min时，转基因株系(L1,L2,L3)的失水率分别为27.31％、25.96％、22.15％，而野生对照(WT)失水率达到了30.84％，明显髙于转基因植株(图4C)。由于转基因株系(L1,L2,L3)的失水率比野生对照(WT)较低，发明人比较了外源ABA处理后转基因株系(L1,L2,L3)和野生对照(WT)叶片上气孔的开度。结果表明当外源ABA浓度为10μM时，三个转基因株系(L1,L2,L3)的气孔开度均比野生对照(WT) 低(图6)。为了进一步验证欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17在提高拟南芥抗非生物胁迫方面的作用，发明人还对盐胁迫和干旱胁迫后的转基因株系(L1,L2,L3)和野生对照(WT)叶片进行了台盼兰染色，以观察死细胞数量。结果显示胁迫处理后，野生对照(WT)中的死细胞数量明显多于转基因株系(L1,L2,L3)(图4D)。

这些结果都表明欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17在拟南芥中的过量表达明显提高了成年植株对盐胁迫和干旱胁迫的抗性。

实施例4：VlAP17转基因拟南芥在非生物胁迫下活性氧的产生和活性氧清除剂的活性分析

植物细胞长期处于逆境胁迫时，活性氧就会大量积累造成氧化伤害，导致细胞损伤甚至死亡。为了验证欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17对于氧化胁迫的作用，发明人利用化学染色的方法分别检测了在盐胁迫和干旱胁迫处理后叶片中超氧阴离子自由基(O₂ ^.-)和过氧化氢(H₂O₂)的水平。由图可以明显的看出在各种非生物胁迫下，用氯化硝基四氮唑蓝液(NBT)和二氨基联苯胺(DAB)染色后各个转基因株系(L1,L2,L3)都呈现出较浅的颜色，而野生对照染色较重(图5A，B)。表明在胁迫处理后，与野生对照相比较转基因株系中活性氧积累比较少，受的氧化胁迫也较小。同时，发明人还分析了盐胁迫和干旱胁迫处理后叶片中活性氧清除剂的活性。结果显示胁迫处理后，转基因株系(L1,L2,L3)中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性均高于野生对照(WT),表明欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17的过量表达增强了植株的活性氧清除剂的活性，从而减少了活性氧的积累，增强了植株对非生物胁迫的抗性。

实施例5：胁迫相关基因在野生对照和VlAP17转基因株系中的表达

干旱，高盐，冷胁迫等都会引起植物缺水使植物处于水分胁迫下。为了进一步了解VlAP17基因在植物响应各种胁迫过程中的调控作用，发明人通过实时定量PCR检测了盐胁迫和干旱胁迫后一些已知功能的胁迫相关基因AtSOS2，AtSOS3，ATRD29A，AtRD29B，AtADH1，ATNCED3，AtFRY1，AtRD22,AtDREB2A和AtERD1在野生对照(WT)及转基因株系(L1,L2,L3)中的表达量(图7)。

实时定量结果表明，盐胁迫后，在拟南芥中过量表达欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17提高了AtSOS2，AtSOS3，AtRD29A，AtRD29B，AtADH1和AtNCED3的表达量。在三个转基因株系(L1,L2,L3)中，AtRD29B基因的表达量均达到了野生对照的5倍左右；AtADH1基因的表达量均达到了对照的10倍以上；AtSOS2，AtSOS3和AtRD29A基因的表达量也达到了对照的2倍左右。干旱胁迫后，转基因株系(L1,L2,L3)中AtRD29A,AtRD29B,AtRD22,AtNCED3的表达量均比野生对照(WT)高，而VlAP17在拟南芥中的过量表达并不影响不依赖ABA途径的AtDREB2A和AtERD1的表达。另外，盐胁迫和干旱胁迫后，欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17的过量表达对于AtFRY1的基因表达表现出了抑制作用(图7)。

Claims

1.一种欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17，其特征在于，该基因的编码区序列如SED ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17用于提高植株的抗盐胁迫能力和干旱胁迫能力的应用。