CN104198543A

CN104198543A - 一种快速评价杀菌剂对生物膜剥离能力的方法

Info

Publication number: CN104198543A
Application number: CN201410453359.4A
Authority: CN
Inventors: 王彪; 姚峰; 杨帆; 吴伟林; 刘宏芳; 秦双
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Jiangsu Oilfield Co
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Jiangsu Oilfield Co
Priority date: 2014-09-09
Filing date: 2014-09-09
Publication date: 2014-12-10

Abstract

一种快速评价杀菌剂对生物膜剥离能力的方法，属于石油技术领域，配备待测试的杀菌剂，制备具有生物膜的多个试片，准备多组电化学阻抗测试用三极电池，每组以具有生物膜的试片为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，金属铂电极为辅助电极；在各杀菌剂溶液中分别放置一组上述三极电池，分别取得与各杀菌剂溶液对应的电化学阻抗值；从各组电化学阻抗值中分别获得各杀菌剂溶液的阻抗值或容抗值，以此评价杀菌剂溶液的浓度对生物膜的剥离能力。本发明模拟现场，辅助生物膜内细菌含量测定，从而获得不同杀菌剂、同一杀菌剂在不同浓度下的剥离效果，为确定现场杀菌剂投加剂量和投加周期、提高现场杀菌剂应用效果提供依据。

Description

一种快速评价杀菌剂对生物膜剥离能力的方法

技术领域

本发明属于石油工程应用技术领域，特别是评价杀菌剂对生物膜的剥离能力的技术方法。

背景技术

许多研究表明，在油气田水系统中生物膜（Biofilm）下腐蚀是MIC的主要表现形式，且生物膜下碳钢腐蚀被认为是不均匀的。生物膜(Biofilm)是在相对封闭水环境体系中形成的一层微生物膜。该膜主要由微生物体同水体中的盐及无机离子形成的一层有机质膜。在生物膜中，微生物生活在一个与自由悬浮状态完全不同的微生态环境中，微生物大体上是不动的，被包藏与水化的有机质中。生物膜中的细胞密度比悬浮状态要高，有时甚至高出5～6个数量级，相邻位置细胞之间通过长时间接触可能产生生理相互作用，导致协同微生物作用。生物膜中可存在多种菌属，包括硫酸盐还原菌(SRB)、硝化菌、脱氮细菌和各种异养微生物，细菌密度在10⁷～10¹⁰菌落单位/cm²生物膜范围内波动。当金属表面存在微生物膜时，金属表面和微生物膜间界面的pH值、有机物和无机物的种类和浓度、矿化物等都大大有别于本体溶液，生物膜内的反应改变了腐蚀的机理和速率。

生物膜腐蚀的危害不仅在于其对设备的腐蚀，更重要的是引起腐蚀的突发性，给工业生产带来严重的影响，但生物膜的存在，使杀菌效率降低、甚至失效，以至于产生耐药菌。故考察杀菌剂对生物膜内的微生物的杀灭作用是控制生物膜腐蚀的重要研究方向。

硫酸盐还原菌、腐生菌和铁细菌是油田水系统腐蚀性较强的主要菌群，浮游的微生物通常采用化学杀菌的手段加以控制，且对液体介质中的细菌数量检测手段比较成熟。而对于生物膜下细菌的杀菌浓度及生物膜的剥离能力则鲜有测试及评价的方法。这是因为生物膜是一种不均匀的动态膜，其膜内环境的复杂性使我们很难对生物膜的性质和状态进行定量描述。

从二十世纪八十年代起，电化学阻抗法被广泛的应用到腐蚀相关的研究中，具有对测试本体无破坏、准确直观、测试简单等特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、准确的用于评价杀菌剂对生物膜的渗透和剥离能力的快速评价方法。

本发明包括以下步骤：

1）配备待测试的杀菌剂：以水将杀菌剂配制成至少两种不同浓度的杀菌剂溶液；

2）制备具有生物膜的多个试片：将与油田采出水集输管线材料相同的多个试片分别浸入含腐蚀性微生物的介质中，待试片表面附着有生物膜后取出各试片；

3）准备多组电化学阻抗测试用三极电池：每组以具有生物膜的试片为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，金属铂电极为辅助电极；

4）电化学阻抗测试：在各杀菌剂溶液中分别放置一组上述三极电池，分别取得与各杀菌剂溶液对应的电化学阻抗值；

5）从各组电化学阻抗值中分别获得各杀菌剂溶液的阻抗值或容抗值，以此评价杀菌剂溶液的浓度对生物膜的剥离能力。

本发明通过电化学阻抗法，模拟现场，辅助生物膜内细菌含量测定，从而获得不同杀菌剂、同一杀菌剂在不同浓度下的剥离效果，为确定现场杀菌剂投加剂量和投加周期、提高现场杀菌剂应用效果提供了有力的依据。

本发明电化学阻抗法是一种对生物膜的完整程度及状态变化响应非常灵敏的电化学方法，当杀菌剂在介质中扩散到达生物膜表面后，其对生物膜的破坏和剥离会产生相应的响应，如电阻增大，电容减小，此外，在bode图上还可以反映出相位角常数的增减，峰值对应的频率的改变等等直观信息。

本发明具有以下优点：

1、使用电化学阻抗法对生物膜表面影响甚微。

2、电化学阻抗法间接评价杀菌剂对生物膜的剥离能力，并可获得杀菌剂的最佳添加剂量、作用周期；同时辅助生物膜下细菌测定，进一步验证杀菌剂对生物膜剥离和膜下细菌的杀灭效果。和采用游离介质中细菌抑制的常用杀菌剂评价方法—绝迹稀释法相比，对现场药剂的投加更具有指导意义。

为了快速地获得试验用试片，本发明在所述步骤2）中，将密封有试片的介质置于30～60℃恒温环境下培养14天。

为了方便试验，所述试片的工作面积优选为0.5～1.5cm²。

另外，本发明在进行电化学阻抗测试时，以开路电位作为工作电位，振幅为5mV，测试频率范围为0.005～100000Hz。开路电位是值工作电极与参比电极之间的电势差，也成为自然腐蚀电位。自然腐蚀电位是腐蚀金属电极的一个重要热力学参数，在本发明中，可反映带生物膜试片表面的稳定电位，进行交流阻抗时，选择开路电位为稳定电位，围绕这个电位进行小幅扰动，可最大限度反映杀菌剂对生物膜不同剥离能力的真实情况。

交流阻抗测试外加的扰动信号要求很小，目的是满足线性关系，本发明是基于保证生物膜物理完整性的前提下通过阻抗获得的电阻电容等信息来获得不同剥离能力杀菌剂对生物膜的剥离和破坏作用。具生物膜的碳钢表面电位的差异通常在几十个毫伏以内，因此选择此幅值的振幅可确保实验结果的有序和真实性。

化学反应速度不同的过程很容易在频率域上分开，速度快的子过程出现在高频区，速度慢的子过程出现在低频区，因此电化学阻抗谱的高频区域（>10E4Hz）主要反映的是材料表面的双电层结构特性，属于电化学控制，低频区域（<10E-2）则反映膜的致密程度及金属离子的扩散情况，属于扩散控制，在本发明中用来反映生物膜的完整性及致密性，进而反映杀菌剂的剥离能力。在较宽频率范围内测量得到的阻抗谱，能比其它常规的电化学方法得到更多的电极过程动力学信息和电极界面结构信息。故选择测试频率为0.005～100000Hz。

附图说明

图1为加入不同浓度的杀菌剂KD-24的阻抗Nyquest图。

图2为加入不同浓度的杀菌剂KD-24后体系等效电路图。

图3为加入不同浓度的KD-24后电阻值与浓度的变化关系图。

图4为加入不同浓度的KD-24后电容值与浓度的变化关系图。

图5为经过电化学阻抗试验后的试片进行细菌培养的结果对比表。

具体实施方式

一、试片准备：

以下金属试片材料与油田采出水集输管线材料相同，都为金属材料。事先分别加工成大小相同、厚度相同、具有相同表面积（如，工作面积为0.5～1.5cm²）的多个金属试片，并测得、记录各金属试片的表积面。

1、先将各金属试片用金相砂纸打磨至镜面，再以丙酮去油、以无水乙醇脱脂，经干燥后置于干燥器中，并放于紫外线下消毒，备用。

2、将采样的油气田水系统的污水罐装于容器中，并向容器内接种SRB培养，然后将从干燥器中取出的各试片分别悬于污水中，并采用橡胶塞密封，以隔绝空气。将该厌氧体系置于37℃恒温箱中培养14天，即获得覆盖大量生物膜的多个具有生物膜的试片。

二、杀菌剂的准备：

本发明方法可以对不同的杀菌剂进行测试评价。本例对杀菌剂KD-24进行测试评价：

在八个测试池中，分别以SRB培养基为介质配制成杀菌剂含量分别为10mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L的杀菌剂溶液，另在一个测试池中作空白对照组。

三、电化学阻抗试验：

准备八组三极电池组，各组中以将带生物膜的试片作为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以金属铂电极为辅助电极。

在具有不同含量的杀菌剂的八组测试池中，分别将放入一组三极电池组，并分别连接电化学测试仪器，如科斯特CS电化学工作站。

在进行电化学阻抗测试时使用开路电位作为工作电位，振幅为5mV，测试频率范围为0.005～100000Hz。待测试池中电化学开路电位稳定后分别开始测量。

通过以上方法分别获得如图1所示的阻抗Nyquest图。

若需评价杀菌剂的长效性，可添加同一杀菌剂后在不同的时刻点如1h，4h，8h，16h，24h，48h等等分别进行记录。

四、分析：

将测得的电化学数据——如图1所示的阻抗Nyquest采用zView2软件进行拟合和分析，获得拟合等效电路图谱，见图2，并分别获得与八个测试池体系相对应的八组阻抗值和容抗值。

将不同体系的电容及阻抗值对杀菌剂的浓度做图，分别得到图3所示的加入不同浓度的KD-24后电阻值与浓度的变化关系图和图4所示的加入不同浓度的KD-24后电容值与浓度的变化关系图。

从图3和图4中可见：KD-24的浓度从0至60 mg/L之间，随着浓度的增加，体系内电阻值和电容值也相应增加，但KD-24的浓度为60 mg/L至70 mg/L之间体系内电阻值和电容值趋于稳定，说明：采用浓度为70mg/L的杀菌剂KD-24溶液对生物膜的剥离作用是较合适的。

五、验证：

将测试后的各试片用灭菌生理盐水冲洗去除残留杀菌剂，置于已灭菌的试验瓶中，注满培养基，在37℃下恒温培养1周，观察试验瓶中培养液是否变黑评价所加杀菌剂在不同浓度下对生物膜中SRB的是否完全杀灭，验证杀菌剂对生物膜下细菌的杀灭效果。制成如图5所示的表。

从图5的表可见：在浓度为70mg/L的杀菌剂KD-24溶液中处理后的试片上无活性生物存留。这也进一步验证了采用浓度为70mg/L的杀菌剂KD-24溶液对生物膜的剥离的较果是最佳的。

解析：由于体系采用SRB的培养基，电导率较大，因此高频区阻抗环为不完整的四分之一圆环。随着杀菌剂加入量的增加，电极表面电阻不断增大，电容不断减小。说明KD-24与生物膜接触后，通过与生物膜中细菌的吸附作用，在抑制细菌呼吸杀死细菌的同时，也不断渗透进入疏松的生物膜中，生物膜被剥离后金属表面腐蚀产物及生物膜层变薄，因而电容值不断变小，抗菌剂覆盖率增加，季铵盐对基体材料既有缓蚀作用，因此阻抗值随着杀菌剂浓度的增大而增大，在加入量为70mg/L时电阻和电容都趋于稳定值，生物膜完全剥离；同时，杀菌剂KD-24在加入量为70mg/L时，培养瓶培养一周后培养液依然透明，说明生物膜下细菌完全杀灭。

六、应用：

采用浓度为70mg/L的杀菌剂KD-24溶液对现场的油气田水系统进行生物膜剥离。

效果优于以往技术。

Claims

1.一种快速评价杀菌剂对生物膜剥离能力的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述步骤2）中，将密封有试片的介质置于30～60℃恒温环境下培养14天。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于所述试片的工作面积为0.5～1.5cm²。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于在进行电化学阻抗测试时，以开路电位作为工作电位，振幅为5mV，测试频率范围为0.005～100000Hz。