CN104189906A - 用于治疗糖尿病并发症的药用组合物 - Google Patents

Abstract

公开了一种用β-阻滞剂进行给药来治疗糖尿病并发症的方法。糖尿病并发症是由糖尿病引起的，并对它存在很少或不存在治疗选择。本发明描述了β-阻滞剂在糖尿病并发症治疗中的使用。本发明还描述了对作为糖尿病并发症的主要诱发因素之一的醛糖还原酶的抑制作用。还提供了糖尿病伤口愈合的方法。公开了用来治疗诸如糖尿病伤口的糖尿病并发症的组合物。本发明包括施用β-阻滞剂外用制剂来改善糖尿病伤口愈合的过程，所述β-阻滞剂基本上不具有抗菌活性。本发明还涉及提高糖尿病个体在伤口上皮化组织愈合时胶原蛋白的累积速率。

Description

用于治疗糖尿病并发症的药用组合物

本发明申请是名称为“用于治疗糖尿病并发症的药用组合物”、申请日为2008年1月24日、国际申请号为PCT/IN2008/000044，国家申请号为200880003337.0的发明专利申请的分案申请。

技术领域

公开了一种用β-阻滞剂进行给药来治疗糖尿病并发症的方法。糖尿病并发症是由糖尿病引起的，并对它存在很少或不存在治疗选择。本发明描述了β-阻滞剂在糖尿病并发症治疗中的使用。本发明还描述了对作为糖尿病并发症的主要诱发因素之一的醛糖还原酶的抑制作用。还提供了糖尿病伤口愈合的方法。公开了用来治疗诸如糖尿病伤口的糖尿病并发症的组合物。本发明包括施用β-阻滞剂外用制剂来改善糖尿病伤口愈合的过程，所述β-阻滞剂基本上不具有抗菌活性。本发明还涉及提高糖尿病个体在伤口上皮化组织(epithelializedtissue)愈合时胶原蛋白的累积速率。

背景技术

全球范围内发生的糖尿病从1985年估计的30,000,000位患者增加到2007年的估计245,000,000位患者，并将在2025年进一步增加至380,000,000(来源：国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation))。糖尿病和糖尿病并发症的治疗费用在2007年达到了232,000,000,000美元并预计到2025年时将超过302,500,000,000美元。慢性糖尿病导致了多种糖尿病并发症，例如糖尿病神经病变、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病变、糖尿病皮肤病变、糖尿病微血管病变、心肌梗死、黄斑水肿，神经传导受损和糖尿病伤口。

糖尿病并发症的治疗依赖于对血糖水平的控制。因此，标准的抗糖尿病药并不适合作为糖尿病并发症的治疗选择。迫切需要用于糖尿病并发症的新组合物和治疗方式。

面对糖尿病的主要潜在问题之一即是被减弱的伤口愈合。所有患有糖尿病的人群(2,600,000)中的15％在其有生之年可能患上足部溃疡。由于这些溃疡不愈合或愈合极度缓慢，因此这些溃疡实际上有发展为慢性的趋势。目前，患有糖尿病足部溃疡的患者在美国约有750,000人，欧洲约有980,000人，世界上其他地方约有110万人，总计约280万人。由于高达25％的糖尿病足部溃疡患者最终需要进行截肢，因此糖尿病足部溃疡是严重的问题。糖尿病伤口愈合的医疗重要性并没有被过分夸大。进行愈合的能力是人类健康的核心，由于伤口愈合能使患者克服外伤性损伤、外科手术以及由于例如糖尿病的代谢紊乱、微生物因素或其他的物理或化学因素所造成的伤口。

伤口无法愈合在糖尿病中是一个严重的问题，它使发病率增加(JJ.雷诺兹，英国皮肤病学杂志，112715-723(1985)(JJ.Reynolds,British J Dermatol,112715-723(1985))；J.A.加洛韦和C.R.舒曼，美国工业医学期刊，34177-191(1963)(J.A.Galloway and C.R.Shuman,Am J Med,34177-191(1963))；以及S.H.珀尔和I.O.肯纳特，足外科杂志，27,268-270(1988)(S.H.Pearl and I.O.Kanat,J Foot Surg,27,268-270(1988)))。伤口愈合中的修复应答由多个细胞成分进行协调，所述多个细胞成分通过多种途径来共同发挥作用，包括由炎症效应细胞的损害的浸润。随后，成纤维细胞组成与炎症效应细胞一起提供抗菌机制并促进坏死组织的除去，同时产生新的结缔组织。葡萄糖代谢基础性紊乱可能扰乱这些复合物和互相作用的保护过程。

早期的工作已经指出糖尿病伤口愈合中的细胞功能障碍涉及有缺陷的中性粒细胞功能(J.D.巴格达蒂等人，糖尿病，27,677-681(1978)(J.D.Bagdadeet al.,Diabetes,27,677-681(1978)；C.M.诺兰等人，糖尿病，27,889-894(1978)(C.M.Nolan et al.,Diabetes,27,889-894(1978))；A.G.莫厄特和J.鲍姆，临床研究期刊十二月刊，50,2541-2549(1971)(A.G.Mowat and J.Baum,J.ClinInvest December,50,2541-2549(1971)))、伤口的炎性细胞的延迟浸润(D.G.格林哈德等人，美国临床病理学杂志，136,1235(1990)(D.G.Greenhalgh etal.,Am J Pathol,136,1235(1990))和法赫等人，外科学214,175-180(1991)(Fahey et al.,Surg 214,175-180(1991)))、胶原蛋白产量的减少(W.H.古德森和T.K.汉特，分析学报，124,401-411(1977)(W.H.Goodson and T.K.Hunt,J Anal,124,401-411(1977))和W.H.古德森和T.K.汉特，糖尿病四月刊，35,491-495(1986)(W.H.Goodson and T.K.Hunt,Diabetes Apr,35,491-495(1986)))和内源性生长因子(例如碱性成纤维细胞生长因子，它为肉芽组织的较缓慢的形成和伤口闭合提供基础)活性的降低。

超过100种已知的生理因素造成了患有糖尿病的个体的伤口愈合缺陷(欧亚玛等人，糖尿病：研究与临床实践73,227-234(2006)(Oyama,et al.Diabetes:Research and Clinical Practice 73,227-234(2006))；H.布雷姆和M.托米奇-坎尼克，临床研究期刊，117,1219-1222(2007)(H.Brem and M.Tomic-Canic,J.Clin.Invest,117,1219-1222(2007)))。这些因素包括降低或减弱的生长因子产量、血管生成应答、巨噬细胞功能、胶原蛋白的累积、表皮屏障功能、肉芽组织的数量、角质形成细胞和成纤维细胞的迁移和增殖、表皮神经的数量、骨愈合、以及细胞外基质(ECM)组成的积累及其通过金属蛋白酶(MMPs)进行的重建之间的平衡。伤口愈合作为对损伤的细胞应答而发生，并涉及角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和血小板的活化。需要由这些细胞类型释放的许多生长因子和细胞因子相互配合并维持愈合的进行。对患者表皮活检进行的分子分析已经识别了与延迟的伤口愈合有关的病原体标记物。它们包括c-myc的过度表达和β-连环蛋白的核定位。与表皮生长因子受体(EGFR)降低和异常定位以及糖皮质激素途径的活化相结合，抑制了角质形成细胞的迁移。在糖尿病足部溃疡(DFUs)的未愈合边缘(胼胝)处，角质形成细胞表现出不迁移、过度增殖和不完全分化。成纤维细胞显示了表型转化以及降低的迁移和增殖。

糖尿病足部溃疡的病因是复杂的，并且由于各种原因，伤口愈合通常不是非常成功的。糖尿病足部溃疡的病因与外周血管疾病、自主神经病变和内皮功能障碍有关。非最适于伤口愈合的代谢条件(高血糖、高血脂症、高胰岛素血症、促凝血状态)会愈发延迟该过程，并且也可能存在。伤口愈合是一个复杂的过程，它以三个交迭的阶段为特征：炎症、组织形成和组织重建(H.布雷姆和M..托米奇-坎尼克，临床研究期刊，117,1219-1222(2007))。这一顺序过程由真皮和表皮内的细胞的互相作用而引发，伴随着化学赋形剂从炎症细胞、成纤维细胞和角质形成细胞释放。在组织形成过程中，局部细胞和迁移细胞合成的生长因子刺激成纤维细胞迁移进入伤口，成纤维细胞在该伤口处进行增殖并构建细胞外基质。已经知道糖尿病与结缔组织代谢的各种改变有关，结果糖尿病面临伤口愈合不良的问题。在大鼠的糖尿病伤口愈合过程中观察到的普遍特征是炎症，它是初始愈合阶段的缓慢开始，其倾向于使愈合时间延长，降低愈合区域的中性粒细胞的密度，以及导致发生愈合的区域内不能进行巨噬细胞对中性粒细胞的置换。皮肤伤口愈合是复杂且得到良好协调的生物过程，它需要角质形成细胞和成纤维细胞二者及其他细胞类型相互配合的迁移和增殖。表皮创伤产生细胞因子、生长因子、蛋白酶并启动细胞外基质组成的合成，所有这些可以对上皮再形成所必须的角质形成细胞迁移和增殖的过程进行调节。

与糖尿病有关的胶原蛋白的缺失可能是由于新合成的胶原蛋白的合成水平降低和/或其代谢增强所导致的。这些在性质上和在数量上的异常使得在糖尿病病症中观察到被减弱的伤口愈合。

已经报道了糖尿病中细胞损伤的多种机制(酒田等人，动脉粥样硬化血栓症杂质，3,169-176(2000)(Sakata et al.,J.Atheroscler.Thromb.3,169-176(2000))；D.K.维斯、M.J.希兹，维生素与激素，60,149-193(2000)(D.K.Ways,M.J.Sheetz,Vitam.Horm.60,149-193(2000)；真岛等人，脂血症新见，4,411-418(2001)(Mashima,et al.,Curr.Opin.Lipidol.4,411-418(2001)))，包括加速的糖化作用、提高的蛋白激酶C的活性以及增加的氧化应激，但对于精确的机制并没有得到完全的理解。崛田小组(N.坂本、J.H.木下、P.F.卡多尔、N.崛田，多元醇通路及其在糖尿病并发症中的作用，艾斯维尔科学出版社B.V.，阿姆斯特丹，1988(N.Sakamoto,J.H.Kinoshita,P.F.Kador,N.Hotta,PolyolPathway and its Role in Diabetic Complications,Elsevier Science B.V.,Amsterdam,1988))认为多元醇通路的参与是由高浓度葡萄糖诱导的多种器官损伤的机制。所述多元醇通路由两步组成。第一步是葡萄糖向山梨糖醇的转化，第二步是山梨糖醇向果糖的转化。关键酶是将葡萄糖转化为山梨糖醇的醛糖还原酶。在许多组织中发现了这种酶。高血糖增强了这种多元醇通路，结果使山梨糖醇在细胞内累积。山梨糖醇在细胞内的累积引起各种器官损伤。已经认为高渗透压和高氧化应激是多元醇通路参与细胞损伤的机制。然而，仍然没有完全理解多元醇通路的精确机制。已经观察到，高葡萄糖诱导的内皮细胞损坏可以由伴随有增强的氧化应激的多元醇通路的活化介导。醛糖还原酶抑制剂的使用说明了对多元醇通路的抑制可以防止糖尿病病症下发生的内皮细胞损坏。

已知β-肾上腺素能受体参与了伤口愈合的过程，而且激动剂已经表现出延迟伤口愈合过程。也已经证实了β-肾上腺素能受体的诱导抑制角质形成细胞迁移，这延迟了伤口愈合(陈等人，皮肤病学研究杂志，119,1261-8(2002)(Chenet al.,J.Invest.Dermatol.119,1261-8(2002)))。还有其他的文献描述了水溶液形式或滴眼液(opthalmic drops)形式的β-拮抗剂的外部应用(雷迪等人，英国眼科学杂志，78,377-380(1994)(Reidy et al.,Br.J.Ophthalmol.78,377-380(1994))。传田等人，皮肤病学研究杂志，121,142-148(2003)(Denda et al.,J.Invest.Dermatol.121,142-148(2003)))。此外，β-阻滞剂能够增加梗塞的心脏处的血管生成说明了它们促进了血管生成，这在伤口愈合中可能是有用的(美国生理学杂志-心脏与循环生理学(Am J Physiol Heart Circ Physiol.2005))。另外，普萘洛尔(propranolol)通过控制cAMP和cGMP的比例显示出增强肺胶原蛋白(RC林登斯米特和HP威特斯奇；药理与实验治疗，232,346-350(1985)(RC Lindenschmidt and HP Witschi；Pharmacology andExperimental Therapeutics,232,346-350(1985)))。然而，对于β-肾上腺素能受体阻滞剂在糖尿病并发症(例如糖尿病伤口愈合)中的用途未有报道，而且糖尿病伤口愈合涉及的病理与常规或外伤伤口愈合不同。

发明内容

本发明提供了通过用β-肾上腺素能拮抗剂或β-阻滞剂进行给药来治疗由糖尿病引起的糖尿病并发症的方法和组合物。本发明还提供了用来治疗糖尿病患者的慢性糖尿病伤口的方法，该方法包括用治疗剂量的试剂向患者进行给药，例如β-肾上腺素能阻滞剂，它对增强的醛糖还原酶活性进行抑制，提高一氧化氮水平，促进成纤维细胞的迁移，减少肉芽组织的形成并提高血管灌注，因此使向愈合的糖尿病伤口供给的氧气增加。

本发明的一个目的是提供一种治疗哺乳动物的糖尿病并发症的方法，该方法包括将在治疗上有效量的β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐给药于需要这种治疗的患者。该在治疗上有效量的β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐在其药用可接受载体、赋形剂或稀释剂中被提供。优选地，所述糖尿病并发症选自由糖尿病神经病变、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病变、糖尿病皮肤病变、糖尿病微血管病变、心肌梗死、黄斑水肿、神经传导受损和糖尿病伤口所组成的组。

β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐可以以缓释形式进行给药。所述哺乳动物可以为灵长类动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、骆驼科动物、山羊、啮齿动物或马科动物。优选地，所述哺乳动物为人类。

可以通过用在治疗上有效量的β-肾上腺素能阻滞剂进行给药来治疗糖尿病并发症，所述β-肾上腺素能阻滞剂可以包括但不限于：醋丁洛尔(acebutolol)、阿普洛尔(alprenolol)、氨磺洛尔(amosulalol)、阿罗洛尔(arotinolol)、阿替洛尔(atenolol)、苯呋洛尔(befunolol)、倍他洛尔(betaxolol)、贝凡洛尔(bevantolol)、比索洛尔(bisoprolol)、波吲洛尔(bopindolol)、溴苄铵(bretylol)、布库洛尔(bucumolol)、布菲洛尔(bufetolol)、丁呋洛尔(bufuralol)、布尼洛尔(bunitrolol)、布引洛尔(buprandolol)、布拉洛尔(bupranolol)、丁非洛尔(butofilolol)、卡拉洛尔(carazolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、西他洛尔(cetamolol)、西那洛尔(cinamolol)、氯拉洛尔(cloranolol)、地来洛尔(dilevatol)、恩布洛尔(entbutolol)、依泮洛尔(epanolol)、艾司洛尔(esmolol)、呋洛尔(fumolol)、茚诺洛尔(indenolol)、替莫洛尔(istalol)、拉贝洛尔(labetalol)、左倍他洛尔(levobetaxolol)、左布诺洛尔(levobunolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、美替洛尔(metipranolol)、美替普萘洛尔(metipropranolol)、美托洛尔(metoprolol)、莫普洛尔(moprolol)、纳多洛尔(nadolol)、萘肟洛尔(nadoxolol)、奈比洛尔(nebivolol)、尼普地洛(nipradilol)、美替卜洛尔(optipranolol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、培布洛尔(perbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普拉洛尔(practolol)、萘心定(pronethalol)、普萘洛尔(propranolol)、胡椒喘定(protokylol)、索他洛尔(sotalol)、磺苄心定(sulfinalol)、他林地洛(talindol)、特他洛尔(tertatolol)、替索洛尔(tillisolol)、噻吗洛尔(timolol)、托利洛尔(toliprolol)、抑肽酶(trasylol)、希苯洛尔(xibenolol)及其药物可接受盐或溶剂化物。可以按每小时、每日、每周或每月进行给药。每日给药可以为每天给药1-6次。

β-肾上腺素能阻滞剂可以通过经口、静脉内、腹腔内、眼部、非消化道、外用、皮下、硬膜下、静脉内、肌肉内、鞘内、腹腔内、脑内、动脉内、病灶内、局部或肺部途径进行给药。当通过经口途径进行给药时，β-肾上腺素能阻滞剂的剂量优选为约1mg至1000mg。当通过眼部途径给药时，β-肾上腺素能阻滞剂的剂量优选为约0.001％至10.0％。当通过外用途径进行给药时，β-肾上腺素能阻滞剂的剂量优选为约0.001％至50.0％.

本发明还提供用于对需要治疗的患者的糖尿病伤口愈合进行治疗的外用药用组合物，该组合物包括在治疗上有效量的β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐，以及药用可接受外用载体、赋形剂或稀释剂，其中，所述组合物的形式为乳膏(cream)、软膏(ointment)、外用药签(topical swab)、乳液(emulsion)、喷雾(spray)或洗剂(lotion)。

本发明还提供一种用于对需要治疗的患者的糖尿病伤口愈合进行治疗的外用药用组合物，该组合物包括在治疗上有效量的β-肾上腺素能阻滞剂艾司洛尔、其前药或其药物可接受盐，以及药用可接受外用载体、赋形剂或稀释剂，其中，所述组合物的形式为乳膏、凝胶、外用液(topical solution)、皮肤贴(patch)、软膏、外用药签、乳液、喷雾或洗剂。

本发明还提供一种治疗糖尿病伤口的方法，该方法包括向需要治疗的患者用治疗量的β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐进行外部给药。优选地，所述β-肾上腺素能阻滞剂为艾司洛尔。用来治疗糖尿病并发症的艾司洛尔可以参与选自由以下机制所组成的组的机制：诱导一氧化氮产生；提高糖尿病伤口处胶原蛋白的水平；通过增强糖尿病伤口处的新生血管来提高血管灌注；通过增强糖尿病伤口的血管灌注来增加氧供给；对糖尿病患者体内提高的醛糖还原酶活性进行抑制；增强在糖尿病伤口中的生长因子，例如神经生长因子、上皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子，以及它们的组合。

可以以乳膏、软膏、外用药签、乳液、喷雾或洗剂的形式外部施用β-肾上腺素能阻滞剂。当所述β-肾上腺素能阻滞剂为艾司洛尔时，可以以乳膏、凝胶、外用液、皮肤贴、软膏、外用药签、乳液、喷雾或洗剂的形式外部施用艾司洛尔。所述哺乳动物可以为灵长类动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、骆驼科动物、山羊、啮齿动物或马科动物。优选地，所述哺乳动物为人类。

本发明进一步提供治疗哺乳动物中的由醛糖还原酶介导的糖尿病并发症的方法，该方法包括向需要治疗的患者用在治疗上有效量的具有醛糖还原酶活性的β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐进行给药。优选地，所述β-肾上腺素能阻滞剂为艾司洛尔、噻吗洛尔或普萘洛尔(propanolol)。在治疗上有效量的β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐可以在其药用可接受载体、赋形剂或稀释剂中被提供。

优选地，由醛糖还原酶介导的糖尿病并发症选自由糖尿病神经病变、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病变、糖尿病皮肤病变、糖尿病微血管病变、心肌梗死、黄斑水肿、神经传导受损和糖尿病伤口所组成的组。

具体实施方式

根据本发明的具体实施方式，使用下列缩写和定义。应该注意的是，当使用于此时，单数形式“一个(a)”、“与”和“该(the)”包括多个被提及对象，除非上下文已经明确表示是其他意思。因此，例如，对“剂量”的描述包括本领域公知的一种或多种剂量及其等效量。

本文所讨论的出版物在本申请的申请日之前单独地提供它们公开的内容。本文中没有形成这样的认可：本发明无权借助于在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版物的日期可能与实际公开日期不同，这需要另外进行确认。

本文使用的术语“受治疗者(subject)”或“患者”表示包括哺乳动物。所述哺乳动物可以为灵长类动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、骆驼科动物、山羊、啮齿动物或马科动物。优选地，所述哺乳动物为人类。

本文使用的术语“疗效(efficacy)”表示的特定处理规则的有效性。对治疗糖尿病并发症和伤口的疗效进行评价的方法是治疗和诊断医疗行业中公知的。

短语“药物可接受载体”和“药物可接受赋形剂”是表示用于形成制剂中仅起到载体作用的部分的任意化合物。所述药物可接受载体或赋形剂通常是安全无毒的，并且既不是生物剂也不会产生不期望的效果。本发明中使用的药物可接受载体或赋形剂包括一种或多于一种的这种载体或赋形剂。

本文使用的术语“治疗”和“处理”等通常表示获得期望的药理学和生理学的效果。更具体地说，本文中描述的试剂用于治疗患有糖尿病并发症和/或糖尿病伤口的患者。可以通过醛糖还原酶或其他的作用机制(例如对醛糖还原酶活性增强进行抑制、诱导一氧化氮产生；提高糖尿病伤口处胶原蛋白的水平；通过增强糖尿病伤口处的新生血管来提高血管灌注；通过增强糖尿病伤口的血管灌注来增加氧供给；对糖尿病患者体内提高的醛糖还原酶活性进行抑制；增强在糖尿病伤口中的生长因子，例如神经生长因子、上皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子)来介导糖尿病并发症。本文中使用的术语“处理”，包括了对哺乳动物(特别是人类)的疾病进行的任何处理。

“在治疗上有效量”表示当用本文公开的剂(agent)、试剂、化合物、组合物或这些物质的组合对哺乳动物进行给药时，它们的足以有效地对抗糖尿病并发症或糖尿病伤口的量。

在美国，至少有17,000,000的人患有糖尿病，并且每年还会诊断出接近1,000,000的新增病例。糖尿病人口中的大部分被诊断有严重的糖尿病并发症，包括糖尿病神经病变、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病变、糖尿病皮肤病变、糖尿病微血管病变、心肌梗死、黄斑水肿、神经传导受损和糖尿病伤口。目前对患有糖尿病并发症的患者的治疗选择是有限的。因此，对于有效治疗糖尿病并发症的迫切需要就成为本发明的主要课题。

糖尿病伤口患者通常表现出减少的伤口炎症、伤口感染的复发、减少的皮肤微血管灌注、伤口胶原蛋白沉积不足以及疤痕化脓。血小板衍生生长因子(PDGF)不足与慢性糖尿病溃疡有关，并引起减弱的愈合(H D毕尔，M T龙雅可，S沃纳，皮肤病学研究杂志109,132(1997)(H D Beer,M T Longaker,S Werner,J Invest Dermatol 109,132(1997))。使用了瑞格兰奈RTM(Regranex.RTM)的临床试验仅在半数或更少的被评价患者中表现出了促进慢性足部溃疡愈合的疗效(D L斯蒂德，血管外科杂志，21,71(1995)(D LSteed,J Vase Surg,21,71(1995))。

对促使糖尿病伤口愈合减弱的通路进行的调查揭示了一些造成不良愈合应答的因子。大血管和小血管的动脉粥样硬化阻止氧气和营养物质向伤口的输送。神经病变导致了保护性敏感性的损失和局部外伤。最终，有缺陷的免疫防御抑制了对死细胞的细胞吞噬作用并促进了感染。高血糖本身导致了晚期糖基化终产物(AGE’s)的形成，它将细胞膜与外细胞间质蛋白结合并阻止它们发挥作用。发现在糖尿病伤口处缺乏生长因子(例如血小板衍生生长因子、转化生长因子β和血管内皮生长因子)，而在糖尿病伤口液体中的基质金属蛋白酶和过氧化物的水平上升。

长期升高的血糖水平导致了白细胞功能的降低和细胞营养不良，这引起了高的伤口感染率以及糖尿病患者中的相关愈合问题。糖尿病足部溃疡的发生也是多种其他因素的结果。这些因素包括足部的骨架结构构造的机械变化、外周神经病变和动脉粥样硬化外周动脉疾病，所有这些在糖尿病人口中具有高发频率和强度。非酶糖化容易使韧带变得僵硬。神经病变造成脚和腿中的保护性感觉丧失和肌肉群的协调丧失，这二者增加了行走过程中的机械应力。也已知糖尿病与结缔组织代谢中的各种变化有关，其结果是，糖尿病面临着伤口愈合不良的问题。与糖尿病有关的胶原蛋白的损失可能是由于新合成的胶原蛋白的合成水平降低或代谢增强，或同时由于这二者的原因所导致的。这些在性质上和在数量上的异常使得在糖尿病病症中观察到减弱的伤口愈合。

在上述描述的其他通路中，已经反映出多元醇通路是由高浓度葡萄糖诱导的各种器官损伤(包括糖尿病足部溃疡)的机制。病原学研究的结果表示高血糖通过山梨糖醇的累积和蛋白质糖化作用而诱导了与糖尿病有关的并发症。多元醇通路包括两个步骤。第一步是葡萄糖向山梨糖醇的转化，第二步是山梨糖醇向果糖的转化。关键酶是将葡萄糖转化为山梨糖醇的醛糖还原酶。在许多组织中发现了这种酶。

现存的醛糖还原酶抑制剂包括例如托瑞司他(tolrestat)、唑泊司他(zopolrestat)、非达司他(fidarestat)、和依帕司他(epalrestat)的分子。本发明提供了特定β-肾上腺素能阻滞剂(例如艾司洛尔、普萘洛尔和噻吗洛尔)的醛糖还原酶抑制活性的第一证据。本发明发现的特定β-肾上腺素能阻滞剂的醛糖还原酶抑制活性使它们被定位成用来治疗由醛糖还原酶介导的疾病(例如糖尿病并发症)的药物。提高的醛糖还原酶活性导致了山梨糖醇累积的加剧，引起了多种糖尿病并发症。本发明提供了对β-肾上腺素能阻滞剂的醛糖还原酶抑制活性的发现，以及它们在治疗诸如糖尿病伤口愈合的糖尿病并发症中的应用。

山梨糖醇在细胞内的累积引起各种细胞损伤，这种细胞损伤又引起了皮肤微血管病变。糖尿病可以通过多种机制导致微血管病变。这些机制包括过量的山梨糖醇的形成、增加的糖基化终产物、氧化性损坏和蛋白激酶C过度活动。所有这些过程都在皮肤内发生，并且糖尿病皮肤微血管病变的存在已经得到了完全地证实。这些微血管病变的变化与皮肤血流量的异常有关。因为皮肤起到体温调节的作用，所以在正常皮肤内存在大量的毛细血管富余(capillar_yredundancy)。在糖尿病患者中，毛细血管的损失与灌注储量的减少有关。相关的微血管灌注不能满足皮肤代谢的要求可能导致患有糖尿病例如糖尿病伤口的患者的各种皮肤损害。

神经病变是另一种常见的糖尿病并发症，它由多元醇通路的活化导致。糖尿病足部溃疡患者在足底、足内侧和足外侧表面几乎都患有临床意义上的外周神经病变。因而发生的神经损坏显示了外周神经病变，这易使患者患上糖尿病溃疡。糖尿病神经病变的病理学涉及氧化应激、晚期糖基化终产物、多元醇通路流量以及蛋白激酶C活化，这些都促进糖尿病伤口中所见的微血管病变和神经功能障碍。

已经提出将渗透压和氧化应激的增加作为多元醇通路参与细胞和组织损伤的其他机制。因此，醛糖还原酶抑制剂改善皮肤灌注，诱导神经再生并降低氧化应激，从而促进糖尿病伤口愈合。

设计本发明的方法和组合物，其基于在控制条件下对来自患者的样本中的一氧化氮(NO)的合成进行测量，来检测、治疗和监控具有不良伤口愈合能力的糖尿病患者。本发明发现糖尿病患者表现了NO合成能力的连续谱，并且在谱的较低端的糖尿病患者具有被减弱的伤口愈合功能。

对于NO在伤口发炎、组织修复和微血管稳态(microvascular homeostasis)中的作用的近期研究表明，NO是伤口愈合的主要调节因子(D布鲁赫-吉哈尔兹，T鲁茨卡，V科尔布-巴霍芬，皮肤病学研究杂志，110,1(1998)(DBruch-Gerharz,T Ruzicka,V Kolb-Bachofen.J Invest Dermatol.110,1(1998))；M R谢弗等人，外科学，121,513(1997)(M R Schaffer et al.,Surgery 121,513(1997)))。已经在所有的糖尿病中观察到了内皮细胞产生的NO的全身性不足(A维弗斯等人，糖尿病，47,457(1998)；(A Veves et al.,Diabetes,47,457(1998))；M胡斯卡等人，血栓形成研究，86(2),173(1997)(M Huszka etal.,Thrombosis Res,86(2),173(1997))；S B威廉斯，J A库斯科，M A罗迪，M T汉斯顿，MA克里格，美国心脏学会杂志，27(3),567(1996)(S BWilliams,J A Cusco,M A Roddy,M T Hohnston,M A Creager,J.Am.Col.Cardiol.,27(3),567(1996)))，这反映了在慢性的、难愈性的下肢溃疡(LEU)的发病机制中NO发挥了基础作用。因此，需要将糖尿病病人的伤口愈合能力与NO的产量联系起来。这种联系使得可能开发出基于糖尿病病人的NO产量来预测他们的伤口愈合能力的方法，并可能提供一种有用的临床指标，该临床指标可以起到选择适当疗法的基础的作用。

NO是小的疏水性气态自由基，它是用于自主功能(例如血管舒张、神经传递和肠蠕动)的重要的生理介体。NO通过活化其靶分子鸟苷酸环化酶而提供细胞信号传导，所述鸟苷酸环化酶提高了环磷酸鸟苷(cGMP)的细胞内浓度(JS贝克曼，一氧化氮，J.兰卡斯特，初级版(学术出版社，纽约)第一章(J S Beckman,in Nitric Oxide,J.Lancaster,Jr.,Ed.(Academic Press,N.Y.),chap.1)。细胞信号传导的进行不需要通道或细胞膜受体的介导，依赖于细胞环境中的NO浓度。NO在生物组织中的半衰期约5秒。它由一氧化氮合酶(NOS)的三种亚型产生，所述一氧化氮合酶将L-精氨酸和分子氧代谢产生瓜氨酸和NO。这三种亚型中的两种为结构酶系统(cNOS)，被描述在神经元细胞(nNOS)和内皮细胞(eNOS)中(D布鲁赫-吉哈尔兹，T鲁茨卡，V科尔布-巴霍芬，皮肤病学研究杂志，110,1(1998)(D Bruch-Gerharz,T Ruzicka,V Kolb-Bachofen.J Invest Dermatol.110,1(1998))。由于这些亚型，细胞内的钙通过钙调蛋白对酶进行活化。钙依赖性cNOS系统产生低(皮摩尔)浓度的NO。第三种系统为可诱导亚型(iNOS)，它是不依赖于钙的。iNOS的表达是通过组织特异性的刺激(例如炎性细胞因子或细菌脂多糖(LPS))而被诱导。所述可诱导的亚型以比cNOS高得多(纳摩尔(nanomolar))的浓度释放NO，并具有有力的细胞毒作用。

cNOS酶参与调解并保持皮肤稳态(S蒙卡达，A希格斯，新英格兰医学杂志，329,2002(1993)(S Moncada,A Higgs,N Eng J Med 329,2002(1993))。iNOS酶表现出主要与也存在于特定皮肤疾病中的炎症和免疫应答有关。在人类皮肤中，角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞具有cNOS和iNOS这两种亚型。伤口巨噬细胞和角质形成细胞具有iNOS亚型。在伤口愈合研究中显示，当受到损伤并且产生巨噬细胞成为主要的细胞来源之后，发生NO合成以延长期间(10-14天)(MR谢弗，U唐翠，RA范韦瑟普，A巴布尔，外科研究杂志，71,25(1997)(M R Schaffer,U Tantry,R A vanWesep,A Barbul.J Surg Res,71,25(1997)))。作为组织修复的介体，NO被证实为促进血管生成(A帕帕沛丘珀鲁斯，G加西亚-卡登那，JAA马德瑞，WC西萨，临床研究杂志，100(12),3131(1997)(A Papapetropoulos,G Garcia-Cardena,J A A Madri,W CSissa.J Clin Invest,100(12),3131(1997)))和细胞迁移(志津子等人，美国生理学杂志，279:C794(1996)(Noiri et al.,Am.J.Physiol.279:C794(1996)))，增加伤口胶原蛋白沉积和胶原蛋白交联(MR谢弗，U唐翠，SS格罗斯，HL瓦瑟堡，A巴布尔，外科研究杂志，63,237(1996)(M R Schaffer,U Tantry,S S Gross,H L Wasserburg,A Barbul.J Surg Res,63,237(1996)))，调节微血管稳态(血管舒张)(D布鲁赫-吉哈尔兹，T鲁茨卡，V科尔布-巴霍芬，皮肤病学研究杂志，110,1(1998)(D Bruch-Gerharz,T Ruzicka,VKolb-Bachofen.J Invest Dermatol.110,1(1998))，抑制血小板聚集(JS贝克曼，一氧化氮，J.兰卡斯特，初级版(学术出版社，纽约)第一章(J S Beckman,inNitric Oxide,J.Lancaster,Jr.,Ed.(Academic Press,N.Y.),chap.1)，抑制内皮-白细胞粘附的形成(AM勒夫尔，DJ勒夫尔，心血管研究，32,743(1996)(A M Lefer,D J Lefer,Cardiovascular Res.32,743(1996)))，调节内皮的增殖和细胞凋亡(YH沈，XL王，DE威尔卡克，生化学会通讯，433(1-2),125(1998)(Y H Shen,X L Wang,D E Wilcken,FEBS Lett,433(1-2),125(1998)))，提高随意皮瓣(random cutaneous flaps)的活力(SC厄姆等人，整形外科，101 785(1998)(SC Um et al.,Plast Reconstr Surg.101 785(1998))；GF皮尔斯等人，美国科学院院刊，86,2229(1989)(G F Pierce et al.,Proc Natl Acad Sci USA.86,2229(1989)))，以及增强细胞免疫调控和细菌细胞毒性(JS贝克曼，一氧化氮，J.兰卡斯特，初级版(学术出版社，纽约)第一章(J S Beckman,in Nitric Oxide,J.Lancaster,Jr.,Ed.(Academic Press,N.Y.),chap.1)。

糖尿病中，正常的伤口修复可能受到严重威胁。通常来说，在伤口愈合过程中，NO提供增强的组织氧的可利用度、修复机制的炎性介导和伤口基质的发展和重建。NO的主要代谢途径是变成硝酸盐和亚硝酸盐，它们是组织、血浆和尿液中的稳定的代谢物(S蒙卡达，A希格斯，新英格兰医学杂志，329,2002(1993)(S Moncada,A Higgs,N Eng J Med 329,2002(1993))。人类中的示踪研究已经证实了体内硝酸盐/亚硝酸盐的总量的50％产生自NO合成的底物L精氨酸(PM罗德斯，AM利昂，PL弗朗西斯，AD史特瑟斯，S蒙卡达，生物药学生理研究通讯，209,590(1995)(P M Rhodes,A M Leone,P L Francis,AD Struthers,S Moncada,Biomed Biophys Res.Commun.209,590(1995))；L卡斯蒂略等人，美国学院院刊，90,193(1993)(L Castillo et al.,Proc Natl Acad SciUSA 90,193(1993)))。虽然硝酸盐和亚硝酸盐不是具有生物活性的NO的度量，但是从经历适当的禁食期后并可选地进行饮食控制之后(低硝酸盐/低精氨酸)的受治疗者所获得的血浆和尿液样品允许使用硝酸盐和亚硝酸盐作为NO活性指数(C贝利斯，P瓦伦斯，肾与高血压当前观点，7,59(1998)(C Baylis,P Vallance,Curr Opin Nephrol Hypertens 7,59(1998))。

本发提供了确定糖尿病受治疗者是否为伤口愈合糖尿病病人或难愈性伤口糖尿病病人的方法。“伤口愈合糖尿病病人”指的是糖尿病受治疗者的伤口愈合能力大约与非糖尿病受治疗者相同。“难愈性伤口糖尿病病人”指的是糖尿病受治疗者的伤口愈合能力比非糖尿病受治疗者低，并因此处于下肢溃疡(LEU)的风险中。例如，在一个临床研究中，认为非伤口愈合糖尿病病人是那些具有一次或多次糖尿病足部溃疡病史的患者，在Regranex.RTM治疗20周后仍未完全愈合。患有糖尿病病症的人或动物是血浆葡萄糖浓度的调节有缺陷的人或动物，这通常是胰岛素产生不足或抗胰岛素生理效果的结果。例如，该受治疗者可以为由内科医生诊断为患有I型或II型糖尿病的人类患者。

根据本发明的受治疗者可以为任意的患有糖尿病病症(例如糖尿病)的人或动物。所述动物可以为哺乳动物。所述哺乳动物可以为灵长类动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、骆驼科动物、山羊、啮齿动物或马科动物。优选地，所述受治疗者为人。

给药方法

本发明的一个方面是β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐在治疗包括由任意形式的糖尿病引起的糖尿病并发症的病症中的应用。

β-肾上腺素能阻滞剂可以包括但不限于：醋丁洛尔、阿普洛尔、氨磺洛尔、阿罗洛尔、阿替洛尔、苯呋洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、波吲洛尔、溴苄铵、布库洛尔、布菲洛尔、丁呋洛尔、布尼洛尔、布引洛尔、布拉洛尔、丁非洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、塞利洛尔、西他洛尔、西那洛尔、氯拉洛尔、癸酰(decanoyl)、十二酰(dodecanoyl)、地来洛尔、恩布洛尔、依泮洛尔、艾司洛尔、呋洛尔、茚诺洛尔、替莫洛尔、拉贝洛尔、左倍他洛尔、左布诺洛尔、甲吲洛尔、美替洛尔、美替普萘洛尔、美托洛尔、莫普洛尔、十四酰(myristoyl)、纳多洛尔、萘肟洛尔、奈比洛尔、尼普地洛、辛酰(octanoyl)、美替卜洛尔、氧烯洛尔、十六酰(palmitoyl)(美国专利No.4897417)、喷布洛尔、培布洛尔、吲哚洛尔、普拉洛尔、萘心定、普萘洛尔、胡椒喘定、索他洛尔、康力龙(stanozolol)、磺苄心定、他林地洛、特他洛尔、替索洛尔、噻吗洛尔、托利洛尔、抑肽酶、希苯洛尔、肾上腺素能阻断剂、它们的前药或它们的药用可接受盐。它们的前药包括能够在体内代谢中释放β-肾上腺素能阻滞剂的所有β-肾上腺素能阻滞剂衍生物。例如，能够在代谢中释放艾司洛尔的所有艾司洛尔衍生物都是潜在的艾司洛尔前药。

已经发现艾司洛尔通过各种机制治疗例如糖尿病伤口的糖尿病并发症，所述机制包括但不限于：诱导一氧化氮产生；提高糖尿病伤口处胶原蛋白的水平；通过增强糖尿病伤口处的新生血管来提高血管灌注；通过增强糖尿病伤口的血管灌注来增加氧供给；对糖尿病患者体内提高的醛糖还原酶活性进行抑制；增强在糖尿病伤口中的生长因子，例如神经生长因子、上皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、或他们的组合。

本发明的β-肾上腺素能阻滞剂可以具有介导醛糖还原酶活性。所述具有介导醛糖还原酶活性的β-肾上腺素能阻滞剂包括但不限于艾司洛尔、噻吗洛尔或普萘洛尔。具有介导醛糖还原酶活性的β-肾上腺素能阻滞剂在对糖尿病并发症的治疗中特别有用。例如，艾司洛尔是优选的用于糖尿病伤口愈合治疗的β-肾上腺素能阻滞剂。然而，所有的β-肾上腺素能阻滞剂在任意预想的糖尿病并发症的治疗中都可以是有用的。

用于伤口愈合的β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其盐优选在生理可接受载体内向受治疗者进行外部给药。然而，对于除了糖尿病伤口以外的糖尿病并发症的治疗，β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐可以以多种方式进行给药，给药方式包括但不限于经口给药、经眼部给药、非消化道给药(包括外用、皮下(s.c.)、硬膜下、静脉注射(i.v.)、肌肉注射(i.m.)、鞘内、腹腔注射(i.p.)、脑内、动脉内或病灶内给药途径)、局部(例如外科施用或外科栓剂(surgical suppository))和肺部(例如，喷雾剂、吸入剂或粉末)，将在下文中进一步描述。

含有具有β-肾上腺素能受体拮抗剂的化合物的药用组合物的正确剂量将根据药物制剂、施用模式以及特定位点、寄主以及所治疗的糖尿病并发症而不同。包括年龄、体重、性别、饮食、给药时间、排泄率、寄主病症、联合用药、反应敏感度和疾病的严重程度的其它因素是治疗的专业人员或本领域技术人员可以很容易地考虑到的。

可以在最大耐受剂量的范围内持续地或周期性地进行给药。例如，根据需要，可以每小时进行给药、每两小时给药一次、每三小时给药一次、每六小时给药一次、每12小时给药一次、每日进行给药、每周进行给药、每两周进行给药、每三周进行给药或每月进行给药。

给药的外用途径是治疗诸如难愈合糖尿病伤口的糖尿病并发症的优选途径。适于外部给药的组合物可以包括乳膏、洗剂、肥皂、香波(shampoo)、气雾剂、香脂(balm)、凝胶、血清、摩丝(mousse)、皮肤贴、泵式喷雾剂(pumpspray)、走珠(roll-on)、外用液、棒、湿巾(towelette)、护足产品、软膏、湿纸巾(wipe)、乳液、润肤剂、外用药签和它们的任意组合。

因此，本发明提供了用于外部给药的药用组合物，用于治疗糖尿病伤口愈合，该组合物包括β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐，以及药用可接受外用载体、赋形剂或稀释剂。所述外用组合物的形式优选为乳膏、软膏、外用药签、乳液、喷雾或洗剂。该组合物可以以缓释的形式被提供。

已经发现艾司洛尔在糖尿病伤口愈合的治疗中是有用的。因此，本发明提供了用于外部给药的药用组合物，用于治疗糖尿病伤口愈合，该组合物包括艾司洛尔、其前药或其药物可接受盐，以及药用可接受外用载体、赋形剂或稀释剂。包括艾司洛尔的外用组合物的形式优选为凝胶、皮肤贴、外用液、乳膏、软膏、外用药签、乳液、喷雾或洗剂。该组合物可以以缓释的形式被提供。

根据摄入方式，可以以各种方式配制β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐。用于外部给药的制剂中的治疗活性成分的浓度可以在约0.001％至50.0％的浓度范围内变化。优选地，用于外部给药的制剂中的治疗活性成分的浓度可以在约0.01％至40.0％的浓度范围内变化。更优选地，用于外部给药的制剂中的治疗活性成分的浓度可以在约0.001％至20.0％的浓度范围内变化。

有文献记载了现存的用来治疗高眼压(IOP)的滴眼液(滴剂)和眼用凝胶形式的β-阻滞剂的外用制剂。用于治疗心脏病的β-阻滞剂的经皮贴剂(国际专利公布No.WO/2000/035439/美国专利No.5362757)也已经被制造出来了。然而，并没有文献记载外部施用于皮肤或真皮的β-肾上腺素能阻滞剂的制剂。本发明提供了作为外部施用的β-肾上腺素能阻滞剂(例如艾司洛尔)的制剂。

在例如糖尿病伤口的糖尿病并发症的治疗中，含有盐酸艾司洛尔作为活性成分的组合物可以以外用制品的方式方便地向需要治疗的受治疗者进行给药，所述外用制品具有约0.001％至50.0％的盐酸艾司洛尔浓度。

优选地，所述β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐被配制为用于在合适的惰性载体内进行外部给药。例如，所述β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐在载体溶液中的浓度通常为约0.1％至约50.0％。通过给药途径来确定给药剂量。

用于经口给药的制剂中的治疗活性成分的浓度可以在约1mg到1000mg的浓度范围内变化。用于眼部给药的制剂中的治疗活性成分的浓度可以在约0.001％到10.0％的浓度范围内变化。

对于非肠道给药，本发明的β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐可以以可注射剂量的在具有药用可接受载体的生理可接受稀释剂中的物质的溶液或悬浮液的形式进行给药，所述具有药用可接受载体的生理可接受稀释剂可以为无菌液，例如添加有或未添加有表面活性剂的水和油。其它可接受稀释剂包括动物油、植物油或合成油，例如，花生油、大豆油和矿物油。通常来说，二醇类(例如丙二醇或聚乙二醇(PEG))是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液而言。本发明的β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐可以以储库型注射(depot injection)或植入制品的方式进行给药，它们可以以允许活性成分控制或缓释的方式被配制

根据本发明的一个方面，β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐可以被单独给药，或者与其他以上讨论的试剂的组合给药以治疗和/或改善由任意形式糖尿病引起的诸如糖尿病并发症的病症。这些试剂也可以用于制备对患者进行治疗所用的药剂中。用于治疗与糖尿病有关的病症的治疗剂给药可以在给药β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐之前、同时或之后进行。对受治疗者用β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐进行的给药可以在任意其他的糖尿病治疗形式之前、同时或之后进行。基于伤口的严重程度和熟练的医疗服务提供者公知的其他因素，可以根据需要以每小时、每日、每周或每月向受治疗者进行β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐的给药。优选地，以每周进行β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐的给药，给药一周或更多周。治疗的优选规则是连续地或间歇地外部施用优选的制剂，这根据每个患者的情况和糖尿病伤口的位置和严重程度而不同。

含有β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐的药用组合物还可以包括药用可接受的无毒的载体或稀释剂，它们是通常用来配制对动物或人类进行给药的药用组合物的赋形剂。制剂也可以包括传统的添加剂、例如助溶剂、等渗剂(isotonic agents)、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

所述组合物可以被配制为缓释。本发明的所述β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐可以以缓释形式进行给药，例如，储库型注射、植入制品、或渗透泵，它们可以以允许活性成分缓释的方式来配制。缓释制剂的植入剂是本领域公知的。植入剂被配制为微球体、片等，具有可生物降解的或不可生物降解的聚合物。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成易蚀的聚合物，寄主对该易蚀的聚合物具有良好耐受性的。

本发明还提供治疗由醛糖还原酶介导的糖尿病并发症的方法，该方法包括将在治疗上有效量的具有醛糖还原酶活性的β-肾上腺素能阻滞剂、其前药或其药物可接受盐进行给药。优选地，所述β-肾上腺素能阻滞剂为艾司洛尔、噻吗洛尔或普萘洛尔。所述由醛糖还原酶介导的糖尿病并发症可以包括但不限于：糖尿病神经病变、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病变、糖尿病皮肤病变、糖尿病微血管病变、心肌梗死、黄斑水肿、神经传导受损和糖尿病伤口。

实施例

实施例1

醛糖还原酶(AR)抑制作用研究：

为了研究酶抑制作用，使用甘油醛作为底物，通过分光光度分析法，用提纯的人类重组醛糖还原酶(在大肠杆菌(E.coli)中表达)来测试β-肾上腺素能拮抗剂的醛糖还原酶(AR)抑制活性(分子视界，2004,10,148-154(Mol.Vis.2004,10,148-154))。

材料：

DL-甘油醛、葡萄糖、硫酸锂、2-巯基乙醇、NADPH(还原型辅酶II)、二甲基亚砜，TC-199培养基(M-3769)、山梨糖醇、山梨糖醇脱氢酶、NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和谷胱甘肽还原酶购自西格玛化学公司(圣路易斯，密苏里)(Sigma Chemical Company(St.Louis，MO))。用于实验的包括噻吗洛尔、艾司洛尔、索他洛尔、奈比洛尔、卡维地洛、美托洛尔和拉贝洛尔的β-肾上腺素能拮抗剂是作为纯活性药用成分(APIs)从当地供应商获得的。用于实验的β-拮抗剂的盐为：马来酸噻吗洛尔、盐酸索他洛尔、盐酸拉贝洛尔、酒石酸美托洛尔、盐酸奈比洛尔、盐酸艾司洛尔和盐酸普萘洛尔。

大鼠晶状体醛糖还原酶：

从大鼠晶状体制备粗醛糖还原酶(AR)。将获得自国家实验动物中心(全国营养学会，海德拉巴，印度)的9周大的WNIN雄性大鼠的眼球取出。动物护理和方案符合动物伦理委员会(Institutional Animal Ethics Committee)并受到其认可。用后路手术将晶状体切开并且在10体积的10mM的磷酸钾缓冲液(pH6.2)中均质。将匀浆在4℃以15,000×g离心分离30分钟，并将得到的上清液用作AR来源。

重组人类醛糖还原酶的提纯：

从细菌培养物中提纯重组人类醛糖还原酶。提取来自表达培养物(expression cultures)的酶，并基本按照在先描述(生物化学杂志1992；267:24833-40(J Biol Chem 1992；267:24833-40))进行纯化，不同的是，使用亲和色谱代替蓝胶(AffiGel Blue)(伯乐(Bio-Rad))作为最后的提纯步骤。

醛糖还原酶(AR)分析：

根据由海曼(Hayman)和木下(Kinoshita)(生物化学杂志，1965；240:877-82(J Biol Chem 1965；240:877-82))所描述的方法来分析AR活性。1ml的分析混合物包含50μM的磷酸钾缓冲液(pH 6.2)、0.4mM的硫酸锂、5μM的2-巯基乙醇、10μM的DL-甘油醛、0.1μM的NADPH和酶制品(大鼠晶状体或重组酶)。使用合适的空白组进行校正。将分析混合物在37℃恒温培育并通过在37℃加入NADPH来启动。在卡瑞生物100(Cary Bio 100)分光光度计中检测到由于NADPH氧化而发生的在340nm处吸光度的改变。

抑制作用的研究：

为了研究抑制作用，在水中制备β-肾上腺素能拮抗剂、噻吗洛尔、艾司洛尔、索他洛尔、奈比洛尔、卡维地洛、美托洛尔和拉贝洛尔的浓缩原料。将作为测试化合物的不同浓度的β-肾上腺素能拮抗剂加入分析混合物中，并在进行如以上所述地由NADPH引发的反应之前进行5-10分钟的恒温培育。将不存在抑制剂时AR活性考虑为100％，从而计算具有测试化合物的抑制的百分数。然后评价产生50％抑制(IC₅₀)的各个测试样品的浓度。

表1：β-肾上腺素能拮抗剂的醛糖还原酶抑制剂IC50值(μM)

β-肾上腺素能受体拮抗剂	IC50(μM)
		艾司洛尔	160
噻吗洛尔	250
		普萘洛尔	350
索他洛尔	>350
		奈比洛尔	>350

卡维地洛	>350
		美托洛尔	>350
拉贝洛尔	>350

实施例2

血红细胞内山梨糖醇的估算

测试表现出有效的醛糖还原酶抑制作用的化合物(艾司洛尔、噻吗洛尔、普萘洛尔)的抑制山梨糖醇在血红细胞(RBC)内形成的潜力。将细胞在体外用30 mM的葡萄糖进行恒温培育。通过由马龙等人，糖尿病，1980；29:861-864(Malone,et al.Diabetes；1980；29:861-864)所报道的方法估算山梨糖醇。

表2：RBC内的山梨糖醇浓度

序号	条件	山梨糖醇(μg/ml)
			1	正常条件下的RBC	12.13
2	30mM的葡萄糖下的RBC	21.83
			3	30mM的葡萄糖+150μM的艾司洛尔下的RBC	16.16
4	30mM的葡萄糖+250μM的噻吗洛尔下的RBC	17.34
			5	30mM的葡萄糖+350μM的普萘洛尔下的RBC	18.25

实施例3

动物实验：糖尿病伤口愈合

将韦斯大鼠(Wistar rat)装在具有能任意采食食物(哈兰德特克兰德辐照啮齿动物饲料)和无菌水的标准消毒的啮齿动物笼里。将大鼠关在静止于微隔离器中的哈兰特克片粒化的纸(Harlan Tek-chip pelleted paper)上，微隔离器被保持在72°F，湿度60％和12小时的光周期下。将动物买来后装在该设备中饲养10天以适应环境。通过连续五天腹腔注射50mg/kg体重的链脲佐菌素在大鼠内诱导糖尿病。用扭曲的刮痕器在动物背部皮肤上制造深0.57-0.62mm的2mm的切口，从而在大鼠身上造成伤口。在使用刮痕器前，剪去该部分的毛发并用标准鲁戈氏碘液进行清洁。

化合物给药和伤口处理

盐酸艾司洛尔(10％)每天给药三次，或在标准治疗对照中直接将试剂涂抹在伤口上。所使用的阳性对照为可商购得到的血小板衍生生长因子。持续治疗直至被治疗的鼠的伤口完全愈合。

将伤口用标准生理盐水进行漂洗，收集冲洗伤口的液体并在2500rpm下离心5分钟。除去上清液并将沉淀物染色，在高倍显微镜下观察任意异常细胞的存在。此外，将沉淀物物质在1ml的RPMI450中稀释，使用血细胞计数器来确定巨噬细胞的数量。

动物实验结果：可以观察到，用赋形剂(生理盐水)处理的大鼠中的初始伤口在产生伤口后(27天)没有愈合并仍然有痂，而在被治疗的动物的皮肤上的伤口已经完全愈合并且也观察到伤口闭合。

在产生伤口后的第3天、第7天、第12天和第19天测量该伤口的多个伤口愈合参数。这些参数在以下单独的表中列出。每隔一天测量伤口大小和大鼠的体重。特别地，每隔一天用微游标卡尺测量伤口的长度和宽度，并记录伤口边缘处的抗张强度。由同一调查者在第3、12、19天时利用电子数字式游标卡尺(B&D，普马勒斯，新泽西(B&D,Pomanus,NJ))测量伤口直径。在即将进行测量前通过调零将卡尺进行校准。伤口直径的减小记录于表1中。

表1：伤口直径的减小

用张力口径测量器(哈佛仪器，昆西，马萨诸塞州(Harvard apparatus,Quincy,MA))测量伤口的收缩，结果示于表2。

表2：伤口直径：收缩程度(％)

用于评价的部分用艾本德(Eppendorf)10号手术刀进行切割，并将组织保存在10％的磷酸盐缓冲的福尔马林溶液中。将组织从福尔马林溶液中取出并在100％的乙醇中浸没6小时。再次将该组织取出并保存于10％的鲍音液(Bouins solution)中以待评价。伤口的活检参数列于表3。

表3：糖尿病大鼠中伤口活检评价

基于在高倍显微镜观察的伤口上发现的新的上皮细胞来测量上皮化。通过标准数字式游标卡尺(B&D,Pomanus,NJ)测量疤痕形成得分。结果示于表4。

表4：伤口完全闭合所花费的时间、上皮化和疤痕形成的期间

使用微量吸管(Eppendorf)测量来自伤口的渗出物的量。结果示于表5.

表5：渗出物μl

通过观察折射率来测量伤口的透明度。结果示于表6。

表6：膜透明度

伤口粘附性示于表7。粘附性是将伤口两端附着在一起的强度，通过维可牢(Velcro)指数计测量。

表7：伤口粘附力

通过使用微量吸管根据从伤口获得的液体体积测量积液，示于表8。

表8：积液

用Velcro指数计测量伤口消失的容易性并示于表9。

表9：伤口消失的容易性

伤口弹性通过同一动物的正常皮肤与伤口区域的皮肤相比观察到的平和度而测得，并示于表10。

表10：弹性

实施例4

一氧化氮的测量

将新鲜组织(约0.2g)加入到1ml的冷的均质缓冲液(20mmol/l的羟乙基哌嗪乙磺酸-KOH(HEPES-KOH)，pH 7.9；25％的甘油；420mmol/l的NaCI；1.5mmol/l的MgCl₂；0.2mmol/l的EDTA；0.5mmol/l的二硫苏糖醇；0.2mmol/l的苯甲基磺酰氟)。将缓冲的组织以最大速度均质5秒钟并在冰水中冷却30秒。将该过程重复五次以确保组织完全破坏。

脱蛋白：

将2体积的100％的冷乙醇加入到均质后的样品中；将这些进行涡旋搅拌并在冰上培养30分钟。均匀混合物在4℃以12,000×g离心5分钟，并将上清液转移到冰上的新试管中用于NO测量。

亚硝酸盐/硝酸盐的测量：

使用迅速应答化学荧光分析器来测量总的气相NO(硝酸盐/亚硝酸盐)。NO气体与臭氧反应，产生光形式的能量，该光与NO的存在量成比例。使用光度计测量光的发生以确定NO浓度。

将样品管牢固地连接到零点气体过滤器(Zero Gas Filter)(西弗斯仪器(Sievers Instruments))上，并将室内空气通过该装置5分钟。使用4次重复校正(分别为空白、1、10、50、100和200mmol/l；<1nmol/l的下限用于本仪器)对分析器应答的线性进行插值。向用氦气洗吹的含有0.8％的氯化钒的盐酸的容器中注入该样品(10ml)，以将气态NO从溶解的NO和亚硝酸盐中释放出来。然后将样品在反应器中暴露于臭氧下以形成活化的二氧化氮(NO₂)，它可以使用红敏光电倍增管进行检测，并使用积分描笔式记录器(integrating pen recorder)记录输出结果。对于各个样品，将曲线下的面积转化为NO浓度。

表11：NO增加

实施例5

胶原蛋白的测量

与其他蛋白质相同地，19种已知胶原蛋白的合成发生在细胞内。胶原蛋白分子的特征在于Gly-X-Y的重复序列，其中X通常为脯氨酸而Y通常为羟脯氨酸。羟脯氨酸是胶原蛋白降解的最终产物。由于此原因，组织羟脯氨酸水平是组织胶原蛋白产量的间接而客观的变量。在许多试验研究中，羟脯氨酸被用于评价组织胶原蛋白产量。

通过使用高效液相色谱法(HPLC)从大鼠组织中分离并定量羟脯氨酸水平来测量组织中的胶原蛋白水平。使用反向诺瓦帕克(Nova-Pak)C₁₈柱和溶剂体系(140 mM的乙酸钠、0.05％的三乙胺(TEA)、6％的乙腈)使羟脯氨酸完全分离。标准回收范围为89-103％，批内差异为<8％。此外，利用[³H]羟脯氨酸的测量来检测用[³H]脯氨酸标记并在10mM未被标记的脯氨酸存在下进行“追踪”的大鼠体内的胶原蛋白转换的变化。

表12：胶原蛋白产量

虽然参考以下实施例对本发明进行了详细描述，应该理解的是，在不背离本发明的主旨的前提下可以对本发明做出各种修改，并且这种修改将是本领域技术人员易于知道的。

Claims (17)

1.一种皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，该皮肤外用药用组合物包括在治疗上有效量的具有醛糖还原酶抑制作用的β-肾上腺素能阻滞剂或其药物可接受盐及药用可接受外用载体、赋形剂或稀释剂，其中所述皮肤外用药用组合物被施用于皮肤或真皮，其中所述β-肾上腺素能阻滞剂选自由醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、塞利洛尔、西他洛尔、依泮洛尔、艾司洛尔、左倍他洛尔和普拉洛尔构成的组。

2.根据权利要求1所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中氧化应激、晚期糖基化终产物、多元醇通路流量和蛋白激活酶C活化促进所述糖尿病伤口中的微血管病变和神经功能障碍。

3.根据权利要求1所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中，所述皮肤外用药用组合物以缓释形式进行给药。

4.根据权利要求1所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中，其中所述β-肾上腺素能阻滞剂选自由艾司洛尔或其药物可接受盐。

5.根据权利要求2所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中，所述氧化应激、晚期糖基化终产物、多元醇通路流量和蛋白激活酶C活化也涉及糖尿病神经病变。

6.根据权利要求1所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中，所述糖尿病伤口是由于微血管灌注不能满足皮肤代谢的要求而导致的皮肤损伤。

7.根据权利要求1所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中，所述皮肤外用药用组合物的形式为乳膏、凝胶、外用液、皮肤贴、软膏、外用药签、乳液、喷雾或洗剂。

8.根据权利要求6所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中所述微血管灌注不能满足皮肤代谢的要求和皮肤灌注的异常有关，尤其和与灌注储量的减少相关的毛细管损失有关。

9.根据权利要求1-8中的任一项所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中所述哺乳动物是灵长类动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、骆驼科动物、山羊、啮齿动物或马科动物。

10.根据权利要求9所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中所述灵长类动物是人类。

11.一种通过皮肤外用施用到皮肤上的具有醛糖还原酶抑制作用的β-肾上腺素能阻滞剂或其药物可接受盐在制备治疗哺乳动物的由醛糖还原酶介导的糖尿病伤口药物中的应用，其中所述β-肾上腺素能阻滞剂选自由醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、塞利洛尔、西他洛尔、依泮洛尔、艾司洛尔、左倍他洛尔和普拉洛尔构成的组。

12.根据权利要求11所述的通过皮肤外用施用到皮肤上的具有醛糖还原酶抑制作用的β-肾上腺素能阻滞剂或其药物可接受盐在制备治疗哺乳动物的由醛糖还原酶介导的糖尿病伤口药物中的应用，其中，所述β-肾上腺素能阻滞剂为艾司洛尔或其药物可接受盐。

13.根据权利要求11或12所述的通过皮肤外用施用到皮肤上的具有醛糖还原酶抑制作用的β-肾上腺素能阻滞剂或其药物可接受盐在制备治疗哺乳动物的由醛糖还原酶介导的糖尿病伤口药物中的应用，其中，所述哺乳动物是灵长类动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、骆驼科动物、山羊、啮齿动物或马科动物。

14.根据权利要求13所述的通过皮肤外用施用到皮肤上的具有醛糖还原酶抑制作用的β-肾上腺素能阻滞剂或其药物可接受盐在制备治疗哺乳动物的由醛糖还原酶介导的糖尿病伤口药物中的应用，其中，其中所述灵长类动物是人类。

15.根据权利要求1所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中所述皮肤外用药用组合物为凝胶的形式。

16.根据权利要求1所述的皮肤外用药用组合物在制备治疗哺乳动物的糖尿病伤口的药物中的应用，其中具有醛糖还原酶抑制作用的β-肾上腺素能阻滞剂是盐酸艾司洛尔。

17.根据权利要求11所述的通过皮肤外用施用到皮肤上的具有醛糖还原酶抑制作用的β-肾上腺素能阻滞剂或其药物可接受盐在制备治疗哺乳动物的由醛糖还原酶介导的糖尿病伤口药物中的应用，其中所述具有醛糖还原酶抑制作用的β-肾上腺素能阻滞剂是盐酸艾司洛尔。