CN104178549A - 一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量的分离方法 - Google Patents
一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量的分离方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104178549A CN104178549A CN201410431318.5A CN201410431318A CN104178549A CN 104178549 A CN104178549 A CN 104178549A CN 201410431318 A CN201410431318 A CN 201410431318A CN 104178549 A CN104178549 A CN 104178549A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- centrifuge tube
- supernatant
- contents
- centrifugal
- centrifugal tube
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离方法，其步骤，A、分离缓冲液的试剂配制；B、实验方法：（1）选取猪肠道内容物和粪便，无菌收集胃、空、回、盲、结肠内容物和粪便；（2）分别称取容物和粪便重量于无菌离心管中，离心，弃上清；（3）向离心管加入分离缓冲液，漩涡混匀仪上摇匀，离心；（4）将离心管取出，将上清液倒入离心管中，将装有上清液的离心管，离心，弃上清；（5）量取分离缓冲液，加入离心管a中，漩涡混匀仪上摇匀，离心，弃上清；（6）重复步骤3、步骤4、步骤5各二次；（7）倒掉上清液，将菌体转入2ml离心管中，－70℃保存，用于测定菌体干重和微生物区系。方法易行、操作简便、成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及微生物分离技术领域，更具体涉及一种猪胃肠道内容物与粪便微生物总量梯度离心分离方法。
背景技术
猪胃肠道中的微生物菌群种类复杂、数量庞大。胃肠道微生物对氮营养素的代谢程度及代谢去向直接影响机体对日粮氮营养素利用和氮排放，同时微生物及其代谢产物通过模式识别受体的信号感应调节肠黏膜功能，进而影响氮营养素的吸收。研究微生物区系、内源氨基酸排出的微生物菌体氨基酸组成及微生物酶活对解析肠道微生物与氮营养素的代谢机理至关重要。猪胃肠道微生物总量的分离是研究微生物区系及胃肠道微生物酶活测定的先决条件。粪便微生物氮和氨基酸是组成内源氮和氨基酸的重要组成部分，粪便微生物总量分离对于了解粪便微生物氮和氨基酸排出情况十分重要，然而，目前国内外没有统一的分离标准。因此本发明通过摸索猪胃肠道内容物及粪便与分离缓冲液的适宜比例，采用梯度离心法对猪胃肠道及粪便微生物总量进行分离。该分离方法具有成本低廉、重复性好、操作简单等特点。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离方法，操作简便，成本低廉，重复性好，所得微生物总量可供猪胃肠道微生物相关指标的测定，为研究微生物区系、内源氨基酸排出的微生物菌体氨基酸组成及微生物酶活和解析肠道微生物与氮营养素的代谢机理提供技术基础。
为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离方法，其步骤如下：
1.分离缓冲液的试剂配制：
称取氯化钠(NaCl)0.85溶于950-1050ml双蒸水中，待溶解后再加于1ml吐温-80，121℃高压(100-110kPa)灭菌18-22min。
2.实验方法：猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离的操作过程是：
(1)选取猪肠道内容物和粪便(1头30kg左右)，无菌收集胃、空、回、盲、结肠内容物和粪便，于4℃保存待用。取10g测定总菌含量。
(2)根据样品与分离缓冲液的稀释比例：分离程度、菌体干重含量和微生物区系结果前肠(胃、空、回)的最佳稀释比例范围为8％～10％，后肠(盲、结、粪便)的最佳稀释比例范围为2％～4％。按表5分别称取相应胃、空、回、盲、结肠内容物和粪便重量于无菌50ml离心管a中，10000rpm4℃离心4－6min，弃上清。每个样做2－4个重复。
表5.不同肠段内容物与粪便稀释比例
| 稀释比例 | 14％ | 12％ | 10％ | 8％ |
| 胃(g) | 5.6 | 4.8 | 4 | 3.2 |
| 空(g) | 5.6 | 4.8 | 4 | 3.2 |
| 回(g) | 5.6 | 4.8 | 4 | 3.2 |
| 稀释比例 | 8％ | 6％ | 4％ | 2％ |
| 盲肠(g) | 3.2 | 2.4 | 1.6 | 0.8 |
| 结肠(g) | 3.2 | 2.4 | 1.6 | 0.8 |
| 粪便(g) | 3.2 | 2.4 | 1.6 | 0.8 |
(3)向离心管a加入40ml分离缓冲液(请见分离缓冲液的试剂配制)，漩涡混匀仪上剧烈摇匀2-3min，1500rpm4℃离心4－6min。
(4)轻轻将离心管a取出(不能剧烈摇晃)将上清液倒入对应编号的50ml离心管b中，将装有上清液的离心管b10000rpm4℃离心4－6min，弃上清。
(5)量取40ml分离缓冲液(请见分离缓冲液的试剂配制)，加入离心管a中，漩涡混匀仪上剧烈摇匀2-3min(需将沉淀摇散)，1500rpm4℃离心4－6min，将提取上清液倒入对应编号的离心管b，将装有上清液的离心管b10000rpm4℃离心4－6min，弃上清。
(6)重复步骤3、步骤4、步骤5各二次。
(7)倒掉上清液，将菌体转入2ml离心管中，－70℃保存，用于测定菌体干重和微生物区系(待各项指标测定)。分离程度和菌体干重结果见表3和表4，微生物区系结果见图2和图3。
表3.在不同稀释比例下胃、空、回肠内容物与粪便分离程度及菌体干重含量
| 稀释比例 | 14％ | 12％ | 10％ | 8％ |
| 分离程度A | ||||
| 胃-1(％) | 99.1 | 99.5 | 99.9 | 99.9 |
| 胃-2(％) | 99.0 | 99.4 | 99.9 | 99.9 |
| 空-1(％) | 95.7 | 98.6 | 99.1 | 99.9 |
| 空-2(％) | 95.3 | 98.7 | 99.6 | 99.9 |
| 回-1(％) | 93.8 | 98.5 | 98.8 | 99.8 |
| 回-2(％) | 93.0 | 98.1 | 98.5 | 99.6 |
| 菌体干重含量B | ||||
| 胃-1(g/kg) | 1.65 | 1.70 | 1.73 | 1.74 |
| 胃-2(g/kg) | 1.63 | 1.68 | 1.72 | 1.73 |
| 空-1(g/kg) | 2.02 | 2.20 | 2.44 | 2.47 |
| 空-2(g/kg) | 2.00 | 2.17 | 2.41 | 2.43 |
| 回-1(g/kg) | 2.53 | 2.58 | 2.79 | 2.88 |
| 回-2(g/kg) | 2.50 | 2.55 | 2.76 | 2.84 |
A分离程度＝(鲜样总菌数量-分离后沉淀总菌数量)/鲜样总菌数量*100％
B菌体干重含量＝分离后的菌体干重(g)/鲜样总重(kg)
表4.在不同稀释比例下盲、结肠内容物与粪便分离程度及菌体干重含量
A分离程度＝(鲜样总菌数量-分离后沉淀总菌数量)/鲜样总菌数量*100％
B菌体干重含量＝分离后的菌体干重(g)/鲜样总重(kg)。
(8)取离心管a中的沉淀测定分离后总菌含量。计算微生物分离程度(鲜样总菌数量-分离后沉淀总菌数量)/鲜样总菌数量*100％)。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、分离缓冲液中的氯化钠和吐温-80价格低廉，配制方法操作简便，重复性好。
2.与以前方法相比本方法提供了不同胃肠道样品的最佳稀释比例范围：前肠(胃、空、回)的最佳稀释比例范围为8％～10％，微生物分离程度达到98％以上，后肠(盲、结、粪便)的最佳稀释比例范围为2％～4％，微生物分离程度也达到98％以上。
3、分离程度和菌体干重含量结果表明，在最佳稀释比例范围内所分离的微生物重复性达到99.8％,因此重复性好。
4、此方法整个过程只需要冷冻离心机，灭菌锅和漩涡混匀仪等常规实验设备，这些仪器操作简单。
附图说明
附图1为一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离方法的流程图。
附图2为一种前肠内容物不同稀释比例PCR-DGGE电泳图。
附图3为一种后肠内容物与粪便不同稀释比例PCR-DGGE电泳图。
具体实施方式
实施例1：
一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离方法(应用此方法研究日粮不同蛋白水平对回肠与粪便微生物菌体氨基酸组成的影响)，其步骤如下：
A、试验设计：
选取18头健康的30kg杜×长×大三元瘘管试验生长猪进行试验，按照完全随机设计进行分组，共3组，每组6头，分别饲喂12％、15％、18％三种蛋白水平的玉米－豆粕型日粮。饲喂30天，单栏饲养，自由采食和饮水。试验结束后，收集每组6头猪的肛门粪便，采用无菌厌氧操作方法收集回肠内容物(50g)，用于分离微生物总菌体，以备菌体氧基酸组成的测定。
B、微生物分离方法：
1、分离缓冲液的试剂配制：
称取氯化钠(NaCl)0.85溶于950或980或1000或1020或1050ml双蒸水中，待溶解后再加于1ml吐温-80，121℃高压(100或103或105或108或110kPa)灭菌18或19或20或21或22min。
2、实验方法：猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离的操作过程如下：
(1)无菌收集试验猪回肠内容物和粪便，于4℃保存，待用。
(2)根据分离程度、菌体干重含量和微生物区系结果前肠(胃、空、回)的最佳稀释比例范围为8或9或10％，后肠(盲、结、粪便)的最佳稀释比例范围为2或3或4％。分别称取4g回肠内容物和1.6g粪便于无菌50ml离心管a中。
所述的菌体干重为所分离的菌体经冻干后的重量。
所述的微生物区系指微生物所处的微环境只适合某种或某类微生物的生长繁殖，而不适合其它微生物的生长从而形成的群落结构。
(3)向离心管a加入40ml分离缓冲液(请见步骤1分离缓冲液的试剂配制)，漩涡混匀仪上剧烈摇匀2或3min，1500rpm4℃离心4或5或6min。
(4)轻轻取出离心管a(不能剧烈摇晃)，将上清液倒入对应编号的50ml离心管b中，将装有上清液的离心管b10000rpm4℃离心4或5或6min，弃上清。
(5)取40ml分离缓冲液(请见步骤1分离缓冲液的试剂配制)，加入离心管a中，漩涡混匀仪上剧烈摇匀2或3min(需将沉淀摇散)，1500rpm4℃离心4或5或6min，将提取上清液倒入对应编号的离心管b，将装有上清液的离心管b10000rpm4℃离心4或5或6min，弃上清。
(6)重复步骤3，步骤4，步骤5各二次，获得总菌体沉淀。
(7)将总菌体沉淀转入2ml离心管中，－70℃保存，待微生物菌体氨基酸的测定(待各项指标测定)。所测实验结果见表1和表2。
表1不同氮营养素水平对粪便微生物菌体AA组成的影响(％)
| L-CP | M-CP | H-CP | SEM | P值 | |
| Asp | 11b | 10.9b | 13.7a | 0.19 | <0.01 |
| Ser | 1.49c | 2.28a | 1.83b | 0.06 | <0.01 |
| Glu | 12.54 | 12.16 | 12.64 | 0.34 | 0.57 |
| Gly | 7.83 | 7.68 | 7.7 | 0.18 | 0.8 |
| Ala | 10.7a | 10.3ab | 9.8b | 0.21 | 0.03 |
| Pro | 5.89a | 5.71a | 4.39b | 0.12 | <0.01 |
| Tyr | 3.59 | 3.83 | 3.91 | 0.12 | 0.11 |
| Thr | 4.36 | 4.51 | 4.13 | 0.12 | 0.12 |
| Cys | 0.76b | 0.77b | 1.2a | 0.08 | <0.01 |
| Val | 5.44b | 6.39a | 5.53b | 0.14 | <0.01 |
| Met | 1.64 | 1.86 | 1.85 | 0.06 | 0.04 |
| Ileu | 6.06a | 6.38a | 4.37b | 0.13 | <0.01 |
| Leu | 11.3a | 10.1b | 11.4a | 0.23 | <0.01 |
| Phe | 4.61 | 4.63 | 4.78 | 0.15 | 0.66 |
| Lys | 4.04b | 4.08b | 4.5a | 0.12 | 0.03 |
| His | 2.32b | 2.47b | 2.83a | 0.09 | <0.01 |
| Arg | 6.45a | 5.93b | 5.44c | 0.16 | <0.01 |
| TAA | 100 | 100 | 100 | 0 | 1 |
表2不同氮营养素水平对回肠微生物AA组成的影响(％)
| L-CP | M-CP | H-CP | SEM | P值 | |
| Asp | 11.8a | 8.8b | 11.8a | 0.23 | <0.01 |
| Ser | 4.36a | 4.03a | 3.23b | 0.12 | <0.01 |
| Glu | 9.04b | 9.74b | 12.84a | 0.25 | <0.01 |
| Gly | 5.59b | 6.54a | 4.93c | 0.12 | <0.01 |
| Ala | 8.96a | 8.28b | 6.00c | 0.18 | <0.01 |
| Pro | 6.30a | 6.80a | 4.85b | 0.19 | <0.01 |
| Tyr | 3.64 | 3.97 | 3.5 | 0.19 | 0.24 |
| Thr | 3.01a | 2.26b | 3.26a | 0.12 | <0.01 |
| Cys | 1.57b | 1.36c | 2.57a | 0.05 | <0.01 |
| Val | 6.88a | 6.94a | 5.31b | 0.17 | <0.01 |
| Met | 3.14b | 2.24c | 3.95a | 0.15 | <0.01 |
| Ileu | 6.75a | 6.80a | 5.29b | 0.28 | <0.01 |
| Leu | 10.6b | 11.8a | 11.8a | 0.23 | <0.01 |
| Phe | 5.77c | 6.91b | 7.75a | 0.12 | <0.01 |
| Lys | 4.67 | 4.8 | 4.3 | 0.32 | 0.52 |
| His | 4.61a | 3.71b | 4.38a | 0.19 | 0.01 |
| Arg | 3.26c | 5.00a | 4.22b | 0.15 | <0.01 |
| TAA | 100 | 100 | 100 | 0 | 1 |
Claims (1)
1.一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离方法，其步骤是：
A、分离缓冲液的试剂配制：
称取氯化钠0.85溶于950-1050 ml双蒸水中，待溶解后再加于1 ml吐温-80，121℃高压：100-110 kPa灭菌18-22 min；
B、实验方法：猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离的操作过程是：
（1）选取猪肠道内容物和粪便，无菌收集胃、空、回、盲、结肠内容物和粪便，于4℃保存待用；
（2）根据样品与分离缓冲液的稀释比例：胃、空、回肠内容物为8~10%，盲、结肠内容物与粪便的稀释比例为2~4%，分别称取胃、空、回、盲、结肠内容物和粪便于无菌50 ml离心管a中，10000 rpm 4℃ 离心4－6min，弃上清；
（3）向离心管a加入40 ml分离缓冲液，漩涡混匀仪上摇匀2-3 min，1500 rpm 4℃ 离心4－6 min；
（4）将离心管a取出，将上清液倒入离心管b中，将装有上清液的离心管b 10000 rpm 4℃ 离心4－6 min，弃上清；
（5）量取40 ml分离缓冲液，加入离心管a中，漩涡混匀仪上摇匀2-3 min，1500 rpm 4℃ 离心4－6 min，将提取上清液倒入离心管b，将装有上清液的离心管b 10000 rpm 4℃ 离心4－6 min，弃上清；
（6）重复步骤3、步骤4、步骤5各二次；
（7）倒掉上清液，将菌体转入2 ml离心管中，－70℃保存，用于测定菌体干重和微生物区系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410431318.5A CN104178549A (zh) | 2014-08-28 | 2014-08-28 | 一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量的分离方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410431318.5A CN104178549A (zh) | 2014-08-28 | 2014-08-28 | 一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量的分离方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104178549A true CN104178549A (zh) | 2014-12-03 |
Family
ID=51959893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410431318.5A Pending CN104178549A (zh) | 2014-08-28 | 2014-08-28 | 一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量的分离方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104178549A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104688781A (zh) * | 2015-03-31 | 2015-06-10 | 徐高骁 | 一种利用粪菌移植技术防治幼禽腹泻的方法 |
| CN109609587A (zh) * | 2019-01-17 | 2019-04-12 | 广州承葛生物科技有限公司 | 一种高粪菌活性离心力的确定方法 |
-
2014
- 2014-08-28 CN CN201410431318.5A patent/CN104178549A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104688781A (zh) * | 2015-03-31 | 2015-06-10 | 徐高骁 | 一种利用粪菌移植技术防治幼禽腹泻的方法 |
| CN109609587A (zh) * | 2019-01-17 | 2019-04-12 | 广州承葛生物科技有限公司 | 一种高粪菌活性离心力的确定方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Semenov et al. | Does fresh farmyard manure introduce surviving microbes into soil or activate soil-borne microbiota? | |
| Spatz et al. | Overview of the potential role of Malassezia in gut health and disease | |
| Castells et al. | Effects of forage provision to young calves on rumen fermentation and development of the gastrointestinal tract | |
| Bueno et al. | In vitro methane production and tolerance to condensed tannins in five ruminant species | |
| Ma et al. | Effect of the ratio of non-fibrous carbohydrates to neutral detergent fiber and protein structure on intake, digestibility, rumen fermentation, and nitrogen metabolism in lambs | |
| Ivan et al. | Rumen fermentation and microbial population in lactating dairy cows receiving diets containing oilseeds rich in C-18 fatty acids | |
| Firkins et al. | Extending Burk Dehority’s perspectives on the role of ciliate protozoa in the rumen | |
| Alves et al. | Rumen bacterial diversity in relation to nitrogen retention in beef cattle | |
| Faichney et al. | Effect of concentrates in a hay diet on the contribution of anaerobic fungi, protozoa and bacteria to nitrogen in rumen and duodenal digesta in sheep | |
| Eryavuz et al. | Effect of Yucca schidigera extract on the concentration of rumen microorganisms in sheep | |
| AU2017388535A1 (en) | Methods, apparatuses, and systems for microorganism strain analysis of complex heterogeneous communities with tracer analytics, determination of functional relationships and interactions thereof, and synthesis of microbial ensembles including dosed microbial ensembles and inoculative microbial ensembles | |
| Visscher et al. | Performance, fermentation characteristics and composition of the microbiome in the digest of piglets kept on a feed with humic acid-rich peat | |
| Xia et al. | Effects of dietary Saccharomyces cerevisiae on growth, intestinal and liver health, intestinal microbiota and disease resistance of channel catfish (Ictalurus punctatus) | |
| CN104178549A (zh) | 一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量的分离方法 | |
| Cacite et al. | Ruminal dosing with Megasphaera elsdenii and strain persistence are associated with milk fat depression in Holstein cows | |
| Thépot et al. | Effects of a seaweed feed inclusion on different life stages of the mottled rabbitfish Siganus fuscescens | |
| Liu et al. | Assessing effects of guar gum viscosity on the growth, intestinal flora, and intestinal health of Micropterus salmoides | |
| Li et al. | Effect of sodium butyrate on slaughter performance, serum indexes and intestinal barrier of rabbits | |
| Volmer et al. | The evolving role of methanogenic archaea in mammalian microbiomes | |
| Danielsson | Methane production in dairy cows | |
| Wang et al. | A new potential risk: The impacts of Klebsiella pneumoniae infection on the histopathology, transcriptome and metagenome of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) | |
| Lokesh et al. | Interaction between genetics and inulin affects host metabolism in rainbow trout fed a sustainable all plant-based diet | |
| CN106755529A (zh) | 一种检测猪细菌性肠炎病原的多重pcr特异性引物及其应用 | |
| Yaxing et al. | Effects of Allium mongolicum regel essential oil supplementation on growth performance, nutrient digestibility, rumen fermentation, and bacterial communities in sheep | |
| Rajtar et al. | Effect of rye grain derived from different cultivars or maize grain use in the diet on ruminal fermentation parameters and nutrient digestibility in sheep |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141203 |