CN104159913A - 针对细胞内靶分子的结合剂 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了包含至少一个Alphabody或基本由其组成的多肽，其中所述Alphabody能够被内化入细胞并且特异性结合细胞内靶分子。本申请还提供了编码这样的多肽的核酸；用于制备这样的多肽的方法；表达或能够表达这样的多肽的宿主细胞；包含这样的多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，特别地药物组合物；以及这样的多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，特别地用于预防性、治疗性或诊断性目的的用途。

Description

针对细胞内靶分子的结合剂
发明领域
本申请涉及针对细胞内靶分子，更具体地针对细胞内蛋白质，例如参与细胞凋亡和受控细胞死亡的蛋白质的结合剂的领域。本申请还涉及这样的结合剂用于预防、治疗或诊断目的以及用于筛查和检测的用途。
背景
与细胞的细胞内组分的相互作用需要预期与这样的细胞内组分相互作用的药剂穿过细胞膜。
在治疗领域，大分子(例如多肽和核酸)一直为主要焦点，因为对于许多疾病，小分子药物(即包含少于100个原子的化合物)极难被发现和/或开发。大分子用作治疗剂的用途具有优于小化学药物的许多有利方面，最重要的有利方面是能够采用大的稳定的三维构象，所述三维构象适合于对靶的强结合，从而允许干扰与难以使用小分子实现的天然蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸界面。此外，大分子的稳定性、尺寸和复杂性可导致使用小分子不容易实现的特异性。
然而，巨大的困难是这样的大分子不能扩散进入细胞，从而虽然绝大部分疾病目标靶位于细胞内，但大多数大分子治疗剂仅能够针对细胞外靶。
虽然已发展了促进或增强大分子的细胞内化的不同策略，但它们的适用性受到限制，因为这些方法利用内化的细胞机制，例如胞吞作用。这些细胞内化机制导致作用子在内体或溶酶体中的积累，最终导致作用子化合物的蛋白酶降解和失活。
已描述的解决这些问题的一种策略是产生烃装订肽(hydrocarbonstapled peptide)。该概念基于这样的事实：蛋白酶仅在肽基本上以未折叠状态存在时才能识别和降解它们。已发现，当被锁入某些折叠状态时，肽在很大程度上得到保护而免于蛋白酶攻击。然而化学装订法需要复杂的化学合成。
因此，虽然过去已努力将(多)肽递送至细胞并使它们形成在细胞内环境中赋予它们稳定性和对蛋白酶的抗性的稳定状态，但生物活性的丢失、不充足的渗入细胞的能力(虽然维持功能性)或复杂的制造过程已阻碍了作用于细胞内组分的生物治疗剂的成功开发。
Alphabody是具有10至14kDa分子量的单链、三链卷曲螺旋蛋白质。已开发了以高亲和力结合特异性分子靶的Alphabody(WO2011003935,WO2011003936)。然而，迄今为止，仅开了抗细胞外靶的Alphabody。
发明概述
本申请提供了可选择的改善的结合剂，特别地多肽，所述结合剂
(1)能够穿过细胞膜，
(2)在细胞内环境中高度稳定，和
(3)能够特异性结合细胞中的细胞内靶分子。更具体地，结合剂从而能够高效地抑制或至少调节相关细胞内靶分子在其中起作用的生物学机制和/或信号传导途径。
在第一方面，提供了包含至少一种Alphabody或基本上由至少一种Alphabody组成的多肽，其中所述多肽能够被内化入细胞，并且特异性结合该细胞中的细胞内靶分子。事实上，已发现Alphabody结构可用于产生被细胞高效摄入并用作这些细胞内的细胞内靶的稳定和特异性结合剂的多肽。
在某些实施方案中，本文中提供的多肽包含确保它们能够进入细胞的序列，在所述细胞中它们可与目标靶蛋白相互作用。因此，本文中设想的多肽包含确保它们能够穿过细胞膜或增强它们的细胞进入的序列。
因此，已专门设计了本文中提供的多肽，即它们的结构相较于现有技术的Alphabody序列已被修饰，从而允许使多肽内化入细胞。
具体地，本文中提供的多肽可包含修饰来允许通过例如(但不限于)如下方式来进行细胞内化：(i)Alphabody序列与至少一个允许内化入细胞的基团、部分、蛋白质或肽的融合或缀合，和/或(ii)通过一个或多个含氨基酸残基基序或氨基酸残基模式的内化区域在Alphabody序列内的存在。
在某些具体实施方案中，本文中提供的多肽包含至少一个Alphabody或基本上由至少一个Alphabody组成，所述Alphabody主要通过存在于Alphabody上的结合位点而特异性结合细胞内靶分子。
在一些具体实施方案中设想的Alphabody和多肽可特异性结合的细胞内靶分子的实例包括例如但不限于参与细胞过程的蛋白质，所述细胞过程选自细胞信号传导、细胞信号转导、细胞和分子运输(例如主动运输或被动运输)、渗透、吞噬作用、自噬、细胞衰老、细胞粘附、细胞运动、细胞迁移、胞质流、DNA复制、蛋白质合成、增殖(例如细胞周期、减数分裂、有丝分裂、分裂间期、胞质分裂)、细胞代谢(例如糖酵解和呼吸、能量供应)、细胞通讯、DNA修复、细胞凋亡和程序化细胞死亡。
在一些具体实施方案中，某些实施方案中设想的Alphabody和多肽可特异性结合的细胞内靶分子包括细胞内蛋白，所述细胞内蛋白天然地参与在真核细胞例如动物细胞，具体地哺乳动物细胞或人细胞中发生的过程。
由于本文中设想的多肽具有影响细胞内部的细胞内靶的生物功能的潜能，因此它们特别适合用于许多疾病适应征的医学应用，即诊断、治疗或预防性应用。
本文中设想的多肽具有针对细胞内靶(即一类对于两个主要种类的治疗药物即小的化学药物和治疗性抗体来说是“无药可及的”蛋白质)的潜能。事实上，所有已知的人蛋白靶中大部分不能被小的化学药物或生物制品寻找到。小的化学药物通常与疏水口袋相互作用，这将它们的靶空间限定于约10％的所有人蛋白质；类似地，生物制品(即基于蛋白质的治疗剂如抗体)缺乏穿过细胞膜的能力，从而仅可寻找到另外10％(作为细胞外蛋白质存在的那些靶蛋白)。这意味着在所有治疗领域内、所有潜在(主要地细胞内)蛋白靶中绝大部分(据估计>80％)目前被认为对于两个主要已知种类的治疗药物来说是“无药可及的”。
此外，许多细胞内蛋白属于最吸引人的种类的潜在药物靶，即参与细胞内蛋白质间相互作用的蛋白质。细胞内蛋白质间相互作用调节众多种必需细胞过程，所述细胞过程中的许多过程已知牵涉重要的疾病过程，例如引起癌症、中枢神经系统疾病或代谢疾病的那些过程。本文中公开的多肽经显示具有细胞内穿透的能力并且在细胞内保持稳定以及在细胞中结合其靶。因此，它们代表了用于调节细胞内蛋白质间相互作用的独特工具以及用作可寻找到大量牵涉广泛疾病的目前“无药可及的”靶的治疗剂。
其它方面提供了本文中描述的多肽用作药剂，更具体地在用于治疗与其中牵涉细胞内靶分子的生物途径或生物相互作用相关的疾病或障碍的方法中用作药剂的用途。
癌症是例如其中对新型治疗选择的需求很高以及其中对细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的调节的时机特别迫切的一个疾病领域。许多良好确定的癌基因是细胞内蛋白并且通常是“无药可及的”的靶，即不能被高效靶向以用于治疗或诊断性应用的蛋白质。这些靶的实例有属于BCL-2家族(细胞凋亡的调节剂)的蛋白。本文中描述的多肽代表了在寻找这样的靶的能力上很独特的新型药物开发平台。
因此，在具体实施方案中，提供了包含至少一个Alphabody的多肽，所述Alphabody能够被细胞内化，其中所述至少一种Alphabody特异性结合细胞凋亡或抗细胞凋亡细胞内蛋白，具体地BCL-2蛋白家族的抗细胞凋亡成员，例如选自MCL-1、BCL-2、BCL-2a、BCL-XL、BCL-w和BFL-1/A1的蛋白。
在其它具体实施方案中，所述多肽的特征在于它们特异性结合MCL-1并且包含选自SEQ ID NO：1至16、26和27的序列。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合MCL-1的多肽，其中所述多肽的特征在于它们包含选自SEQ ID NO：4至16、26和27的序列。
在具体实施方案中，在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合MCL-1的多肽，其所述多肽的特征在于它们包含与SEQID NO：19中定义的多肽序列(MSIEEITKQIAAIQLRIVGDQVQIYAMT)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合MCL-1的多肽，其中所述多肽的特征在于它们包含SEQ ID NO：20中定义的序列(LRXVGDXV)。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合BCL-2a的多肽，其中多肽的特征在于它们包含选自SEQ ID NO：26和27的序列。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合BCL-XL的多肽，其中多肽的特征在于它们包含选自SEQ ID NO：26和27的序列。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合MCL-1、BCL-2a和/或BCL-XL的多肽，其中多肽的特征在于它们包含与SEQ IDNO：29中定义的多肽序列(MSIEEIAAQIAAIQLRIIGDQFNIYYMT)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合MCL-1、BCL-2a和/或BCL-XL的多肽，其中多肽的特征在于它们包含SEQ ID NO：30中定义的序列(LRIIGDQF)。
在其它方面，提供了包含至少一种本文中描述的多肽和任选地一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。
在其它方面，还提供了用于产生本文中描述的一种或多种多肽的方法，其至少包括以下步骤：
a)产生一种或多种包含至少一种Alphabody或基本上由至少一种Alphabody组成的多肽，所述至少一种Alphabody经修饰而允许多肽内化入细胞，
b)测试多肽是否具有可检测的对于细胞内靶分子的结合亲和力，和任选地
c)分离所述一种或多种多肽。
如根据本文中公开的其它详细说明和实施例将变得清楚的，本发明人已显示可提供包含至少一种Alphabody的多肽，所述多肽可高效地穿过细胞膜，在细胞内环境中保持稳定，并且可有效地特异性地结合位于细胞内的细胞内靶并影响其功能。如本文中进一步显示的，本文中描述的多肽可用于治疗各种疾病适应征，例如癌症，其通过特异性调节与这样的疾病适应征相关的细胞内靶的功能和/或通过影响其中细胞内靶参与的生物(信号转导)途径来进行。
发明详述
[定义]
如本文中所用，除非明确地另有所指，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所指物(the)”包括单数和复数所指物。
如本文中所用，术语“包含”、“包括”和“由……组成”与“包括(including)”、“包含(includes)”或“含有(containing)”、“包含(contains)”同义，并且是包含在内的或开放式，并且不排除另外的未指明的成员、组件或方法步骤。
通过端点表示的数值范围包括包含在各自范围内的所有数字和部分以及所记载的端点。
如本文中所用，术语“约”当指可测量的值例如参数、量、时间长度等时，意欲包括距离指定值的+/-10％或更小，优选+/-5％或更小，更优选+/-1％或更小，更优选+/-0.1％或更小的变化，只要在这个范围内这样的变化适合在本公开发明中进行。应理解，修饰词“约”所指的值本身也被明确地和优选地公开。
如本文中所用，“Alphabody”或“Alphabody结构”通常可定义为自我折叠的单链的三链体、主要地α-螺旋、卷曲螺旋氨基酸序列、多肽或蛋白质。更具体地，如本文中所用，Alphabody或Alphabody结构可被定义为具有通式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的氨基酸序列、多肽或蛋白质，其中HRS1、HRS2和HRS3的每一个独立地是由2至7个连续七肽重复单位组成的七肽重复序列(HRS)，至少50％的所有七肽a-和d-位置处被异亮氨酸残基占据，每一个HRS始于和终于位于七肽a-或d-位置之一处的脂肪族或芳香族氨基酸残基，并且HRS1、HRS2和HRS3一起形成三链体α-螺旋卷曲螺旋结构；并且L1和L2的每一个独立地是接头片段，如在下文中进一步定义的，其分别地将HRS1共价连接于HRS2和将HRS2共价连接于HRS3。
如本文中所用，“平行Alphabody”将具有其中三链体α-螺旋卷曲螺旋结构的α-螺旋一起形成平行卷曲螺旋结构(即其中所有3个α-螺旋平行的卷曲螺旋)的Alphabody(结构)含义。
如本文中所用，“反向平行Alphabody”将具有其中三链体α-螺旋卷曲螺旋结构的α-螺旋一起形成反向平行卷曲螺旋结构(即其中两个α-螺旋平行并且第三α-螺旋相对于这两个螺旋是反向平行的卷曲螺旋)的Alphabody(结构)含义。
如根据本文中的进一步说明将变得清楚的，本申请还设想了包含具有通式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的序列的多肽，但所述多肽在某些具体实施方案中包含其它基团、部分和/或残基，其共价连接于，更具体地N-和/或C-末端共价连接于具有式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的基本Alphabody结构。因此在本文中通称为包含Alphabody的“(Alphabody)多肽”。针对本文中的Alphabody描述的结合性质通常也可用于包所述Alphabody的Alphabody多肽。本文中设想的Alphabody多肽的特征在于存在至少一个如此形成卷曲螺旋的三螺旋结构(由3个螺旋组成的)。
术语“七肽”、“七肽单位”或“七肽重复单位”在本文中可互换使用，并且在本文中将具有7个残基的(多)肽片段的含义，所述肽片段在本文中设想的Alphabody、多肽或组合物的每一个七肽重复序列内重复2或更多次，并且表示为“abcdefg”或“defgabc”，其中符号“a”至“g”表示常规七肽位置。例如，通过使用专门的软件例如Lupas等人的COILS法(Science1991,252:1162-1164；http://www.russell.embl-heidelberg.de/cgi-bin/coils-svr.pl)将常规七肽位置赋予存在于本文中设想的Alphabody、多肽或组合物中的七肽、七肽单位或七肽重复单位内的特定氨基酸残基。然而，应注意，存在于本文中设想的Alphabody(或本文中设想的包含这些Alphabody的多肽和组合物)中的七肽或七肽单位并不严格限定于上述代表(即”abcdefg”或”defgabc”)，这根据本文中的进一步说明将变得明了，并且在它们最广的意义上本身构成了7个残基的(多)肽片段，包括至少可分配的七肽位置a和d。
术语“七肽a-位置”、“七肽b-位置”、“七肽c-位置”、“七肽d-位置”、“七肽e-位置”、“七肽f-位置”和“七肽g-位置”分别指本文中设想的Alphabody、多肽或组合物的七肽、七肽重复或七肽重复单位中的常规“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”和“g”氨基酸位置。
如本文中所用，七肽基序具有7个残基的(多)肽模式的含义。类型“abcdefg”的七肽基序通常可表示为“HPPHPPP”，而类型“defgabc”的七肽基序通常可表示为“HPPPHPP”，其中符号“H”表示非极性或疏水性氨基酸残基，符号“P”表示极性或亲水性氨基酸残基。然而，应指出，存在于本文中设想的Alphabody(或包含这些Alphabody的多肽或组合物)中的七肽基序并非严格限定于上述代表(即“abcdefg”、“HPPHPPP”、“defgabc”和“HPPPHPP”)，这根据本文中的进一步说明将变得明了。
如本文中所用，“七肽重复序列”(“HRS”)应当具有由n个连续七肽组成的氨基酸序列或序列片段的含义，其中n为等于或大于2的数。
在Alphabody(如本文中定义的)的单链结构的上下文中，术语“接头”、“接头片段”或“接头序列”在本文中可互换使用，意指作为单链Alphabody的连续氨基酸序列的部分、并且与该Alphabody的HRS序列共价互连的氨基酸序列片段。
在本说明书中，“卷曲螺旋”或“卷曲螺旋结构”在本文中可互换使用，并且基于共同的一般知识和说明以及本文中引用的其它参考资料对于本领域技术人员来说将是很清楚的。在这一点上特别地参考关于卷曲螺旋结构的综述论文，例如Cohen和Parry Proteins1990,7:1-15；Kohn and Hodges Trends Biotechnol1998,16:379-389；Schneider等人Fold Des1998,3:R29-R40；Harbury等人Science1998,282:1462-1467；Mason和Arndt ChemBioChem2004,5:170-176；Lupas和Gruber Adv Protein Chem2005,70:37-78；Woolfson AdvProtein Chem2005,70:79-112；Parry等人J Struct Biol2008,163:258-269；McFarlane等人Eur J Pharmacol2009:625:101-107。
“Alphabody的α-螺旋部分”在本文中将具有拥有α-螺旋二级结构的Alphabody的该部分的含义。此外，具有α-螺旋二级结构的Alphabody完全部分的任何部分也被当作是Alphabody的α-螺旋部分。更具体地，在结合位点的上下文中，在其中位于Alphabody的α-螺旋部分中的一个或多个氨基酸促成该结合位点时该结合位点被认为是由Alphabody的α-螺旋部分形成的。
Alphabody的α螺旋的“溶剂定向(solvent-oriented)”或“暴露于溶剂的(solvent-exposed)”区域在本文中将具有被直接暴露或直接与其所存在于其中的溶剂、环境、外围环境或背景接触的Alphabody的该部分的含义。此外，被直接暴露或与溶剂直接接触的Alphabody完全部分的任何部分也被视作Alphabody的溶剂定向或暴露于溶剂的区域。更具体地，在结合位点的上下文中，在其中位于Alphabody的溶剂定向部分中的一个或多个氨基酸促成结合位点时该结合位点被认为是由Alphabody的溶剂定向部分形成的。
术语“Alphabody的沟”在本文中将具有Alphabody上的对应于通过Alphabody内空间上相邻α-螺旋的任何对所形成的凹陷的沟样局部形状的该部分的含义。
如本文中所用，氨基酸残基将以它们的全名或根据标准3字母或单字母氨基酸代码来显示。
如本文中所用，术语“同源性”表示来自相同或不同分类群的两个大分子之间，具体地两个多肽或多核苷酸之间的至少二级结构相似性，其中所述相似性归因于共有的祖先。因此，术语“同源物”表示具有所述二级和任选地三级结构相似性的这样相关的大分子。为了比较两个或更多个核苷酸序列，可使用本领域技术人员已知的方法，例如通过将第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列内对应位置上的核苷酸相同的核苷酸的数目除以第一核苷酸序列中核苷酸的总数，然后乘以100％，或通过使用用于序列比对的已知计算机算法例如NCBI Blast来计算第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“(百分比)序列同一性”。在测定两个Alphabody之间的序列同一性的程度中，本领域技术人员可考虑所谓的“保守”氨基酸置换，所述保守氨基酸置换通常可被描述为其中氨基酸残基被另一个具有相似化学结构的氨基酸残基替代并且对多肽的功能、活性或其它生物性质几乎没有影响或基本上无影响的氨基酸置换。可能的保守氨基酸置换对于本领域技术人员来说将是很明了的。Alphabody和核酸序列如果在它们的整个长度上具有100％的序列同一性的话，它们被认为是“完全相同的”。
当(Alphabody)多肽或Alphabody具有对于特定靶(或对于其至少部分或片段)的亲和力，特异性和/或特异性抗所述靶时，该Alphabody或多肽被认为“特异性结合”该靶。
如本文中所用，Alphabody或多肽的结合的“特异性”可基于亲和力和/或亲合力来测定。Alphabody或多肽的“亲和力”通过Alphabody或多肽与其结合的目标靶蛋白解离的平衡常数来表示。KD值越低，Alphabody或多肽与其结合的目标靶蛋白之间的结合强度越强。或者，还可通过亲和力常数(KA)来表达亲和力，所述亲和力常数对应于1/KD。取决于具体的目标靶蛋白，Alphabody或多肽的结合亲和力可以以本领域技术人员已知的方式来测定。在本领域通常已知KD可表达为复合物的解离速率常数(表示为kOff(以秒-1或s-1表示))对其缔合速率常数(表示为kOn(以molar-1秒-1或M-1s-1表示))的比率。大于约1毫摩尔浓度的KD值通常被认为表示不结合或非特异性结合。
Alphabody或多肽针对给定的靶的的“亲合力”是Alphabody或多肽与给定的目标靶蛋白之间的结合强度的量度。亲合力与目标靶蛋白上的结合位点和Alphabody或多肽上的结合位点之间的亲和力以及存在于Alphabody或多肽上的相关结合位点的数目相关。
当Alphabody或多肽以为该Alphabody或多肽用以结合第二目标靶蛋白的亲和力的至少5倍，例如至少10倍，例如至少100倍，优选至少1000倍的亲和力结合第一目标靶蛋白时，所述Alphabody或多肽被认为是“相对于第二目标靶蛋白而言对于第一目标靶蛋白是特异性的”。因此，在某些实施方案中，当Alphabody或多肽被认为是相对于第二目标靶蛋白而言“特异于”第一目标靶蛋白时，其可特异性结合(如本文中定义的)第一目标靶蛋白，但不特异性结合第二目标靶蛋白。
Alphabody或多肽的“半衰期”通常可被定义为Alphabody或多肽的体内血清或血浆浓度减小至50％所需的时间。可以以本领域技术人员已知的任何方式，例如通过药代动力学分析来测定Alphabody或多肽的体内半衰期。如对于本领域技术人员来说将很明了的，可使用参数如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)来表达半衰期。通常地，增加的体内半衰期的特征在于参数t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积AUC)中一个或多个、优选地所有3个参数的增加。
如本文中所用，术语“抑制”、“减弱”和/或“阻止”可指本文中设想的多肽(的用途)，所述多肽特异性结合目标靶蛋白并且抑制、减弱和/或阻止目标靶蛋白与其天然结合伴侣之间的相互作用。术语”抑制”、”减弱”和/或”阻止”还可指本文中设想的多肽(的用途)，所述多肽特异性结合目标靶蛋白并且抑制、减弱和/或阻止该目标靶蛋白的生物活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定测量的。因此，“抑制”、“减弱”和/或“阻止”还可指多肽(的用途)，所述多肽特异性结合目标靶蛋白并且抑制、减弱和/或阻止其中牵涉该目标靶蛋白的一个或多个生物或生理机制、作用、反应、功能途径或活性。取决于目标靶蛋白，多肽作为拮抗剂的这样的作用可以以任何适当的方式和/或使用本领域已知的任何适当(体外和通常地细胞或体内)测定来测定。
如本文中所用，术语“增强”、“增加”和/或“激活”可以指多肽(的用途)，所述多肽特异性结合目标靶蛋白并且增强、增加和/或激活该目标靶蛋白与其天然结合伴侣之间的相互作用。术语“增强”、“增加”和/或“激活”可以指多肽(的用途)，所述多肽特异性结合目标靶蛋白并且增强、增加和/或激活该目标靶蛋白的生物活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定测量的。因此，“增强”、“增加”和/或“激活”还可指多肽(的用途)，所述多肽特异性结合目标靶蛋白并且增强、增加和/或激活其中牵涉该目标靶蛋白的一个或多个生物或生理机制、作用、反应、功能途径或活性。取决于目标靶蛋白，本文中设想的多肽作为激动剂的这样的作用可以以任何适当的方式和/或使用本领域已知的任何适当(体外，通常地细胞或体内)测定来测定。
抑制或拮抗本文中设想的多肽的活性或者增强或激动多肽的活性可以是可逆的或不可逆的，但对于制药和药理应用通常可逆地发生。
如本文中所用，但对于Alphabody或多肽或核酸序列已从其中产生其的宿主细胞和/或培养基提取或纯化出来时，所述Alphabody或多肽或核酸序列被认为是“(以)基本上分离的(形式)存在”。
在包含在本文中设想的多肽内的Alphabody或Alphabody结构的方面，术语存在于Alphabody上的“结合区域”、“结合位点”或“相互作用位点”在本文中将具有存在于Alphabody上的负责结合靶分子的氨基酸残基特定位点、部分、结构域或区段的含义。这样的结合区域基本上由来自Alphabody的与靶分子接触的特定氨基酸残基组成。
如果Alphabody或多肽对于两不同的目标靶蛋白是特异性的(如本文中定义的)，则其被认为显示对于这两种不同的目标靶蛋白的”交叉反应性”。
如果Alphabody包含一个针对于或特异性结合目标靶的氨基酸残基位点、决定簇、部分、结构域或区段的结合位点，则Alphabody或多肽被认为是“单价”的。在其中Alphabody或多肽的两个或更多个结合位点针对于或特异性结合目标靶的相同氨基酸残基位点、决定簇、部分、结构域或区段的情况下，Alphabody或多肽被认为是“双价的”(在两个结合位点存在于Alphabody或多肽上的情况下)或多价的(在超过两个结合位点存在于Alphabody或多肽上的情况下)，例如三价的。
术语“双特异性”当指Alphabody或多肽时，意指a)Alphabody或多肽的两个或更多个结合位点针对于或特异性结合相同目标靶但不结合该靶的相同(即结合不同)氨基酸残基位点、决定簇、部分、结构域或区段，Alphabody被认为是“双特异性的”(在两个结合位点存在于Alphabody上的情况下)或多特异性的(在超过两个结合位点存在于Alphabody上的情况下)，或b)Alphabody的两个或更多个结合位点针对于或特异性结合不同的目标靶分子。在超过两个结合位点存在于Alphabody的情况下使用术语“多特异性的”。
因此，如本文中所用，“双特异性Alphabody(或多肽)”或“多特异性Alphabody(或多肽)”将具有分别包含两个或至少两个结合位点的式(N-)HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3(-C)的单链Alphabody结构(包含所述结构的多肽)的含义，其中这两个或更多个结合位点具有不同的结合特异性。因此，如果两个或超过2个不同结合区域存在于相同的单体单结构域Alphabody中，则Alphabody(或多肽)在本文中被认为是“双特异性的”或“多特异性的”。
如本文中所用，术语“预防和/或治疗”包括预防和/或治疗特定疾病和/或障碍，防止特定疾病和/或障碍的发作，减缓或逆转特定疾病和/或障碍的进展，阻止或减缓与特定疾病和/或障碍相关的一个或多个症状的发生，减轻和/或缓解与特定疾病和/或障碍相关的一个或多个症状，减轻特定疾病和/或障碍的严重度和/或持续时间，以及通常地本文中设想的对待治疗的受试者或患者有益的多肽的任何预防或治疗作用。
如本文中所用，术语“生物膜”或“膜”是指将细胞或成群的细胞与细胞外空间分隔的含脂质屏障。生物膜包括但不限于质膜、细胞壁、细胞内细胞器膜，例如线粒体膜、核膜等。
将本说明书中引用的所有文献通过引用整体并入本文。除非另外定义，否则本公开内容中使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有如本教导所属领域的技术人员通常理解的含义。借助于其它指导，术语定义被包括来更好地理解本文中提供的教导。
[本发明相关描述]
已发现可产生Alphabody多肽，所述多肽能够进入细胞，在细胞内保持稳定，并且可特异性结合该细胞中的细胞内靶以及调节其功能。更具体地，已获得Alphabody多肽，所述多肽相较于包含Alphabody或由其组成的现有技术多肽而言，已经修饰而使它们能够内化入细胞(即细胞内摄入)和特异性结合细胞内部的细胞内靶分子或与所述靶分子相互作用(与本领域已知的Alphabody序列相反)。此外，已发现本文中设想的Alphabody多肽可以以高于常规结合剂的亲和力或至少与其相当的亲和力结合细胞内靶。
多肽进入细胞的能力可由本领域技术人员利用常规方法，例如利用本文中的实施例(更具体的本文中的实施例3和9.1.2)中描述的方法来进行测试。例如，在提供具有适当的标签的多肽后，可用显微镜跟踪至细胞内的进入。通常地，为了客观地评价增强的多肽被细胞内摄入的能力，可在这些测定中将本文中设想的多肽与现有技术多肽比较，所述现有技术多肽是包含未修饰Alphabody序列或由其组成的多肽。
因此对于本领域技术人员来说很清楚的是，现有技术的Alphabody序列不包含本文中提供的多肽的结构性质的特定组合。事实上，迄今为止，仍未设想Alphabody仅被设想用于细胞外靶，从而未曾设想用于细胞内靶向的特定修饰。因此，对于本领域技术人员来说很清楚的是，本申请的权利要求中不包括现有技术中公开的Alphabody序列，所述序列包括：
-Complix NV名下的公开申请WO2010/066740中的SEQ ID NO：4至10，
-Complix NV名下的公开申请WO2011/003935中的SEQ ID NO：1至5、10、17、22、24、27、32和36，
-Complix NV名下的公开申请WO2011/003936中的SEQ ID NO：2至7，
-Complix NV名下的公开申请WO2012/092970中的SEQ ID NO：1至85，
-Complix NV名下的公开申请WO2012/092971中的SEQ ID NO：1至4和8，
-Complix NV名下的公开申请WO2012/093013的SEQ ID NO：64至69、71至75和77至80，和
-Complix NV名下的公开申请WO2012/093172中的SEQ ID NO：1至135。
在第一方面，提供了包含至少一个Alphabody(如本文中定义的)或基本上由其组成的多肽，所述多肽能够被内化入细胞并且特异性结合在细胞内具有生物活性的细胞内靶分子。
本文中描述的多肽能够高效地穿过生物细胞膜。生物活性分子的细胞内运输通常是一般药物递送中的至关重要的问题之一，因为生物膜的亲脂性质限制了这样的化合物的直接细胞内递送。除非存在有关的主动运输机制，否则细胞膜阻止大分子例如肽、蛋白质和DNA自发进入细胞。
本文中提供了独特的和高效力的多肽，所述多肽不仅以高亲和力与细胞内目标靶特异性相互作用，而且其还能够通过穿过细胞膜自主地进入细胞，并且在细胞内环境中保持完全活性和功能性。
虽然许多将化合物运输入细胞的方法是已知的，但这些方法的大部分不导致高效穿膜以获得显著的(治疗性)作用(即通常仅小百分比的化合物分子到达细胞内环境)。此外，最终确实终止于细胞中的化合物通常被蛋白酶活性快速分解和/或当通过内体摄取途径摄入时通过严苛(酸性)内体pH条件变性。
用于细胞内递送的已知方法包括侵入性和非侵入性方法。在细胞实验中用于递送不可透过膜的分子的显微注射或电穿孔在性质上是侵入性的，其可损害细胞膜(Chakrabarti,R.等人(1989)Transfer ofmonoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.J.Biol.Chem.264,15494 15500；Arnheiter,H.和Haller,O.(1988)Antiviral state against influenza virus neutralized bymicroinjection of antibodies to interferon-induced Mx proteins.EMBO J.7,1315 1320)。
非侵入性方法包括pH-敏感性载体(例如pH-敏感性脂质体)的使用和允许细胞穿透的载体的使用。
[用于将多肽转运通过细胞膜的技术]
1.与基团、部分、蛋白质或肽的融合或缀合
在前些年被其它研究人员用于细胞内递送分子的策略是将这些分子偶联于可将它们运送或转移通过细胞膜的“载体”。
通常地，这样的“载体”由具有从天然存在的细胞穿透蛋白(来自病毒、细菌或高等生物)分离的特定序列的线性肽(称为蛋白质转导域(PTD)或细胞穿透肽(CPP))组成。通常将这样的载体融合于”货物(cargo)”(所述货物为假定作用于细胞内靶的功能性治疗性蛋白)，以有利于货物至细胞内的转移。这样的构建体对细胞的体外功能活性已详尽地记录在文献中。然而，由于CPP或PTD至目前为止主要用作研究工具，因此它们在动物模型中的体内活性的显示很有限。
一般而言，除了这些CPP/PTD融合构建体已被当作相当复制的结构(包含至少两个分子实体)的事实外，它们在现有技术中还被描述为遭受几个缺点，即货物保持被捕获在内体中而不被有效地释放入胞质溶胶，CPP/PTD融合构建体强烈地倾向于聚集-在生产和纯化中引发问题，更重要地，减小效率和导致潜在有害的副作用(例如众所周知聚集体激发免疫反应)以及靶位置上的极小生物利用度和稳定性问题，因为大多数CPP/PTD构建体被当作易受蛋白酶攻击的柔性附加物(appendage)。
令人惊讶地，如实施例中详尽描述的，本发明人已发现，通过将至少一个Alphabody多肽与细胞穿透肽融合，所得的多肽被高效地递送进入细胞并且在细胞内保持稳定，同时允许高亲和力结合细胞内部的靶。事实上，本发明人已显示针对细胞内抗细胞凋亡靶MCL-1的多肽被细胞以剂量依赖性的方式(参见例如实施例1至8)高效地摄入并且，更重要地，能够诱导期望的作用，即通过与靶分子MCL-1相互作用而诱导这些细胞的细胞凋亡。
因此，在具体实施方案中，提供了多肽，所述多肽包含至少一个针对细胞内靶分子的Alphabody或基本上由其组成，所述多肽与基团、部分或肽融合或缀合，从而确保多肽的高效细胞穿透，其中多肽的稳定性在细胞内得到维持，从而使得能够高效结合细胞内靶。
在某些具体实施方案中，本文中提供的多肽包含至少一个针对细胞内靶分子的Alphabody，所述Alphabody直接或间接连接于即偶联于、融合于或缀合于基团、(蛋白质)部分或肽，以允许或确保多肽的细胞穿透。
在某些具体实施方案中，多肽包含可结合细胞内靶的Alphabody，所述Alphabody直接连接于基团、(蛋白质)部分或肽，从而允许细胞穿透，即在Alphabody与允许细胞穿透的所述基团、(蛋白质)部分或肽之间无任何中间实体或序列。
在可选择的具体实施方案中，允许Alphabody多肽进入细胞的基团、(蛋白质)部分或肽还可连接于除针对细胞内靶分子的Alphabody外的实体，只要该实体形成多肽的部分即可。这样的其它实体(可将允许细胞穿透的基团、部分或肽连接于其上)可以例如是第二Alphabody(例如在包含串连在一起的Alphabody的二价或多价多肽的情况下)或可以例如是具有特定功能的基团或蛋白，例如延长多肽的体内半衰期的蛋白，或靶向肽，其将多肽靶向或导向某些特定细胞类型。同样地，所述其它实体可以是接头，例如偶联蛋白质的适当肽接头，如本领域技术人员已知的。
在其它具体实施方案中，提供了包含至少一个针对细胞内靶分子的Alphabody或由基本上由其组成的多肽，所述Alphabody被缀合于细胞穿透肽(CPP)，例如但不限于TAT、CPP5、Penetratin、Pen-Arg、pVEC、M918、TP10(Madani等人,Journal of Biophysics,Volume2011,Article ID414729)或TAT-HA融合肽(Wadia等人,2004,10,310-315)。在具体实施方案中，提供了包含至少一个特异性结合细胞内靶分子的Alphabody的多肽，所述多肽的特征在于存在缀合于Alphabody结构序列、确保多肽至细胞内的内化的序列。在具体实施方案中，本文中设想的多肽的特征在于序列例如但不限于KLPVM(SEQID NO：21)、VPTLK(SEQ ID NO：22)或YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：23)的存在。在具体实施方案中，所述序列为CPP5肽。
因此，如本文中所显示的，提供了能够结合细胞内靶的多肽，所述多肽包含序列KLPVM(SEQ ID NO：21)、VPTLK(SEQ ID NO：22)或YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：23)。
2)通过设计进行的细胞穿透：CPAB技术
虽然Alphabody的α-螺旋卷曲螺旋结构本身不赋予膜穿透能力，但本文中描述了将包含一个或多个Alphabody结构的多肽带入细胞的新型改进技术，所述技术包括在Alphabody支架中设计特定氨基酸区域，任选地包括序列模式或基序。事实上，已开发了新型高效的细胞穿透技术，所述技术在本文中称为“CPAB技术”，其使得能够将包含Alphabody的多肽转化成高效细胞穿透分子，即所谓的“细胞穿透Alphabody”(cell penetrating Alphabodies，CPAB)或“细胞穿透Alphabody多肽”。
利用CPAB技术设计特定CPAB Alphabody多肽至少包括制备或修饰包含Alphabody结构序列的多肽，以获得至少部分地包含于多肽的Alphabody结构序列内的氨基酸区域的步骤，所述氨基酸区域确保多肽至细胞内的内化。因此，特定CPAB Alphabody的设计包括将一个或多个内化区域引入(例如通过序列设计或通过突变)Alphabody序列或其部分。在具体实施方案中，这包括在Alphabody支架的序列中的特定位置上引入特定氨基酸残基。
已发现，通过将这样的内化区域至少部分地引入Alphabody序列，可产生能够自主地穿透(即无需任何其它使得能够穿入细胞的结构)细胞的多肽。此外，如将在下文中详述的，已发现可任选地将这与在Alphabody结构内提供细胞内靶的结合位点组合，以便获得高效细胞内结合剂。
本文中提供的CPAB多肽已被设计来在包含Alphabody结构的多肽中的一个或多个有限区域内，更具体地至少部分地在Alphabody结构内包含某些类型的氨基酸残基。更具体地，已发现特定的带正电荷(也称为阳离子性)区域能够非常好地确保多肽的内化。因此，在具体实施方案中，本文中设想的多肽包含至少一个带正电荷的内化区域，所述区域的特征在于许多存在于Alphabody支架的特定位置上的带正荷氨基酸残基，通过所述氨基酸残基给多肽提供了进入细胞的能力。在某些实施方案中，所述至少一个带正电荷的内化区域可被认为包含细胞穿透基序或“细胞穿透模式”(在本文中也称为“CPAB基序”或“CPAB模式”)。这样的基序或模式可被认为特征在于给本文中设想的多肽提供细胞穿透活性。
在第一方面，本文中提供了多肽，所述多肽包含至少一个Alphabody结构序列和至少一个带正电荷的内化区域(确保所述多肽至细胞的内化)或基本上由所述结构序列和内化区域组成，其中所述内化区域至少部分地包含于所述Alphabody结构序列内。
如本文中所用，带正电荷的内化区域被当作是这样的序列，所述序列为Alphabody结构序列(如本文中定义的)的至少部分并且在本文中设想的多肽的两个带正电荷氨基酸残基之间延伸。
在本说明书中，术语“带正电荷的氨基酸”是指选自精氨酸和赖氨酸的氨基酸。
因此，本文中提供的多肽包含带正电荷的序列，其始于带电荷的氨基酸残基和终于带正电荷的氨基酸残基并且确保多肽能够进入细胞。
对于本领域技术人员来说将很明了的是，本文中设想的多肽可包含(但不一定包含)位于本文中设想的内化区域外部的另外的带正电荷氨基酸残基。因此，特定数目的带正电荷的氨基酸残基可存在于本文中设想的多肽中，所述氨基酸残基不形成本文中描述的内化区域的部分，从而被认为对多肽的细胞穿透能力没有贡献。此外，本文中设想的多肽可以包含或可以不包含两个或更多个本文中描述的内化区域，所述内化区域彼此分隔或彼此重叠。
本文中设想的多肽的至少一个带正电荷内化区域的进一步特征在于存在至少6个带正电荷的氨基酸残基。所述至少6个氨基酸残基可选自精氨酸和赖氨酸。事实上，本发明人已发现当6个或更多个带正电荷的氨基酸残基(例如精氨酸或赖氨酸或精氨酸与赖氨酸的混合物)簇聚在本文中设想的多肽内的特定位置上时，确保了多肽至细胞的高效进入。
此外，已观察到当内化区域中的所述至少6个带正电荷残基中的至少4个残基是精氨酸时或当内化区域中的所述至少6个带正电荷残基中的至少5个残基是赖氨酸时，观察到高效细胞穿透。
包含于本文中设想的多肽中的内化区域是这样的氨基酸片段，所述氨基酸片段(i)在两个带正电荷的氨基酸残基之间延伸，(ii)特征在于存在至少6个带正电荷的氨基酸残基，和以下情形之一
(iiia)由最多16个氨基酸组成，或
(iiib)至少35％由带正电荷氨基酸组成。
对于本领域技术人员来说将很明了的是，现有技术的Alphabody序列不包含本文中提供的多肽的结构特性的该特定组合。与之一致地，现有技术的Alphabody序列未被所附权利要求包括。
因此，本文中描述的带正电荷的内化区域可以是在两个带正电荷的氨基酸残基之间延伸的最多16个氨基酸的片段，其特征在于存在至少6个带正电荷的氨基酸残基。在某些具体实施方案中，内化区域是16个氨基酸的片段，其以两个带正电荷的氨基酸为界，并且特征在于存在至少6个带正电荷的氨基酸。在其它具体实施方案中，内化区域为16个氨基酸的片段，其包含6、7、8、9或10个或更多个(例如16个)带正电荷的氨基酸，并且以2个带正电荷的氨基酸为界。
在其它具体实施方案中，所述区域为以两个带正电荷的氨基酸为界并且特征在于存在至少6个带正电荷的氨基酸的16个氨基酸的片段，所述片段的至少4个残基为精氨酸或其至少5个残基为赖氨酸。
在其它具体实施方案中，内化区域可包含7、8、9、10或更多个(例如16个)带正电荷的氨基酸，包含加在一起达到总共7、8、9、10或超过10个(例如16个带正电荷的氨基酸)的精氨酸与赖氨酸的组合。这样的带正电荷的氨基酸残基的组合包括例如4个精氨酸和3个赖氨酸、5个精氨酸和3个赖氨酸、6个精氨酸和4个赖氨酸、4个精氨酸和4个赖氨酸、5个精氨酸和4个赖氨酸、5个精氨酸和5个赖氨酸、6个精氨酸和3个赖氨酸的组合，以及加在一起达到最多总共16个带正电荷氨基酸残基的精氨酸与赖氨酸的任何适当的其它组合。
在其它具体实施方案中，内化区域可包含至少4个，例如5、6、7、8、9、10或超过10个，例如最多16个精氨酸。在其它具体实施方案中，内化区域可包含至少5个，例如6、7、9、10或超过10个，例如最多16个赖氨酸。
在某些实施方案中，包含在本文中设想的多肽中的带正电荷的内化区域内的所述至少6个带正电荷氨基酸残基完全由精氨酸组成或完全由赖氨酸组成。或者，在某些具体实施方案中，包含在本文中设想的多肽中的带正电荷的内化区域内的所述至少6个带正电荷氨基酸残基由精氨酸和赖氨酸组成。
已发现在包含Alphabody结构序列的多肽序列中彼此集簇靠近的正电荷增强多肽的细胞穿透。
因此，所述至少一个本文中设想的带正电荷的内化区域可以是在两个带正电荷的氨基酸残基之间延伸的片段，其特征在于存在至少6个带正电荷的氨基酸残基并且至少35％由带正电荷的氨基酸组成。在具体实施方案中，本文中设想的所述至少一个带正电荷的内化区域的至少35％由带正电荷的氨基酸组成，例如至少40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％由带正电荷的氨基酸残基组成。所述带正电荷的氨基酸残基可以是精氨酸或赖氨酸。在其它具体实施方案中，本文中设想的多肽中所述至少一个带正电荷的内化区域至少35％由带正电荷的氨基酸组成并且特征在于存在至少6个带正电荷的氨基酸残基，所述带正电荷的氨基酸残基中至少4个残基为精氨酸。在其它具体实施方案中，本文中设想的多肽中所述至少一个带正电荷的内化区域至少35％由带正电荷的氨基酸组成并且特征在于存在至少6个带正电荷的氨基酸残基，所述带正电荷的氨基酸残基中至少5个残基为赖氨酸。
事实上，本发明人已令人惊讶地发现，当不同的和相对短的氨基酸残基片段-至少部分地(优选完全地)位于Alphabody结构内-被饰以或提供以许多彼此靠近的带正电荷的氨基酸残基时，可产生在细胞穿透以及细胞内稳定性和功能性方面具有高度有利性质的多肽。
虽然在现有技术中已进行了许多努力来以随机的方式使蛋白质带正电荷或阳离子化(基本上使电荷散布在整个蛋白质表面)，以增强细胞穿透，但观察到许多副作用并且在细胞内未显示功能性。这些副作用例如包括对细胞器和膜的非特异性结合或粘滞性，不稳定性和因”带电过多(overchargement)”而引起的静电排斥，导致聚集的变性以及与例如膜组分和酸性蛋白质的假相互作用。
然而本发明人现已发现，在包含Alphabody结构序列的多肽序列的狭窄窗口(即对应于约15至20个氨基酸残基，优选不超过16个氨基酸残基的窗口)中彼此靠近的正电荷可最佳地实现多肽的细胞穿透。
在本文中设想的具体实施方案中，本文中设想的多肽的内化区域中的正电荷在包含于多肽的Alphabody序列内的狭窄窗口中彼此靠近，所述狭窄窗口不超过总Alphabody序列的约15-20％。
在一些具体实施方案中，所述至少一个内化区域完全包含于所述至少一个Alphabody结构序列的一个α-螺旋内。
该内化区域内的带正电荷氨基酸不一定彼此相接，而是可相隔一个或多个非-带正电荷的氨基酸。事实上，本领域技术人员将承认Alphabody基序带来某些限制。通常地，内化区域被认为在于最多16个氨基酸残基的片段内彼此相距最远的两个带正电荷的氨基酸残基之间延伸。
在根据这些实施方案设想的多肽中，内化区域被整合入Alphabody结构内，至少80％(例如至少约13/16的氨基酸)位于多肽中的Alphabody结构内，从而有限数目的氨基酸(例如至多约3/16的氨基酸)可在Alphabody结构外部于多肽中延伸。在某些具体实施方案中，本文中设想的内化区域内的至少50％例如至少60％、70％、80％、90％或100％(即全部)的带正电荷氨基酸残基包含于本文中提供的多肽的Alphabody结构序列内。
然而在一些具体实施方案中，整个内化区域位于Alphabody结构序列内。
内化区域中的带正电荷氨基酸在Alphabody中的位置将影响内化的效率。事实上，在具体实施方案中，内化区域的一个或多个带正电荷的氨基酸残基位于Alphabody的外表面，具体地在Alphabody的溶剂定向外表面上，例如在Alphabody的至少一个α-螺旋外部溶剂定向表面上。事实上，已发现如果内化区域的带正电荷氨基酸残基位于Alphabody结构或支架外表面上，则内化得到增强。因此，在具体实施方案中，内化区域的带正电荷氨基酸位于多肽中的Alphabody结构的α-螺旋外表面上，更具体地(完全地)在Alphabody结构的α-螺旋外表面上。
鉴于以上所述，已确定如果在Alphabody结构中的特定位置上提供带正电荷的氨基酸，则可获得增强的内化。因此，在具体实施方案中，内化区域包含具有带正电荷的氨基酸的特殊基序。这样的基序或模式从而在蛋白质水平上是独特的氨基酸序列(或在基因水平上是独特的核酸序列)，其在特定位置上包含一个或多个特征性氨基酸残基(或编码所述氨基酸残基的核酸序列)。某些CPAB基序(如本文中使用的)内的“特征性氨基酸残基”代表了该CPAB基序内对于包含该CPAB基序的CPAB Alphabody的细胞穿透能力而言至关重要的那些氨基酸残基。因此，改变CPAB Alphabody中的CPAB基序的所谓的“特征性或至关重要的残基”的身份(例如通过突变或从头序列设计)将影响该CPAB Alphabody的细胞穿透能力。
在某些具体实施方案中，当带正电荷的氨基酸残基的数目减少至少于4个时，本文中设想的内化区域的CPAB基序不再能够介导多肽的细胞内化。
如上所述，如本文中所用的带正电荷的内化区域、CPAB基序或CPAB模式至少部分地被这样整合入Alphabody结构序列(如本文中定义的)，从而与缀合于或连接于Alphabody序列的末端之一(以确保细胞穿透)的细胞穿透肽或蛋白质序列或其它细胞穿透基团不同。
已发现内化区域在多肽的α-螺旋结构中的位置不是至关重要的，即本文中设想的带正电荷的内化区域可位于Alphabody结构的螺旋A、B或C中。
在具体实施方案中，本文中提供的多肽包含至少一个内化区域，其位于Alphabody结构的螺旋A中。在其它具体实施方案中，本文中提供的多肽包含至少一个内化区域，其位于Alphabody结构的螺旋C中。在其它具体实施方案中，本文中提供的多肽包含2个内化区域，其各自位于本文中描述的Alphabody结构的螺旋A和螺旋C中。
在某些具体实施方案中，已发现Alphabody结构的两个不同部分(例如A螺旋和C螺旋)中2个内化区域的组合也还可增加至细胞内的穿透性。
然而，在具体实施方案中，优选地，内化区域不包含于Alphabody结构的环或接头区域内。在其它具体实施方案中，预期Alphabody结构的3个螺旋中至多2个包含内化区域。
在其它特别优选实施方案中，本文中设想的多肽包含至少一个内化区域，其完全位于Alphabody结构的一个α-螺旋(例如A螺旋、B螺旋或C螺旋)内，或大体上完全包含于所述螺旋中。在其它具体实施方案中，本文中设想的多肽包含至少一个内化区域，其完全位于Alphabody结构的一个α-螺旋(例如A螺旋或C螺旋)内，或大体上完全包含于所述螺旋中。
在具体实施方案中，所述带正电荷的氨基酸位于常规七肽b-、c-、e-、f-和g-位置(即Alphabody支架的非核心位置(如本文中定义的))上，所述位置通常位于Alphabody支架的外部(即暴露于溶剂的)α-螺旋表面。
因此，在具体实施方案中，CPAB基序可以例如(不限于)存在于下列16个氨基酸的片段中，所述片段包含于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内：XXHXXXHXXHXXXHXX，
其中H代表疏水性和/或非极性氨基酸残基，
其中X代表亲水性和/或极性氨基酸残基，并且
其中至少6个X残基为精氨酸或赖氨酸。
在具体实施方案中，H代表异亮氨酸。
在其它具体实施方案中，基序为16个氨基酸片段XXHXXXHXXHXXXHXX的子片段，其包含于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内,
其中H代表疏水性和/或非极性氨基酸残基，
其中X代表亲水性和/或极性氨基酸残基，条件是X残基中的至少6个为精氨酸或赖氨酸。在一些具体实施方案中，H代表异亮氨酸。
本发明人已鉴定了不同的有用的带正电荷内化基序。在具体实施方案中，CPAB基序对应于ZZXXZXXZZXXZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸并且X代表任意氨基酸残基。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HZZHPZPHZZHPZPHPPHPPPHPP，以便带正电荷的氨基酸(Z)位于螺旋的外表面上。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXZXXZZXXZXXZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPZHPZPHZZHPZPHZPHPPPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXZZXXZXXZZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHPZPHZZHPZPHZZHPPPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXZXXXZXXXZXXZZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HZPHZPPHZPHPZPHZZHPPPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXXZXXXZXXZZXXZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHZPPHZPHPZPHZZHPZPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXZXXXZXXXZXXZZXXZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HZPHZPPHZPHPZPHZZHPZPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXZZXXZXXZZXXZXXZZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HZPHZZPHZPHZZPHZZHZZPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXZZXXZXXZZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HZPHZZPHZPHZZPHPPHPPPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZZXXZXXZZXXZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHZZPHZPHZZPHZPHPPPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXZXXZZXXZXXZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHZPPHZPHZZPHZPHZPPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXZZXXZXXZZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHPPPHZPHZZPHZPHZZPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZZXXZXXXZXXZZXXZZXZZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHZZPHZPHPZPHZZHPZZHZZ。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZZXXZXXXZXXZZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHZZPHZPHPZPHZZHPPPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXZXXXZXXZZXXZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHPZPHZPHPZPHZZHPZPHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXXZXXZZXXZZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHPPPHZPHPZPHZZHPZZHPP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZXXZZXXZZXZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHPPPHPPHPZPHZZHPZZHZP。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZZXXZZXZZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于HPPHPPPHPPHPPPHZZHPZZHZZ。
在其它具体实施方案中，CPAB基序对应于ZZXXXXXZZXXXXXZZ，其中Z代表带正电荷的氨基酸。更具体地，该CPAB基序位于Alphabody结构的一个或多个螺旋的七肽重复序列内。在具体实施方案中，该基序在特征为结构HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋结构上的定位对应于ZZHPPPHZZHPPPHZZ。
还已发现其它基序适合用于确保多肽至细胞内的内化，例如ZXXXZXXXXXXZZXXXZXZZ(其在被引入七肽重复基序时对应于ZPPHZPHPPHZZHPZHZZ)。本领域技术人员也可设想本文中提供的CPAB基序的其它变化。
如上所述，本文中设想的多肽可在Alphabody结构中包含超过一个内化区域。这样的基序可包含相同或不同的基序。
本文中设想的多肽中的一个或多个内化区域(即在每区域最多16个氨基酸的片段上延伸)可被表征为具有净电荷。本文中设想的带正电荷的内化区域的净电荷通常对应于该内化区域中的带正电荷的氨基酸的总数。在具体实施方案中，内化区域的净电荷为至少+6。还可设想可提供具有+7、+8、+9、+10，例如最大+16的净电荷的带正电荷内化区域。
已显示(如实施例9至11中详述的)CPAB基序可被整合进入Alphabody支架而不破坏靶结合位点。
在具体实施方案中，本文中提供的多肽包含至少一个Alphabody结构序列或基本上由其组成，所述Alphabody结构序列：
(i)能够通过至少一个本文中描述的带正电荷的内化区域的存在被内化入细胞，所述内化区域至少部分地包含于所述Alphabody结构序列内，此外
(ii)主要通过存在于Alphabody结构序列上的结合位点而特异性结合细胞内靶分子。
在这些具体实施方案中，本文中提供的多肽主要通过存在于Alphabody结构序列的B螺旋上的结合位点而特异性结合细胞内靶分子。
在某些具体实施方案中，提供了包含Alphabody结构的多肽，所述多肽能够结合细胞内靶，并且特征在于存在至少部分地位于所述多肽中存在的Alphabody结构序列内的一个或多个带正电荷的内化区域，其中所述内化区域由不超过16个氨基酸残基的片段组成，其特征在于存在至少6个带正电荷的氨基酸残基。
在某些具体实施方案中，提供了包含Alphabody结构的多肽，所述多肽能够结合细胞内靶，并且特征在于存在至少一个至少部分地位于所述多肽中存在的Alphabody结构序列内的带正电荷的内化区域，其中所述内化区域的特征在于存在至少6个带正电荷的氨基酸残基，并且至少35％由带正电荷的氨基酸组成。
在其它具体实施方案中，提供了包含Alphabody结构的多肽，所述多肽能够结合细胞内靶，并且特征在于存在一个或多个至少部分地位于所述多肽中存在的Alphabody结构序列内的内化区域，其中内化区域包含至少6个带正电荷的氨基酸残基，所述带正电荷的氨基酸残基中(i)至少4个残基为精氨酸，或(ii)至少5个残基为赖氨酸。在某些其它具体实施方案中，所述至少一个内化区域由不超过16个氨基酸残基的片段组成。在某些其它具体实施方案中，所述至少一个内化区域至少35％由带正电荷的氨基酸组成。
在本文中提供的多肽的其它具体实施方案中，包含于所述至少一个带正电荷的内化区域中的氨基酸残基中至少80％包含于所述至少一个Alphabody结构序列中；在其它具体实施方案中，所述至少一个内化区域基本上完全包含于所述至少一个Alphabody结构序列中，例如(大体上完全地)包含于所述至少一个Alphabody结构序列的一个α-螺旋内。在其它具体实施方案中，所述至少一个内化区域(大体上完全地)包含于所述至少一个Alphabody结构序列的A螺旋和/或C螺旋内。
在其它具体实施方案中，内化区域是这样的区域，其至少35％由带正电荷的氨基酸残基组成，所述带正电荷的氨基酸残基当均被突变成非-带正电荷的氨基酸时，包含该内化区域的多肽的细胞摄入减少至少50％，例如至少60％，至少70％，至少80％或至少90％或更多。在其它具体实施方案中，内化区域是这样的区域，其至少35％由带正电荷的氨基酸残基组成，所述带正电荷的氨基酸残基当全部被突变成非-带正电荷的氨基酸时，包含该内化区域的多肽的细胞摄入被大体上完全消除。
由于本文中设想的多肽具有直接或间接影响细胞内靶在细胞内的生物功能，因此它们对于在广泛的疾病适应征中的医学(即治疗或预防)应用是特别有用的。
[细胞内目标靶]
预期本文中描述的多肽在Alphabody结构内包含针对细胞内蛋白的结合位点。
某些实施方案中设想的Alphabody和多肽可特异性结合的细胞内靶分子的实例包括例如但不限于参与细胞过程的蛋白，所述细胞过程选自细胞信号传导、细胞信号转导、细胞和分子运输(例如主动运输或被动运输)、渗透、吞噬作用、自噬、细胞衰老、细胞粘附、细胞运动、细胞迁移、胞质环流、DNA复制、蛋白质合成、增殖(例如细胞周期、减数分裂、有丝分裂、分裂间期、胞质分裂)、细胞代谢(例如糖酵解和呼吸、能量供应)、细胞通讯、DNA修复、细胞凋亡和程序化细胞死亡。
本文中设想的的多肽还能够在细胞内环境中维持它们的生物活性。事实上，本文中已显示，本文中提供的多肽不仅在细胞内环境中是稳定的，而且还能够结合它们的细胞内靶并抑制其功能。
本文中描述的特定多肽能够特异性结合BCL-2蛋白家族的抗细胞凋亡成员。BCL-2蛋白家族的抗细胞凋亡成员的实例为MCL-1、BCL-2、BCL-2a、BCL-XL、BCL-w和BFL-1/A1。应当理解，一个Alphabody可结合数种(即一种或多种)细胞内目标蛋白。在具体实施方案中，Alphabody的结合由其α-螺旋之一驱动，所述α-螺旋在Alphabody卷曲螺旋结构中得到稳定化。
在其它具体实施方案中，多肽的特征在于它们包含选自SEQ IDNO：1至16、26和27的序列。在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合MCL-1的多肽，其中所述多肽的特征在于它们包含选自SEQ ID NO：4至16、26和27的序列。在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合MCL-1的多肽，其中所述多肽的特征在于它们包含与SEQ ID NO：19中定义的多肽序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更大的序列同一性的序列。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合MCL-1的多肽，其中所述多肽的特征在于它们包含SEQ ID NO：20中定义的序列(LRXVGDXV)。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合BCL-2a的多肽，其中所述多肽的特征在于它们包含选自SEQ ID NO：26和27的序列。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合BCL-XL的多肽，其中所述多肽的特征在于它们包含选自SEQ ID NO：26和27的序列。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合MCL-1和/或BCL-2a和/或BCL-XL的多肽，其中所述多肽的特征在于它们包含与SEQ ID NO：29中定义的多肽序列(MSIEEIAAQIAAIQLRIIGDQFNIYYMT)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更大序列同一性的序列。
在具体实施方案中，提供了能够被细胞内化并且能够结合MCL-1和/或BCL-2a和/或BCL-XL的多肽，其中所述多肽的特征在于它们包含SEQ ID NO：30中定义的序列(LRIIGDQF)。
在具体实施方案中，某些实施方案中设想的Alphabody和多肽可特异性结合的细胞内靶分子包括细胞内蛋白，所述细胞内蛋白天然地参与在真核细胞例如动物细胞(具体地哺乳动物细胞或人细胞)中发生的过程。
[ALPHABODY多肽的结合亲和力]
通常地，本文中设想的多肽可以以小于约1微摩尔浓度(1μM)，优选小于约1纳摩尔浓度(1nM)的解离常数(KD)[即以约1,000,000/摩尔浓度(106M-1,1E6/M)或更高、优选约1,000,000,000/摩尔浓度(109M-1,1E9/M)或更高的缔合常数(KA)]结合目标靶蛋白。大于约1毫摩尔浓度的KD值通常被认为表示不结合或非特异性结合。本领域中通常已知KD还可表达为复合物的解离速率常数(表示为kOff(以秒-1或s-1表示的))对其缔合速率常数(表示为kOn(以摩尔浓度-1秒-1或M-1s-1表示的))的比率。具体地，本文中公开的多肽可以以范围在0.1与0.0001s-1之间的kOff和/或范围在1,000与1,000,000M-1s-1之间的kOn结合目标靶蛋白。结合亲和力，kOff和kOn率可利用本领域技术人员已知的方法例如ELISA法、等温滴定量热法、表面等离子体共振术、荧光激活细胞分选分析等来测定。
[ALPHABODY支架的结构]
本文中描述的靶结合多肽为包含具有通式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的一个或多个Alphabody支架的氨基酸序列，所述氨基酸序列任选地包含另外的N-和C-末端连接基团、残基或部分、导致式N-HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3-C。所述任选的N和C延伸可以例如是用于检测或纯化的标签(例如His-标签)或另一种蛋白质或蛋白质结构域，在该情况下完整的构建体表示融合蛋白。为清楚起见，任选的延伸N和C在本文中被认为不形成通式”HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3”定义的单链Alphabody结构的部分。
如上所示，Alphabody结构的七肽重复通常表示为“abcdefg”或“defgabc”，其中符号“a”至“g”表示常规七肽位置。本文中描述的Alphabody的每一个七肽单位中的“a-位置”和“d-位置”是其中与溶剂隔离的(即，包埋的)核心残基所位于的卷曲螺旋结构内氨基酸残基位置。Alphabody结构的每一个七肽单位中的“e-位置”和“g-位置”是其中部分暴露于溶剂的氨基酸残基所位于的卷曲螺旋结构内氨基酸残基位置。在三链体卷曲螺旋中，这些“e-位置”和“g-位置”位于在两个空间上相邻的α-螺旋之间形成的沟中，并且相应的氨基酸残基通称为“沟残基”。Alphabody结构的每一个七肽单位中的“b-位置”、“c-位置”和“f-位置”是卷曲螺旋结构中暴露于溶液中最多的位置。
应指出，在现有技术中，七肽可称为“七肽重复”，因为该7个残基的片段通常在真实卷曲螺旋氨基酸序列中重复许多次。
类型“abcdefg”的七肽基序(如本文中定义的)通常表示为“HPPHPPP”，而类型“defgabc”的“七肽基序”通常表示为“HPPPHPP”，其中符号”H”表示非极性或疏水性氨基酸残基，符号“P”表示极性或亲水性氨基酸残基。位于a-或d-位置的典型的疏水残基包括脂肪族(例如，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸)或芳香族(例如，苯丙氨酸)氨基酸残基。卷曲螺旋序列内的七肽并不总是遵从疏水性和极性残基的理想模式，因为极性残基偶尔位于“H”位置以及疏水性残基偶尔位于“P”位置。因此，模式“HPPHPPP”和“HPPPHPP”被当作理想模式或特征性参照基序。偶尔地，特征性七肽基序表示为“HPPHCPC”或“HxxHCxC”，其中“H”和“P”具有与上述相同的含义，“C”表示带电荷的残基(赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸)，“x”表示任意(未指定的)天然氨基酸残基。由于七肽可同样地正好始于d-位置，因此后面的基序也可写为“HCPCHPP”或“HCxCHxx”。应指出，单链Alphabody固有地如此稳定以至于它们不需要七肽e-和g-位置上带电荷的(“C”)残基之间的离子相互作用的帮助。
七肽重复序列(HRS)(如本文中定义的)通常用指示常规七肽位置的符号表示为(abcdefg)n或(defgabc)n，或用指示七肽基序的符号表示为(HPPHPPP)n或(HPPPHPP)n，条件是并非HRS中的所有氨基酸残基都应当严格遵从疏水性和极性残基的理想模式。为了鉴定七肽重复序列和/或它们的边界，这些七肽重复序列包含偏离共有基序的氨基酸或氨基酸序列，并且，如果手上仅有氨基酸序列信息，则Lupas等人的COILS法(Science1991,252:1162-1164)是用于七肽重复序列及其边界的测定或预测，以及用于七肽位置的分配的适当方法。此外，可基于在比一级结构(即，氨基酸序列)更高水平上的知识解析七肽重复序列。事实上，可基于二级结构信息(即，α-螺旋性)或基于三级结构(即，蛋白质折叠)信息来鉴定和描绘七肽重复序列。假定的HRS的典型特征是α-螺旋结构。另一个(强)标准是序列或片段在卷曲螺旋结构中的涉及。已知形成规则卷曲螺旋结构(即无Brown等人Proteins1996,26:134-145中描述的断续或间断)的任何序列或片段在本文中被当作HRS。同样地和更具体地，HRS片段的鉴定可基于高分辨率3-D结构信息(X-射线或NMR结构)。最后，但不限于此，除非存在相反的明确证据，或除非另有所指，否则任何HRS片段的边界可被定义为标准疏水性氨基酸残基(选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)所位于的第一(分别地最后)a-或d-位置。
Alphabody结构(如本文中定义的)的单链结构内的接头将Alphabody中的HRS序列相互连接，更具体地将第一HRS与第二HRS连接，以及将第二HRS与第三HRS连接。Alphabody中的每一个接头序列始于前一个HRS的最后一个七肽残基之后的残基并终止于下一个HRS的第一个七肽残基之前的残基。通过二硫桥或化学交联或一般地通过任何链间连接(与链内连接相反)的方法进行的HRS片段之间的连接被明确地排除在接头片段的定义内(至少在Alphabody的上下文中)，因为这将与单链Alphabody的定义矛盾。Alphabody中的接头片段优选在构象上是柔性的，以确保作为α-螺旋卷曲螺旋结构的3个七肽重复序列的松弛(不受阻碍的)缔合。此外，在Alphabody的上下文中，”L1”将表示接头片段1，即HRS1与HRS2之间的接头，而”L2”表示接头片段2，即HRS2与HRS3之间的接头。用于Alphabody结构的适当接头对于本领域技术人员来说是明了的，并且通常可以是本领域中用于连接氨基酸序列的任何接头，只要接头在结构上是柔性的即可，在这个意义上它们不影响Alphabody的特征性三维卷曲螺旋结构。特定Alphabody结构中的两个接头L1和L2可以相同或可以不同。基于本文中的其它公开内容，任选地在进行有限次数的常规实验后，本领域技术人员能够确定特定Alphabody结构的最佳接头。在具体实施方案中，接头L1和L2是由至少4个，特别地至少8个，更特别地至少12个氨基酸残基组成的氨基酸序列，因方便的原因选择的非临界上限为约30个氨基酸残基。在一个具体的非限定性实施方案中，优选接头序列中至少50％的氨基酸残基选自脯氨酸、甘氨酸和丝氨酸。在其它非限定性实施方案中，优选至少60％，例如至少70％，例如80％，更特别地90％的接头序列氨基酸残基选自脯氨酸、甘氨酸和丝氨酸。在其它具体实施方案中，接头序列基本由极性氨基酸残基组成；在这样的具体实施方案中，优选至少50％，例如至少60％，例如70％或80％，更特别地90％或达到100％的接头序列氨基酸残基选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。
在某些具体实施方案中，Alphabody结构中的接头L1和L2的每一个独立地是接头片段，所述片段分别共价地将HRS1连接于HRS2和将HRS2连接于HRS3，并且由至少4个氨基酸残基组成，优选其中至少50％的所述氨基酸残基选自脯氨酸、甘氨酸和丝氨酸。
Alphabody的“卷曲螺旋”结构被认为是α-螺旋七肽重复序列的装配体，其中螺旋七肽重复序列是如上文中定义的；
·所述α-螺旋七肽重复序列以左手超扭曲(超螺旋)缠绕(彼此环绕)；
·a-和d-位置上的核心残基形成装配体的核心，其中它们以Socket algorithm(Walshaw and Woolfson J Mol Biol2001,307:1427-1450)中定义的以及Lupas和Gruber Adv Protein Chem2005,70:37-78中反复提及的臼内杵(knobs-into-holes)方式彼此堆叠；
·核心残基被包装在规则的核心填充层中，其中所述层是如Schneider等人Fold Des1998,3:R29-R40中定义的。
不要将Alphabody结构的卷曲螺旋结构与普通三螺旋束混淆。区分真正的卷曲螺旋与非-卷曲螺旋螺旋束的标准提供于Desmet等人WO2010/066740A1和Schneider等人Fold Des1998,3:R29-R40中；这样的标准实质上分别与卷曲螺旋和螺旋束的核心残基堆叠中结构对称的存在或不存在相关。同样地，卷曲螺旋和螺旋束的左手超螺旋的存在或不存在分别地提供了区分两种类型的折叠的有用标准。
虽然上述标准原则上适用于2链体、3链体、4链体和甚至更多链体卷曲螺旋，但本文中设想的Alphabody结构限制于3链体卷曲螺旋。可将Alphabody的卷曲螺旋区域组织成所有α-螺旋平行取向(对应于属于申请者Complix NV的EP2161278中描述的”平行Alphabody”)或3个α-螺旋之一与另外两个α-螺旋反向平行(对应于属于申请者Complix NV的WO2010/066740中描述的”反向平行Alphabody”)。
Alphabody结构(如本文中定义的)的α-螺旋部分通常大致与七肽重复序列一致，尽管在边界附近存在差异。例如，具有明确的七肽基序的序列片段可以因一个或多个螺旋扭曲残基(例如，甘氨酸或脯氨酸)的存在而为非-螺旋的。相反地，接头片段的部分可以是α-螺旋，尽管其位于七肽重复区域外部。此外，一个或多个α-螺旋七肽重复序列的任何部分也被视为单链Alphabody的α-螺旋部分。
Alphabody结构(如本文中定义的)(的α-螺旋)的溶剂定向区域是重要的Alphabody区域。鉴于Alphabody中的α-螺旋的构型，其中七肽a-和d-位置上的残基形成核心，溶剂定向区域主要由b-、c-和f-残基形成。每个单链Alphabody上存在3个这样的区域，即每一个α-螺旋中存在一个。这样的溶剂定向区域的任何部分也被当作溶剂定向区域。例如，由来自Alphabodyα-螺旋中的3个连续七肽的b-、c-和f-残基组成的亚区域也形成溶剂定向表面区域。
参与Alphabody中两个相邻α-螺旋之间的沟(的表面)形成的残基通常位于七肽e-和g-位置上，但一些更加暴露的b-和c-位置以及一些大部分被包埋的核心a-和d-位置也可促成沟表面；这基本上取决于置于这些位置上的氨基酸侧链的尺寸。如果空间上相邻的α-螺旋平行，则沟的一半由来自第一螺旋的b和e-残基形成，沟的另一半由第二螺旋由第二螺旋的c-和g-残基形成。如果所述空间上相邻的α-螺旋为反向平行，则存在两种可能性。在第一可能性中，沟的两半都由b-和e-残基形成。在第二种可能性中，沟的两半都由c-和g-残基形成。3种类型的可能的沟在本文中由它们的主要沟形成(e-和g-)残基来表示：如果螺旋是平行的，则沟称为e/g-沟；如果螺旋是反向平行的，则沟称为e/e-沟或g/g-沟。平均Alphabody具有3个e/g-沟，而反向平行Alphabody具有一个e/g-沟、一个e/e-沟和一个g/g-沟。Alphabody沟的任何部分也被视为沟区域。
在其它方面，提供了(Alphabody)多肽，所述多肽包含至少一个本文中定义的Alphabody或基本上由其组成，以及任选地包含一个或多个其它基团、部分或残基(任选地通过一个或多个接头连接)。
因此，本文中设想的多肽可任选地包含一个或多个其它基团、部分或残基以结合其它目标靶或靶蛋白。应当清楚，这样的其它基团、残基、部分和/或结合位点可以给或可以不给本文中设想的Alphabody(和/或其所存在于的多肽或组合物)提供其它功能性，以及可以修饰或可以不修饰本文中包括的Alphabody(Alphabodies)的性质。这样的基团、残基、部分或结合单位还可以例如是可具有生物和/或药理活性的化学基团。
在具体实施方案中，将这些基团、部分或残基在N-或C-末端连接于Alphabody结构。然而，在一些具体实施方案中，将一个或多个基团、部分或残基连接于Alphabody结构的体部，例如连接于α-螺旋中的游离半胱氨酸。
在具体实施方案中，本文中设想的多肽包含一个或多个已被化学修饰的Alphabody。例如，这样的修饰可包括引入或连接一个或多个官能团、残基或部分至Alphabody结构。这些基团、残基或部分可为多肽赋予一个或多个期望的性质或功能性。这样的官能团的实例对于本领域技术人员来说是明了的。
例如，这样的官能团至Alphabody结构的引入或连接可导致多肽的半衰期、溶解度和/或稳定性的增加和/或多肽的毒性的减弱，或多肽的任何不期望副作用的消除或减弱，和/或其它有利的性质。
在具体实施方案中，本文中设想的多肽包含已被化学修饰来增加其生物或血浆半衰期的Alphabody，所述化学修饰例如通过PEG化，通过添加其结合的基团或为血清蛋白的基团(例如血清白蛋白或转铁蛋白)或，一般地，通过将Alphabody连接至增加多肽半衰期的部分进行。作为实例，可使用马来酰亚胺mPEG40kD PEG(Jenkem Technology)或具有不同分子量的其它PEG部分在暴露于溶剂的半胱氨酸处对Alphabody进行PEG化。
在具体实施方案中，本文中设想的多肽包含已被融合于蛋白结构域或肽以增加其生物或血浆半衰期的Alphabody，例如融合了其所结合的结构域或为血清蛋白(例如血清白蛋白或免疫球蛋白的Fc部分)的结构域。所述蛋白结构域可以是结合血清蛋白质(例如血清白蛋白或转铁蛋白)的Alphabody。
在具体实施方案中，本文中设想的多肽包含Alphabody，所述Alphabody除它们的靶结合(针对细胞内靶，例如目标BCL-2蛋白家族的抗细胞凋亡成员)外，还结合血清蛋白(例如血清白蛋白或转铁蛋白或免疫球蛋白的Fc部分)以增加所述Alphabody的生物或血浆半衰期。
通常地，具有增加的半衰期的本文中设想的多肽的半衰期相较于缺乏用于半衰期延长的上述装备的对应Alphabody的半衰期而言超过1周，同样优选地超过2周(在人中或在用于PK评价的动物模型例如大鼠、狗、猴、小鼠、马、猪、猫等中)。
存在于本文中设想的多肽的Alphabody的特定修饰可包括一个或多个可检测标记或其它信号生成基团或部分的引入，这取决于标记多肽的期望用途。
其它特定的修饰可包括螯合基的引入，例如用于螯合一个或多个金属或金属阳离子。
特定修饰可包括作为特定结合对(例如生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对)中一个部分的官能团的引入。
对于一些应用，特别地对于其中期望杀死表达本文中设想的多肽特异性结合的靶的细胞(例如，在癌症的治疗中)，或期望减少或减缓这样的细胞的生长和/或增殖的那些应用中，本文中设想的多肽可包含连接于毒素或毒性残基或部分的Alphabody结构。
其它潜在化学和酶促修饰对于本领域技术人员来说是明了的。
在具体实施方案中，所述一个或多个基团、残基、部分通过一个或多个适当的接头或间隔子连接于Alphabody结构。
在其它具体实施方案中，本文中设想的多肽包含两个或更多个靶特异性Alphabody。在这样的具体实施方案中，所述两个或更多个靶特异性Alphabody可以以直接或间接的方式彼此连接(偶联、串联、互联、融合)。在其中所述两个或更多个Alphabody彼此直接连接的实施方案中，可在无间隔子或接头片段或部分帮助的情况下连接它们。或者，在其中所述两个或更多个Alphabody彼此间接连接的实施方案中，可通过适当的间隔子或接头片段或接头部分连接它们。
在其中两个或更多Alphabody直接连接的实施方案中，它们可以单链融合蛋白(即，为其中两个或更多个Alphabody序列在单个连续氨基酸序列中彼此直接相接的单链蛋白构建体)形式生成。或者，Alphabody的直接连接还可通过在两个Alphabody之间形成二硫键的半胱氨酸来实现(即，在适当的条件，例如氧化条件下，两个各自包含游离半胱氨酸的Alphabody可彼此反应而形成其中组成性单体通过二硫桥共价连接的二聚体)。
或者，在其中两个或更多个Alphabody间接连接的实施方案中，它们可通过适当的间隔子或接头片段或接头部分彼此连接。在这样的实施方案中，它们还可被产生为单链融合构建体(即，作为单链蛋白构建体，其中两个或更多个Alphabody序列在单个连续氨基酸序列中彼此相随，但其中Alphabody通过用作间隔子片段的适当选择的氨基酸序列片段的存在保持分隔)。或者，Alphabody的间接连接还可通过氨基酸侧链基团或通过Alphabody N-或C-末端来实现。例如，在适当选择的条件下，两个各自包含游离半胱氨酸的Alphabody可与同双功能化合物反应，产生其中组成性Alphabody通过所述同双功能化合物共价交联的Alphabody二聚体。类似地，一个或多个Alphabody可通过反应性侧链基团或末端与适当选择的同或异双功能化合物(用于蛋白质的交联)的任意组合来进行交联。
在包含连接的Alphabody的多肽的具体实施方案中，所述两个或更多个连接的Alphabody可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。所述两个或更多个连接的Alphabody还可具有相同的结合特异性或不同的结合特异性。所述两个或更多个连接的Alphabody还可具有相同的结合亲和力或不同的结合亲和力。
用于在本文中设想的的多肽中偶联不同Alphabody的适当间隔子或接头对于本领域技术人员来说是明了的，其通常可以是在本领域中用于连接肽和/或蛋白质的任何接头或间隔子。具体地，这样的接头或间隔子适合用于构建期望用于制药用途的蛋白质或多肽。
用于偶联单链氨基酸序列中的Alphabody的一些特别适合的接头或间隔子包括例如但不限于多肽接头，例如甘氨酸接头、丝氨酸接头、混合的甘氨酸/丝氨酸接头、富含甘氨酸和丝氨酸的接头或主要由极性多肽片段组成的接头。用于通过化学交联偶联Alphabody的一些特别适合的接头或间隔子包括例如但不限于同双功能化学交联化合物，例如戊二醛、酰亚胺酯类例如己二酸二甲酯(DMA)、辛二酸二甲酯(DMS)和庚二亚氨酸二甲酯(DMP)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯例如二巯基双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(DSP)和二巯基双(磺酸琥珀酰亚胺丙酸酯)(DTSSP)。用于交联的异双功能试剂的实例包括但不限于具有一个胺反应性末端并且在另一端上具有巯基反应性部分的交联剂，或在一个末端上具有NHS酯并且在另一个末端上具有SH反应性基团(例如，马来酰亚胺或吡啶基二硫化物)的交联剂。
用于单链互联的Alphabody构建体的多肽接头或间隔子可以是任何适当的(例如，富含甘氨酸的)氨基酸序列，其具有1至50个氨基酸，例如1至30个，特别地1至10个氨基酸残基的长度。应当清楚，间隔子的柔性程度和/或其它性质可对本文中设想的最终多肽的性质(包括但不限于对于目标蛋白或对于一种或多种其它目标靶蛋白的亲和力、特异性或亲合力)具有一定影响。应当清楚，当两个或更多个间隔子用于本文中设想的的多肽时，这些间隔子可以相同或不同。在本说明书中，本领域技术人员将能够确定用于偶联本文中设想的多肽中的Alphabody(而无需任何过度实验负担)的目的的最优间隔子。
本文中设想的连接的Alphabody多肽通常可通过如下方法来制备，所述方法包括至少一个任选地通过一个或多个适当的接头，适当地将一个或多个Alphabody连接于所述一个或多个其它基团、残基、部分和/或其它Alphabody(以提供本文中设想的多肽)的步骤。
同样地，本文中设想的多肽可通过如下方法来产生，所述方法至少包括以下步骤：(i)在适当的宿主细胞或表达系统中表达本文中设想的多肽，和(ii)分离和/或纯化本文中设想的多肽。用于进行上述步骤的技术对于本领域技术人员来说是已知的。
[部分/片段/类似物/衍生物]
本文中还提供了如本文中公开的多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物，和/或包含Alphabody的一个或多个部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物或基本上由其组成的多肽，只要这些部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物适合用于本文中设想的预防、治疗和/或诊断目的即可。
本文中设想的这样的部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物仍然能够特异性结合细胞内靶，例如目标BCL-2蛋白家族的抗细胞凋亡成员。
[本文中设想的ALPHABODY、多肽和组合物的来源和形式]
应当指出，关于本文中设想的Alphabody、多肽或组合物(或用于表达它们的本文中设想的核苷酸序列)的来源，本公开内容不受限制。此外，关于产生或获得本文中设想的Alphabody、多肽或核苷酸序列的方式，本教导也不受限制。因此，本文中设想的Alphabody可以是合成或半合成氨基酸序列、多肽或蛋白质。
本文中提供的Alphabody、多肽和组合物可以以基本上分离的形式(如本文中定义的)存在，或可选择地可形成本文中设想的多肽或组合物的部分，所述部分可包含至少一个Alphabody或基本上由其组成，并且任选地还可包含一个或多个其它基团、部分或残基(全部任选地通过一个或多个适当的接头连接)。
[靶种类和交叉反应性]
基于本说明书，应了解，对于预防性、治疗性和/或诊断性应用，本文中设想的多肽和组合物原则上是针对人细胞内靶或特异性结合人细胞内靶。然而，当期望多肽和组合物用于兽用目的时，它们可针对来自期望治疗的物种的细胞内靶或特异性结合所述细胞内靶，或它们至少与来自待治疗的物种的细胞内靶有交叉反应。因此，特异性结合来自一个受试物种的细胞内靶的多肽和组合物可以显示或可以不显示与来自一个或多个其它受试物种的细胞内靶的交叉反应性。当然，预期在用于人或动物的多肽的开发背景中，可开发结合来自另一物种而非待治疗物种的细胞内靶的多肽来用于研究和实验室测试。
还预期本文中设想的多肽可结合细胞内靶的许多天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段，例如细胞内目标蛋白的天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。更具体地，预期本文中设想的多肽至少可结合细胞内靶的如下类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段，所述类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段(仍然)包含那些Alphabody和多肽所结合的(天然/野生型)细胞内靶的结合位点、部分或结构域。
[核酸序列]
在另一方面，提供了编码包含一个或多个单链Alphabody结构的Alphabody多肽的核酸序列，所述核酸序列可通过本文中设想的方法获得，以及包含这样的核酸序列的载体和宿主细胞。
在其它方面，提供了编码本文中设想的多肽(或其适当的片段)的核酸序列。这些核酸序列在本文中也称为本文中设想的核酸序列，其还可以是载体或基因构建体或多核苷酸的形式。核酸序列可以是合成或半合成序列、已从文库(具体地，表达文库)分离的核苷酸序列、已通过PCR、使用重叠引物制备的核苷酸序列，或已使用本身已知的用于DNA合成的技术制备的核苷酸序列。
基因构建体可以是DNA或RNA，优选为双链DNA。本文中设想的基因构建体还可以以适合于期望宿主细胞或宿主生物体的转化(以适合用于整合进入期望宿主细胞的基因组DNA的形式或于在期望宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式)的形式存在。例如，基因构建体可以以载体例如质粒、粘粒、YAC、病毒载体或转座子的形成存在。具体地，载体可以是表达载体，即可在体外和/或体内(例如在适当的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)提供表达的载体。本文中设想的基因构建体可包含将表达的Alphabody导向期望的细胞内或细胞外区室的适当的前导序列。例如，可将本文中设想的基因构建体在pelB前导序列位点插入适当载体以将表达的Alphabody导向细菌周质空间。同样地，可使载体配备适当的启动子系统以例如最优化Alphabody的产率。
在其它方面，提供了包含编码单链Alphabody或包含所述单链Alphabody的多肽的核酸的载体，所述载体可通过本文中设想的方法获得。
在其它方面，提供了包含编码包含可通过本文中设想的方法获得的所述单链Alphabody的多肽的核酸或包含这些核酸的载体的宿主细胞。因此，在具体实施方案中，利用编码包含可通过本文中描述的方法获得的Alphabody的核酸序列并且能够表达包含一个或多个Alphabody结构的多肽的载体转染或转化宿主细胞。用于表达本文中设想的多肽的宿主或宿主细胞的适当实例对于本领域技术人员来说是明了的，包括任何适当的真核或原核细胞(例如，细菌细胞例如大肠杆菌(E.coli)、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼细胞和昆虫细胞)，无论位于体外还是体内。
[抑制性ALPHABODY、多肽和组合物]
在具体实施方案中，本文中设想的特异性结合细胞内目标靶分子的多肽能够特异性抑制、阻止或减弱细胞内目标靶分子的活性和/或抑制、阻止或减弱这些细胞内靶分子在其中起作用的信号转导和生物学机制及途径。
通过结合一个或多个特定的细胞内靶，本文中设想的多肽和药物组合物可用于阻止或抑制一个或多个细胞内靶之间的相互作用，从而阻止、抑制或减弱由那些细胞内靶介导的信号转导途径和/或调节其中牵涉那些细胞内靶的生物途径和机制。在具体实施方案中，本文中设想的多肽和药物组合物可用于影响、改变或调节受试者的免疫系统和/或一个或多个特异性免疫反应，所述免疫系统和/或所述免疫反应牵涉本文中设想的多肽和组合物的一种或多种所结合的细胞内目标靶分子。
因此，在具体实施方案中，本文中设想的多肽和组合物特异性结合BCL-2蛋白家族的抗细胞凋亡成员并抑制其。
更具体地，使用本文中设想的多肽或组合物进行的“抑制”、“减弱”和/或“防止”可表示相较于在相同条件下但不使用本文中设想的多肽或组合物时在相同测定中目标靶蛋白的活性而言，抑制、减弱和/或阻止目标靶蛋白与其天然结合伴侣之间的相互作用，或抑制、减弱和/或阻止目标靶蛋白的活性，或抑制、减弱和/或阻止其中牵涉目标靶蛋白的一个或多个生物或生理机制、作用、反应、功能途径或活性，水平达到例如至少10％，但优选地至少20％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或更多，如使用适当的体外、细胞或体内测定测量的。此外，“抑制”、“减弱”和/或“阻止”还可指，相较于相同的条件但无本文中设想的多肽或组合物存在时的情况而言，诱导目标靶蛋白对于其一个或多个天然结合伴侣的亲和力、亲合力、特异性和/或选择性的减弱，和/或诱导目标靶蛋白对于其中存在目标靶蛋白的培养基或环境中一个或多个条件(例如pH、离子强度、辅因子的存在等)的敏感性的减弱。在本说明书中，“抑制”、“减弱”和/或“阻止”还可包括目标靶蛋白的活性的变构性抑制、减弱和/或阻止。
本文中设想的多肽对细胞内目标靶分子的结合的结果可以是，在结合该靶后，相较于在本文中设想的这样的多肽或药物组合物不存在的情况下靶对其天然存在的结合伴侣的结合而言，其阻止、减弱或抑制该靶对其天然存在的结合伴侣或对其至少一个亚基的结合达到至少20％，例如至少50％，如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或更多，如通过本领域已知的适当测定法测定的。或者，多肽对细胞内靶分子的结合使得其仍然允许靶分子结合其天然存在的结合伴侣，但相较于在本文中设想的这样的多肽或药物组合物不存在的情况下细胞内靶对其天然结合伴侣结合后的信号转导而言，阻止、减弱或抑制可通过细胞内目标靶分子对其结合伴侣或至少其亚基的结合触发的信号转导达到至少20％，例如至少50％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或更多,如通过本领域已知的适当测定法测定的。
如对于本领域技术人员来说将明了的，上述多肽和包含本文中设想的多肽的组合物通常用作细胞内靶介导的信号转导(即通过细胞内目标靶分子对其天然结合伴侣的结合引起的信号转导)以及由这样的信号转导诱导的生物学机制和作用的拮抗剂。
[激动性ALPHABODY、多肽和组合物]
在某些非限定性实施方案中，本文中设想的多肽或组合物可特异性结合细胞内目标靶分子，从而增强、加强和/或激活该细胞内靶和/或其天然结合伴侣之间的相互作用。本文中设想的这样的激动性多肽或组合物可特异性结合细胞内目标靶分子，从而增强、加强和/或激活该细胞内靶和/或其天然结合伴侣的生物活性和/或一个或多个生物学或生理学机制、作用、反应、功能或途径，如使用适当的体外、细胞或体内测定测量的。如对于本领域技术人员来说将会很明了的，根据该具体实施方案的多肽和组合物通常用作细胞内靶介导的信号转导(即通过细胞内目标靶分子对其天然结合伴侣的结合引起的信号转导)以及由这样的信号转导诱导的生物学机制和作用的激动剂。
因此，在这些具体实施方案中，本文中设想的多肽和药物组合物可用于增强受试者的一个或多个特异性免疫反应，所述免疫反应牵涉本文中公开的一种或多种多肽和组合物所结合的细胞内目标靶分子。结合某些细胞内靶分子的本文中设想的激动性多肽或药物组合物可用于刺激或增强受试者的一个或多个免疫反应，例如用以预防和/或治疗特征在于减弱的免疫反应或可因具有减弱的免疫反应而发生的疾病。
另一个方面涉及用于产生多肽的方法，所述多肽包含对于一种或多种细胞内靶蛋白具有可检测的亲和力或具有抑制活性的至少一个Alphabody。基于本文中的进一步描述，这样的方法对于本领域技术人员来说是很明了的。
因此在本文中还提供了本文中描述的多肽的不同应用。具体地，本文中提供的多肽可用于体外调节细胞内蛋白的生物功能，例如用以影响(具体地抑制)细胞内蛋白与天然结合伴侣之间的相互作用。
[用于产生多肽的方法]
本文中设想的多肽将对于细胞内靶的结合亲和力和进入细胞的能力结合起来。对于本领域技术人员来说很清楚的是，可以设想不同的方法用于产生本文中描述的多肽，所述方法始于靶特异性或多肽的内化性质。
因此，在具体实施方案中，提供了如下方法，所述方法包括鉴定靶结合Alphabody序列和随后修饰所述结构(通过添加氨基酸或Alphabody序列的实际修饰)，以确保所得Alphabody多肽的内化。用于获得对于给定靶有结合亲和力的适当Alphabody的方法对于本领域技术人员来说是已知的，并且在本文的下文中进行进一步描述。更具体地，本文中提供了用于获得能够结合细胞内BCL-2蛋白家族的MCL-1的Alphabody的方法。本申请还描述了用于从其获得能够内化进入细胞的多肽的不同方法。
在可选择的实施方案中，可预期所述实施方案始于多肽支架，所述多肽支架能够被内化进入细胞，随后对其进行修饰或筛选其靶结合性质。在这些方法的具体实施方案中，提供多肽文库，其特征在于至少一个Alphabody结构的存在，以及进一步地一个或多个内化区域的存在，或细胞穿透部分的存在，其中Alphabody的靶结合结构域的氨基酸变化多样。在这些实施方案中，可就对细胞内目标靶的结合筛选文库以获得能够结合所述细胞内靶的多肽。在其它实施方案中，可预期修饰具有细胞穿透能力的适当的多肽支架以引入(例如基于模拟)适当的结合基序。
最适当的获得本文中设想的多肽的方法将取决于靶和内化的方法。事实上，在给定靶的结合基序已知的情况下，可将靶结合和细胞穿透性质同时引入多肽。然而，对于其中结合基序仍然未知的靶，必需包括对于在适合用于结合靶的那些位置上具有变化多样的氨基酸的Alphabody或多肽的文库的筛选步骤。
[用于产生靶结合ALPHABODY的方法]
[利用文库产生ALPHABODY的方法]
在本文中设想的具体实施方案中，靶特异性Alphabody或Alphabody多肽可通过如下方法获得，所述方法包括产生Alphabody的随机文库和筛选文库以获得能够特异性结合目标靶(具体地细胞内目标靶)的Alphabody多肽。这些方法详细地描述于在Complix NV名下的公开国际专利申请No.WO2012/092970。
应理解，WO2012/092970中描述的方法的选择步骤可通过通常称为选择法的方法或通过通常称为筛选法的方法来进行。两种方法包括从包含期望和非期望组分的原始总集(original ensemble)(即Alphabody文库)鉴定期望的组分(即Alphabody文库成员)和随后分离所述期望的组分。在选择法的情况下，文库成员通常通过其中应用期望的性质来实现期望目的的步骤来分离；在这样的情况下，期望的性质通常限于对于给定的细胞内目标靶分子的高亲和力性质，并且期望的目的通常限于将这样的高亲和力文库成员与其它成员分离。这样的方法通常称为亲和力选择法，在本说明书，这样的亲和力选择法将被用于单链Alphabody文库，以选择对于细胞内目标靶分子或其亚结构域或亚区域具有高亲和力的Alphabody。同样地可能的是通过调整适当的选择条件(例如短的温育时间或长洗涤周期，或如文库选择技术领域内的技术人员已知的其它条件)来选择动力学性质，例如对给定的细胞内目标靶分子的结合的高缔合速率(on-rate)，或结合于所述靶的文库成员的低离解速率(off-rate)。或者，在筛选法的情况下，文库成员通常通过这样的步骤来分离，其中在所述步骤中，单个地检查所有文库成员或至少一大批库成员的给定的期望性质，并且其中保留具有这样的期望性质的成员，而弃除不具有这样的期望性质的成员；在这样的情况下，和在本说明书中，期望的性质可涉及对于细胞内目标靶分子或其亚结构域或亚区域的高亲和力，或功能活性例如抗-细胞内靶分子活性，包括细胞内目标靶分子的活性的抑制、减弱和/或阻止。用于产生本文中设想的多肽的方法的选择步骤从而可通过(亲和力)选择技术或通过基于亲和力或基于活性的功能筛选技术来实现，两个技术均导致选择到包含相较于文库的非选择多肽而言具有有益的(有利的、期望的、优良的)亲和力或活性性质的至少一个单链Alphabody的一种或多种多肽。
Alphabody对目标靶分子或蛋白的特异性结合可以以本身已知的任何适当方式来测定，所述方式包括例如生物淘选、Scatchard分析和/或竞争性结合测定，例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争性测定，以及本领域已知的其不同变型。
因此，在具体实施方案中，本说明书中使用的Alphabody文库以噬菌体文库的形式提供，通过将噬菌体与被标记的靶分子接触，随后通过检测或选择性收集标记的结合靶来收回结合性噬菌体，由此鉴定结合性Alphabod。通常地，可使用生物素化靶，其中产生结合靶的Alphabody的噬菌体利用链霉抗生物素蛋白涂覆的支持物(例如磁珠)来捕获。
在具体实施方案中，用于产生一种或多种单链Alphabody或对于目标蛋白具有可检测的结合亲和力(如本文中定义的)的多肽的方法的选择步骤可包括，通过反复执行将目标蛋白与单链Alphabody文库或与本文中描述的单链Alphabody文库的混合物接触，随后从与所述蛋白接触的单链Alphabody文库或单链Alphabody文库的混合物鉴定一种或多种对于目标蛋白具有可检测的结合亲和力的单链Alphabody的步骤，来(进一步)对Alphabody文库或Alphabody文库的混合物富集对于目标蛋白具有可检测的结合亲和力的单链Alphabody。
通过与目标靶蛋白相互作用来选择具有可检测的体外活性的单链Alphabody(或多肽)的步骤通常包括：
a)将单链Alphabody(或包含所述Alphabody的多肽)的文库或单链Alphabody文库的混合物与细胞内目标靶分子或其片段接触，和
b)从文库或文库的混合物鉴定对细胞内目标靶分子具有可检测的体外活性的一种或多种单链Alphabody或多肽。
更具体地，细胞内靶分子可以是膜锚定受体、可溶性受体或包含所述细胞内靶分子的一个或多个胞外结构域的分子。
更具体地，在本说明书中，对细胞内靶分子的活性或对细胞内靶分子的活性的作用可通过本领域已知的方式来测量。更具体地，这包括体外测定Alphabody或多肽对已知的细胞内靶介导的作用的效果。
应理解，本文中描述的选择法还可以以筛选法的方式来进行。因此，如本说明书中所用，术语”选择”可包括选择、筛选或选择和/或筛选技术的任意适当组合。
[分离]
在一些情况下，用于产生本文中设想的特异性结合细胞内目标靶蛋白的Alphabody多肽的方法还可包括以下步骤：从单链Alphabody或多肽文库分离对于细胞内目标靶分子具有可检测的结合亲和力或对所述靶分子具有可检测的体外活性的至少一种单链Alphabody或多肽。
这些方法还可包括扩增对于细胞内目标靶分子具有可检测的结合亲和力或可检测的体外活性的至少一种单链Alphabody(多肽)的步骤。例如，可通过再感染宿主细菌和在生长培养基中进行温育来扩增从本文中描述的方法的选择步骤获得的展示特定单链Alphabody或多肽的噬菌体克隆。
在具体实施方案中，这些方法可包括测定所述一种或多种能够结合细胞内靶分子的Alphabody或多肽的序列。
当在适当的细胞或噬菌体或颗粒上展示包含在Alphabody多肽序列的组、集合或文库中的Alphabody多肽序列时，有可能从所述细胞或噬菌体或颗粒分离编码该Alphabody多肽序列的核苷酸序列。这样，选择的Alphabody文库成员的核苷酸序列可利用常规测序法来测定。
在其它具体实施方案中，用于产生本文中设想的Alphabody多肽的方法包括在适当的条件下在宿主生物体中表达所述核苷酸序列以获得真实的期望的Alphabody多肽序列的步骤。可通过本领域技术人员已知的方法进行该步骤。
此外，对于细胞内目标靶分子具有可检测的结合亲和力或可检测的体外活性的所获得的Alphabody或多肽序列，可以任选地它们的序列已被鉴定后，以可溶性蛋白构建体形成合成。
例如，通过上述方法获得的，可通过上述方法获得的或通过上述方法选择的Alphabody或多肽可使用本领域已知的重组或化学合成法来合成。同样地，通过上述方法获得的，可通过上述方法获得的或通过上述方法选择的Alphabody或多肽可通过基因工程技术来产生。因此，用于合成通过上述方法获得的，可通过上述方法获得的或通过上述方法选择的Alphabody或多肽的方法可包括用编码Alphabody或多肽序列(所述Alphabody或多肽序列对于细胞内目标靶分子具有可检测的结合亲和力或可检测的体外活性)的核酸或载体转化或感染宿主细胞。因此，对于细胞内目标靶分子具有可检测的结合亲和力或可检测的体外活性的Alphabody或多肽序列可通过重组DNA法来产生。编码Alphabody或多肽的DNA可使用常规方法来容易地合成。制备后，可将DNA引入表达载体，随后可将所述表达载体转化或转染进入宿主细胞例如大肠杆菌或任何适当的表达系统，以在重组宿主细胞中和/或这些重组宿主细胞所存在的培养基中获得Alphabody或多肽的表达。
应理解，如蛋白质表达和纯化领域的技术人员所已知的，可用例如His-标签或用于容易纯化的其它序列标签标记(通常地在Alphabody的N端或C端末端)使用适当的表达系统从表达载体产生的Alphabody或多肽。
核酸或载体至宿主细胞内的转化或转染可通过多种本领域技术人员已知的方法来实现，所述方法包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺(polybrene)介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪法(biolistics)。
用于表达期望的Alphabody或多肽的适当宿主细胞可以是任何真核或原核细胞(例如，细菌细胞例如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼细胞和昆虫细胞)，无论位于体外还是体内。例如，宿主细胞可位于转基因动物中。
因此，本申请还提供了用于产生对于细胞内目标靶分子具有可检测的结合亲和力或可检测的体外活性的Alphabody或多肽的方法，包括用编码这样的Alphabody的核酸序列或载体转染或感染宿主细胞，并在适当的条件下表达所述Alphabody。
[序列合理化和专用文库筛选]
用于产生一种或多种靶特异性多肽的方法可任选地包括用于增强或最优化靶特异性多肽的结合特异性和/或功效的其它步骤或方法。
在具体实施方案中，还可在进行用于产生一种或多种靶结合多肽的方法之后进行涉及对获得的或产生的Alphabody多肽序列进行合理化的步骤或方法。这样的序列合理化过程可包括鉴定或测定在已使用本文中描述的方法产生的针对特定目标靶分子的不同Alphabody或多肽之间或之中保守的特定氨基酸残基、氨基酸残基位置、区段、基序或模式。因此，该合理化过程可通过比较产生的特异于某一目标靶分子或蛋白的不同Alphabody或多肽序列和鉴定这些序列之间的序列一致性来进行。这样的过程可任选地通过使用用于分子建模、交互式配体对接(interactive ligand docking)或生物统计数据挖掘的技术来支持或进行。
被鉴定为在针对特定目标靶分子的不同Alphabody结构之间或之中保守的特定氨基酸残基、氨基酸残基位置、区段、基序或模式可被视为促成靶特异性Alphabody的结合或活性。
在具体实施方案中，还可在上述序列合理化的过程之后，从已被鉴定为对于目标靶分子是特异性的并已使用本文中描述的方法产生的不同Alphabody序列的组开始Alphabody序列的新文库。在这样的所谓的“专用文库”(已被鉴定为对于某一目标靶分子是特异性的不同Alphabody序列的组)中，所述不同的Alphabody序列在确定的一组变化多样的氨基酸残基位置中产生变化。该确定组的变化多样的氨基酸残基位置对应于在不同的靶结合Alphabody之间或之中保守的氨基酸残基、区段、基序或模式所定位的位置外部的那些位置。所获得的Alphabody文库被称为Alphabody的“专用文库”。随后再次筛选这些专用文库以鉴定最佳靶结合Alphabody。
因此，在这样的专用Alphabody序列文库的产生中，在不同Alphabody之间或之中保守的氨基酸残基、区段、基序或模式在文库产生过程中保持恒定。可从这样的专用文库鉴定和任选地分离对于目标靶分子具有增强的或最优化的结合特异性和/或体外活性的Alphabody序列。
在具体实施方案中，在上述序列合理化的过程后，还可从已被鉴定为对于目标靶分子是特异性的并已使用本文中设想的方法产生的不同Alphabody序列的组生成Alphabody序列的新文库。在这样的所谓的“增敏(spiked)文库”(已被鉴定为对于某一目标靶分子是特异性的不同Alphabody序列的组)中，所述不同的Alphabody序列通过在有限数目的随机选择的位置上引入随机氨基酸置换来产生变化。如文库产生领域内的技术人员已知的，易错PCR是产生“增敏文库”的方便方法。这还可使用DNA合成领域中的技术人员已知的增敏寡核苷酸通过直接DNA合成法来方便地实现。
因此，用于产生一种或多种靶结合多肽的方法还可在从随机文库中鉴定两种或更多种靶结合Alphabody后包括如下步骤：
-比较产生的结合目标靶蛋白的Alphabody序列，
-鉴定在这些不同Alphabody序列之间或之中保守的氨基酸残基、氨基酸残基位置、区段、基序或模式，和：
-从所比较的两个或更多个Alphabody序列的至少一个开始，产生spiked文库，其中文库包含不同的在有限数目的随机选择的位置上变化多样的Alphabody或多肽序列，或产生专用文库，其中文库包含在一组氨基酸位置中变化多样的不同Alphabody或多肽序列，所述氨基酸位置不是在所述不同的靶结合Alphabody序列之间或之中保守的氨基酸残基、氨基酸残基位置、区段、基序或模式，
-从随机文库选择和/或鉴定那些对于目标靶分子具有增强的或最优化的结合特异性和/或体外活性的Alphabody或多肽序列，和任选地
-分离这些对于目标靶分子具有增强的或最优化的结合特异性和/或体外活性的Alphabody或多肽序列。
应理解，用于产生专用或spiked文库以及选择、鉴定和分离对于目标靶分子具有增强的或最优化的结合特异性和/或体外活性的Alphabody或多肽序列的方法中包括的步骤，如上所述，可以以与针对用于产生靶结合性Alphabody或多肽的方法的对应步骤所描述的方式相似地进行。
如本文中进一步描述的，存在于本文中设想的多肽内的Alphabody结构中的氨基酸残基总数可在约50至约210个的范围内，这主要取决于每个七肽重复序列中的七肽的数目和互联七肽重复序列的柔性接头的长度。关于本文中提供的多肽或组合物的部分、片段、类似物或衍生物在它们的长度和/或尺寸上不受特别限制，只要这样的部分、片段、类似物或衍生物仍然具有它们所源自的多肽或组合物的生物功能并且仍然可用于设想的(药理学)目的即可。
应当注意，定向进化法(例如DNA改组法)还可用于从已被鉴定为对于目标靶分子是特异性的一个或多个不同Alphabody序列开始构建Alphabody文库。还可将这样的“定向进化”文库选择和/或鉴定那些对于目标靶分子具有增强的或最优化的结合特异性和/或体外活性的Alphabody序列。
[基于模拟生产ALPHABODY的方法]
在可选择的实施方案中，提供了基于模拟生产对于细胞内靶分子具有可检测的结合亲和力或抑制活性的多肽的方法。应理解，Alphabody结构的特异性靶结合位点的移植可在引入细胞穿透性质之前或之后进行。因此，应理解，可对Alphabody结构本身或对包含这样的Alphabody结构或由其组成的多肽进行下文中针对本文中的方法所描述的步骤。具体地，用于产生靶特异性Alphabody结构的这样的方法至少包括如下步骤：
(a)Alphabody螺旋的鉴定，所述螺旋被选择用于模拟结合该目标靶分子的配体的结合位点的至少部分，和
(b)该特定Alphabodyα-螺旋中的区段的确定，所述区段用于模拟结合该目标靶分子的所述配体的所述结合位点。
该方法详细地公开于在Complix NV名下的公开国际专利申请WO2012/093013中。
[药物组合物]
在进一步的方面，提供了包含一种或多种本文中设想的多肽和/或核酸序列和任选地至少一种药学上可接受的载体的药物组合物(在本文中也称为本文中设想的药物组合物)。根据某些具体实施方案，本文中设想的药物组合物还可任选地包含至少一种其它药物活性化合物。
本文中设想的药物组合物可用于诊断、预防和/或治疗与细胞内目标靶分子相关的疾病和障碍。具体地，本申请提供了包含一种或多种本文中设想的多肽的药物组合物，其适合在温血动物中，具体地在哺乳动物中，更具体地在人类中进行预防性、治疗性和/或诊断性使用。
还提供了包含一种或多种本文中设想的多肽的药物组合物，所述药物组合物可在与细胞内目标靶分子(例如BCL-2蛋白家族的抗细胞凋亡成员)相关和/或由所述细胞内目标靶分子介导的一种或多种疾病、障碍或病况的预防和/治疗中用于兽用目的。
一般而言，对于制药用途，可将本文中设想的多肽配制为药物制剂或组合物，所述制剂或组合物包含至少一种本文中设想的Alphabody或多肽和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，和任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。这样的制剂可适合于口服、胃肠外、局部施用或适合于通过吸入施用。因此，同样取决于待使用的具体药物制剂或组合物，本文中设想的Alphabody或多肽和/或包含所述Alphabody或多肽的组合物可以例如通过口服、腹膜内、静脉内、皮下、肌内、经皮肤、局部途径，通过栓剂，通过吸入来施用。临床医生将能够选择适当的施用途径和待在这样的施用中使用的适当的药物制剂或组合物。
药物组合物还可包含适当的粘合剂、崩解剂、甜味剂或调味剂。可以例如用明胶、蜡或糖等涂覆片剂、丸剂或胶囊。此外，可将本文中设想的Alphabody和多肽掺入持续释放制剂和装置。
适合用于注射或输注的药物剂型可包括包含活性成分的无菌水溶液或分散体或无菌粉剂，所述无菌粉剂适合用于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散体(任选地封装在脂质体中)。在所有情况下，最终的剂型必须在制造和贮藏条件下是无菌的、流体的和稳定的。液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适当的混合物。可任选地添加抗细菌剂和抗真菌剂等。
本文中设想的多肽的有用剂量可通过测定它们的体外活性和/或在动物模型中的体内活性来进行测定。用于将小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法对于本领域技术来说是已知的。
用于预防和/或治疗所需的本文中设想的多肽的量不仅可随选择的具体Alphabody或多肽而变化而且还可随施用途径、待治疗的病况的性质以及患者的年龄和病况而变化，并且最终凭巡诊医生或临床医生自行处理。同样地，取决于靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官，本文中设想的Alphabody和多肽的剂量可变化。
按照适合用于预防和/或治疗待预防或治疗的疾病或障碍的治疗方案，施用本文中设想的多肽和/或包含所述多肽的组合物。临床医生通常能够确定适当的治疗方案。一般而言，治疗方案会包括以一个或多个药物有效量或剂量施用一种或多种多肽，或一种或多种包含所述多肽的组合物。
可以以单次剂量或以适当间隔施用的分份剂量(可再次地以亚剂量提供其)方便地提供期望的剂量。施用方案可包括长期(即，至少两周，例如数月或数年)或每日治疗。
以由执业医生基于病况的严重度和待治疗的患者以及其它因素决定的量施用本文中设想的多肽。通常地，对于每一种疾病适应征，将测定最佳剂量，从而指定每日每kg体重待施用(以单份日剂量的形式连续地进行的(例如通过输注)，或在一天的过程中以多个分份剂量的形式进行的)的量。取决于本文中提及的因素，临床医生通常能够确定适当的日剂量。也清楚的是，在特定情况下，临床医生可以例如基于上述因素和他的专业判断而选择偏离这些量。
具体地，可将本文中设想的多肽与其它药物活性化合物或成分组合使用，所述其它药物活性化合物或成分用于或可用于预防和/或治疗本文中所述的疾病和障碍，作为所述组合使用的结果可以获得或不获得协同作用。这样的化合物和成分以及施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物的实例对于临床医生来说是明了的。
[预防性、治疗性和/或诊断性应用]
根据其它方面，特异性结合细胞内目标靶的本文中设想的多肽可用于制备药剂，所述药剂用于预防和/或治疗其中牵涉所述细胞内靶分子的至少一种细胞内靶介导的疾病和/或障碍。因此，本申请提供了特异性结合细胞内靶的多肽和药物组合物，例如但不限于BCL-2蛋白家族的抗-细胞凋亡成员，以用于预防和/或治疗其中牵涉所述细胞内靶分子的至少一种细胞内靶介导的疾病和/或障碍。在具体实施方案中，还提供了用于预防和/或治疗至少一种细胞内靶介导的疾病和/或障碍的方法，其包括给有此需要的受试者施用药物活性量的一种或多种本文中设想的多肽和/或药物组合物。具体地，药物活性量可以是这样的量，该量足以(在循环中产生一定水平的多肽)抑制、阻止或减少(或在本文中设想的激动性Alphabody和多肽的情况下：增强、促进或增加)细胞内靶(例如但不限于BCL-2蛋白家族的抗-细胞凋亡成员)，或它们的生物或药理学活性和/或其中牵涉它们的生物途径或信号转导。
待用本文中描述的多肽治疗的受试者或患者可以任何温血动物，但具体地是哺乳动物，更具体地是人，所述动物或人患有或有风险患有其中牵涉本文中描述的多肽所特异性结合的细胞内靶分子的疾病和障碍。
取决于牵涉的具体疾病或障碍，本文中描述的多肽和包含所述多肽的组合物的功效可使用任何适当的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型或其任意组合来测定。适当的测定和动物模型对于本领域技术人员来说是明了的。
取决于牵涉的细胞内靶，本领域技术人员通常能够选择适当的体外测定、细胞测定或动物模型来测试本文中描述的多肽对细胞内靶分子的结合或它们影响这些细胞内靶分子活性和/或其中牵涉这些细胞靶分子的生物学机制的能力；以及它们在一种或多种与细胞内靶分子相关的疾病和障碍方面的治疗和/或预防作用。
因此，提供了用作药剂，更具体地用于治疗选自下述的疾病或障碍的方法中的包含至少一个Alphabody或基本上由其组成的多肽，所述至少一个Alphabody能够被内化入细胞并且特异性结合在细胞内具有生物活性的细胞内靶分子，所述疾病或障碍选自癌症、感染性疾病、造血系统疾病、代谢疾病、免疫疾病、神经性障碍、增殖性障碍、心血管疾病和炎性疾病。在具体实施方案中，本文中设想的多肽被用于治疗、预防和/或诊断癌症和肿瘤病况。癌症或肿瘤病况的实例包括但不限于纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、食管癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈部肿瘤、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilms瘤(、宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波西肉瘤。
本文中设想的多肽还可用于治疗多种增殖性障碍。增殖性障碍的实例包括造血肿瘤性障碍和细胞增殖和/或分化障碍，例如但不限于上皮细胞增生、硬化性腺病和小导管乳头状瘤；肿瘤，例如，间质瘤例如纤维腺瘤、叶状瘤和肉瘤以及上皮肿瘤例如巨大导管乳头状瘤；乳腺的癌包括原位(非侵袭性)癌，包括原位导管癌(包括佩吉特病)和原位小叶癌，和侵袭性(浸润性)癌，包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、髓样癌、胶质(粘蛋白状的)癌、小管癌和侵袭性乳头状癌(invasive papillary carcinoma)、混合性恶性肿瘤(miscellaneousmalignant neoplasms)、男子乳腺发育、支气管原癌、包括类肿瘤综合征、细支气管肺泡癌、神经内分泌瘤、例如支气管类癌、各种肿瘤和转移性肿瘤；胸膜的病状，包括炎性胸腔积液、非炎性胸腔积液、气胸和胸膜肿瘤，包括孤立性纤维瘤(胸膜纤维瘤)、恶性间皮细胞瘤、非肿瘤性息肉、腺瘤、家族性综合征(familial syndromes)、结直肠致癌发生、结直肠癌、类癌瘤、结节性增生、腺瘤和恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肿瘤、体腔上皮的肿瘤、浆液性肿瘤(seroustumors)、粘液性瘤、卵巢子宫内膜样瘤、透明细胞腺癌、囊腺纤维瘤、Brenner瘤、表面上皮肿瘤(surface epithelial tumors)；生殖细胞肿瘤例如成熟(良性)畸胎瘤、单胚层畸胎瘤、未成熟畸胎瘤、无性细胞瘤、内胚层窦瘤、绒毛膜癌；性索间质肿瘤例如颗粒-卵泡膜细胞、泡膜细胞瘤、男性母细胞瘤、hill细胞瘤和性腺母细胞瘤；和转移性肿瘤例如Krukenberg瘤。
本文中设想的多肽还可用于治疗多种免疫障碍，例如但不限于炎性疾病或障碍，或自身免疫疾病或障碍。
本文中设想的多肽还可用于治疗造血障碍或疾病，包括但不限于自身免疫疾病(包括，例如，糖尿病、关节炎(包括类风湿关节炎、幼年型类风湿关节炎、骨关节炎、牛皮癣关节炎)、多发性硬化、脑脊髓炎、重症肌无力、系统性红斑性狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、银屑病、干燥综合征、克罗恩氏病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性脑病、特发性双向进行性感觉神经性听力丧失(idiopathicbilateral progressive sensorineural hearing loss)、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少、多软骨炎、Wegener”s氏肉芽肿、慢性活动型肝炎、斯-约二氏综合征、特发性脂肪泻、扁平苔癣、格雷夫斯病、结节病、原发性胆汁性肝硬变、葡萄膜炎和间质肺纤维化(interstitial lung fibrosis))、移植物抗宿主病、移植的病例(cases of transplantation)和过敏症。
本文中设想的多肽还可用于治疗心血管障碍(例如，炎症性障碍)，包括但不限于动脉粥样硬化、心肌梗死、中风、血栓症、动脉瘤、心力衰竭、缺血性心脏病、心绞痛、心脏猝死、高血压心脏病；非冠状动脉血管病(non-coronary vessel disease)、例如小动脉硬化、小血管病、肾病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、高脂血症、黄瘤病、哮喘、高血压、肺气肿和慢性肺病；或与干预过程(“程序性血管损伤(procedural vascular trauma)”)相关的心血管病况，例如血管成形术、放置分流器、支架、合成或天然切除移植物(excision graft)、留置导尿管、瓣膜或其它可植入装置后的再狭窄。
本文中描述的多肽还可用于治疗处于发生神经性疾病或障碍的风险中或患有所述疾病的人，所述疾病或障碍包括但不限于阿尔茨海默病或帕金森病、亨廷顿病、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩或脊髓小脑性共济失调，例如，SCAl、SCA2、SCA3(Machado-Joseph病)、SCA7或SCA8、ALS、多发性硬化、癫痫、唐氏综合征、荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样病(Dutch Type Hereditary Cerebral HemorrhageAmyloidosis)、应激性淀粉样疾病、家族性淀粉样肾病伴荨麻疹和耳聋、穆-韦二氏综合征、原发性骨髓瘤(Idiopathic Myeloma)；巨球蛋白血症相关骨髓瘤(Macroglobulinemia-Associated Myeloma)、家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病、心脏淀粉样变性(Isolated Cardiac Amyloid)、全身性老年性淀粉样变性、成年型糖尿病、胰岛素瘤、孤立性心房淀粉样变性、甲状腺管道样癌、家族性淀粉样变、遗传性脑出血伴淀粉样变、家族性淀粉多发性神经病变(Familial Amyloidotic Polyneuropathy)、羊瘙痒症、克-亚综合征(Creutzfeldt-Jacob Disease)、格斯特曼-施特劳斯纳综合症(Gerstmann Straussler-Scheinker Syndrome)和牛海绵状脑炎，朊病毒介导的疾病。
现通过下列非限定性实施例和附图进一步描述上述公开内容，其中附图显示：
附图图例
图1：MCL-1结合性Alphabodies的序列。
显示了通过本文中描述的方法产生的scAB-013(SEQ ID NO：24)、参照Alphabody以及设计的Alphabody MCL1-AB1(SEQ ID NO：1)、MCL-AB2(SEQ ID NO：2)和MCL-AB3(SEQ ID NO：3)的比对序列。从蛋白质数据库(Protein Data Bank)(PDB)条目3MK8移植的残基在黑色背景中以白色显示。加框残基表示Alphabody的螺旋中促进或接纳对MCL-1的结合的置换。序列显示为对齐的片段，每一组片段分别对应于Alphabody的“螺旋A”、“环1”、“螺旋B”、“环2”和“螺旋C”。全序列是由这些片段按所示顺序组成的单一多肽序列。
图2：MCL-1结合性Alphabody的序列ID和相关序列。
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3分别对应于MCL-AB1、MCL1-AB2和MCL1-AB3的Alphabody氨基酸序列。
图3：Alphabody多肽KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO：4)、VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID NO：7)和tat-013(SEQ ID NO：25)对点印的MCL-1细胞裂解物的结合。使用缀合有HRP的抗-His抗体检测Alphabody的结合。KLPVM-MCL1-AB1、VPTLK-MCL1-AB1为CPP5-标记的MCL1-AB1Alphabody和tat-标记的对照Alphabody scAB013。
图4：0.5microM tat-013(SEQ ID NO：25)(图框A)、KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO：4)(图框B)和VPTLK-MCL1-AB1(SEQ IDNO：7)(图框C)在与人T细胞白血病细胞(MT4)一起温育2h后的细胞内摄入。使用兔抗-血清和缀合有Alexa488的第二抗体(山羊抗-兔Ab)显现Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。在每一个图框中，第一图像显示细胞核染色(蓝色通道)，第二图像显示分析的细胞的形态学(可见光)，第三图像显示Alphabody染色(绿色通道)，最后一个图像是前3个图像(细胞核染色、细胞形态学和细胞内Alphabody)的合并图像。
图5：0.5microM tat-013(SEQ ID NO：25)(图框A)、KLPVM-MCL1_AB1(SEQ ID NO：4)(图框B)和VPTLK-MCL1-AB1(SEQ IDNO：7)(图框C)在与人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)一起温育2h后的细胞内摄入。使用兔抗-血清和缀合有Alexa488的第二抗体(山羊抗-兔Ab)显现Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。在每一个图框中，第一图像显示细胞核染色(蓝色通道)，第二图像显示分析的细胞的形态学(可见光)，第三图像显示Alphabody染色(绿色通道)，最后一个图像是前3个图像(细胞核染色、细胞形态学和细胞内Alphabody)的合并图像。
图6：10、20和50microM KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO：4)在与人胶质母细胞瘤(U87.MG)一起温育12小时后的细胞内摄入。使用兔抗-血清和缀合有Alexa488的第二抗体(山羊抗-兔Ab)显现Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。在每一个图框中，第一图像显示细胞核染色(蓝色通道)，第二图像显示分析的细胞的形态学(可见光)，第三图像显示Alphabody染色(绿色通道)，最后一个图像是前3个图像(细胞核染色、细胞形态学和细胞内Alphabody)的合并图像。
图7：10、20和50microM VPTLK-MCL1_AB1(SEQ ID NO：7)在与人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)一起温育12h后的细胞内摄入。使用兔抗-血清和缀合有Alexa488的第二抗体(山羊抗-兔Ab)显现Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。在每一个图框中，第一图像显示细胞核染色(蓝色通道)，第二图像显示分析的细胞的形态学(可见光)，第三图像显示Alphabody染色(绿色通道)，最后一个图像是前3个图像(细胞核染色、细胞形态学和细胞内Alphabody)的合并图像。
图8：在12h的50microM KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO：4)(图框A)和VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID NO：7)(图框B)温育后观察到的人胶质母细胞瘤(U87.MG)的细胞凋亡。使用兔抗-血清和缀合有Alexa488的第二抗体(山羊抗-兔Ab)显现Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。在图框A和B中，第一图像显示细胞核染色(蓝色信道)，第二图像显示分析的细胞的形态学(可见光)，第三图像显示Alphabody染色(绿色信道)，最后一个图像是前3个图像(细胞核染色、细胞形态学和细胞内Alphabody)的合并图像。50microM CPP5Alphabody对U87.MG细胞形态学的作用示于图框C中。
图9：在400ng/ml TRAIL不存在(图9A)和存在(图9B)的情况下，利用不同浓度的Alphabody(5、10、20和40microM)温育16h后，通过KLPVM-MCL1_AB1(KLPVM)(SEQ ID NO：4)和VPTLK-MCL1_AB1(VPTLK)(SEQ ID NO：7)Alphabody诱导的人胶质母细胞瘤细胞系U87.MG的细胞凋亡。细胞凋亡被定义为对应于早期细胞凋亡事件(浅色条块)的膜联蛋白V阳性细胞的百分比和对应于晚期细胞凋亡事件(具有边框的黑色条块)的膜联蛋白V和PI阳性细胞的百分比。未处理的细胞(图9A)和仅用TRAIL处理的细胞(TRAIL)(图9B)对应于阴性对照。图9A代表2个实验的平均值和标准差。
图10：在400ng/ml TRAIL不存在(图10A)和存在(图10B)的情况下，利用不同浓度的Alphabody(5、10、20、40和50microM)温育17h后，通过KLPVM-MCL1_AB1(KLPVM)(SEQ ID NO：4)和VPTLK-MCL1_AB1(VPTLK)(SEQ ID NO：7)Alphabody诱导的人T细胞系MT4的细胞凋亡。细胞凋亡被定义为对应于早期细胞凋亡事件(浅色条块)的膜联蛋白V阳性细胞的百分比和对应于晚期细胞凋亡事件(具有边框的黑色条块)的膜联蛋白V和PI阳性细胞的百分比。未处理的细胞(图10A)和仅用TRAIL处理的细胞(TRAIL)(图10B)对应于阴性对照。数据代表2个实验的平均值和标准差。
图11：PI(PerCP-Cy5-5-A)相对于膜联蛋白V(APC-A)的双变量散点图，以及未处理的人胶质母细胞瘤U87.MG的P1阴性细胞群体(图框A)、在TRAIL不存在的情况下利用50microM KPLVM-MCL1_AB1处理的细胞(图框B)和在400ng/ml TRAIL存在的情况下利用20microMKLPVM-MCL1_AB1(SEQ ID NO：4)处理的细胞(图框C)的膜联蛋白V分布直方图。
图12：PI(PerCP-Cy5-5-A)相对于膜联蛋白V(APC-A)的双变量散点图，以及未处理的人胶质母细胞瘤U87.MG的P1阴性细胞群体(图框A)、在TRAIL不存在的情况下利用50microM VPTLK-MCL1_AB1(SEQ ID NO：7)处理的细胞(图框B)和在400ng/ml TRAIL存在的情况下利用20microM VPTLK-MCL1_AB1处理的细胞(图框C)的膜联蛋白V分布直方图。
图13：Alphabody MB23_hiR-V5的序列。精氨酸修饰以粗体显示，C末端V5标签加以下划线显示。序列显示为分别标记以“螺旋A”、“环1”、“螺旋B”、“环2”、“螺旋C”、“His-标签”和“V5-标签”的片段，以区分不同的结构元件。全MB23_hiR-V5序列是由这些片段按所示顺序组成的单一多肽序列。
图14：从312nM至1.2nM的阳离子化MB23_hiR-V5的2倍稀释物在人胶质母细胞瘤(U87.MG)中的细胞内摄入。将Alphabody于37℃在10％血清存在的情况下与细胞一起温育2h。在PBS洗涤，固定并透化细胞后，利用第一抗-V5抗体和标记有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗体显现细胞内Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。对照图像(ctrl)对应于无Alphabody的相同实验条件。图像对应于记录的Z-stack的1μm切片的重叠图像。
图15：625nM非阳离子化MB23-V5和阳离子化MB23_hiR-V5在人胶质母细胞瘤(U87.MG)中的细胞内摄入。将Alphabody于37℃在10％血清存在的情况下与细胞一起温育2h。在PBS洗涤，固定并透化细胞后，利用第一抗-V5抗体和标记有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗体显现细胞内Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。图像对应于记录的Z-stack的1μm切片的图像。
图16：78nM阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)在4个不同细胞系(A：人胶质母细胞瘤-(U87.MG)、B：胰腺癌-(BxPC3)、C：非小细胞肺癌-(H1437)和D：人脂肉瘤(SW872)细胞)中的细胞内摄入。将Alphabody于37℃在10％血清存在的情况下与细胞一起温育2h。在PBS洗涤，固定并透化细胞后，利用第一抗-V5抗体和标记有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗体显现细胞内Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。图像对应于记录的Z-stack的1μm切片的图像。
图17：500nM阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)在人胶质母细胞瘤(U87.MG)中的细胞内摄入。将Alphabody于37℃在10％血清存在的情况下与细胞一起温育不同的时期。在肝素(100个单位/ml)洗涤，固定并透化细胞后，利用第一抗-V5抗体和标记有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗体显现细胞内Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。图像对应于记录的Z-stack的1μm切片的单个细胞图像。
图18：Alphabody AB1_hiKR1-V5(SEQ ID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)的序列。Arg/Lys修饰以粗体显示，并且C末端V5标签加以下划线显示。
图19：人胶质母细胞瘤(U87.MG)中不同浓度(10nM,20nM,40nM,78nM,156nM和312nM)的AB1_hiKR1-V5(SEQ ID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)的细胞内摄入。将Alphabody于37℃在10％血清存在的情况下与细胞一起温育2h。在PBS洗涤，固定并透化细胞后，利用第一抗-V5抗体和标记有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗体显现细胞内Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。图像对应于记录的Z-stack的1μm切片的图像。
图20：500nM AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)在人胶质母细胞瘤(U87.MG)中的细胞内摄入的动力学。将Alphabody于37℃在10％血清存在的情况下温育180min、120min、60min、30min、15min、7.5min和3.5min。在肝素(100个单位/ml)洗涤，固定并透化细胞后，利用第一抗-V5抗体和标记有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗体显现细胞内Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。图像对应于记录的Z-stack的一个1μm的切片。
图21：在Alphabody的系列稀释物存在的情况下人T细胞白血病细胞(MT4)的细胞活力。在利用Alphabody处理48h后测量细胞存活力。数据对应于一式三份重复的平均值±SD。细胞存活力表达为相对于未处理对照细胞的百分比。
图22：在Alphabody的系列稀释物存在的情况下人T细胞白血病细胞(Jurkat)的细胞存活力。在利用Alphabody处理48h后测量细胞存活力。数据对应于一式三份重复的平均值±SD。细胞存活力表达为相对于未处理对照细胞的百分比。
图23：在Alphabody的系列稀释物存在的情况下PBMC的细胞存活。在利用Alphabody处理48h后测量细胞存活。数据对应于一式三份重复的平均值±SD。细胞存活力表达为相对于未处理对照细胞的百分比。
图24：具有C末端His-标签和V5标签的阳离子化AlphabodyAB1_pan_hiKR3-V5的序列(SEQ ID NO：10)。精氨酸/赖氨酸修饰以粗体显示，N末端V5标签加以下划线显示。序列显示为分别标记以“螺旋A”、“环1”、“螺旋B”、“环2”、“螺旋C”、“His-标签”和“V5-标签”的片段，以区分不同的结构元件。全AB1_pan_hiKR3-V5序列是由这些片段按所示顺序组成的单一多肽序列。
图25：重组BCL-2家族蛋白对Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5的结合。Alphabody(500nM)被固定的抗-V5抗体(5microg/ml)捕获于微量滴定板。使用缀合于辣根过氧化物酶的抗-GST抗体检测谷胱甘肽S-转移酶(GST)-标记的重组BCL-2家族蛋白MCL-1、BCL-XL和BCL-2a的5倍稀释物的结合。在492nm和630nm处读取板。
图26：重组BCL-2家族蛋白对Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5、AB1_A2aF_hiKR3-V5和MB23_hiR-V5的结合。Alphabody(500nM)被固定的抗-V5抗体(5microg/ml)捕获于微量滴定板。使用缀合于辣根过氧化物酶的抗-GST抗体检测谷胱甘肽S-转移酶(GST)-标记的重组BCL-2家族蛋白MCL-1(图26A)、BCL-XL(图26B)和BCL-2a(图26C)的5倍稀释物的结合。在492nm和630nm处读取板。
图27：在Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5和MB23_hiR-V5的系列稀释物存在的情况下人T细胞白血病细胞(MT4)的细胞存活。在利用Alphabody处理48h后测量细胞存活。数据对应于一式三份重复的平均值±SD。细胞存活表达为相对于未处理对照细胞的百分比。
实施例
I.导言
许多细胞内作用的分子已被鉴定为治疗应用的潜在吸引人的靶。在这些分子当中，参与细胞凋亡过程的蛋白质形成重要的一类细胞内靶分子。如最近所描述的(Quinn等人,Expert Opinion,2011,20：1397-1411；Akgul,Cell.Mol.Life.Sci.2009,66:1326-1336和本文中引用的参考资料)，众所周知细胞凋亡是生物体中细胞动态平衡维持的至关重要的过程。细胞凋亡可通过两个相关途径发生：细胞凋亡的外在和内在途径。外在途径包括利用细胞外配体例如FasL或TNF激活细胞表面死亡受体(Fas,TNFR)。内在途径可通过多种应激信号启动，其中涉及线粒体外膜的透化，这导致细胞色素c释放，从而导致细胞凋亡过程中的其它步骤，包括胱天蛋白酶-9的切割和激活以及最终细胞死亡。
此外众所周知的是，BCL-2蛋白家族(也表示为Bcl-2蛋白家族)的成员是参与细胞凋亡过程的调节和控制的主要蛋白。BCL-2蛋白家族包括促细胞凋亡成员以及抗-细胞凋亡成员。该蛋白质家族以BCL-2(在关于B细胞淋巴瘤的研究中发现的该蛋白质家族的创建成员)命名。
基于结构和功能性质，BCL-2蛋白家族通常分成3个亚组：两个促细胞凋亡BCL-2成员亚组和一个抗-细胞凋亡BCL-2成员亚组。
抗-细胞凋亡亚组包括成员BCL-2、BCL-2a、MCL-1、BCL-w、BCL-XL和BFL-1/A1(这些蛋白质有时以小写符号Bcl-2、Mcl-1、Bcl-w、Bcl-xL、Bfl-1/A1表示)。这些蛋白质通过结合或捕获促-细胞凋亡BCL-2家族成员的至关重要的细胞凋亡诱导结构域来充当存活因子(Stewart等人,Nature Chemical Biology,2010,6,595-601)。该结构域称为BCL-2同源结构域3(BH3)。抗-细胞凋亡蛋白沿着其表面具有衔接BH3α-螺旋的疏水性结合区(Sattler等人,Science,1997,275：983-986)。BCL-2、BCL-XL和BCL-W包含4个BH(BCL-2同源性)结构域(表示为BH1、BH2、BH3和BH4)，而MCL-1和BFL-1/A1不存在明确确定的BH4结构域。
两个促-细胞凋亡亚组之一包含Bax和Bak(也以大写表示为BAX和BAK)，其具有多个BH(BCL-2同源性)结构域(BH1、BH2和BH3)。另一促-细胞凋亡亚组的成员(包括BAD、BID、BIM、NOXA、PUMA)仅包含BH3结构域，因而被称为仅含BH3的蛋白。
BCL-2家族的抗-细胞凋亡成员在肿瘤细胞存活中起着重要作用，并且可被当作有价值的靶用于癌症治疗。事实上，这些存活蛋白在范围广泛的人癌症中表达。例如，MCL-1据报导在许多癌症类型(乳腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝细胞癌、头颈癌、多发性骨髓瘤、结肠癌、肺癌、白血病和淋巴瘤)中过表达(Quinn等人,Expert Opinion,2011,20：1397-141)。
因此，对于与阻断抗-细胞凋亡蛋白的BH3模拟物的开发相关的药物发现存在相当的吸引力。
例如，ABT-737为结合BCL-2、BCL-XL和BCL-w但不结合MCL-1或BFL-1/A1的BH3-模拟物(Lee等人,Cell Death andDifferentiation(2007),14,1711-1719)。该识别上的差异可通过结合沟的差异来解释，已知其中MCL-1结合沟比其它抗-细胞凋亡蛋白带有更多的正电荷。
同样地，已产生了模拟BH3α-螺旋的烃装订肽，从而目标在于最优化亲和力和保持结合选择性。这样的方法最近由Stewart等人研究出(Nature Chemical Biology,2010,6,595-601)，其从抗-细胞凋亡性MCL-1BH3螺旋衍生出排他性MCL-1抑制剂。
然而，这些装订肽通常受困于如下事实：仅观察到中等水平的α-螺旋性(例如对于双装订SAH-gp41626-662肽显示36％的α-螺旋性(Bird等人,PNAS,.2010,107,14093-14098))；和螺旋转角之间所需的装订是人工制品，其本身可能对生物活性具有不可预测的效应。
在下列实施例中，描述了模拟MCL-1的BH3结构域并且结合MCL-1(目的在于阻断MCL-1与促-细胞凋亡蛋白之间的相互作用以将癌症/肿瘤细胞驱向程序化细胞死亡)的Alphabody是如何设计的。
II.缀合于细胞穿透肽的MCL-1靶向ALPHABODY
实施例1.MCL-1结合性Alphabody的设计
设计工作使用MCL-1(残基172-327)与装订肽的复合物的晶体结构，代表BH3α-螺旋。基于该晶体结构(PDB代码3MK8)，将Alphabody设计成在很大程度上以与MCL-1SAHB相同的方式结合MCL-1。
Alphabody B-螺旋被选择来模拟MCL-1BH3α-螺旋，初步拟合操作表明在该结合模式中，完整的Alphabody与MCL-1结合沟最相容。
BH3α-螺旋中的α-螺旋区段为具有序列LRRVGDGV(SEQ ID NO：28)的长度为8的区段，其包含由Stewart等人(Nat.Chem.Biol.,2010,6:595-601)描述的介导对抗-细胞凋亡蛋白MCL-1的结合的高度保守的BH3元件。pdb3MK8结构的B-链中的对应区段用于所有叠加(superimposition)或拟合操作，其中周围的MCL-1蛋白也被考虑来判断拟合的相容性。可看到最佳拟合通过在参照Alphabody scAB013中的残基B2f-B3f上叠加区段B9-B16可以实现，其中我们为了方便已使用Alphabody的七肽编号方案。更精确地，区段B2f-B3f包含下列位置B2f、B2g、B3a、B3b、B3c、B3d、B3e、B3f(注意B代表Alphabody的第二α-螺旋，编号2或3表示七肽编号，小写字母表示7个七肽位置的每一个位置)。
3个Alphabody被设计来结合MCL-1和模拟具有序列LRRVGDGV(SEQ ID NO：28)的BH3α-螺旋区段。这些Alphabody示于下文中。这些Alphabody的序列与用于设计这些Alphabody的参照Alphabody scAB-013的序列一起示于图1中。
MCL1-AB1
根据3MK8结构，选择Alphabody B螺旋中的6个位置来用于接枝：B2fL,B2gR,B3bV,B3cG,B3dD和B3fV。对应位置和序列突出显示于图1中。
引入许多另外的置换以最优化与MCL-1的相互作用或容纳Alphabody残基对MCL-1的结合，如图1中加框显示的。
更具体地，引入A3eE和B1eT以有利于与MCL-1上的Lys234的相互作用。注意，A3eE应当读为Alphabody第一螺旋的第3七肽中e-七肽位置上的谷氨酸(以一字母符号表示为E)。类似地，B1eT表示第二螺旋中第1七肽的e-七肽位置上的苏氨酸(以一字母符号表示为T)。
在C-螺旋中，N末端甲硫氨酸至甘氨酸的突变和C1gS突变被选择来防止与MCL-1的空间位阻。C2gE被选择来容纳接枝的B2gR突变。
MCL1-AB2
C1gA被选择作为安全突变，因为即使MCL1-AB1的该位置上的丝氨酸能参与局部H键网络，由OH-基团产生的位阻可能是个潜在问题。由于相似的原因，L2的位置14和15上的GS序列被反转成SG。
MCL1-AB3
鉴于接枝的B3dD突变(在核心位置上)的风险，B3dT突变被选择作为MCL1-AB1的安全性支持。
这3个Alphabody的序列和SEQ-ID示于图2中。
在本实施例中，我们意欲主要通过基于细胞的功能性测定测试MCL-1结合性Alphabody，所述测定需要细胞内递送Alphabody以结合细胞凋亡靶，从而诱导细胞凋亡或使得对细胞凋亡敏感。在这方面，将细胞穿透肽添加至Alphabody的N末端。使用3个不同的细胞穿透肽：(1)来源于HIV-1的tat蛋白的tat肽(YGRKKRRQRRR)(SEQ ID NO：23)，(2)细胞穿透五肽(CPP5)：KLPVM(SEQ ID NO：21)和(3)第二CPP5肽：VPTLK(SEQ ID NO：22)(Frankel和Pabo,1988；Cell,1988,55(6)：1189-1193；Green等人,Cell,1988,55(6)：1179-1188；Gomez等人,Pharmaceutical,2010,3(12)：3594-3613)。CPP5肽来源于蛋白Ku70(参与非同源性末端连接的DNA修复和细胞死亡调控的多功能蛋白)。肽VPTLK具有抗-细胞凋亡活性，因为其抑制促-细胞凋亡蛋白Bax的激活和从胞质溶胶至线粒体的转运(Gomez等人,Pharmaceutical,2010,3(12)：3594-3613)。
将tat和CPP5序列添加在Alphabody的N末端，间隔以Gly-Gly-Ser-Gly接头。为了克隆目的，将另外的Met-Gly引入tat和CPP5序列的N末端。为了纯化和检测目的，分别地在Alphabody的C末端引入His-标签(6xHis)和V5表位(Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr)。
对于MCL1-AB1，仅产生CPP5-标记的Alphabody。本实施例的其余部分将聚焦在CPP5-标记的MCL1-AB1。
实施例2.Alphabody的产生和纯化
将实施例1和3至8中描述的对应于不同Alphabody的基因克隆进入细菌表达载体pET16b，并用于化学地转化感受态BL21(DE3)pLysS细菌。从用6.7ml的过夜预培养物接种的1l培养物产生Alphabody。在OD600nm0.5时用1mM IPTG诱导Alphabody产生，并在30℃生长4小时。
使用下列方案从包涵体纯化CPP5-MCL1-AB1：在细菌培养物离心(以4000rpm进行40分钟)后，将细胞沉淀重悬浮于10ml的50mM Tris,500mM NaCl pH7.8(含有20mM AEBSF)中，于-20℃贮存直至纯化。随后对细胞沉淀进行超声处理(以40％幅度进行10x10秒)，随后以17000xg离心20分钟。将沉淀重悬浮于Tris50mM,NaCl100mM,EDTA20mM,Triton X-1002％,pH7.8，在振荡的条件下于4℃温育10分钟。将样品在4℃以17000xg离心15分钟，用Tris50mM,Triton X-1001％,pH7.8洗涤沉淀，随后重悬浮于10ml H2O。在于4℃以17000xg离心15分钟后，将沉淀重悬浮于Tris50mM,NaCl500mM,GuHCl6M,pH7.8中。
将溶解化的包涵体通过0.45μm滤器过滤，添加至500微升Ni-NTA树脂(GE Healthcare)，在室温温育1小时。用10ml的50mM Tris,500mM NaCl和20mM咪唑洗涤树脂，随后用10ml50mM Tris,500mM NaCl和50mM咪唑洗涤5次。用1ml的50mM Tris,500mM NaCl以及1M咪唑和6M GuHCl洗脱Alphabody，进行10次。
将洗脱的Alphabody(10ml)浓缩，使用PBS在3K Amicon过滤器上替代缓冲液至500μl的体积。浓缩的Alphabody呈现一些沉淀，将其离心以沉淀出聚集体。将沉淀溶解在400微升的150mM醋酸中。再次地，观察到沉淀，离心后将沉淀溶解于20mM醋酸钠,150mM NaCl,pH6中。将3种不同的Alphabody制剂在SDS-PAGE(10％Bis/Tris)上进行分析，测定其浓度。
实施例3.细胞内摄入的分析
使用2个不同的癌细胞系：MT4细胞(人T细胞白血病)和U87.MG细胞(人胶质母细胞瘤细胞)通过共聚焦显微镜研究所述不同的CPP5标记的MCL1-AB1Alphabody的细胞内摄入。U87.MG细胞具有Mcl-1的高度表达，并且对索拉非尼(多激酶抑制剂)和TRAIL(死亡受体配体)敏感(Yang等人,Mol.Cancer Ther.,2010,9(4)：953-962)。
用不同浓度的Alphabody(0.5μM至50μM)温育细胞2小时或12小时。利用Alphabody处理MT4悬浮细胞(400.000个细胞/载片)，随后将其通过多聚-Lys附着于LabTek小室的载玻片。相反地，将贴壁U87.MG细胞(10.000个细胞/载片)粘附于载玻片(无多聚Lys涂层)，随后用Alphabody温育。
在用Alphabody温育结束时，用含钙和镁的PBS洗涤细胞3次，随后用4％甲醛在4℃固定10分钟。用0.1％Triton X-100在室温(RT)透化细胞15分钟，随后用甘氨酸(0.75g/100ml PBS)进行2个10分钟的洗涤步骤，以中和甲醛。在RT添加封闭缓冲液(PBS中的1％BSA)，进行10分钟，随后用兔49血清(针对Alphabody的血清)(1/1000，于封闭缓冲液中)在RT温育1小时。用封闭缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟，随后添加缀合于Alexa488的山羊抗兔(1/300，于封闭缓冲液中)(Invitrogen)，在RT用DAPI(SIGMA-Aldrich)进行细胞核染色(1/100)30分钟。最后，用封闭缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟，用PBS洗涤一次，随后在共聚焦显微镜(ZEISS Axiovert200M LSM510Meta)上读出结果。
实施例4.通过流式细胞术分析细胞凋亡
通过使用膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)作为细胞凋亡标志物来测量细胞凋亡。膜联蛋白V是位于健康非凋亡细胞的细胞膜内叶(innerleaflet)上的小分子结合性磷脂酰丝氨酸。在细胞凋亡后，发生磷脂酰丝氨酸向外叶(outer leaflet)的翻转，从而允许膜联蛋白V的结合。膜联蛋白V阳性细胞被视为早期细胞凋亡的细胞。在细胞进一步崩解后，细胞膜变得完全渗漏，从而PI可进入细胞以嵌入DNA。膜联蛋白V和PI阳性细胞被视为晚期凋亡的细胞。仅为PI阳性的细胞是坏死细胞。
在MT4细胞(200.000个细胞/300微升，于48孔板中)和U87.MG细胞(50.000个细胞/400微升，于24孔板中)中研究由不同浓度MCL1-AB1Alphabody诱导的细胞凋亡。在TRAIL(R&D Systems)(死亡受体的配体)不存在的情况下或在1小时后添加至细胞/Alphabody混合物的400ng/ml TRAIL存在的情况下研究细胞凋亡。在用Alphabody温育14小时后，用膜联蛋白V(BD Biosciences)和PI(Invitrogen)对细胞进行染色。
用300微升胰蛋白酶解离U87.MG细胞。在完全解离后，通过添加400微升U87.MG细胞培养基中和胰蛋白酶活性，将细胞悬浮物以300xg离心10分钟。直接离心悬浮物MT4细胞而无需任何其它处理。用800微升结合缓冲液(0.01M HEPES,pH7.4；0.14M NaCl；2.5mM CaCl2)洗涤细胞，随后以300xg离心10分钟。通过添加100微升含有2.5微升膜联蛋白V/样品的结合缓冲液来进行膜联蛋白V染色，将样品在4℃于黑暗处温育15分钟。用1ml结合缓冲液洗涤样品，以300xg离心10分钟。最后，在于FACS Canto测量细胞之前5分钟，用80微升PI溶液(0.1μg/ml PI，于结合缓冲液中)对细胞进行染色。
凋亡细胞的百分比测定为膜联蛋白V阳性细胞的百分比或者膜联蛋白V和PI阳性细胞的百分比。
实施例5.CPP5Alphabody的纯化
从1l细菌培养物纯化2种CPP5-MCL1-AB1Alphabody，获得3个不同缓冲液中的制剂。对于所有制剂，通过SDS凝胶电泳在适当的长度(约15kDa)上观察到清晰的蛋白质条带。在PBS可溶性制剂(对于VPTLK-MCL1-AB1和KLPVM-MCL1-AB1分别为1.4和1.8mM)中测量到Alphabody的最高浓度。
实施例6.CPP5Alphabody对MCL-1细胞裂解物的结合
CPP5Alphabody对MCL-1的结合在使用商购可得的MCL-1转染HEK细胞裂解物(Santa Cruz)的斑点印迹分析中得到确认。将MCL细胞裂解物点印在硝酸纤维素滤膜(2.5微升)上，用含2％脱脂乳的PBS封闭1小时，用1μM、5μM和10μM CPP5Alphabody和阴性对照tat-013Alphabody(SEQ ID NO：25)在室温温育2小时。在用PBS/0.05％Tween20洗涤膜后，添加缀合于辣根过氧化物酶(HRP)的抗-His抗体(1/2000，于含有5％脱脂乳的PBS中)，进行1小时。添加HRP显色剂底物(Biorad)以检测Alphabody的结合。
CPP5Alphabody(VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID NO：7)和KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO：4))都显示明确的对Mcl-1细胞裂解物的结合。对照Alphabody tat-013在相同的浓度上未显示对MCL-1细胞裂解物的结合(如图3中显示的)。
实施例7.CPP5Alphabody在癌细胞系MT4和U87.MG中的细胞内摄入
首先在人T细胞白血病细胞系MT4中研究CPP5Alphabody的细胞内摄入。将tat-013Alphabody(SEQ ID NO：25)用作细胞内摄入的阳性对照。该对照还允许比较tat与CPP5肽的货物内化模式。
在Alphabody与MT4细胞温育2小时后，观察到CPP5Alphabody的微弱细胞内摄入。观察到Alphabody tat-013(SEQ ID NO：25)的细胞内摄入，如通过胞质溶胶中该Alphabody以相对高浓度存在所显示的(图4图框A)。
也对贴壁人胶质母细胞瘤癌细胞系U87.MG测试CPP5Alphabody和对照Alphabody的细胞内摄入。在于U87.MG细胞上温育0.5μMAlphabody2小时后，研究细胞内摄入。2小时后观察到2种CPP5Alphabody和对照tat-013的清晰细胞内摄入(图5)。
在U87.MG细胞中通过在12小时的温育期中分析10μM、20μM和50μM的摄入来研究CPP5Alphabody的剂量依赖性细胞内摄入。可以预期，在高剂量Alphabody上和在延长的温育时间后能观察到细胞凋亡事件。文献中已知U87.MG细胞具有MCL-1的高度表达，并且对下调MCL-1表达的索拉非尼敏感(Yang等人,Mol.Cancer Ther.,2010,9(4)：953-962)。如果CPP5Alphabody与细胞内MCL-1相互作用并且阻止其对Bak或Bax的结合，则细胞凋亡可被诱导。
观察到KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO：4)和VPTLK-MCL1-AB1(SEQ IDNO：7)Alphabody的浓度依赖性细胞内摄入(图6和7)。该作用对于KLPVM-MCL1-AB1细胞内摄入更加明显(图7)。
在CPP5Alphabody的最高浓度上，U87.MG细胞的形态学从细长形改变成圆形细胞。大部分细胞从载玻片解离。这些形态学变化表明细胞处于非最佳形状，以及高浓度的Alphabody影响细胞的存活(图8)。
在CPP5Alphabody(50μM)的这些高浓度下，观察到细胞凋亡事件。约50％的保持附着于载玻片的细胞显示被观察为细胞凋亡小体的核崩解(图8)。特别要指出的的是，在对TRAIL处理不敏感的细胞中观察到细胞凋亡事件。这些结果表明CPP5Alphabody的MCL-1抑制性活性强至足以诱导其自身的细胞凋亡。
实施例8.CPP5Alphabody的细胞凋亡活性
为了获得关于CPP5Alphabody对细胞凋亡的诱导的定量数据，使用膜联蛋白V和PI作为细胞凋亡标志物进行流式细胞术。与通过共聚焦显微镜进行的细胞凋亡定量分析相反，流式细胞术允许分析更大量的细胞。在死亡受体配体TRAIL不存在和存在的情况下进行实验。许多论文报导了当用TRAIL敏化癌细胞时抗癌药物的细胞凋亡。选择导致20％细胞凋亡的TRAIL浓度。在添加细胞凋亡诱导药物后，细胞凋亡的百分比升高超过20％。
我们使用2个定义来定义正在经历细胞凋亡的细胞。早期细胞凋亡中的细胞被定义为膜联蛋白V阳性细胞，而晚期细胞凋亡中的细胞被定义为膜联蛋白V和PI阳性细胞。使用这2个定义分析流式细胞术数据。对MT4和U87.MG细胞进行实验。当在TRAIL不存在的情况下用40μM KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO：4)温育U87.MG细胞14小时时，相较于未处理细胞，观察到细胞凋亡百分比的急剧升高。在该body浓度上观察到超过60％的凋亡细胞。当用相同浓度的VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID NO：7)Alphabody处理细胞时，观察到不太显著的凋亡增加(图9)。该Alphabody诱导20％的细胞凋亡。该差异可通过如下方面来解释：(1)肽VPTLK相较于KLPVM的更低效的摄入，如文献中记载的(相较于KLPVM，60％的细胞内摄入)和(2)VPTLK的固有抗-细胞凋亡特征。事实上，VPTLK是Bax抑制性肽并且保护细胞免受细胞凋亡。
在TRAIL存在的情况下，CPP5Alphabody诱导细胞凋亡的浓度下降至20μM。该浓度的Alphabody在TRAIL不存在的情况下不诱导显著的细胞凋亡，而在TRAIL存在的情况下，对于KLPVM-MCL1-AB1和VPTLK-MCL1-AB1分别观察到40％和30％的细胞凋亡(图9)。
确定细胞凋亡百分比的两个定义在U87.MG细胞中给出了相同的细胞凋亡百分比。这最可能是因为大部分细胞在这些Alphabody的浓度(40μM)上和在12小时的温育时间后处于早期细胞凋亡。可以预期，如文献中描述的更长温育时间(48小时)将导致更大群体的细胞处于晚期细胞凋亡。
在400ng/ml TRAIL存在和不存在的情况下，利用10、20、40和50μM的Alphabody对人T细胞白血病细胞MT4进行相同实验。一般而言，当与U87.MG细胞相比较时，在该细胞系中观察到更低百分比的细胞凋亡。在TRAIL不存在的情况下，早期和早期细胞凋亡的百分比不同，更多细胞处于晚期细胞凋亡阶段(膜联蛋白V和PI阳性细胞)。与关于U87.MG细胞的结果相反，VPTLK诱导超过40％的细胞凋亡，而KLPVM诱导30％的细胞凋亡。TRAIL的存在导致更不显著的细胞凋亡效应，如在U87.MG细胞中观察到的(图10)。
细胞凋亡结果也展示为显示双重阴性细胞(Q3)、膜联蛋白V阳性细胞(Q1)、膜联蛋白V以及PI阳性细胞(Q2)和PI阳性(Q4)细胞的点阵图(dot plot)。直方图对应于PI阴性细胞群体的膜联蛋白V分布。当细胞凋亡发生时，膜联蛋白V阳性群体出现(P4门)(图11和12)。
结论
CPP5标记的Alphabody KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO：4)和VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID NO：7)的溶解度最高，并且在PBS中可溶的获得高度浓缩的Alphabody，所述Alphabody在高于1mM的浓度上保持溶解。两种Alphabody都与MCL-1细胞裂解物相互作用，然而，对照Alphabody tat-013(SEQ ID NO：25)未显示与Mcl-1细胞裂解物的相互作用。
这些结果显示Alphabody的B螺旋中的结合基序LRXVGDXV(SEQ IDNO：20)介导Alphabody对MCL-1的结合。
细胞穿透肽5(KLPVM(SEQ ID NO：21)和VPTLK(SEQ ID NO：22)的存在允许人T细胞白血病(MT4)和人胶质母细胞瘤细胞(U87)对Alphabody的细胞内摄入。取决于细胞类型，观察到细胞内摄入效率的差异。T细胞中的摄入效率不太高。我们还显示CPP5-MCL1Alphabody的细胞内摄入是浓度依赖性的。在更高的浓度(50μM)上和更长的温育时间下，更明确地观察到细胞凋亡。
由KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO：4)和VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID NO：7)诱导的细胞凋亡在流式细胞术中通过2个细胞凋亡标志物膜联蛋白V和PI得到确认。重要地，这些Alphabody在死亡受体配体(TRAIL)进行的细胞敏化不存在的情况下诱导达到60％的细胞凋亡。TRAIL的敏化使得能够使用更低剂量的Alphabody获得细胞凋亡。
当与KLPVM-MCL1-AB1相比较时，VPTLK-MCL1-AB1诱导更低程度的细胞凋亡。这可通过该Alphabody的效率不太高的细胞内摄入和通过该肽的固有抗-细胞凋亡性质来解释。
上述数据显示Alphabody在细胞内环境中是稳定的，这在先前从未被证明过。此外，数据显示设计特异性针对MCL-1的抑制性Alphabody(模拟BH3α-螺旋)的方法是成功的。事实上，明确地观察到对MCL-1的特异性结合以及功能活性，即敏化和细胞凋亡的诱导。
III.包含CPAB基序的ALPHABODY的细胞内摄入
实施例9.阳离子化CPAB Alphabody MB23_hiR-V5的细胞内摄入
本实施例针对时间和Alphabody浓度描述了阳离子化Alphabody在不同细胞类型(包括癌细胞和非癌细胞)中的细胞内摄入。为了研究阳离子化Alphabody的细胞内摄入能力，我们最初选择针对IL-23的Alphabody(命名为MB23)。为了保留位于A和C螺旋上的IL-23结合位点，在B螺旋中添加8个Arg，从而产生称为MB23_hiR-V5(SEQ IDNO：18)(+9的电荷)的带正电荷的Alphabody(图13)。
此外，通过研究摄入的温度依赖性、对葡糖氨基聚糖存在的依赖性和细胞培养基中血清的存在对细胞穿透的影响来探究Alphabody细胞摄入机制。
利用共聚焦显微镜研究摄入，使用识别与His-标签一起融合于Alphabody C末端的V5标签的抗V5抗体显现细胞内Alphabody。在固定的透化的细胞上进行所有实验。包括利用非透化的实验的对照实验(数据未显示)。
9.1使用的方法
利用参照阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)在8个不同的细胞系(包括6个癌细胞系和2个非癌细胞系)中针对浓度和时间研究细胞穿透。为了理解细胞内Alphabody摄入的机制，研究细胞穿透的温度依赖性、硫酸肝素依赖性和血清依赖性。
9.1.1MB23_hiR-V5的表达和纯化
阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)表达在大肠杆菌的可溶性级分中。通过Ni-NTA层析，随后通过脱盐和缓冲液交换法纯化蛋白质。将蛋白质于20mM柠檬酸pH3.0(5.3mg/ml)中贮存。
9.1.2阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5的细胞内摄入
在6个不同的癌细胞系(U87.MG、BxPC-3、H1437、SW872、MT-4和Jurkat)和3个非癌细胞系(HEK、CHO-K1和CHO.pgSA)(表1)中研究细胞内摄入。
将贴壁细胞系(U87.MG,BxPC-3,H1437,SW872,HEK,CHO-K1和CHO.pgSA)培养在DMEM+10％胎牛血清(FBS)中，并以10.000个细胞/小室接种在LabTek小室中，在37℃和5％CO2下温育过夜。第二天，用接种的细胞在37℃和5％CO2下温育阳离子化Alphabody(系列稀释或单个浓度)，进行2小时或从3.5分钟变化至48小时的不同时间。在利用Alphabody温育后，用PBS(包含Mg和Ca(DPBS))洗涤细胞4次(5分钟/洗涤)。
表1：用于细胞内摄入研究的细胞系
将悬浮细胞系(MT4和Jurkat)培养在RPMI+10％FBS中，以100.000个细胞/孔接种在96孔板中。将阳离子化Alphabody的系列稀释在37℃和5％CO2下添加至96孔板中的细胞中，进行2小时。平行地，在室温(RT)将多聚赖氨酸添加至LabTek小室进行2小时，以制备用于细胞贴壁的LabTek小室的载玻片。2小时后，洗涤细胞2次(5分钟/洗涤)，在RT将其添加至多聚-Lys涂覆的LabTek小室，进行1小时(＝细胞贴壁)。
为了显现细胞内Alphabody，在4℃用4％甲醛固定细胞10min，随后在RT用0.1％Triton X-100透化细胞15分钟。用甘氨酸(0.75g/100ml)洗涤细胞2次(10分钟/洗涤)以终止甲醛的交联，随后用DPBS洗涤(5分钟/洗涤)。
用封闭缓冲液(DPBS+1％BSA)在RT封闭细胞10分钟，随后用以1/400于封闭缓冲液中稀释的针对Alphabody的V5标签的一抗(小鼠抗-V5Ab,Invitrogen,46-0705)在RT温育1小时。用封闭缓冲液洗涤细胞3次(5分钟/洗涤)，随后添加以1/300于封闭缓冲液中稀释的第二抗体，标记有Alexa488的山羊抗-小鼠抗体(Invitrogen,A-10680)和DAPI(4”,6--二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)(细胞核染色)(1/100)，在RT进行30分钟。最后，用封闭缓冲液洗涤细胞3次(5分钟/次)，添加150ul DPBS，在Zeiss Axiovert200,LSM510Meta共聚焦显微镜上读取板。
9.2结果
9.2.1不同细胞系中阳离子化MB23_hiR-V5的细胞内摄入
在人胶质母细胞瘤细胞系U87.MG中研究始于312nM的阳离子化MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)的2倍稀释物的细胞内摄入。在Alphabody与细胞一起温育2小时后，利用抗-V5抗体和Alexa488标记的第二抗检测细胞内Alphabody。图14显示MB23_hiR-V5(312nM至1.2nM)在U87.MG细胞中的剂量依赖性摄入。弥散性荧光图案表明Alphabody的胞质定位。阳离子化MB23在人胶质母细胞瘤中的可检测的细胞内摄入的下限为4.9nM。在该浓度上，高于对照信号(无Alphabody的细胞)的荧光信号仍然可见。
在相同条件下于人胶质母细胞瘤细胞中研究对应的非阳离子化Alphabody MB23的摄入。对于非阳离子化MB23没有可检测的细胞内摄入，表明MB23_hiR-V5的摄入归因于阳离子化基序的存在(图15)。
在5个另外的癌细胞系(BxPC-3、H1437、SW872、MT-4、Jurkat)和2个非癌细胞系(HEK、CHO-K1)中研究MB23_hiR-V5(1250nM、312.5nM、156.3nM、78.1nM、39.1nM、19.5nM和9.8nM)的剂量依赖性摄入。对于所有测试的细胞类型(包括非癌细胞)都观察到剂量依赖性细胞内摄入。在4个不同的细胞系(U87.MG、BxPC-3、H1437和SW872)中在78nM的浓度上检查到阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5的细胞内摄入。阳离子化Alphabody穿透入所有分析的细胞类型，虽然程度不同(定性比较)(图16)。
在共聚焦显微镜上定性测定细胞内摄入的浓度下限，并概述于表2中。对于所有细胞系，除人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)外，测试的最低浓度为9.8nM。在测试的最低浓度上，在BxPC-3、H1437和CHO-K1细胞中检测到细胞内Alphabody。对于SW872和HEK细胞，需要更高浓度的阳离子化Alphabody来获得高于本底的荧光信号。在人T细胞白血病细胞系MT4和Jurkat中需要最高浓度的Alphabody的用于细胞内摄入。
表2：阳离子化MB23_hiR-V5在8个不同细胞系中的细胞内摄入的浓度下限
9.2.2阳离子化MB23_hiR-V5的细胞内摄入
(i)血清对MB23_hiR-V5的细胞内摄入的影响
为了测定血清的存在对细胞内摄入的影响，研究阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)的系列稀释在人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)中的细胞内摄入。在37℃在10％血清存在和不存在的情况下将Alphabody与细胞一起温育2小时。在PBS洗涤后，固定和透化细胞，利用第一抗-V5抗体和标记有Alexa488的山羊抗-小鼠二抗显现细胞内Alphabody。用DAPI对细胞核染色。总之，在无血清与10％血清条件之间在摄入效率上仅有较小的差异。摄入的差异在Alphabody的最高浓度(1250nM)上最显著(数据未显示)。
(ii)硫酸肝素和硫酸软骨素对MB23_hiR-V5的细胞内摄入的影响
通过使用缺乏硫酸肝素合成的CHO.pgsA-745细胞来研究硫酸肝素和硫酸软骨素的潜在影响。这些细胞(CHO.pgsA-745)缺乏木糖基转移酶并且在它们的细胞表面上不表达硫酸肝素和硫酸软骨素。研究阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5的稀释系列在CHO-K1和CHO.pgsA-745细胞中的细胞内摄入。在37℃于10％血清存在的情况下将Alphabody与细胞温育2小时。在对细胞进行PBS洗涤、固定和透化后，利用第一抗-V5抗体和标记有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗体显现细胞内Alphabody。用DAPI对细胞核染色。结果显示硫酸肝素/硫酸软骨素(HS/CS)缺陷型细胞的细胞内摄入未被完全消除(数据未显示)。然而，在HS/CS缺陷型细胞中摄入效率明显不太高。这表明阳离子化Alphabody的摄入部分地但非完全地依赖于带负电荷的HS/CS部分的存在。
(iii)温度对MB23_hiR-V5的细胞内摄入的影响
也在4℃研究阳离子化Alphabody的摄入，以确定阳离子化Alphabody的细胞穿透是能量依赖性过程还是不依赖于能量的过程。为此目的，研究阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)的稀释系列在人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)中的细胞内摄入。在37℃和4℃在10％血清存在的情况下将Alphabody与细胞一起温育2小时。在对细胞进行PBS洗涤、固定和透化后，使用第一抗-V5抗体和标记有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗体显现细胞内Alphabody。利用DAPI对细胞核进行染色。当比较37℃与4℃的Alphabody细胞穿透时，仅观察到较小的摄入差异(数据未显示)。这些数据表明了显著地不依赖于能量的Alphabody细胞穿透机制，其主要依赖于Alphabody通过膜的直接穿透。
9.2.3MB23_hiR-V5的细胞内摄入的动力学
为了获得阳离子化Alphabody摄入的动力学和长时间温育后细胞内Alphabody的命运的了解，在2个不同的Alphabody浓度(1250nM和500nM)上使用人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)进行利用短的(240分钟、120分钟、60分钟、30分钟、15分钟、7.5分钟、3.5分钟)和长的(48小时、24小时和12小时)Alphabody温育时间的实验(数据未显示)。
细胞内摄入的动力学对于Alphabody的两个浓度是相同的。3.5分钟后，已在细胞中检测到Alphabody。这些数据表明Alphabody至细胞内的摄入是个快速过程。阳离子化Alphabody在细胞上的长时间温育导致了细胞内Alphabody的丢失，特别地在48小时后。
9.2.4肝素洗涤对Alphabody对细胞外膜的结合的影响
在Alphabody温育后进行细胞的肝素洗涤(100U/ml)以分析(1)肝洗涤是否从细胞外膜除去Alphabody，和(2)确保观察到的细胞内Alphabody不是染色过程的人工假像(因染色处理(即细胞的固定和透化)而导致的细胞外Alphabody进入细胞)。
在Alphabody温育后，用PBS或肝素洗涤细胞，对细胞进行固定和透化或仅固定不透化(＝细胞外Alphabody染色)。在这些实验中研究2个不同浓度的Alphabody(1250nM和500nM)：
1250nM和500nM阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)在人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)中的细胞内摄入。在37℃在10％血清存在的情况下将Alphabody与U87.MG细胞一起温育2小时。在对细胞进行PBS或肝素洗涤、固定和透化/不透化后，利用第一抗-V5抗体和标记有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗体显现细胞内Alphabody。利用DAPI对细胞核染色(数据未显示)。
虽然对于肝素和PBS洗涤的细胞观察到细胞内Alphabody，但仅在PBS洗涤的细胞上看到膜结合的Alphabody。当不对细胞进行透化、从而导致细胞外Alphabody的可视化时，相较于PBS洗涤的细胞而言，对于肝素洗涤的细胞观察到更弱的Alphabody染色。
这些结果表明肝素除去细胞外膜结合的Alphabody，尽管除去不完全，并且细胞透化后检测到的细胞内Alphabody不是因实验方法而导致的内化的细胞外Alphabody技术假像。
9.2.5在除去细胞外结合的Alphabody后摄入MB23_hiR-V5的动 力学
根据先前的实验可知，肝素除去大部分细胞外结合的Alphabody。因此，使用肝素洗涤来研究MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)的摄入的动力学。该方案允许评价细胞内Alphabody的演化同时弃除大部分细胞外结合的Alphabody。记录多个细胞的细胞内摄入的图像，也记录单个细胞的细胞内摄入的图像，从而提供更详细的时间依赖性细胞内摄入的图像(图17)。
3.5分钟后，当与对照图像(无Alphabody的细胞)相比较时，存在可见的细胞内Alphabody。当用肝素洗涤细胞时，荧光信号针对时间的增加(细胞内Alphabody的增加)更加可见。
当分析单细胞图像时，荧光模式针对时间的演变变得明显。在更早的时间点上，细胞内膜染色清晰可见(达到30分钟)。30分钟后，膜染色消裉，小囊泡存在于细胞质中，进一步远离膜(图17)。
9.3结论
本实施例的结果显示阳离子化Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ IDNO：18)(在B螺旋中具有电荷)在不同细胞类型(包括癌细胞系和非癌细胞系)中以剂量依赖性方式穿透。摄入效率和摄入模式是细胞类型依赖性。
低至5至10nM的Alphabody浓度在2小时细胞温育后导致Alphabody的细胞内摄入。
阳离子化Alphabody的细胞内摄入在4℃不被消除，这表明Alphabody摄入主要通过不依赖于能量的机制，有可能依赖于细胞膜的直接穿透来驱动。
这些发现表明阳离子化Alphabody遵循不同的细胞内摄入途径。
阳离子化Alphabody的摄入过程是快速过程。3.5分钟后，Alphabody出现在细胞内部。
肝素除去大细胞外结合的Alphabody。进行使用肝素洗涤的动力学摄入实验以去除细胞外结合的Alphabody的染色。结果基本上与利用PBS洗涤获得的结果相似，但随时间过去细胞内Alphabody浓度的增加更明显。单细胞的分析显示荧光模式的演化，表明Alphabody从内细胞膜至细胞内空间内的移动(即扩散)。
实施例10.针对MCL-1的CPAB Alphabody的细胞内摄入
本实施例描述了Alphabody AB1_hiKR1-V5(SEQ ID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)(两个针对细胞内靶MCL-1的Alphabody)的细胞内摄入。这些Alphabody被设计来通过阳离子化(即，通过用Arg/Lys氨基酸残基修饰)进行细胞内摄入。如下文中所述，已显示这些Alphabody在存活测定(特别地T细胞白血病细胞(MT4)的存活测定)中能够在48小时后诱发细胞死亡。
10.1使用的方法
在一组癌细胞系和非癌细胞系中针对Alphabody浓度研究Alphabody AB1_hiKR1-V5(SEQ ID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQID NO：16)的细胞内摄入。利用共聚焦显微镜研究摄入，使用识别Alphabody的C末端V5标签的抗-V5抗体显现细胞内Alphabody。在固定的和透化的细胞上进行所有实验。包括无透化实验的对照实验。
这些Alphabody在B螺旋中包含MCL-1结合位点，并且显示不同的阳离子化模式，如图18中显示的。将Lys和Arg残基用于修饰Alphabody，从而对于AB1_hiKR1-V5和AB1_A2aF_hiKR3-V5分别导致+11和+19的净电荷。Alphabody AB1_A2aF_hiKR3-V5被设计来提供更好的核心堆叠。AB1_A2aF_hiKR3-V5与AB1_hiKR3-V5之间的其它差异是对于A2aF变体而言更短的环1序列和更长的His-标签(图18)。
在8个不同的细胞系(包括6个癌细胞系和2非癌细胞系)中研究针对浓度的细胞穿透。
10.1.1AB1_hiKR1-V5和AB1_A2aF_hiKR3-V5的表达和纯化
阳离子化Alphabody AB1_hiKR1-V5(SEQ ID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)在大肠杆菌的可溶性级分中表达。通过Ni-NTA层析，随后进行脱盐和缓冲液交换法来纯化蛋白质。将蛋白质贮存于20mM柠檬酸pH3.0(对于AB1_hiKR1-V5为2.8mg/ml，对于AB1_A2aF_hiKR3-V5为3.9mg/ml)中。
10.1.2阳离子化Alphabody AB1_hiKR1-V5和 AB1_A2aF_hiKR3-V5的细胞内摄入
在6个不同的癌细胞系(U87.MG、BxPC-3、H1437、SW872、MT-4和Jurkat)和2个非癌细胞系(HEK、CHO-K1)中研究细胞内摄入(表3)。
将贴壁细胞系(U87.MG,BxPC-3,H1437,SW872,HEK,CHO-K1和CHO.pgSA)在DMEM+10％胎牛血清(FBS)中进行培养，以10.000个细胞/小室接种LabTek小室，在37℃和5％CO2下温育过夜。第二天，在37℃和5％CO2下将阳离子化Alphabody(系列稀释或单个浓度)与接种的细胞一起温育2小时或从3.5分钟变化至48小时的不同时期。在用Alphabody温育后，用PBS(包含Mg和Ca(DPBS))洗涤细胞4次(5分钟/洗涤)。
表3：用于细胞内摄入研究的细胞系
将悬浮细胞系(MT4和Jurkat)在RPMI+10％FBS中进行培养，和以100.000个细胞/孔接种在96孔板中。将阳离子化Alphabody的稀释系列在37℃和5％CO2下添加至96孔板内的细胞中，进行2小时。平行地，在室温(RT)将多聚赖氨酸添加至LabTek小室进行2小时，以制备用于细胞贴壁的LabTek小室的载玻片。2小时后，洗涤细胞2次(5分钟/洗涤)，在RT将其添加至多聚-Lys涂覆的LabTek小室，进行1小时(＝细胞贴壁)。
为了显现细胞内Alphabody，在4℃用4％甲醛固定细胞10min，随后在RT用0.1％Triton X-100透化细胞15分钟。用甘氨酸(0.75g/100ml)洗涤细胞2次(10分钟/洗涤)以终止甲醛的交联，随后用DPBS洗涤(5分钟/洗涤)。
用封闭缓冲液(DPBS+1％BSA)在RT封闭细胞10分钟，随后用以1/400于封闭缓冲液中稀释的针对Alphabody的V5标签的一抗(小鼠抗-V5Ab,Invitrogen,46-0705)在RT温育1小时。用封闭缓冲液洗涤细胞3次(5分钟/洗涤)，随后添加以1/300于封闭缓冲液中稀释的第二抗体，即标记有Alexa488的山羊抗-小鼠抗体(Invitrogen,A-10680)和DAPI(4”,6--二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)(细胞核染色)(1/100)，在RT进行30分钟。最后，用封闭缓冲液洗涤细胞3次(5分钟/次)，添加150ul DPBS，在Zeiss Axiovert200,LSM510Meta共聚焦显微镜上读取板。
10.2结果
10.2.1AB1_hiKR1-V5和AB1_A2aF_hiKR3-V5在人胶质母细胞瘤 细胞U87.MG中的细胞内摄入
在人胶质母细胞瘤细胞中研究一系列浓度的AB1_hiKR1-V5(SEQID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)的细胞内摄入。在Alphabody与细胞温育2小时后，利用抗-V5抗体和第二Alexa488标记的抗体检测细胞内Alphabody。
对于阳离子化AB1Alphabody观察到剂量依赖性摄入(图19)。
根据单细胞的图像定性测定AB1_hiKR1-V5和AB1_A2aF_hiKR3-V5的细胞内摄入浓度下限，其分别对应于39.1nM和19.5nM。在这些浓度上，高于对照信号(无Alphabody的细胞)的荧光信号仍然可见。
10.2.2AB1_hiKR1-V5和AB1_A2aF_hiKR3-V5在不同细胞系中的 细胞内摄入
在2个非癌细胞系(HEK、CHO-K1)和6个另外的癌细胞系(U87.MG、BxPC-3、H1437、SW872、MT-4、Jurkat)(图19和表4)中研究AB1_hiKR1-V5(SEQ ID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)(1250nM、312.5nM、156.3nM、78.1nM、39.1nM、19.5nM和9.8nM)的剂量依赖性摄入。在相同的浓度下在相同的细胞中以定性的方式(共聚焦显微镜图像的目视比较)比较AB1_A2aF_hiKR3-V5的细胞内摄入与MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)的细胞内摄入。
对于所有测试的细胞类型观察到剂量依赖性细胞内摄入。在人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)(图19)和脂肪肉瘤细胞(SW872)(数据未显示)中观察到极高效的摄入。
AB1_A2aF_hiKR3-V5和MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)的摄入效率在某些测试的细胞类型之间不同。AB1_A2aF_hiKR3-V5的细胞内摄入的浓度下限通过分析单细胞图像来定性测定。结果概述于表4中。变得清楚的是对于SW872和HEK细胞仅需要低浓度的Alphabody(9.8nM)就可观察到细胞内蛋白。对于U87.MG、BxPC-3、H1437、MT4、CHO-K1细胞和Jurkat T细胞白血病细胞(表4)需要更高浓度的Alphabody来获得高于本底的荧光信号。
表4：阳离子化AlphabodyMB23_hiR-V5和AB1_A2aF_hiKR3-V5在8个不同细胞系中的细胞内摄入的浓度下限
10.2.3肝素洗涤对B1_A2aF_hiKR3-V5的细胞内摄入的作用
使用肝素洗涤(以除去细胞外结合的Alphabody)在3个不同的癌细胞系中研究AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)的细胞内摄入。将细胞与对于相同细胞系使用PBS洗涤的细胞内摄入结果相比较。
取决于细胞类型，在用肝素洗涤后膜染色部分或完全消失，这表明存在于细胞外细胞表面上的过量Alphabody可被除去(数据未显示)。
10.2.4AB1_A2aF_hiKR3-V5摄入的肝素洗涤的作用和动力学
使用肝素洗涤进行AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)在人胶质母细胞瘤细胞中的细胞内摄入的动力学。3.5分钟后，Alphabody出现在细胞内部，180分钟(测量的最长温育时间)后荧光信号最大(图20)。当分析单细胞图橡(数据未显示)时，细胞内摄入的演化是最可见到的。针对温育时间观察到荧光信号的增强。在短的温育时间上，Alphabody主要存在于细胞内膜附近，当温育时间延长时远离膜移动。
10.3结论
在不同细胞类型(包括癌细胞和非癌细胞系)中，阳离子化MCL-1Alphabody(在A和C螺旋中具有电荷)以剂量依赖性方式穿透。
获得的关于MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：7)和2个MCL-1Alphabody(AB1_hiKR1-V5和AB1_A2aF_hiKR3-V5)在人胶质母细胞瘤细胞中的摄入的数据表明AB1_A2aF_hiKR3-V5的摄入效率高于MB23_hiR-V5的摄入效率，MB23_hiR-V5又高于AB1_hiKR1-V5的摄入效率。这些数据表明摄入效率并非单由电荷数目决定的。事实上，MB23_hiR-V5具有9个净电荷，而AB1_hiKR1-V5具有11个净电荷。
AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)的细胞内摄入似乎是细胞类型依赖性的。事实上，虽然Alphabody被几乎所有测试的细胞类型内化，但效率不同。如对于MB23_hiR-V5观察到的，细胞内摄入在人T细胞白血病细胞中更低。在另一方面，癌细胞系SW872和U87.MG中的摄入是高效的。
类似地，MB23_hiR-V5的摄入效率似乎是细胞类型依赖性的。对于一些测试的细胞类型，特别地对于BxPC-3和CHO-K1细胞，观察到差异。这些数据确认了摄入效率不仅与净正电荷相关，而且还与电荷在Alphabody上的分布相关。
与MB23_hiR-V5的细胞摄入类似，阳离子化MCL-1Alphabody的摄入过程是快速过程。3.5分钟后，Alphabody出现在细胞内部。单细胞的分析显示荧光模式的演化，从而显示了Alphabody离开内细胞膜向细胞内空间的扩散或散布(如对于MB23_hiR-V5观察到的)。
实施例11.利用特异性针对MCL-1的CPAB AlphabodyAB1_hiKR1-V5(SEQ ID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)的肿瘤细胞存活研究
本实施例描述了MCL-1Alphabody对癌细胞和非癌细胞系的存活的作用。一般而言，MCL-1与BAK之间的相互作用的抑制导致BAK的释放和线粒体外膜孔(MOMP)的形成(通过BAK/BAX同和/或异二聚化)以及最终细胞的凋亡。用针对MCL-1的Alphabody和缺乏对MCL-1的结合位点的对照Alphabody处理一组癌细胞系，使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑2-基)-2,5--二苯基溴化四唑)监测细胞存活。
11.1使用的方法
关于Alphabody对癌细胞存活的影响，我们集中在两个MCL1结合性Alphabody，即AB1_hiKR1-V5(SEQ ID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)上。这些Alphabody在B螺旋中包含MCL-1结合位点，并且显示不同的阳离子化模式，如图18中显示的。Lys和Arg残基用于修饰Alphabody，从而对于AB1_hiKR1-V5和AB1_A2aF_hiKR3-V5分别导致+11和+19的净电荷。
在7个不同的细胞系(包括6个癌细胞系MT4、Jurkat、SW872、H1437、BxPC3、U87.MG)中针对浓度研究细胞存活。还对原代细胞(PBMC)研究Alphabody对细胞死亡的诱导。
11.1.1AB1_hiKR1-V5和AB1_A2aF_hiKR3-V5的表达和纯化
如实施例2中所述表达和纯化阳离子化AlphabodyAB1_hiKR1-V5(SEQ ID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)。
11.1.2细胞存活测定
在6个不同癌细胞系(U87.MG、BxPC-3、H1437、SW872、MT-4和Jurkat)(表5)中研究细胞存活。也在获自健康供体的原代细胞(PBMC)中研究Alphabody对存活的作用。
将贴壁细胞系(U87.MG、BxPC-3、H1437、SW872)于DMEM或RPMI+10％胎牛血清(FBS)中进行培养，接种于96孔板中，在37℃和5％CO2下温育过夜。第二天，将阳离子化Alphabody(稀释系列)与接种的细胞于无胎牛血清(FBS)的Opti-MEM细胞培养基中温育2小时。将悬浮细胞系(MT4和Jurkat)于无FBS的Opti-MEM细胞培养基中接种于96孔板中，所述细胞系包含系列稀释的Alphabody，并于37℃和5％CO2下温育2小时。从健康供体分离PBMC，将其在含有10％FBS和IL-2的RPMI中进行培养。
2小时后，添加具有FBS的Opti-MEM以获得10％FBS的终浓度，将细胞在37℃和5％CO2下温育48小时。使用MTT监测细胞存活。MTT被活细胞还原成甲臜。甲臜晶体的增溶作用导致可在540nm利用分光光度法测量的有色产物。细胞存活表达为非处理细胞(＝100％存活)的存活的百分比。以一式三份进行所有实验。数据表达为平均值+标准差。
表5：用于细胞存活研究的细胞系
11.2结果
11.2.1MCL-1Alphabody对血液癌细胞系的细胞存活的作用
在人T细胞白血病细胞系MT4和Jurkat中研究阳离子化MCL-1Alphabody AB1_hiKR1-V5(SEQ ID NO：14)和AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQID NO：16)对细胞存活的作用。
阳离子化Alphabody AB1_A2aF_hiKR3-V5诱导MT4细胞的剂量依赖性细胞死亡，在10μM Alphabody下几乎完全消除细胞存活。AB1_hiKR1-V5Alphabody的效力不太强。对照AlphabodyKLPVM-scAB013-V5和MB23_hiR-V5对细胞存活没有影响，即100％的细胞即使在最高浓度下也是有活力的(图21)。对于Jurkat细胞，两种MCL-1Alphabody的效力稍弱。对于AB1_A2aF_hiKR3-V5和AB1_hiKR1-V5，利用最高浓度Alphabody的处理分别导致60％和40％的细胞死亡(图22)。对于MT4和Jurkat细胞，存活数据与AB1_A2aF_hiKR3-V5的细胞内摄入效率一致。该Alphabody在MT4细胞中相较于Jurkat细胞(数据未显示)显示更显著的细胞内摄入。
11.2.2MCL-1Alphabody对不同癌细胞系的细胞存活的作用
(i)人脂肪肉瘤细胞(SW872)
Alphabody AB1_A2aF_hiKR3-V5和AB1_hiKR1-V5诱导人脂肪肉瘤细胞的剂量依赖性细胞死亡，尽管处于低百分比水平(数据未显示)。在测试的Alphabody的最高浓度上，对于AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ IDNO：16)和AB1_hiKR1(SEQ ID NO：14)分别测量出40％和30％的细胞死亡。对照Alphabody MB23_hiR-V5在10μM诱导10％的细胞死亡。AB1_A2aF_hiKR3-V5和对照Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)都被SW872细胞摄入(数据未显示和图16)。
(ii)人非小细胞肺癌细胞(H1437)
Alphabody AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)诱导非小细胞肺癌细胞(H1437)的剂量依赖性细胞死亡(数据未显示)。所测试的最高浓度Alphabody(10μM)诱导50％的细胞死亡。对照Alphabody(MB23_hiR-V5)和AB1_hiKR1-V5在10μM诱导15％的细胞死亡。相较于对照MB23_hiR-V5，AB1_A2aF_hiKR3-V5被H1437细胞摄入的效率较低(图16)。
(iii)人胰腺癌细胞(BxPC-3)
Alphabody AB1_A2aF_hiKR3-V5诱导人胰腺癌细胞(BxPC-3)的剂量依赖性细胞死亡(数据未显示)。测试的最高浓度Alphabody(10μM)诱导60％的细胞死亡。10μM的对照Alphabody(KLPVM-scAB013-V5)和AB1_hiKR1-V5分别诱导30％和35％的细胞死亡。AlphabodyA2aF_hiKR3-V5被摄入BxPC-3细胞(数据未显示)。
(iv)人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)
Alphabody AB1_A2aF_hiKR3-V5和AB1_hiKR1-V5诱导人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)的剂量依赖性细胞死亡(数据未显示)。两种测试的最高浓度Alphabody(10μM)诱导35％的细胞死亡。对照AlphabodyKLPVM-scAB013-V5对细胞存活几无影响。Alphabody A2aF_hiKR3-V5被高效地摄入U87.MG细胞(图19)。
11.2.3MCL-1Alphabody对非癌细胞系的细胞存活的作用
(i)PBMC
Alphabody AB1_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO：16)在10μM诱导35％的PBMC的细胞死亡(图23)。其它测试的Alphabody未诱导PBMC的细胞死亡。
11.3结论
MCL-1结合性Alphabody对细胞死亡的诱导似乎是细胞类型依赖性的，并且对血液癌细胞系MT4的作用最显著。对于该细胞系，10μM AB1_A2aF_hiKR3-V5在48小时后诱导完全细胞死亡。AlphabodyAB1_A2aF_hiKR3-V5相较于其它MCL-1Alphabody(AB1_hiKR1-V5)对细胞存活具有更大作用。
尽管MT4和Jurkat细胞都是T细胞白血病细胞，但MCL-1Alphabody对这些细胞的行为不同：Alphabody对MT4细胞相较于Jurkat细胞更有效力。这些数据表明这些癌细胞系的不同存活机制。
当将不同细胞系的易感性与AB1_A2aF_hiKR3-V5的细胞死亡诱导作用相比较时，可建立下列MCL-1Alphabody的敏感性顺序：MT4>Jurkat＝BxPC-3>H1437＝SW872>U87.MG，其中MT4细胞最易感。
摄入效力与细胞死亡诱导无关。被不同细胞系非常高效地摄入的对照Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)不诱导细胞死亡，表明内化的Alphabody对细胞无毒。在另一方面，AB1_A2aF_hiKR3-V5被U87.MG细胞高效摄入，然而这不导致最佳细胞杀伤活性。.
实施例12.特异性针对BCL-2蛋白家族的不同成员的CPABAlphabody AB1_pan_hiKR3-V5
本实施例描述了Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5(SEQ ID NO：27)的设计和结合活性，其蛋白质序列示于图24中。该Alphabody被设计用于通过阳离子化(即通过利用Arg/Lys氨基酸残基的修饰)进行细胞内摄入，和特异性结合3种不同的细胞内靶蛋白即MCL-1、BCL-XL和BCL-2a。
12.1使用的方法
12.1.1重组细胞内靶蛋白的产生和纯化
重组人BCL-2家族蛋白在大肠杆菌中以在蛋白的N末端具有GST标签的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白形式生产。对于所有蛋白，除去C末端Tm(跨膜)区。产生下列重组蛋白：具有24个氨基酸的C末端缺失的BCL-XL、具有32个氨基酸的C末端缺失的BCL-2的同种型α(BCL-2a)。为了产生MCL-1，缺失N末端PEST区(包含用于蛋白的快速降解的信号的区域)和C末端Tm区，重组MCL-1对应于人MCL-1的残基172至327。使用GST-标签纯化所有蛋白。
12.1.2ELISA测定
在4℃用100microl抗-V5抗体(5μg/ml)于碳酸盐缓冲液pH9.6涂覆Maxisorp Nunc板过夜。第二天，用包含0.05％Tween20(TBST)的Tris缓冲盐溶液洗涤板3次，在37℃用包含0.1％BSA和0.5％明胶的TBS封闭2小时。在用TBST洗涤板5次后，在振荡的条件下，在RT将500nM AB1_pan_hiKR3-V5Alphabody添加至板进行2小时。用TBST洗涤板10次，添加谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记的重组BCL-2家族蛋白(MCL-1、BCL-XL和BCL-2a)的5倍稀释物，在振荡的条件下在RT进一步温育2小时。使用缀合有辣根过氧化物酶的抗-GST抗体检测GST-标记的重组BCL-2家族蛋白的结合。通过与邻苯二胺反应来产生信号，当OD达到2至3的值时，用4M H2SO4终止反应。在492nm和630nm读取表示AB1_pan_hiKR3-V5对特定BCL-2家族重组蛋白的特异性结合的信号。
12.2结果
图25和26显示Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5能够以剂量依赖性方式特异性结合不同类型的BCL-2家族成员。事实上，AB1_pan_hiKR3-V5以约1.9nM的结合亲和力特异性结合MCL-1(图25和26A)。也如图26A中显示的，先前实施例中描述的AlphabodyAB1_A2aF_hiKR3-V5也是针对MCL-1的并且以1.0nM的结合亲和力特异性结合该细胞内蛋白。针对不是细胞内蛋白的IL-23的对照Alphabody MB23_hiR-V5未显示对MCL-1的结合。
如图25和26中进一步举例说明的，AB1_pan_hiKR3-V5以剂量依赖性方式特异性结合两种其它细胞内蛋白即BCL-XL和BCL-2a，结合亲和力分别约为4.5和18.7nM(图26B和26C)。相反地，先前实施例中描述的并且针对MCL-1特异性设计的AlphabodyAB1_A2aF_hiKR3-V5以及针对IL-23的对照Alphabody MB23_hiR-V5均未显示对BCL-XL或BCL-2a中任一者的特异性结合(图26B和26C)。
12.3结论
阳离子化Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5(SEQ ID NO：27)(在A和C螺旋中具有正电荷)以高亲和力特异性结合3种不同的细胞内蛋白。
实施例13.CPAB Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5的细胞内摄入
13.1使用的方法
在人胶质母细胞细胞(U87.MG)中针对Alphabody浓度研究Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5(SEQ ID NO：27)的细胞内摄入。利用共聚焦显微镜研究摄入，使用识别Alphabody的C末端V5标签的抗-V5抗体显现细胞内Alphabody。对固定和透化的细胞进行所有实验。包括利用未透化的细胞的对照实验。
该Alphabody通过存在于其B螺旋上的结合位点结合BCL-2家族的3种不同细胞内蛋白，并且在其A-螺旋和其C-螺旋上显示不同的阳离子化模式，如图24中显示的。事实上，Lys和Arg残基用于修饰Alphabody和设计带正电荷的内化区域。
13.1.1阳离子化Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5的表达和纯化
阳离子化Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5(SEQ ID NO：27)在大肠杆菌的可溶性级分中表达。通过Ni-NTA层析，随后进行脱盐和缓冲液交换法来纯化蛋白质。将蛋白于20mM柠檬酸pH3.0中贮存。
13.1.2阳离子化Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5的细胞内摄入
在人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)中研究AB1_pan_hiKR3-V5(SEQID NO：27)的细胞内摄入，将细胞于DMEM+10％胎牛血清(FBS)中进行培养，以10.000个细胞/小室接种在LabTek小室中，在37℃和5％CO2下温育过夜。第二天，在37℃和5％CO2下将阳离子化Alphabody(稀释系列)与接种的细胞一起温育2小时。在用Alphabody温育后，用PBS(包含Mg和Ca(DPBS))洗涤细胞4次(5分钟/洗涤)。
为了显现细胞内Alphabody，在4℃用4％甲醛固定细胞10min，随后在RT用0.1％Triton X-100透化细胞15分钟。用甘氨酸(0.75g/100ml)洗涤细胞2次(10分钟/洗涤)以终止甲醛的交联，随后用DPBS洗涤(5分钟/洗涤)。
用封闭缓冲液(DPBS+1％BSA)在RT封闭细胞10分钟，随后用以1/400于封闭缓冲液中稀释的针对Alphabody的V5标签的一抗(小鼠抗-V5Ab,Invitrogen,46-0705)在RT温育1小时。用封闭缓冲液洗涤细胞3次(5分钟/洗涤)，随后添加以1/300于封闭缓冲液中稀释的第二抗体，即标记有Alexa488的山羊抗-小鼠抗体(Invitrogen,A-10680)，以及DAPI(4”,6--二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)(细胞核染色)(1/100)，在RT进行30分钟。最后，用封闭缓冲液洗涤细胞3次(5分钟/次)，添加150ul DPBS，在Zeiss Axiovert200,LSM510Meta共聚焦显微镜上读取板。
13.2结果
13.2.1AB1_pan_hiKR3-V5在人胶质瘤细胞U87.MG中的细胞内摄 入
在人胶质母细胞瘤细胞中研究一系列浓度的AB1_pan_hiKR3-V5(SEQ ID NO：27)的细胞内摄入。在Alphabody与细胞一起温育2小时后，利用抗-V5抗体和Alexa488标记的第二抗检测细胞内Alphabody。
观察到剂量反应依赖性摄入(数据未显示)。根据单个细胞的图像定性测定AB1_pan_hiKR3-V5的细胞内摄入的浓度下限，其对应于156nM。在该浓度上，可看到比对照信号(无Alphabody的细胞)更高的荧光信号。
13.3结论
阳离子化Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5(SEQ ID NO：27)(在A和C螺旋内具有正电荷)能够以剂量依赖性方式穿透细胞。
实施例14.利用特异性针对3种不同细胞内靶蛋白即MCL-1、BCL-XL和BCL-2a的CPAB Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5的肿瘤细胞存活研究
本实施例描述了特异性结合BCL-2蛋白家族的3个不同成员的CPAB Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5(SEQ ID NO：27)对两个癌细胞系的存活的作用。用Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5和阴性对照Alphabody MB23_hiR-V5处理人胶质瘤细胞(U87.MG)和人T细胞白血病细胞(MT4)，使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑2-基)-2,5--二苯基溴化四唑)监测细胞存活。
14.1使用的方法
阳离子化Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5(SEQ ID NO：27)通过存在于其B-螺旋上的结合位点结合BCL-2家族的3种不同细胞内蛋白，并且在其A-螺旋和其C-螺旋中显示不同的阳离子化模式，如图24中显示的。事实上，Lys和Arg残基用于修饰Alphabody和设计带正电荷的内化区域。
14.1.1AB1_pan_hiKR3-V5的表达和纯化
如实施例2中所述表达和纯化阳离子化AlphabodyAB1_pan_hiKR3-V5(SEQ ID NO：27)。
14.1.2细胞存活测定
在癌细胞系U87.MG(人胶质瘤细胞)和MT4(人T细胞白血病细胞)中研究细胞存活。将U87.MG和MT4细胞在DMEM或RPMI+10％胎牛血清(FBS)中进行培养，接种在96孔板中，在37℃和5％CO2下温育过夜。第二天，将阳离子化Alphabody(稀释系列)与接种的细胞一起在无胎牛血清(FBS)的Opti-MEM细胞培养基中温育2小时。2小时后，添加具有FBS的Opti-MEM以获得10％FBS的终浓度，将细胞在37℃和5％CO2下温育48小时。使用MTT监测细胞存活。MTT被活细胞还原成甲臜。甲臜晶体的增溶作用导致可在540nm利用分光光度法测量的有色产物。细胞存活表达为非处理细胞(＝100％存活)的存活的百分比。以一式三份进行所有实验。
14.2结果
在人胶质瘤细胞(U87.MG)(数据未显示)和人T细胞白血病细胞(MT4)(图27中显示的结果)中研究阳离子化AlphabodyAB1_pan_hiKR3-V5(SEQ ID NO：27)对细胞存活的作用。
Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5在人胶质母细胞瘤细胞(U87.MG)和人T细胞白血病细胞(MT4)中诱导剂量依赖性细胞死亡。U87.MG细胞的细胞存活在超过1μM的AB1_pan_hiKR3-V5浓度下减少，在10μM AB1_pan_hiKR3-V5的浓度下减少至56％。阴性对照AlphabodyMB23_hiR-V5(SEQ ID NO：18)显示对U87.MG细胞存活没有显著作用，即约100％的细胞即使在最高浓度下仍然保持活力。如图27中显示的，Alphabody AB1_pan_hiKR3-V5在人T细胞白血病细胞(MT4)中诱导甚至更多细胞死亡。MT4细胞的细胞存活在超过2.5μM的AB1_pan_hiKR3-V5浓度下减少，在10μM AB1_pan_hiKR3-V5的浓度下减少至仅8％。对于阴性对照Alphabody MB23_hiR-V5，约100％的MT4细胞在达到5μM的浓度下仍然存活，在10μM的最高浓度下仅观察到18％的存活减少。
总结论
如根据实施例9至14中获得的结果将明确的，CPAB多肽和CPABAlphabody在低nM范围的浓度上被多种肿瘤细胞系快速摄入。该摄入是剂量依赖性的，并且在很大程度上是不依赖于能量的(即通过直接转导)。已显示本文中公开的具有抗-MCL1、抗-BCL-XL和抗-BCL-2a活性的多肽：(i)有效地穿透癌细胞，(ii)特异性结合选自MCL-1、BCL-XL和BCL-2a中的一种或多种细胞内靶分子，和(iii)激发显著的生物学效应，即细胞凋亡的诱导。
这些结果表明，本文中设想的多肽显示在寻找细胞内靶、用于预防性、治疗性或诊断目的以及用于筛选和检测方面具有优于其它已知方法的明确竞争性优势。

Claims (13)

1.一种包含至少一个Alphabody或基本上由其组成的多肽，其中所述多肽能够被内化入细胞并且其中所述Alphabody特异性结合所述细胞内的细胞内靶分子。
2.权利要求1的多肽，其中所述Alphabody与允许至细胞内的内化的至少一个基团、部分、蛋白质或肽融合或用其缀合。
3.权利要求2的多肽，其中所述至少一个Alphabody缀合于细胞穿透肽(CPP)，优选地TAT或CPP5。
4.权利要求1的多肽，其中所述至少一个Alphabody包含一个或多个内化区域，所述内化区域含有所述至少一个Alphabody内的氨基酸残基基序或氨基酸残基模式。
5.权利要求4的多肽，其中所述内化区域是包含至少6个带正电荷的氨基酸残基的16个氨基酸的序列。
6.权利要求1至5中任一项的多肽，其中所述至少一个Alphabody主要通过存在于所述Alphabody的至少一个α-螺旋内的结合位点特异性结合所述细胞内靶分子。
7.权利要求1至6中任一项的多肽，其中所述细胞内靶分子是细胞凋亡或抗-细胞凋亡蛋白。
8.权利要求1至7中任一项的多肽，其中所述细胞内靶分子是BCL-2蛋白家族的抗-细胞凋亡成员。
9.权利要求8的多肽，其中所述BCL-2蛋白家族的抗-细胞凋亡成员选自MCL-1、BCL-2、BCL-2a、BCL-XL、BCL-w和BFL-1/A1。
10.权利要求1至9中任一项的多肽，其用作药剂。
11.权利要求1至10中任一项的多肽，其用于治疗疾病或障碍的方法中，所述疾病或障碍与其中牵涉所述细胞内靶分子的生物学途径或生物学相互作用相关。
12.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1至11中任一项中定义的多肽和任选地一种或多种药学上可接受的载体。
13.一种生产权利要求1至12中任一项中定义的一种或多种多肽的方法，所述方法至少包括如下步骤：
a)产生包含至少一个Alphabody或基本上由其组成的一种或多种多肽，所述多肽经修饰而允许所述多肽内化入所述细胞，
b)测试所述多肽对于所述细胞内靶分子是否具有可检测的结合亲和力，和任选地
c)分离所述一种或多种多肽。
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