CN104151248A - 双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针及其合成方法和应用。该阳离子型荧光探针的结构式为

Description

双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于氨基酸的检测技术领域，具体涉及一种在水中测定氨基酸的荧光探针及其合成方法和检测方法。
背景技术
氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，对生物化学和整个生命科学研究以及产品开发、质量控制和生产管理等具有重要意义。因此，氨基酸分析是工业、医药、农业生产、食品加工及生命科学研究中十分重要的技术之一。其中天冬氨酸通过脱氨生成草酰乙酸而促进三羧酸循环，并且与鸟氨酸循环密切相关，担负着使血液中的氨转变为尿素排泄出去的部分工作。同时，天冬氨酸还是合成乳清酸等核酸前体物质的原料，可作为K+、Mg2+离子的载体向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用。谷氨酸和天冬氨酸具有兴奋性递质作用，当谷氨酸含量达9％时，只要增加10～15mol的谷氨酸就可对皮层神经元产生兴奋性影响。因此，谷氨酸对改进和维持脑功能必不可少。谷氨酸也可用于治疗肝昏迷等症，谷氨酸、天冬氨酸主要用于治疗肝病疾病、消化道疾病、脑病、心血管病、呼吸道疾病以及用于提高肌肉活力、儿科营养和解毒等。此外氨基酸衍生物给癌症治疗上带来了希望。由此可见，氨基酸在人体生命活动中十分重要。
目前，有关氨基酸分离与测定的方法正在不断发展与完善之中，包括化学法、分光光度法、色谱法、毛细管电泳法及其它方法。但是化学法试剂耗量多，测定周期长。分光光度法操作简单、时间短，但是误差大、计算繁琐。色谱法仪器复杂、价格昂贵、用途单一、分析时间较长(目前约减至1小时)、破坏氨基酸的固有结构、灵敏度相对较低。而荧光化学传感器由于其具有制备简单、易于操作、灵敏度高、选择性好及可用于体外或活体测量、实时在线检测，能够成像和输出信号丰富(比如：荧光强度、最大发射波长、光谱形貌、荧光寿命和荧光各向异性等)等优点，采用荧光化学传感器对氨基酸进行检测，则可以很好地解决上述问题。杨清正小组将荧光物种氟硼二吡咯(BODIPY)在乙腈-水混合溶液中实现对半胱氨酸(Cys)的高灵敏传感。Xiaoming Feng等人用手性联二萘酚(BINOL)作为荧光化学传感器实现了在乙腈-水的混合溶液中对谷胱甘肽和半胱氨酸的检测。Chengjian Zhu小组制备了一种与Zn2+一比一配位的聚合物为荧光探针分子实现了在四氢呋喃中对具有手性异构体的丙氨酸区分检测，然而这些传感器只能在有机溶剂和水的混合溶液中进行检测，然而实现在水中对氨基酸的检测具有十分重要的意义。同时对天冬氨酸和谷氨酸的荧光识别检测鲜为报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述氨基酸检测技术的缺点，提供一种灵敏度高、选择性好、测试范围广且可实现水溶液中检测氨基酸的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针，并为该荧光探针提供一种合成方法，以及合成的荧光探针在检测天冬氨酸或谷氨酸中的应用。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：该荧光探针的结构式如下所示：
上述双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针的合成方法由下述步骤组成：
1、合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺
以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，将二乙烯三胺与叔丁基苯基碳酸酯、三乙胺按摩尔比为3.2～5:8～12:1，在氮气保护、冰浴条件下搅拌12～24小时，分离纯化产物，得到式Ⅰ所示的两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺。
2、合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物
以三氯甲烷为溶剂，将两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺、丹磺酰氯、三乙胺按摩尔比为1～1.5:1:2～3.5，在氮气保护、常温条件下搅拌12～36小时，所得反应液用饱和食盐水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，蒸除三氯甲烷，依次用正己烷与乙酸乙酯的体积比为5～8:1的混合物、正己烷与乙酸乙酯的体积比为1:1的混合物、二氯甲烷和甲醇的体积比为50～60:1的混合物作为洗脱液柱层析纯化产物，得到式Ⅱ所示的两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物。
3、合成两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物
以二氯甲烷为溶剂，将两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、三氟醋酸按摩尔比为1:80～90，在氮气保护、冰浴条件下搅拌12～24小时，蒸除二氯甲烷，加入蒸馏水溶解，然后用饱和碳酸钠水溶液调节pH至9～11，用三氯甲烷萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，蒸除三氯甲烷，真空干燥，得到式Ⅲ所示的两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物。
4、合成两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物
以三氯甲烷为溶剂，将两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、溴乙酰溴、三乙胺按摩尔比为1:2.5～4:25～27，在氮气保护、冰浴条件下搅拌36～48小时，所得反应液用去离子水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，蒸除三氯甲烷，用石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:3～5的混合液作为洗脱柱层析纯化产物，真空干燥，得到式Ⅳ所示的两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物。
5、合成双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针
以四氢呋喃为溶剂，将两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、N-甲基咪唑按摩尔比为1:4～6，在氮气保护下加热回流48～72小时，抽滤，所得固体在丙酮中加热回流8～12小时，抽滤，用乙醚淋洗，得到双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针。
本发明的合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物步骤2中，两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺、丹磺酰氯、三乙胺摩尔比优选为1～1.3:1:2.5～3。
本发明的合成两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物步骤4中，两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、溴乙酰溴、三乙胺的摩尔比优选为1:3～3.5:25～27。
本发明的合成双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针步骤5中，两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、N-甲基咪唑的摩尔比优选为1:4～5。
上述的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针在检测氨基酸中的用途，所述的氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸，其检测方法如下：
将双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针溶于10mmol/L十二烷基硫酸钠水溶液中，配制成10μmol/L双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针溶液；向10μmol/L双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针溶液中加入天冬氨酸或谷氨酸，使所得溶液中天冬氨酸的浓度为80～400μmol/L或谷氨酸的浓度为150～500μmol/L，用荧光仪测量荧光强度，绘制相同波长下I0/I-1值随天冬氨酸或谷氨酸浓度变化的标准曲线；按照上述方法用荧光仪测量待测氨基酸样品的荧光强度，根据待测氨基酸样品的I0/I-1值和浓度，结合标准曲线的线性方程即可确定天冬氨酸或谷氨酸。
本发明双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针的水溶性好、化学稳定性好、响应速度快、灵敏度高、选择性好，可直接用荧光仪器进行检测，如FLS920型号的单光子计数时间分辨荧光光谱仪或其他类似的光学检测仪器，实现对天冬氨酸或谷氨酸的高灵敏度、低检出限检测。
附图说明
图1是双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针检测天冬氨酸的荧光强度变化曲线图。
图2是双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针检测天冬氨酸的天冬氨酸浓度-(I0/I)-1值关系曲线图。
图3是双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针检测谷氨酸的荧光强度变化曲线图。
图4是双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针检测谷氨酸的谷氨酸浓度-(I0/I)-1值关系曲线图。
图5是双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针对12种氨基酸中天冬氨酸和谷氨酸的区分图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺
向盛有8mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的圆底烧瓶中加入1mL(9.3mmol)二乙烯三胺、4.0mL(22mmol)叔丁基苯基碳酸酯、0.3mL(2.2mmol)三乙胺(TEA)，在氮气保护、冰浴条件下搅拌12小时，将反应液倒入1L0.025mol/L K2HPO4和0.025mol/L NaH2PO4的缓冲液中，用2mol/L的H2SO4将溶液的pH调至3，再用乙醚萃取，取水层，用9mol/L的NaOH水溶液将水层的pH调至10，用二氯甲烷萃取三次，取二氯甲烷层，用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发蒸除二氯甲烷，即得式Ⅰ所示的两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺，其反应方程式如下：
2、合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物
将2.0g(7mmol)丹磺酰氯和2.8mL(20.1mmol)三乙胺加入到盛有70mL三氯甲烷的三颈烧瓶中，搅拌溶解，再加入2.7g(9mmol)两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺，在氮气保护、常温条件下搅拌12小时，将反应液用饱和食盐水洗三次，取有机层，用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发蒸除三氯甲烷，先用正己烷与乙酸乙酯的积比为6:1的混合液作为洗脱液柱层析纯化产物，然后用正己烷与乙酸乙酯的积比为1:1的混合液作为洗脱液柱层析纯化产物，再二氯甲烷和甲醇的体积比为55:1的混合物作为洗脱液柱层析纯化产物，30℃真空干燥12小时，得到式Ⅱ所示的两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物，产率为41％，其反应方程式如下：
3、合成两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物
将0.4g(0.7mmol)两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物用9mL二氯甲烷溶解并置于50mL的三口烧瓶中，移取4.5mL(60mmol)三氟醋酸置于恒压滴液漏斗中，在氮气保护、冰浴条件下滴到三口烧瓶中，搅拌12小时，蒸除反应液中的二氯甲烷，然后加入10mL蒸馏水溶解并用饱和碳酸钠水溶液调节pH至9，再用三氯甲烷萃取，取有机层，用无水硫酸钠干燥，蒸除三氯甲烷，30℃真空干燥12小时，得到式Ⅲ所示的两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物，产率为98％，其反应方程式如下：
4、合成两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物
将0.25g(0.7mmol)两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物和0.4mL(18mmol)三乙胺加入到盛有50mL三氯甲烷的三口烧瓶中，搅拌溶解，取0.242mL(2.4mmol)溴乙酰溴和12mL三氯甲烷置于恒压滴液漏斗中，在氮气保护、冰浴条件下滴加到三口烧瓶中，搅拌48小时，所得反应液用去离子水洗涤三次，然后用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发蒸除三氯甲烷，用石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:3的混合液作为洗脱液柱层析纯化产物，35℃真空干燥12小时，得到式Ⅳ所示的两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物，产率为62.5％，其反应方程式如下：
5、合成双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针
将0.25g(4mmol)两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物溶解于50mL四氢呋喃中，加入0.14mL(16mmol)N-甲基咪唑，在氮气保护下加热回流60小时，将反应液抽滤，所得固体在25mL丙酮中加热回流8小时，抽滤，用乙醚淋洗，得到双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针，其收率为65.2％，反应方程式如下：
实施例2
在实施例1的合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物步骤2中，将2.0g(7mmol)丹磺酰氯和3.4mL(24.5mmol)三乙胺加入到盛有70mL三氯甲烷的三颈烧瓶中，搅拌溶解，再加入2.1g(7mmol)两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺，在氮气保护、常温条件下搅拌12小时，其他步骤与实施例1相同，得到双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针，其收率为38％。
实施例3
在实施例1的合成两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物步骤4中，将0.25g(0.7mmol)两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物和0.4mL(18mmol)三乙胺加入到盛有50mL三氯甲烷的三口烧瓶中，搅拌溶解，取0.176mL(1.75mmol)溴乙酰溴和12mL三氯甲烷置于恒压滴液漏斗中，在氮气保护、冰浴条件下滴加到三口烧瓶中，搅拌48小时，其他步骤与实施例1相同，得到双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针，其收率为59％。
实施例4
在实施例1的合成双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针步骤5中，将0.25g(4mmol)两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物溶解于50mL四氢呋喃中，加入0.21mL(24mmol)N-甲基咪唑，在氮气保护下加热回流48小时，其他步骤与实施例1相同，双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针，其收率为62.2％。
实施例5
双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针在检测天冬氨酸中的用途，其检测方法如下：
将双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针溶于10mmol/L十二烷基硫酸钠水溶液中，配成10μmol/L双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针溶液，取2.5mL此溶液于比色皿中，加入天冬氨酸，混合均匀，使所得溶液中天冬氨酸的浓度分别为80、110、150、200、250、300、350、400μmol/L，用FLS920型单光子计数时间分辨荧光光谱仪在最大激发波长为370nm、发射波长为537nm处测量荧光强度，激发发射狭缝均为2nm。荧光强度随天冬氨酸浓度变化的荧光光谱图见图1，并绘制(I0/I)-1值随天冬氨酸浓度变化的线性曲线图，结果见图2。
由图1可见，浓度为10μmol/L的荧光探针在10mmol/L的十二烷基硫酸钠水溶液中的荧光强度随着体系中天冬氨酸浓度的增大变化很明显，说明所制备的荧光探针对天冬氨酸的检测灵敏度很高。由图2可见，在天冬氨酸浓度为80～400μmol/L时，(I0/I)-1值与天冬氨酸浓度呈线性关系，线性方程为：
y＝0.58+0.008x
式中y为(I0/I)-1值，x为天冬氨酸浓度，相关系数r为0.997，由相关系数可见，(I0/I)-1值与天冬氨酸浓度的线性关系很好。经测试，该荧光探针对天冬氨酸的检出限为1.6μmol/L。
实施例6
双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针在检测谷氨酸中的用途，其检测方法如下：
将双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针溶于10mmol/L十二烷基硫酸钠水溶液中，配成10μmol/L双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针溶液，取2.5mL此溶液于比色皿中，加入谷氨酸，混合均匀，使所得溶液中谷氨酸的浓度分别为150、200、250、300、350、400、450、500μmol/L，用FLS920型单光子计数时间分辨荧光光谱仪在最大激发波长为370nm、发射波长为537nm处测量荧光强度，激发发射狭缝均为2nm。荧光强度随谷氨酸浓度变化的荧光光谱图见图3，并绘制I0/I-1值随谷氨酸浓度变化的线性曲线图，结果见图4。
由图3可见，浓度为10μmol/L的荧光探针在10mmol/L的十二烷基硫酸钠水溶液中的荧光强度随着体系中谷氨酸浓度的增大变化很明显，说明所制备的荧光探针对谷氨酸的检测灵敏度很高。由图2可见，在谷氨酸浓度为150～500μmol/L时，(I0/I)-1值与谷氨酸浓度呈线性关系，线性方程为：
y＝-0.8+0.006x
式中y为(I0/I)-1值，x为谷氨酸浓度，相关系数r为0.995，由相关系数可见，(I0/I)-1值与谷氨酸浓度的线性关系很好。经测试，该荧光探针对谷氨酸的检出限为6.0μmol/L。
为了证明本发明的有益效果，发明人按照实施例4的方法，对浓度为50、100、150、200、300、400μmol/L的天冬氨酸、色氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸分别进行了检测，测试结果见图5。由图5可见，在相同条件下，加入12种不同的氨基酸，只有天冬氨酸和谷氨酸能够发生明显的猝灭，而其他氨基酸荧光强度未发生明显变化，说明本发明的荧光探针在10mmol/L的十二烷基硫酸钠水溶液中可以很好的选择区分天冬氨酸或谷氨酸，然后进一步根据不同浓度下对应的(I0/I)-1值，结合天冬氨酸和谷氨酸标准曲线的线性方程即可确定天冬氨酸和谷氨酸。

Claims (6)

1.一种双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式如下所示：
2.一种权利要求1的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针的合成方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺
以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，将二乙烯三胺与叔丁基苯基碳酸酯、三乙胺按摩尔比为3.2～5:8～12:1，在氮气保护、冰浴条件下搅拌12～24小时，分离纯化产物，得到式Ⅰ所示的两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺；
(2)合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物
以三氯甲烷为溶剂，将两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺、丹磺酰氯、三乙胺按摩尔比为1～1.5:1:2～3.5，在氮气保护、常温条件下搅拌12～36小时，所得反应液用饱和食盐水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，蒸除三氯甲烷，依次用正己烷与乙酸乙酯的体积比为5～8:1的混合物、正己烷与乙酸乙酯的体积比为1:1的混合物、二氯甲烷和甲醇的体积比为50～60:1的混合物作为洗脱液柱层析纯化产物，真空干燥，得到式Ⅱ所示的两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物；
(3)合成两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物
以二氯甲烷为溶剂，将两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、三氟醋酸按摩尔比为1:80～90，在氮气保护、冰浴条件下搅拌12～24小时，蒸除二氯甲烷，加入蒸馏水溶解，然后用饱和碳酸钠水溶液调节pH至9～11，用三氯甲烷萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，蒸除三氯甲烷，真空干燥，得到式Ⅲ所示的两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物；
(4)合成两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物
以三氯甲烷为溶剂，将两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、溴乙酰溴、三乙胺按摩尔比为1:2.5～4:25～27，在氮气保护、冰浴条件下搅拌36～48小时，所得反应液用去离子水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，蒸除三氯甲烷，用石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:3～5的混合液作为洗脱柱层析纯化产物，真空干燥，得到式Ⅳ所示的两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物；
(5)合成双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针
以四氢呋喃为溶剂，将两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、N-甲基咪唑按摩尔比为1:4～6，在氮气保护下加热回流48～72小时，抽滤，所得固体在丙酮中加热回流8～12小时，抽滤，用乙醚淋洗，得到双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针。
3.根据权利要求2所述的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针的合成方法，其特征在于：在合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物步骤(2)中，所述的两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺、丹磺酰氯、三乙胺按摩尔比为1～1.3:1:2.5～3。
4.根据权利要求2所述的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针的合成方法，其特征在于：在合成两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物步骤(4)中，所述的两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、溴乙酰溴、三乙胺按摩尔比为1:3～3.5:25～27。
5.根据权利要求2所述的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针的合成方法，其特征在于：在合成双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针步骤(5)中，所述的两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、N-甲基咪唑按摩尔比为1:4～5。
6.权利要求1的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针在检测氨基酸中的用途，所述的氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。
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