CN104148123B - 一种新型大通道电泳微芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型大通道电泳微芯片，以PDMS为材质，芯片中设置有直径为0.8～1.2mm、总长为8～30cm的分离通道，分离通道两端固定缓冲槽，分离通道内固定有内制冷毛细管，所述内制冷毛细管两端以中空纤维膜固定，在距离分离通道一端0.5～2cm处设置有与分离通道垂直的进样通道，在距离所述进样通道6～20cm处设置有转移通道，所述转移通道垂直于分离通道，材质为PDMS或石英毛细管。芯片总长度为8～30cm，宽度为2～9cm，芯片厚度为0.2～0.7cm。本发明以WBE技术为基础，通过微流控芯片的手段，开发了分离通道尺寸在毫米级的新型大通道电泳芯片。首次在微流控芯片电泳系统中引入内制冷模块，从而将载样量提高至与WBE相当的水平，同时解决了焦耳热效应过大的问题，并实现了大通道与转移通道的零死体积连接，可全部通过电压控制完成样品的一维分析，二维转移的全过程。

Description

一种新型大通道电泳微芯片

技术领域

本发明属于微流控芯片电泳分析技术领域，具体涉及一种电泳微芯片。

背景技术

芯片实验室(Lab-on-a-chip)或称微全分析系统(Miniaturized Total AnalysisSystem,μ-TAS)是由Manz与Widmer在1990年首次提出的概念，并在此后的20余年中得到了不断的创新和发展。通常微芯片电泳技术的核心是在50-100μm宽和10-20μm深的通道内进行高速的毛细管电泳分离，具有分析速度快、效率高、成本低、易于实现自动化和高通量化的优势，是当今分析化学领域的研究热点。随着当今生物技术的研究逐步深入，常规的一维分析很难满足复杂样品对方法的峰容量的要求，因此芯片电泳一直在朝着多维联用的方向发展，以期获得更好的分析效果，同时兼顾快速、便捷的优势。但是由于传统的毛细管微流控芯片电泳的分离管道的内径过小，导致其载样量较低，这就限制了其在多维分析方面的应用，使得微流控芯片的灵活性和易于实现自动化分析等优势不能得到足够的彰显。

焦耳热是限制芯片电泳分析载样量的关键因素。电泳过程中，通道内的缓冲液在电场作用下产生电流，从而不可避免的出现焦耳热蓄积，这就决定了不能简单地通过扩大通道内径来提高载样量。虽然一些实验结果表明，芯片通道内可承受的电场强度可达传统CE的5-10倍之高，但这都是以短通道、快速分离来实现的，缩短了焦耳热蓄积时间，并不能从根本上解决热量消除的问题。

大管电泳(WBE技术)可以从根本上解决上述问题，大幅提高电泳分析的载样量。本课题组的郭玉高使用类似于列管换热器的思路，将内制冷方法应用在了电泳分离中，从而成功实现了电泳分析载样量由nL到μL级的变化。李优鑫对WBE技术的结构进行了改进，通过中空纤维膜进行制冷管的固定，使其被位置保持在通道中心，从而保证散热效果的均一性和稳定性，极大地提高了WBE技术的分离效率，并开发了WBE在线酶反应及收集系统、WBE-HPLC联用系统等，使WBE的理论不断完善，是大通道电泳微流控芯片设计的理论依据和实验基础。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种新型大通道电泳微芯片，克服现有技术中毛细管微流控芯片载样量低的问题。

本发明的技术方案是：

一种新型大通道电泳微芯片，以PDMS为材质，芯片中设置有直径为0.8～1.2mm、总长为8～30cm的分离通道，分离通道两端固定缓冲槽，分离通道内固定有内制冷毛细管，所述内制冷毛细管外径为400-700μm，两端以中空纤维膜固定。在距离分离通道一端0.5～2cm处设置有与分离通道垂直的进样通道，在距离所述进样通道6～20cm处设置有转移通道。所述转移通道垂直于分离通道，材质为PDMS或石英毛细管，另一端为缓冲液槽。芯片总长度为8～30cm，宽度为2～15cm，芯片厚度为0.2～0.7cm。

大通道芯片电泳缓冲液中需添加0.3％～1％HEC或HPMC等添加剂以增加粘度，一般选择添加0.6％的HEC。施加分离电压前，预先逆向通入内制冷水使体系温度达到平衡，冷却水温度一般控制在10℃左右，流速3-15mL/min，根据实际室温环境进行调节。在三个缓冲液槽内分别插入电极，并依据样品性质施加不同的电势，样品即受到电场力驱动，在不同通道内实现分离以及转移，并通过检测器收集信号。

其中分离通道直径最好为1mm，内制冷管外径最好为690μm。

所述转移通道为多个平行设置。

本发明的有益效果是：本发明以WBE技术为基础，通过微流控芯片的手段，开发了分离通道尺寸在毫米级的新型大通道电泳芯片。首次在微流控芯片电泳系统中引入内制冷模块，从而将载样量提高至与WBE相当的水平，电泳过程中通过逆向通入内制冷水的方式，可以将焦耳热即时原位地消除，解决了焦耳热效应过大的问题，并实现了大通道与转移通道的零死体积连接，可全部通过电压控制完成样品的一维分析，二维转移的全部过程。

附图说明

图1为本发明新型大通道电泳微芯片结构示意图；

图2为大通道电泳微芯片进样量-峰宽关系图；

图3为电场强度-电流曲线；

图4为以毛细管为二维通道的全组分转移；

图5为相异缓冲体系下的解离抑制转移；

图6为电进样结果图(三次重复)；

图7为相近缓冲体系下的全组分转移(259nm检测)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细说明。

本发明的新型大通道电泳微芯片以PDMS为材质，采用模具成型法获得。该大通道微芯片分离通道直径为0.8～1.2mm，可以实现大量样品的分离分析，载样量高达800nl。大通道芯片分离通道总长为8～30cm，通道两端固定缓冲槽，在距离一端0.5～2cm处设计与主分离通道垂直的进样通道，供“十字交叉电进样”或“压力进样”使用。将烧去涂层的石英毛细管固定于芯片主分离通道内部，作为内制冷毛细管，两端以中空纤维膜固定，以保证其位置在分离通道轴心。在与样品运行相反的方向流入冷却水，冷却水流入温度控制在10℃，可保证运行缓冲液内部在场强达到300V/cm时U-I关系不偏离欧姆定律，为样品的高效分离提供基础。芯片总长度为8～30cm，宽度为2～15cm，芯片厚度为0.2～0.7cm。上述大通道芯片的通道直径最好为1mm，内制冷管外径最好为690μm。转移毛细管一端与分离通道相连，另一端连接缓冲液槽。转移通道可选取PDMS和石英毛细管两种材质，为满足一维大通道实现一定程度的样品分离，其位置设计于距离进样位置6～20cm的任意位置，并垂直于一维分离通道。可按需要设计任意多个平行转移通道，当使用石英毛细管材质时，转移毛细管位置及接口在芯片制作时即确定，可灵活插拔，可根据不同分离需要随时更换毛细管。如图1所示，B与BW间为分离通道，直径为1mm；A为进样位点；A与S间、A与SW间均为进样通道，错开距离约为1mm，S与SW距离为1.1cm；C与D间为转移通道(六组平行)，且可根据需要插入转移毛细管。当选择CD为转移通道或以C点为检测点时，A与C间距离为分析有效长度；B与BW间距离为分析总长。CE、CD等六个平行通道均为PDMS材质的转移通道，CE、CD间距离均为二维分析总长，其有效长度依每次实验所选择的转移位点而定。内制冷管贯穿于B与BW之间，并与外部冷却系统相连。

本发明的新型大通道电泳微芯片的制作方法为：在一块平整洁净的玻璃板上，依照上述芯片的结构设计，固定0.8～1.2mm的钢丝以及毛细管作为大通道芯片通道的阳模。并在玻璃板四周制作围挡，以保证制成芯片具有一定的厚度。称取Sylgard184双组份，并以重量比10:1的配比，将预聚物与固化剂充分混匀，静置15min，待气泡消散。将该混合物浇筑在固定有芯片模型的玻璃板上，于75℃烘箱中加热40min。将基片连同模型同时翻面，在背面继续涂覆Sylgard184双组份的10:1混合物，于75℃烘箱中继续加热至其完全老化(约1h左右)。脱模，用蒸馏水测试、清洗，固定内制冷管和缓冲液槽，完成含转移通道的芯片制作。在缓冲槽所需位置开孔，并使用704硅橡胶固定缓冲液槽。将外径为690μm毛细管壁涂层烧去，使用中空纤维膜进行两端的固定，并以AB胶封堵，即完成大通道芯片的制作。

进样与分析：进样过程可灵活选择1～2个进样通道，通过进样针压力进样和电进样完成。一维运行缓冲液中采用添加羟乙基纤维素(HEC)的方法增加粘滞阻力，有效抑制了样品扩散所致的区带展宽和进样过程中样品泄漏。冷却水温度一般控制在10℃左右，流速3-15mL/min，根据实际室温环境进行调节。

转移：大通道芯片上的二维转移通常选择“三电极模式”，是指在大管分离通道一侧设计垂直的转移通道，在施加一维电压的同时，在转移通道槽一端提供电势差，样品即可部分的迁移至转移通道中。在该二维分析系统中，不同通道内可以维持相对独立的缓冲体系，进而可以依据不同物质在不同体系内解离性质的差异，实现混合样品的选择性转移。

试验例1

实验条件：缓冲液：10mM pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液(含0.6％HEC)；样品为：1mg/mL对甲苯磺酸；检测波长为：259nm；分离有效长度/总长＝6.5cm/11cm；负极进样；分离电压1000V，电流280μA.

表1大通道芯片最大载样量测试数据

以进样量和峰宽作图，从图2可以直观的看出，当进样量达到1000nl时，峰展宽变得更加明显。从数值上可以看出，进样1000nl时，峰宽增大的数值超出了10％的范围。表1中，峰面积和保留时间的重复性均良好，证明了以上峰宽数据的可靠性。因此，对于有效长度/总长＝6.5cm/11cm的芯片来说，载样量为800nl。

试验例2

实验条件：缓冲液：10mM pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液；冷却水流速：15mL/min；冷却水温度约为10℃。

如图3所示，加入内制冷水后，电场强度最高可以施加到300V/cm，而不引起明显的热蓄积。而无内制冷水时，场强超过150V/cm后，即偏离线性关系。由此可见，通过与WBE类似的内制冷方法，可以显著削弱大通道芯片中的热蓄积效应。

试验例3

实验条件：一维缓冲液：10mM pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液；二维缓冲液：40mM pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液；样品为：1mg/mL苯甲酸、2mg/mL对甲苯磺酸混合液；负极进样；300V，90s；三电极电压：-1000V，0V，7600V；一维有效长度/总长＝6.5cm/10.5cm；二维有效长度/总长＝13.5cm/27.5cm；检测波长：214nm。

如图4所示(其中1为对甲苯磺酸；2为苯甲酸)，首次将大通道微芯片电泳与毛细管电泳组成了二维联用系统，实现了零死体积连接，以及样品的在线转移。

试验例4

实验条件：一维缓冲液：10mM pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液；二维缓冲液：20mM pH2.5的tris-磷酸缓冲液；样品为：1mg/mL苯甲酸、2mg/mL对甲苯磺酸混合液；负极进样；300V，90s；三电极电压：-1000V，0V，7600V；一维有效长度/总长＝6.5cm/10.5cm；二维有效长度/总长＝13.5cm/27.5cm；检测波长：214nm。

如图5所示，结果表明：苯甲酸在解离抑制的条件下，出峰时间延长至原体系的约1.5倍，并且分离度进一步提高。受到迁移速率的影响，转移量也有所减小，证明对于pKa差异较大的样品，可以通过改变转移体系的pH值进行选择性转移。此外，该结果也证明了在二维连接的大通道芯片与毛细管体系中，各分离通道可以维持相对独立的缓冲体系，从而实现样品的选择性转移。

实施例1：

设计如图1所示芯片，其中B与BW间距离为10.5cm，通道直径为1mm；A为进样位点；S与SW距离为1.1cm；A、S与A、SW间错开距离为1mm；A与C间距离为6.5cm；按照技术方案中步骤制作芯片。采用“双T型”通道电进样方式，分析有机酸样品：

实验条件：缓冲液：10mM pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液(含0.6％HEC)；样品为：1mg/mL苯甲酸、2mg/mL对甲苯磺酸混合液；有效长度/总长＝6.5cm/10.5cm；检测波长为：259nm；进样电压300V；进样电流300μA；进样时间60s；负极进样；分离电压1000V；电流220-240μA；冷却水温度约10℃；冷却水流速为15ml/min。结果如图6，其中1为对甲苯磺酸；2为苯甲酸。

实施例2：

设计如图1所示芯片，其中B与BW间距离为10.5cm，通道直径为1mm；A为进样位点；S与SW距离为1.1cm；A、S与A、SW间错开距离为1mm；A与C间距离为6.5cm；C、D间通道采用插入毛细管的方式，获得通道有效长度/总长＝13.5cm/27.5cm；按照技术方案(c)中步骤制作芯片。采用“双T型”通道电进样方式，以及三电极转移模式，分析有机酸样品：

实验条件：一维缓冲液：10mM pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液；二维缓冲液：40mM pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液；样品为：1mg/mL苯甲酸、2mg/mL对甲苯磺酸混合液；负极进样；300V，90s；转移电压：B点为-1000V，BW点为0V；D点为7600V；一维有效长度/总长＝6.5cm/10.5cm；二维有效长度/总长＝13.5cm/27.5cm；检测波长：259nm。结果如图7，其中1为对甲苯磺酸；2为苯甲酸。

Claims (5)

1.一种大通道电泳微芯片，其特征在于，所述大通道电泳微芯片以PDMS为材质，芯片中设置有直径为0.8～1.2mm、总长为8～30cm的分离通道，分离通道两端固定缓冲槽，分离通道内固定有内制冷毛细管，所述内制冷毛细管两端以中空纤维膜固定，在距离分离通道一端0.5～2cm处设置有与分离通道垂直的进样通道，在距离所述进样通道6～20cm处设置有转移通道，所述转移通道垂直于分离通道，材质为PDMS或石英毛细管，另一端为缓冲液槽；芯片总长度为8～30cm，宽度为2～15cm，芯片厚度为0.2～0.7cm。

2.根据权利要求1所述大通道电泳微芯片，其特征在于，所述转移通道为多个平行设置。

3.一种权利要求1所述大通道电泳微芯片的应用方法，其特征在于，电泳缓冲液中需添加0.3％～1％HEC或HPMC添加剂以增加粘度，施加分离电压前，预先逆向通入内制冷水使体系温度达到平衡。

4.根据权利要求3所述大通道电泳微芯片的应用方法，其特征在于，所述添加剂为0.6％的HEC。

5.根据权利要求3所述大通道电泳微芯片的应用方法，其特征在于，所述冷却水温度控制在10℃，流速3-15mL/min，根据实际室温环境进行调节。